ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS
QUIMICOBIOLÓGICAS
Detección de posibles factores de
virulencia de Vibrio mimicus aislado de
agua y alimentos
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICO BIOLÓGICAS
P R E S E N T A:
Q.B.P. TERCERO ALBURO JOSE JULIO
Por permitirme continuar por este camino en compañía de gente valiosa.
A mis abuelitos:
Por cuidarme siempre.
A mi Mamá y Maru:
Por que aún en los momentos más difíciles hemos estado juntos.
A mi Tía Titi Ricardo, Toño y Joana:
Por su cariño, y apoyo invaluables.
A la Maestra Elsa, al Doctor Carlos y al Doctor Francisco:
Por confiar en mi desde siempre, por la oportunidad de ser parte de su equipo,
por las oportunidades brindadas y por su cariño.
A Liz y Alex:
Por estar a mi lado, alentarme a seguir adelante a pesar de lo malo y brindarme
su cariño.
A Iván:
Por su amistad, por enseñarme el valor del trabajo y por aprender juntos.
A Claudia, Marcela, Chayo, Andrés, Viri, Diana, Laura, Claudia y a todos
aquellos que por alguna circunstancia halla olvidado mencionar:
Gracias por sus consejos, amistad y el tiempo compartido.
A mis sinodales:
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología Sanitaria del Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección de la M en C Elsa Irma Quiñones Ramírez con el financiamiento clave SIP 20080926 y en el Laboratorio de Inocuidad Alimentaria del Departamento de Biotecnología de la Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa a cargo del Dr. Carlos Vázquez Salinas y bajo la co-dirección del Dr. Francisco José Fernández Perrino.
JURADO
M. en C. Elsa Irma Quiñones Ramírez Dr. Francisco José Fernández Perrino
Dr. Carlos Vázquez Salinas Dra. Ethel A. García Latorre Dra. Silvia Giono Cerezo Dr. Cesar H. Hernández Rodríguez
Índice general III Índice de Cuadros V Índice de figuras Abreviaturas VI VII Resumen Abstract VIII IX I. Introducción 1 I.1 Antecedentes 1 I.2 Historia 2
I.3 Características del microorganismo 3
I.4 Hábitat y distribución 4
I.5 Epidemiología 5
I.6 Patogénesis 5
I.7 Factores de virulencia 6
I.7.1 Hemolisinas 6
I.7.2 Proteasas 7
I.7.3 Factores de adherencia 7 I.7.4 Mecanismos de adquisición del hierro 8
I.7.5 Enterotoxinas 9
I.7.6 Elementos genéticos móviles 9 I.7.6.1 Isla de patogenicidad de Vibrio I (VPI-1) 10 I.7.6.2 El bacteriófago CTX 11 I.7.7 Cápsula 12 I.7.8 toxR 13 Justificación 15 Hipótesis 15 Objetivos 16
Esquema general de trabajo
17
II. Metodología 18
II.1 Obtención del DNA genómico 18
II.2 Amplificación de los genes vmhA, ctxA, zot, tcpA, toxT, toxT, iuT y wza
mediante la técnica de PCR. 18
II.3 Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa 19
II.4 Análisis bioinformática 19
II.5 Presencia de hemolisina 19
II.5.1 Prueba fenotípica 19
II.5.2 Prueba genotípica 19
II.6 Amplificación de los genes del fago CTX 20 II.7 Amplificación de los genes de la VPI1 21
II.8 Amplificación del gen tox R 21
II.9 Presencia de sideróforos 22
II.10.2 Prueba genotípica 23 II.11 Evaluación del efecto citotóxico del filtrado libre de células de
V. mimicus 24
II.11.1 Obtención del filtrado 24 II.11.2 Obtención de un abasto de células CHO 24 II.11.3 Efecto de los filtrados de V. mimicus 25 II.12 Ensayo de adherencia en la línea celular HEp-2 25 II.12.1 Preparación de los cultivos 26 II.12.2 Preparación de la monocapa de células HEp-2 y ensayo
. de adherencia 26
III. Resultados 27
III.1 Hemolisina y vmhA 27
III.2 Presencia de la VPI-1 y del bacteriófago CTX 28
III.3 toxR 30
III.4 Búsqueda de sideróforos 31
III.5 Cápsula 32
III.6 Efecto de los filtrados libres de células sobre la línea celular CHO 36 III.7 Adherencia en la línea celular HEp-2 38
IV. Discusión 41
V. Conclusiones 49
VI. Bibliografía 50
Páginas Cuadro 1. Lugares en donde se ha reportado la presencia de V. mimicus 4
Cuadro 2 Cepas testigo usadas en este trabajo 18
Cuadro 3 Condiciones de amplificación para vmhA 20
Cuadro 4 Condiciones de amplificación para los genes del fago CTX 20
Cuadro 5 Condiciones de de los genes de la VPI1 21
Cuadro 6 Condiciones de amplificación para toxR 22
Cuadro 7 Condiciones de amplificación para el operón de aerobactina 23
Cuadro 8 Condiciones de amplificación para del gen wza 24
Cuadro 9 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO 37 Cuadro 10 Genotipos y fenotipos mostrados las cepas de V. mimicus 40
Páginas Figura 1. Estructura química de los Sideróforos producidos por el género Vibrio 8 Figura 2. Organización del cluster de aerobactina en V. mimicus 9
Figura 3. Organización de la VPI-1 10
Figura 4. Organización del bacteriófago CTX 11
Figura 5. Papel de la proteína Wza en la translocación del polisacárido cápsular 13 Figura 6. Procesos que controla la proteína ToxR en V .mimicus 14
Figura 7. Diagrama general de trabajo 17
Figura 8. - hemólisis en agar sangre 27
Figura 9. Electroferograma del producto amplificado del gen vmhA 27 Figura 10. Confirmación del tamaño del amplificado para el gen vmhA 28
Figura 11. Búsqueda de la VPI1 29
Figura 12 Búsqueda del fago CTX 30
Figura 13. Electroferograma del producto amplificado del gen toxR 31 Figura 14. Producción de Sideróforo tipo hidroxamato en agar CAS 31 Figura 15. Electroferograma del producto amplificado del operón de aerobactina 32 Figura 16. Presencia de cápsula en cepas de V. mimicus por medio de la tinción de Rojo
Congo 32
Figura 17. Electroferograma de los productos amplificados para el gen wza 33 Figura 18 Electroferograma del gradiente de temperatura para el gen wza hecho con el
ADN de V. mimicus ATCC 33653 33
Figura 19 Análisis BLAST de la secuencia de 500 pb amplificada por V. mimicus. 34 Figura 20 Análisis BLAST de la secuencia de 800 pb amplificada por V. mimicus. 34 Figura 21 Análisis BLAST de la secuencia de 800 pb amplificada por V. cholerae. 35 Figura 22 Análisis BLAST de la secuencia de 500 pb amplificada por V. vulnificus ATCC
29307 35
Figuras 23 Ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular CHO 38 Figura 24 Determinación del tiempo adecuado para el ensayo de adherencia 38
Figura 25 Adherencia de V. mimicus a las células HEp-2. 39
Figura 26 Localización de los iniciadores en los genes wza y 16S RNA de V. mimicus y
ABREVIATURAS
VPI-1 Isla de patogenicidad de Vibrio 1
CTX Bacteriófago filamentoso que en su genoma tiene los genes para la toxina del cólera CT Toxina del cólera (por sus siglas en ingles cholera toxin)
TCP Pili co regulado con la toxina (por sus siglas en ingles toxin corregulated pilus) HEp-2 Células de carcinoma laríngeo humano.
CHO Células epiteliales de ovario de hámster chino OMS Organización mundial de la salud
FAO Organización de las naciones unidas para la agricultura y alimentación (por sus siglas en ingles Food and Agriculture Organization of the United Nations)
OPS Organización panamericana de la salud CAS Cromo Azurol S
ETA Enfermedad transmitida por alimentos ºC Grado centígrado
pH Potencial de iones H+
UFC Unidad formadora de colonia Kda Kilodalton
% G-C Proporción de Guanina y Citocina en el DNA DNA Acido Desoxiribonucléico
Seg segundo μl microlitro pb pares de bases
BLAST Herramienta de búsqueda de alineamiento básico local (por sus siglas en ingles Basic Local Alignment Search Tool)
NCBI Centro nacional de información biotecnológica (por sus siglas en ingles National Center of Biotechnology Information)
dNTP`s Desoxinucleótidos fosfato
RESUMEN
Vibrio mimicus es una bacteria de hábitat acuático que se ha aislado de costas, estuarios, ríos, lagos y lagunas de agua dulce y salada de las zonas templadas o cálidas. Se encuentra formando parte de la microbiota del zooplancton, en crustáceos y moluscos que se alimentan por filtración. Los alimentos involucrados en su transmisión al humano son ostras, huevos de tortuga, camarón y pescado, que se consumen crudos o poco cocidos, causando casos de gastroenteritis y diarreas severas tipo cólera. Dentro del género Vibrio, V. mimicus y V. cholerae son las especies que están filogenéticamente más relacionadas, compartiendo múltiples características fenotípicas y genotípicas. En la actualidad se desconoce el mecanismo de patogenicidad de V. mimicus, sin embargo, se han descrito algunos factores asociados a la virulencia, como hemolisinas, hemaglutininas, proteasas, sideróforos, enterotoxinas y la presencia de la VPI1 y del fago CTX , necesarios para causar un cuadro similar al cólera. Por ello, en el presente trabajo se consideró de interés estudiar la presencia de algunos factores potencialmente involucrados en la virulencia de V. mimicus en cepas ambientales aisladas de agua, pescados y ostiones capturados en las costas del Golfo de México,. Se trabajó con 20 cepas de V. mimicus aisladas de la laguna de Pueblo Viejo Veracruz: 6 provenientes de agua, 5 de pescado y 9 de ostión. Se utilizaron eritrocitos de carnero y conejo para determinar la actividad hemolítica, el medio CAS para la detección de sideróforos y la tinción con rojo congo para la observación de la presencia de cápsula. Se hizo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se analizó la presencia de los genes para la hemolisina (vmhA), fago CTX (ctxA y zot), VPI1 (tcpA y tox), parte del operón de aerobactina (iutA ,Inc. iucD), cápsula (wza) y un gen regulador, (toxR). Se observó, asimismo, la capacidad citotóxica sobre la línea celular CHO y la adherencia sobre células HEp-2. El 100% de las cepas estudiadas resultaron ser -hemólíticas y poseen el gen de la hemolisina vmhA, confirmando su identidad como V. mimicus, no encontrándose en ellas el fago CTX ni la VPI-1.Todas las cepas tienen el gen toxR. El 40% de las cepas producen sideróforos de tipo hidroxamato en medio CAS y todas amplificaron los genes del operón de aerobactina. Por vez primera se describió en V. mimicus la presencia de cápsula en las cepas, corroborándose al amplificar el gen homólogo al wza. El 75% de las cepas presentaron efecto citopático a las 3 horas de exposición al filtrado, observándose destrucción de la monocapa a las 6 horas de exposición al sobrenadante filtrado. Los filtrados mostraron títulos desde 1:3 hasta 1:81. Se encontró que todas las cepas presentaron adherencia a la línea celular HEp-2, con un patrón de tipo agregativo. En el presente estudio se demostró que las cepas de V. mimicus aisladas de alimentos poseen la capacidad de producir factores asociados a la virulencia. En México no existen estudios sobre aislados de V. mimicus que provengan de productos de la pesca, por lo que nuestros datos son una contribución para describir el modelo de patogénesis de este microorganismo.
ABSTRACT
Vibrio mimicus is a bacterium inhabiting aquatic environments; it has been isolated from fresh and salt water shores, estuaries, rivers, lakes, and lagoons in temperate and warm climates, It is found as part of the microbiota of zooplankton, in crustacea and molluscs that feed through filtration. Its transmission to humans occurs through food, like oyters, turttle eggs, shrimp, and fish that are consumed raw or barely cooked, causing gastroenteritis and severe cholera-type diarrhea. Among the Vibrio genus, V. mimicus and V. cholerae are the most phylogenetically related species, sharing multiple phenotypic and genotypic characteristics. The pathogenicity mechanism of V. mimicus is still unknown; however, some factors associated to virulence have been described, such as hemolysins, hemagglutinins, proteases, siderophores, enterotoxins, and the presence of VPI1 and of the CTX phage, which are necessary to cause similar symptoms to those of cholera. Based on this, the present work was aimed at studying the presence of some factors involved in the virulence of V. mimicus in environmental strains isolated from water, fish, and oysters in the coast line of the Gulf of Mexico. We worked with 20 V. mimicus strains isolated from the Pueblo Viejo lagoon in the state of Veracruz, Mexico; six isolates from water, five from fish, and nine from oysters. We used sheep and rabbit erythrocytes to determine hemolytic activity, CAS medium to detect siderophores, and Congo red staining to determine the presence of the capsule. In addition, we used polymerase chain reaction (PCR) to analyze the presence of genes encoding for hemolysin (vmhA), phage CTX (ctxA and zot), VPI1 (tcpA and tox), part of the aerobactin operon (iutA ,Inc. iucD), capsule (wza), and of a regulator gene (toxR). Likewise, we observed the cytotoxic capacity on the CHO cell line and the adherence on Hep-2 cells. Hundred percent of the studied strains were -hemolytic and possessed the hemolysin vmhA gene, confirming their identity as V. mimicus, neither phage CTX nor VPI-1 were found. All strains had the gene toxR. Forty percent of the strains produced hydroxamate-type siderophores in the CAS medium, and all amplified the aerobactin operon gene. The presence of a capsule in V. mimicus is described for the first time, and was confirmed by amplifying the homologous gene to wza. Seventy-five percent of the strains presented a cytopathic effect at 3 hours of exposition to the filtrate, observing destruction of the monolayer at 6 hours of exposure to the filtered supernatant. Filtrates showed titers from 1:3 to 1:81. All strains presented adherence to the HEP-2 cell line, with an aggregating pattern. It was also demonstrated that the V. mimicus strains isolated from food possess the capacity to produce factors associated to virulence. In Mexico, there are no studies on V. mimicus isolates originating from fish products; therefore, these data are an important contribution to characterize the pathogenesis of this microorganism.
I INTRODUCCIÓN
I.1 ANTECEDENTES
Los problemas de inocuidad de los alimentos son considerados en la actualidad como un problema de salud pública. Los gobiernos del mundo están intensificando esfuerzos para aumentar la seguridad alimentaria, ya que según datos de la OMS en el año 2005 murieron en el mundo alrededor de 1.8 millones de personas debido a enfermedades diarreicas transmitidas por alimentos y agua. Se estima que las pérdidas económicas que generan los alimentos contaminados por algún patógeno ascienden a 35,000 millones de dólares USA al año tan sólo en los EUA (OMS, 2007). Un factor que agrava estos problemas es la apertura del comercio internacional de alimentos, lo que favorece la propagación de microorganismos en poco tiempo, en forma adicional a la mayor movilización de personas y productos (Bertullo y Pollak, 2001). Los productos del mar, como peces, moluscos y crustáceos, entre otros, son de gran importancia para el ser humano, tanto como fuente de alimento (en el 2002 hubo una producción mundial cercana a las 96,029,000 toneladas), como por razones económicas (ganancias en el 2002 por valor de 548,933,000 dólares USA) (SAGARPA, 2003). En países como China y Japón, que son los mayores consumidores a nivel mundial (SAGARPA, 2003), este tipo de alimentos son fundamentales en su dieta. Existen factores que condicionan esta situación, destacando los sociales (condiciones de vida, distribución de la población), los económicos (distribución de la riqueza social, acceso a este tipo de productos) y los culturales (cualidades de los alimentos, preferencia por ciertos sabores) (Barradas et al., 1993). En nuestro país, los productos de la pesca no forman parte de la dieta básica de la población, excepto en las zonas costeras. Aún así, su consumo ascendió a 922,000 toneladas en 2002 y supusieron ganancias por un valor de 777,000 dólares, USA (SAGARPA, 2003). Es importante señalar que México es exportador de este tipo de mercancías.
La explotación, conservación y consumo adecuados de los productos de la pesca son de vital importancia para evitar la transmisión de enfermedades, como las infecciones (salmonelosis, disentería y cólera, por ejemplo) e intoxicaciones (botulismo y marea roja, por ejemplo) (González, 1983). En la actualidad, los riesgos asociados al consumo de alimentos marinos se han visto en aumento en países desarrollados y en vías de desarrollo, a pesar de los avances en los procesos tecnológicos (Tantillo et al., 2004).
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA`s) son especialmente importantes por sus altas tasas de morbilidad y mortalidad entre los grupos más vulnerables de la población, y porque representan una proporción muy alta del costo de la atención médica y de las hospitalizaciones (OPS, 1991). En nuestro país han ocurrido varios brotes de ETA`s relacionados con productos de la pesca, que corresponden al 2.8% del total de ETA`s (Barradas et al., 1993). Oficialmente, no se han reportado casos de cólera desde 2001 (DGE, 2008). Los géneros bacterianos más importantes que se encuentran en los productos de la pesca son: Pseudomonas spp., Alteromonas spp., Vibrio spp., Moraxella spp., Klebsiella spp., Acinetobacter spp., Flavobacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp., Salmonella spp., Corynebacterium spp., Escherichia spp. y Clostridium spp., entre otras (González, 1983; Quiñones et al., 2000). Las bacterias del género Vibrio son las más abundantes de este grupo y la mayoría de estas bacterias son fácilmente cultivables en los laboratorios, siendo algunas especies patógenos para los humanos y organismos marinos vertebrados e invertebrados (Okada et al., 2005; Zhang y Austin 2005).
Las especies del género Vibrio que están principalmente relacionadas con enfermedades en humanos, y cuya transmisión se da generalmente por agua y alimentos, son Vibrio cholerae (agente causal del cólera), Vibrio parahaemolyticus (que causa gastroenteritis, infección de heridas y septicemia), Vibrio vulnificus (causante de infección necrosante severa en heridas y septicemia invasiva fulminante) y Vibrio mimicus (causa gastroenteritis) (Vora et al., 2005).
I. 2 HISTORIA
Desde 1854, con los trabajos de Pacini y en 1883 con los de Koch se inició el estudio del género Vibrio. La primera especie del género que se describió fue V. cholerae, el agente etiológico del cólera. El serotipo O1 ha causado 7 pandemias y actualmente se predice que la octava será debida al serotipo O139 (Faruque y Albert, 1998; Janda y Powers, 1998; Thompson y Lida, 2004).
Las cepas de V. cholerae con características bioquímicas atípicas se designaban antiguamente como V. cholerae lisina descarboxilasa negativo o V. cholerae sacarosa negativo, entre otras. En 1981, Davis y colaboradores estudiaron cepas representativas de estos biogrupos, utilizando técnicas de hibridación de DNA entre cepas de V. cholerae típicas y atípicas y realizando análisis fenotípicos extensos, lo que les llevó a concluir que la mayoría de las cepas atípicas correspondían a V. cholerae, pero que el biogrupo sacarosa negativo formaba un grupo definido
y aparte, por lo que se propuso una nueva especie denominada V. mimicus. El nombre de esta bacteria hace alusión a que “imita” o es muy “semejante” a V. cholerae (Davis et al., 1981).
I. 3 CARACTERÍSTICAS DEL MICROORGANISMO
V. mimicus y V. cholerae comparten múltiples características fenotípicas y genotípicas, como son habitar en agua dulce, aglutinar con un mismo anticuerpo monoclonal dirigido contra el flagelo (Simonson y Siebeling, 1988), tener dos cromosomas (Okada et al., 2005), e incluso tener capacidad de transferirse información genética entre ellos (Boyd et al., 2000a). En estudios recientes, se ha comprobado que estas dos especies son las más relacionadas entre sí dentro del género, desde el punto de vista filogenético (Thompson y Lida, 2004), formando un grupo separado de las demás especies del género.
En cuanto a su taxonomía, a este microorganismo se le ubica según el Manual Bergey´s 2ª edición de la siguiente forma:
DOMINIO: Bacteria PHYLUM : Proteobacteria SECCION: Gammaproteobacteria CLASE: Zymobacteria ORDEN : Vibrionales FAMILIA : Vibrionaceae GENERO : Vibrio ESPECIE: mimicus
Vibrio mimicus es un bacilo curvo Gram negativo, aunque bajo condiciones de estrés puede ser pleomórfico (Janda et al., 1988); es catalasa y oxidasa positivo y móvil por un flagelo polar. Es un microorganismo halotolerante, crece en intervalos de cloruro de sodio de 0 a 3%, y en presencia de iones Na+ se estimula su crecimiento (Wong y Chen, 1994).
Su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C siendo su máxima de 45°C. Es capaz de sobrevivir a la congelación (hasta -30°C), y se ha aislado de alimentos congelados (Wong y Chen, 1992). También se ha descrito su capacidad para crecer a temperaturas de refrigeración, desde 4 hasta 10°C (Wong y Chen, 1994). El intervalo de pH en el cual se desarrolla es de 5 a 11.
I.4 HÁBITAT Y DISTRIBUCIÓN
Vibrio mimicus es de hábitat acuático; se ha aislado de costas, estuarios, ríos, lagos y lagunas de agua dulce y salada, de las zonas templadas o cálidas. Las poblaciones de este microorganismo no se mantienen constantes a lo largo de todo el año, debido a que factores ambientales como el pH, la salinidad y la temperatura afectan a su desarrollo. Se ha reportado que en verano aumenta la concentración de estos microorganismos, debido a que el calor promueve su proliferación; en cambio, las poblaciones disminuyen en invierno (cuando disminuye la temperatura de la columna de agua) (Chowdhury y Yamanaca, 1989; Vieira et al., 2001). Se ha observado que bajo condiciones no favorables estas bacterias pasan a un estado de disminución de la actividad respiratoria llamado “viable no cultivable”, y por ello no pueden ser detectados con métodos convencionales (Okada et al., 2005).
Cuadro 1. Lugares en donde se ha reportado la presencia de V. mimicus
PAIS REFERENCIA
ASIA
Japón Chowdhury y Yamanaca, 1989; Alam et al., 1996; Miyoshi et al., 1997; Shinoda y Nakagawa, 2004 Taiwán Wong y Chen., 1993
China Chowdhury y Yamanaca, 1989
India Davis et al., 1981; Chowdhury y Yamanaca, 1989; Albert et al., 1992
OCEANÍA
Nueva Zelanda Davis et al., 1981 Filipinas Davis et al., 1981
Australia Wong et al., 1995; Payne et al., 2004 ÁFRICA
Egipto Davis et al., 1981 Senegal Schandevyl et al., 1984 EUROPA
España Pérez et al., 2001 Francia Hervio-Heath et al., 2002 Italia Baffone et al., 2001 Rumania Janda y Powers., 1988 AMÉRICA
Perú Cabezas et al., 2005 Brasil Vieira et al., 2001 Cuba Leyva et al., 1996
Ecuador Vandenberghe et al., 1999
Costa Rica Acuña et al., 1999; Campos et al., 1996 México Davis et al., 1981; Vandenberghe et al., 1999 Estados Unidos Davis et al., 1981; Marano et al., 2000 Canadá Davis et al., 1981
I.5 EPIDEMIOLOGÍA
V. mimicus es reconocido como un patógeno emergente humano, aunque también tiene importancia a nivel económico porque es patógeno también para crustáceos y algunos peces de importancia económica (Shandera et al., 1983; Wong et al., 1995; Miyoshi et al., 1997; Vandenberghe et al., 1999).
A partir de que en 1981 se identificó identificara V. mimicus como una especie distinta a V. cholerae, comenzaron los reportes sobre la posible patogenicidad de la misma. Uno de los primeros reportes es de Bangladesh, en 1981, en el cual V. mimicus se vio involucrado en dos casos de otitis, uno en una persona de 39 años y el otro en un niño, ambos causados por la exposición al agua de mar. En otro reporte se presentaron 17 casos de gastroenteritis en adultos que habían consumido ostiones crudos, así, como infección en heridas expuestas al agua de mar (Davis et al., 1981).
Con el paso del tiempo, se han reportado más casos en otras partes del mundo. En 1991, por ejemplo, durante la epidemia de cólera en América Latina (la séptima pandemia), se describieron casos de diarrea aguda debidos a la presencia de V. mimicus en Costa Rica (Campos et al., 1996) Albert y col. (1992) informaron de casos de diarrea severa y de un caso de bacteriemia en un niño, causado por V. mimicus. En la parte norte de Brasil se reportaron casos de diarrea tipo cólera, identificando cepas atípicas de V. cholerae sacarosa negativo, que se confirmaron posteriormente como V. mimicus (Vieira et al., 2001).
El 12 de febrero de 2005, después de una fiesta de carnavales en Cuncashca, (provincia de Carhuaz, en Perú), se produjo un brote de diarrea aguda que afectó a 32 personas, de las cuales 31 eran mayores de 5 años y sólo un menor de 5 años. En todos ellos se determinó a V. mimicus como el agente causal (Cabezas et al., 2005). En México hay reportes de su presencia (Davis et al., 1981), sin embargo no se tienen datos de algún caso clínico, probablemente debido a que este microorganismo no se busca rutinariamente.
I.6 PATOGENESIS
V. mimicus es capaz de causar varios cuadros clínicos, como son gastroenteritis, otitis, infección de heridas, diarrea tipo cólera, disentería y, en muy raras ocasiones, septicemia. La dosis infectiva aún se desconoce, pero se ha considerado que puede ser similar a la de Vibrio cholerae (104 a 109 UFC), debido a la estrecha relación entre ambos (Reidl y Klose, 2002).
El periodo de incubación puede variar de persona a persona, desde unas cuantas horas después de ingerir el alimento hasta tres a cuatro días, dependiendo del inóculo con el que se haya tenido contacto y del estado inmune de la persona.
I.7 FACTORES DE VIRULENCIA
En la actualidad se desconoce el mecanismo de patogenicidad de Vibrio mimicus, sin embargo, se han descrito algunos factores de virulencia, como hemolisinas, hemaglutininas, proteasas, sideróforos y enterotoxinas (Chowdhury y Yamanaca, 1991; Bi et al., 2001; Moon et al., 2004; Shinoda y Nakagawa, 2004).
I.7.1 HEMOLISINAS
El factor de virulencia más estudiado de este microorganismo es una hemolisina, conocida como VMH (hemolisina de Vibrio mimicus). Esta hemolisina es una proteína termolábil, de aproximadamente 66 kDa, que en su forma activa tiene un 81.6% de identidad con la HlyA de V. cholerae. La VMH se considera especie específica, y se encuentra presente en las cepas ambientales y en las aisladas a partir de casos clínicos (Shinoda y Nakagawa, 2004). Wei y colaboradores en 2008 demuestran que la amplificación de este gen correlaciona con otras técnicas con fines de identificación, como perfiles de ácidos grasos y la comparación de secuencias de los genes 16S DNAr, oriC, pyrH, recA y rpoA.
La VMH es capaz de formar poros de 2.8 a 3.5 nm de diámetro sobre la superficie de las células del huésped. También induce la producción de AMP en los enterocitos y activa un canal de iones de Cl- (CFTR), lo que provoca el desbalance de electrolitos y genera diarrea (Bi et al., 2001; Li et al., 2005).
Se ha descrito otra hemolisina, ésta termoestable, denominada Vm-TDH (hemolisina directa termoestable de Vibrio mimicus). Esta segunda termolisina es un dímero, con subunidades de 21 KDa, y está relacionada con la TDH de V. parahaemolyticus. La Vm-TDH le da la capacidad al microorganismo de producir diarrea tipo disentería. V. mimicus adquiere este gen por transferencia horizontal de DNA, ya que el gen de la TDH se encuentra en un transposón (Terai et al., 1991). A diferencia de la VMH que se encuentra en todos los aislados de esta bacteria, ésta hemolisina se encuentra distribuida en el 10% de las cepas de origen clínico y se reporta su presencia en el 1% de las cepas ambientales (Shinoda y Nakagawa, 2004).
En 2000 se reportó la presencia de una tercera hemolisina, la HLX de aproximadamente 11 KDa, en V. cholerae O1 y V. mimicus. Su contribución a la virulencia de la bacteria, sin embargo, se desconoce (Shi et al., 2000; Zhang y Austin, 2005)
Se ha descrito también que la lecitinasa A PHL de V. mimicus tiene un efecto citotoxico sobre la línea celular CHSE-214 (Lee et al., 2002). Su actividad es similar a la VHH de V. harvey y a la TLH de V. parahaemolyticus (Zhang y Austin, 2005).
I.7.2 PROTEASAS
Se ha descrito en V. mimicus la presencia de diversos tipos de proteasas. Una de ellas, con actividad de hemaglutinina (Vm-HA/proteasa) (Alam et al., 1997) y la denominada VMP (proteasa de Vibrio mimicus), es capaz de cambiar la permeabilidad en los vasos sanguíneos, generar edema y causar la acumulación de fluido en asa ligada de conejo. Requiere iones de Ca++ para su actividad y se sugiere que puede ser un factor importante para la patogenicidad (Chowdhury et al., 1991).
En 2005 se describió la VMC (colagenasa de V. mimicus), proteasa con actividad de colagenasa, que se une al colágeno por su extremo carboxilo y se considera que está relacionada con infecciones extraintestinales y con patogenicidad en peces (Lee et al., 2005).
I.7.3 FACTORES DE ADHERENCIA
Se sugiere que los microorganismos patógenos deben ser capaces de adherirse y colonizar superficies bióticas y abióticas para poder sobrevivir en diversos ambientes (Kirn et al., 2005). Para muchas bacterias enteropatógenas, la capacidad de adherirse a la mucosa intestinal es el primer paso en la colonización y un prerrequisito para causar diarrea. Esta interacción está mediada por macromoléculas llamadas colectivamente adhesinas (Bag et al., 2008).
En Vibrio mimicus se han caracterizado 3 hemaglutininas (un tipo de adhesina), que están relacionadas con la adherencia a la mucosa intestinal: el lipopolisacárido (Vm-LPSHA), una proteína de membrana externa termoestable OMPHA) de 39 KDa y una proteasa (Vm-HA/proteasa). Estas moléculas interaccionan eficientemente con las glicoproteínas de la superficie de los enterocitos (Alam et al., 1997).
La Vm-HA/proteasa tiene un doble papel: ayuda a la unión de la bacteria con la célula del huésped y tiene como sustrato a la Vm-OMPHA. Tras una proteólisis limitada la capacidad de la bacteria para adherirse a las células aumenta en gran medida. Se especula con que la interacción de la bacteria con las células blanco es multifactorial, lo que indica que otras
moléculas o estructuras (como pueden ser el flagelo, o algún tipo de fimbria) pueden estar involucrados en el proceso de adhesión (Alam et al., 2006).
I.7.4 MECANISMOS DE ADQUISICIÓN DE HIERRO
Se ha descrito que para algunos integrantes del género Vibrio el hierro es un factor determinante en la virulencia. Por ello, los microorganismos requieren de mecanismos de captación de hierro eficientes. Los sideróforos son moléculas de bajo peso molecular que tienen una alta afinidad por el hierro y pueden extraerlo de complejos minerales o de proteínas acarreadoras, como la lactoferrina y la ferritina (Litwin y Calderwood, 1993). En el género Vibrio se producen por lo general sideróforos de tipo catecolato, como la vibriobactina (Figura. 1). Sin embargo, en V. mimicus se ha descrito la presencia del sideróforo aerobactina (Okujo y Yamamoto, 1994) (Figura. 1) como sideróforo principal, que está más relacionado con las enterobacterias (Moon et al., 2004). La estructura química de la aerobactina es de tipo hidroxamato y se ha considerado como un factor importante (y en algunos casos fundamental) para la virulencia de Shigella flexneri, S. boydii, Klebsiella pneumonie, algunos serotipos de Salmonella spp, y varias cepas invasivas de Escherichia coli. (Schmidt y Hensel, 2004).
A
Figura 1 Estructura química de los Sideróforos producidos por algunas bacterias del género Vibrio. A . Sideróforo producido por V. mimicus. B. Sideróforo producido por V. cholerae.
Moon y colaboradores en 2004 demostraron que en V. mimicus los genes para la síntesis y funcionamiento de la aerobactina son cromosomales, ya que no existe evidencia que indique que provengan de algún tipo de transferencia horizontal (al no haber secuencias de inserción, o integrasas, flanqueando el operón de aerobactina). Además, los genes necesarios para el transporte del sideróforo se encuentran organizados en otro operón,, contiguo al de la aerobactina. Esta organización es única, ya que en las enterobacterias estos genes se
encuentran en elementos móviles como plásmidos, islas de patogenicidad, transposones o fagos.
Figura 2 Organización del cluster de aerobactina en V. mimicus
Fuente: Modificado de Moon et al., 2004
Se encontró además que V. mimicus tiene un segundo mecanismo para la captación de hierro: el complejo ferricromo. Para ello dispone de otro juego de genes homólogos, exclusivo para el transporte de este complejo, al igual que ocurre en Vibrio cholerae (Moon et al., 2004)
I.7.5 ENTEROTOXINAS
V. mimicus es capaz de producir una enterotoxina termoestable (Vm-ST) y una enterotoxina termolábil (Vm-LT), las cuales están relacionadas con la gastroenteritis, y una toxina tipo cólera (CT), semejante en estructura a la producida por Vibrio cholerae (Spira y Fedorka-Cray, 1984; Shi et al., 2000) y que es la causante del cuadro clínico de cólera.
I.7.6 ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES
En 1984 Spira y Fedorka-Cray encontraron que algunas cepas de V. mimicus producían una toxina fisicoquímica, biológica, funcional e inmunológicamente indistinguible de la CT sintetizada por V. cholerae, por lo que se sospechaba que probablemente era la misma toxina. Años después, Acuña y colaboradores en 1999 informaron de la presencia de cepas de V. mimicus con capacidad toxigénica e involucradas en casos de diarrea tipo cólera, encontrando los genes de la toxina colérica en el genoma de éstas. Casi al mismo tiempo, se demostró que las cepas toxigénicas de V. mimicus (al igual que las de V. cholerae) requieren de dos elementos genéticos para ser toxigénicas: un bacteriófago filamentoso llamado CTX y la isla de patogenicidad de Vibrio 1 (VPI1) (Faruque et al., 1999; Boyd et al., 2000a). En los últimos años se han caracterizado cepas de V. mimicus que tienen la VPI 1 y el fago CTX integrados en su genoma (Islam et al., 2005). Se han descrito también cepas que tienen el elemento CTX integrado en su genoma, y que son capaces de expresarlo, pero no contienen el elemento VPI. Esto indica
que existen otros mecanismos para adquirir el CTX así como para su regulación (Lazar y Waldor, 1998).
I.7.6.1 ISLA DE PATOGENICIDAD DE Vibrio 1 (VPI-1)
La VPI1 tiene un tamaño aproximadamente de 40 kb, un %G-C distinto al de V. cholerae y se inserta cerca del gen ssrA (que es muy similar a un gen de RNAt) por medio de secuencias att (Schinidt y Hensel, 2004). Tiene muchos marcos de lectura abierta (ORFs) con similitud con bacteriófagos, por lo que Karaolis en 1999 propuso que en realidad la isla se trata de un bacteriófago (al que llamó VPI , aunque este tema sigue siendo de gran controversia ya que la forma en que se transmite horizontalmente la VPI es desconocida. Dentro de este elemento se encuentra un grupo de genes necesarios para la síntesis y regulación del TCP (pili corregulado con la toxina), un pili de tipo IV que funciona como factor de colonización y como receptor del fago CTX Karaolis et al.,1999 Este pili es un polímero de la proteína TcpA, la cual podría ser parte de la cápside del fago VPI . Se sabe que el TCP favorece la colonización del intestino, por las interacciones bacteria-bacteria durante la formación de la microcolonia (Reidi y Klose 2002). La isla tiene además otros loci que son co-regulados por proteínas codificadas en la isla, así como algunas otras codificadas en el cromosoma de la bacteria (toxT, por ejemplo, que es un regulador transmembranal que esta encargado directamente de activar la transcripción de los genes del pili o los genes ctxAB del fago CTX así como con genes que están relacionados con la colonización del intestino (Figura. 3) (Karaolis et al., 1999, Schinidt y Hensel, 2004). .
Figura 3 Organización de la VPI-1
I.7.6.2 EL BACTERIOFAGO CTX
Se ha demostrado que la generación de cepas toxigénicas de V. cholerae O1 y O139 a partir de cepas no toxigénicas se debe a la presencia de un bacteriófago filamentoso que contiene en su genoma los genes de la toxina colérica (Waldor y Mekalanos, 1996; Faruque y Mekalanos, 2003). El fago CTX lleva en su genoma el operón ctxAB, que corresponde a la toxina colérica responsable de la diarrea severa.
En 2000 se describió que el fago CTX puede infectar tanto a V. cholerae como a V. mimicus (Boyd et al., 2000a)
El fago tiene un tamaño de aproximadamente 6.9 kb y está organizado en dos dominios funcionales:
a) la región del núcleo, en donde se encuentran los genes necesarios para la morfogénesis, como algunas proteínas de cápside (Psh, Cep, OrfU y Ace) y proteínas que ensamblan el virus (Zot). A algunas de estas proteínas, además de ser fundamentales para el virus, se les ha dado un papel como enterotoxinas, como es el caso de la toxina accesoria a la colérica y la toxina de la zónula ocludens (codificadas en los genes ace y zot, respectivamente).
b) la región RS2, que contiene genes para la replicación (rstA), integración (rstB) y regulación (rstR) del virus y dos regiones intergénicas llamadas ig-1 e ig-2 (Figura. 4) (Boyd et al., 2000b).
Figura 4. Organización del bacteriófago CTX
Fuente: Boyd et al., 2000 B
Los genes ctxAB tienen un contenido de %G-C distinto al resto del fago, lo cual indica que se adquirieron recientemente durante la evolución del fago. Esto explica, en parte, la presencia de cepas de V. cholerae y V. mimicus que contienen el gen zot pero son negativas para ctxAB (Boyd et al., 2000b; Faruque et al., 2001). Este virus se encuentra integrado por lo general en el genoma de su hospedero, por medio de sitios attRS, aunque también se ha detectado la forma replicativa, que incluso produce más toxina que cuando el fago está integrado en el cromosoma. (Boyd et al., 2000b).
I.7.7 CÁPSULA
Las células bacterianas tienen la capacidad de secretar una gran variedad de moléculas, incluyendo polisacáridos muy complejos y proteínas. Algunas de estas moléculas son requeridas para la viabilidad de la célula, mientras que otras son usadas para la interacción con el ambiente. Los polisacáridos pueden ser secretados por la célula en dos formas: polisacáridos que se vierten al ambiente próximo a la célula (exopolisacárido para la formación de biopeliculas) y polisacáridos asociados a la célula (cápsulas y lipopolisacárido) (Drummelsmith y Whitfield, 2000).
Dentro de la familia Vibrionaceae se han encontrado estos dos tipos de polisacáridos, que a la fecha no han sido descritos para V. mimicus. La cápsula juega un papel critico en las interacciones entre la bacteria y su ambiente más inmediato. Así, se sabe que en algunos patógenos de este género (como V. vulnificus, V. parahaemolyticus y V. cholerae O139) la cápsula es importante para la virulencia (Wright et al., 2001; Nesper et al., 2002; Whitfield, 2006). La cápsula es una estructura que envuelve la superficie de la bacteria, compuesta por polisacáridos de alto peso molecular que están firmemente anclados a la superficie celular; está demostrado que esta estructura es un factor de virulencia, ofreciendo protección contra la respuesta inmune del hospedero (opsonización, fagocitosis y acción lítica del complemento) (Whitfield, 2006).
El proceso por el cual V. mimicus se sintetiza y exporta este polisacárido se desconoce; en V. cholerae y V. vulnificus se ha descrito el locus de biosíntesis de cápsula, que es homólogo al de las especies de E. coli, del grupo 1, encontrándose altamente conservados tanto en secuencia como en función (Livanis et al., 2006).
El proceso de síntesis de la cápsula es muy complejo e involucra a varias proteínas. Una de las más importantes es la lipoproteína Wza, miembro de la familia de proteínas auxiliares de membrana externa (secretinas), que tiene una estructura octamérica con simetría de tetrámero. Su forma tridimensional es de “tipo hongo” y en su interior forma un canal de aproximadamente 40 Å de diámetro, por donde transloca el polisacarido capsular hacia la superficie de la bacteria. Esta proteina es esencial para el ensamble del polisacarido capsular y requiere acoplarse a la proteína Wzc para su funcionamiento, ya que se sabe que el proceso de biosíntesis está sincronizado con el de translocación (Figura, 5) (Drummelsmith y Whitfield 2000; Beis et al,. 2004; Whitfield 2006; Collins y Derrick, 2007).
Figura 5 Papel de la proteína Wza en la translocación del polisacárido capsular.
Fuente: Collins y Derrick 2007
I.7.8 ToxR
En respuesta a los cambios en el ambiente, los microorganismos responden expresando o reprimiendo genes dependiendo del estimulo (temperatura, pH, u osmolaridad). En V. mimicus y V. cholerae se ha descrito que la mayoría de los genes asociados con la virulencia están regulados por la proteína ToxR, el regulón de esta proteína comprende la expresión aproximada de 20 genes (Skorupski y Taylor, 1997). ToxR es un activador transcripcional del tipo del sistema de 2 componentes: la proteína se divide en 3 dominios, uno transmembranal para anclarse a la membrana de la célula, otro que sirve como sensor de las condiciones del espacio periplásmico y uno más que es citoplásmico y que tiene la capacidad de unirse al DNA. Se sabe que para su funcionamiento esta proteína debe ser un dímero, pudiéndose dimerizar con ella misma o con otros activadores transcripcionales como son ToxS, ToxT o TcpP (Skorupski y Taylor, 1997; Osorio et al., 2000). Un aspecto interesante de esta proteína (Figura. 6) es que controla la expresión de genes presentes en elementos móviles, tanto de la VPI-1 (formación del pili TCP) como del fago CTX ,(se puede unir directamente al promotor de ctxAB).
Peptidoglicana Membrana externa Membrana interna Peptidoglicana Membrana externa Membrana interna
Bilis
Citoplasma
Es probable que regule también la expresión de la hemolisina vhmA y de algunas proteínas de membrana externa que están relacionadas con la resistencia a la bilis, con la modulación de la adherencia y con la regulación de la movilidad del flagelo. Por ello, se le considera el regulador maestro de la virulencia (Provenzano et al., 2000).
Figura 6 Procesos que controla la proteína ToxR en V .mimicus
JUSTIFICACIÓN
Vibrio mimicus ha sido involucrado en diversas etiologías, principalmente las causadas por consumo de alimentos, y son pocos los estudios sobre sus factores de patogenicidad. Por ello se consideró de interés estudiar en cepas ambientales aisladas de agua, pescados y ostiones capturados en las costas del Golfo de México, la presencia de algunos factores involucrados en su virulencia.
HIPÓTESIS
Si las cepas de Vibrio mimicus aisladas de alimentos presentan características asociadas con la virulencia entonces probablemente sean patógenas y pudieran en un momento dado producir un
padecimiento en las personas que consuman los alimentos o estén en contacto con agua contaminada.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar por medio de pruebas fenotípicas, técnicas de biología molecular y biología celular la presencia de factores de virulencia en cepas de Vibrio mimicus
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar por medio de pruebas fenotípicas y genotípicas la presencia de una hemolisina.
2. Evidenciar mediante la técnica de PCR la presencia de algunos marcadores y elementos genéticos móviles relacionados con la virulencia.
3. Estimar si V. mimicus es capaz de sintetizar sideróforos. 4. Observar si V. mimicus presenta cápsula.
5. Llevar a cabo ensayos de citotoxicidad en la línea celular CHO.
Figura 7. Diagrama general de trabajo B Biioollooggííaa cceelluullaarr A Addhheerreenncciiaa e enn HHEEpp--22 ciEfcEitfetoecotcttótoóxo xiiccoo e enn CCHHOO B Biioollooggííaa mmoolleeccuullaarr O Obbtteenncciióónn dede D DNNAA B Búússqquueeddaa Y Y didisseeññoo d dee iinniicciiaaddoorreess E Enn llaa lliitteerraattuurraa A Ammpplliiffiiccaacciióónn ppoorr PPCRCR Pruebas fenotípicas C Ceeppaassddee VV..mmiimmiiccuuss
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I
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A
A
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J
J
O
O
II METODOLOGÍA
Se trabajó con 20 cepas de Vibrio mimicus aisladas de la laguna de Pueblo Viejo, Veracruz: 6 de muestras de agua, 5 de pescado y 9 de ostión.
Cuadro 2. Cepas testigo usadas en este trabajo
Cepa Características
Vibrio mimicus ATCC 33653 vmhA+, iutA+,vm toxR+,CTX -,VPI1-. Vibrio vulnificus ATCC 29307 vvhA+, vvtoxR+, pilA+, viuB+,wza+ Vibrio cholerae O1 Ogawa CLBM-ENCB hly+, vctoxR+, CTX +,VPI1+.
Vibrio cholerae O1 Inaba CLBM-ENCB hly+, vctoxR+, CTX +,VPI1+. Vibrio cholerae No O1-noO139 CECT 557 hly+, vctoxR+, CTX -,VPI1+.
Escherichia coli ATCC 25922 No adherente
CLBM-ENCB = Colección del Laboratorio de Bacteriología Médica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
II.1 Obtención de DNA genómico
Las cepas se sembraron en caldo Luria Bertani y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Para obtener el DNA se empleó el sistema Wizard® Genomic DNA Purification, de la casa comercial PROMEGA, usando el protocolo indicado por el proveedor.
II.2 Amplificación de los genes vmhA, ctxA, zot, tcpA, toxT, toxR, iuT y wza mediante la técnica de PCR.
Se preparó la mezcla de reacción con: 34.95 l de agua destilada estéril, 5 l de regulador 10× (200 mM Tris-HCl pH 8.4 y 500 mM KCl), 2.5 l de MgCl2 50mM, 0.25 l de la mezcla de dNTP (10 mM), 2.5 l de cada iniciador (1 nM), 0.3 l de Taq polimerasa (5 U/ l) y 2 l de la solución que contiene el DNA (aproximadamente 100 ng). Eel volumen total de la mezcla de reacción fue de 50 l. Las reacciones se hicieron en un termociclador Hybaid® Omn-E. Las condiciones de los ciclos tiempos y temperaturas utilizados para cada gen serán descritos posteriormente. Posteriormente se prepararon geles de agarosa al 1.5% (p/v) para los genes vmhA, ctxA, tcpA, toxT y toxR y al 1% (p/v) para los genes zot, uitA y wza, Se mezclaron 4 l del producto de PCR con 1.5 l del regulador de carga [azul de bromofenol (0.25%), sacarosa (40%) y xileno cianol (0.25%)] y 9 l de agua. Las electroforesis se desarrollaron utilizando regulador Tris-Acido
acético glacial-EDTA (TAE),. mediante la aplicación de 121 V durante una hora. Como referencia, se empleó un marcador de talla molecular de 100 pb (Invitrogen®).
La tinción de los geles se hizo con una solución de bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 g/ml. Los geles se observaron en un transiluminador Gel Doc 2000 (Bio Rad®) que emite luz a una longitud de onda de 302 nm y permitió obtener la imagen digital en el software Quality One (BioRad®).
II.3 Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa
Para la purificación previa al análisis de secuencia para verificar la identidad de las bandas amplificadas para el gen wza se usó el sistema QIAquick PCR Purification Kit, de la casa comercial QIAgen®.
II.4 Análisis bioinformático
Se hizo con el paquete DNASTAR® versión 7.1 de Lasergene, el programa Seaview 4.32 y usando las aplicaciones GenBank y la herramienta BLAST del sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
II.5 Presencia de hemolisina
II.5.1 Prueba fenotípica (García y Landgraf, 1998)
Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653
1. Se cultivó cada una de las cepas en caldo TSC de 18-24 horas a 37°C 2. Se sembraron en agar sangre con eritrocitos de carnero y de conejo 3. Se incubaron durante 24 horas a 37°C
4. Se observó el halo de hemólisis, parcial o total II.5.2 Prueba genotípica
Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653, y como testigo negativo las cepas V. cholerae O1 serotipo Ogawa y V. cholerae O1 serotipo Inaba (de la colección del Laboratorio de Bacteriología Medica de la ENCB).
Cuadro 3. Condiciones de amplificación para vmhA
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
vmhA F- 5´GGTAGYCATCAGTCTCATCACG -3´ R-5´TCRTSTCCCAATACTTCACCG-3´
Modificados de Shi, et al., 2000
Desnaturalización inicial 94°C/ 60 seg Desnaturalización Alineamiento Extensión 94°C/ 45 seg 58.5°C/ 45 seg 72°C/ 45 seg Número de ciclos 30 Tamaño del fragmento 389 pb
II.6 Amplificación de los genes del fago CTX
Se hizo la revisión bibliográfica correspondiente, eligiéndose los marcadores ctxA y zot que se encuentran el bacteriófago. Como testigos positivos se usaron las cepas V. cholerae O1 serotipo Ogawa y V. cholerae O1 serotipo Inaba, que se sabe que tienen el bacteriófago integrado en su genoma, y como testigo negativos las cepas V. mimicus ATCC 33653 y V. cholerae No O1 CECT 557.
Cuadro 4. Condiciones de amplificación para los genes del fago CTX
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
ctxA F- 5´ CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG-3´ R-5´TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG -3´ Shinoda y Nakagawa, 2004 zot F- 5´ TCGCTTAACGATGGCGCGT-3´ R-5´AACCCCGTTTCACTTCTACC -3´ Singh, et al., 2002 ctxA zot
Desnaturalización inicial 94°C/ 4 min 94°C/ 3 min Desnaturalización Alineamiento Extensión 94°C/ 60 seg 55°C/ 30 seg 72°C/ 30 seg 94°C/ 60 seg 60°C/ 45 seg 72°C/ 45 seg Número de ciclos 30 32
Se hizo la revisión bibliográfica correspondiente, basada en los genes tcpA y toxT, genes que se encuentran en la VPI1. Como testigo positivo se usaron las cepas V. cholerae O1 serotipo Ogawa, V. cholerae O1 serotipo Inaba y V. cholerae No O1 CECT 557 que se sabe tienen la VPI1 en su genoma. Como testigo negativo se utilizó la cepa V. mimicus ATCC 33653.
Cuadro 5. Condiciones de amplificación para los genes de la VPI1
II.8 Amplificación del gen toxR
Para amplificar este gen se buscaron los iniciadores que están descritos para V. mimicus. Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo las cepas V. cholerae O1 serotipo Ogawa, V. cholerae O1 serotipo Inaba y V. vulnificus ATCC 29307.
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
tcpA F- 5´ GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC-3´ R-5´GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG -3´ Islam et al,. 2005 toxT F- 5´ TTGCTTGGTTAGTTATCAGAT-3´ R-5´TTGCAAACCCAGACTGATAT -3´ Shinoda y Nakagawa, 2004 tcpA toxT
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min 94°C/ 5 min Desnaturalización Alineamiento Extensión 94°C/ 45 seg 57.5°C/ 40 seg 72°C/ 40 seg 94°C/ 45 seg 51.5°C/ 45 seg 72°C/ 45 seg Número de ciclos 30 30
Cuadro 6. Condiciones de amplificación para toxR
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
toxR F- 5´ACAACAGCGACTCCTCAGAA -3´ R-5´ACACACAGTTCTATCGAGGG -3´
Shinoda y Nakagawa, 2004
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min Desnaturalización Alineamiento Extensión 94°C/ 45 seg 51.5°C/ 45 seg 72°C/ 45 seg Número de ciclos 30 Tamaño del fragmento 221 pb
II.9 Presencia de sideróforos II.9.1 Prueba fenotípica
El agar CAS (Schwyn y Neilands, 1987) está diseñado para inducir la producción de sideróforos, porque el medio no contiene hierro disponible para los microorganismos. Todos los ingredientes y materiales fueron desferrados por métodos químicos. La única fuente de hierro del medio está asociada al colorante Cromo-Azurol S; por ello, si el microorganismo produce sideróforos éstos captarán el hierro del colorante y se producirá un viraje en el color de medio.
Como testigo positivo se usó la cepa V. mimicus ATCC 33653 y V. vulnificus ATCC 29307 Se cultivaron las cepas de V. mimicus en caldo nutritivo durante 18-24 horas a 37°C
1. Se sembraron en el agar CAS
2. Se incubaron durante 24 horas a 37°C
Interpretación: Los microorganismos productores de sideróforos estarán rodeados de un halo amarillo-anaranjado, dependiendo del tipo de sideróforo producido.
II.9.2 Prueba genotípica
Se ha descrito que V. mimicus produce aerobactina como sideróforo, por lo que se diseñaron los iniciadores de acuerdo a la secuencia del GenBank para poner en evidencia parte de los genes requeridos para la síntesis y transporte de la aerobactina: iucC, iucD y iutA. (Figura. 2). Como
testigo positivo se uso la cepa V. mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo las cepas V. cholerae O1 serotipo Ogawa, y V. vulnificus ATCC 29307.
Cuadro 7. Condiciones de amplificación para el operón de aerobactina
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
iut F- 5`AACCGCTACCAAATGACCCCAGAT -3´
R-5´CAAAACCGGCGACAGAACCTACTT -3´
Este estudio
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min snaturalización Alineamiento Extensión 94°C/ 60 seg 62°C/ 60 seg 72°C/ 75seg Número de ciclos 33 Tamaño del fragmento 1573 pb
II.10 Presencia de cápsula
II.10.1 Prueba fenotípica Tinción de cápsula (Clarck, 1973)
1. Se sembraron placas con gelosa glicerol y un 2% (p/v) de NaCl y se incubaron a 37°C durante 24 horas.
2. Pasado el tiempo de incubación se hizo un frotis y se tiñó por la técnica de Rojo Congo. 3. Se observó al objetivo de inmersión
Interpretación: la prueba es positiva cuando hay halos sin color alrededor de los bacilos teñidos de rojo en un fondo del mismo color
II.10.2 Prueba genotípica
Hasta el momento no existe reporte alguno de la presencia de capsula en V. mimicus, por lo que se diseñaron los iniciadores a partir de las secuencias de los genes wza de V. cholerae y V. vulnificus. Como testigo positivo se usaron las cepas de V. cholerae O1 serotipo Ogawa y V. vulnificus ATCC 29307.
Cuadro 8 Condiciones de amplificación para del gen wza
Secuencia blanco Iniciadores Referencia
wza F- 5`ATTTGGGATCCACCCAGAGCTGACCA -3´
R-5´ACTTCGCCCATTACAAACACTTTTT -3´
Este estudio
Desnaturalización inicial 94°C/ 5 min Desnaturalización Alineamiento Extensión 94°C/ 60 seg 62°C/ 45 seg 72°C/ 40 seg Número de ciclos 30 Tamaño del fragmento 514 pb
II.11 Evaluación del efecto citotóxico del filtrado libre de células de V. mimicus (Elliot et al., 1995, Baffone et al., 2001)
Como testigo positivo se utilizaron las cepas de Vibrio cholerae O1 Serotipo Ogawa e Inaba, y como testigo negativo caldo AKI.
II.11.1 Obtención del filtrado
1. Se sembró cada una de las cepas de V. mimicus en caldo AKI, se incubó durante 18 horas con agitación (200 rpm) a 37°C.
2. Se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos.
3. Se esterilizó por filtración utilizando una membrana de 0.22 m de diámetro de poro. 4. El filtrado se conservó en congelación a -70°C hasta su uso.
II.11.2 Obtención de un abasto de células CHO
1. A partir de un vial que contiene células CHO (células de ovario de hámster chino) se obtuvo una monocapa confluente después de crecerlas en medio F12 con suero fetal bovino (SFB) al 10%, incubado a 35°C con un 5% de CO2.
2. Pasado el tiempo de incubación, se eliminó el suero y el medio y se adicionaron 2 mililitros de solución de tripsina-verseno al 0.05% para lavar la células.
3. Posteriormente, se adicionó un mililitro más de solución de tripsina-verseno al 0.05% y se incubó durante 5 minutos a 35ºC, disgregándose a continuación la monocapa.
5. Posteriormente se transfirieron 3 mL de la suspensión de células a dos botellas para cultivo y se completó el volumen con 5 mL de medio F12 al 10% de SFB y se incubó a 35°C durante 24-48 horas hasta obtener una confluencia de 100%.
II.11.3 Efecto de los filtrados de V. mimicus
1. Se colocaron 200 l de suspensión de células CHO en medio F12 al 15 % de SFB a cada uno de los 96 pozos de una placa de cultivo. Las placas se Incubaron a 37°C con un 5% de CO2, hasta lograr la confluencia.
2. Transcurrido el tiempo de incubación, se eliminó el medio y se lavó tres veces con regulador salino de fosfatos (PBS) estéril.
3. Se agregaron por pozo 100 L de las diluciones 1:1, 1:3, 1:9, 1:27, 1:81, 1:253, 1:729 y 1:2187 del filtrado (inciso V.XI.I) en medio F12 y se incubó a 35°C con un 5% de CO2, por triplicado.
4. Se observó al microscopio invertido cada 60 minutos hasta observar alteraciones en la morfología del 50% de las células de la monocapa.
5. Paralelamente, en otra placa de 96 pozos con células CHO confluentes, se agregaron por pozo 100 L de las mismas diluciones (por triplicado). En cuanto apareció el cambio en la morfología de las células se retiró el contenido del pozo y se hizo un lavado con PBS estéril, adicionándose 100 l de medio F12 para observar si la alteración era reversible.
6. Terminado el tiempo de incubación, se eliminó el medio y se lavó tres veces con PBS estéril, se fijó con metanol absoluto e inmediatamente se lavó tres veces más con PBS. 7. Finalmente se tiñó con colorante de Giemsa cubriendo los pozos durante 20 minutos, se
lavó con agua destilada hasta no observar de colorante en el enjuague y se observó al microscopio invertido.
El efecto citopático y citotóxico se consideró positivo cuando >50% de las células presentaron destrucción o alteración de su morfología (Baffone et al., 2001).
II.12 Ensayo de adherencia en la línea celular HEp-2 (Cravioto et al., 1979, Gander y Larocco, 1989, Baffone et al., 2001)
Como testigo positivo se utilizó la cepa Vibrio mimicus ATCC 33653 y como testigo negativo E. coli ATCC 25922.
II.12.1 Preparación de los cultivos
1. Se sembró una asada de cada cepa en tubos con 3 mL de caldo triptona con manosa al 1% y se incubó a 37°C/ 18 horas
2. Se centrifugó a 2500 rpm/ 20 min/ 4°C.
3. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el botón en 1 mL de PBS estéril. II.12.2 Preparación de la monocapa de células HEp-2 y ensayo de adherencia
1. Se prepararon microplacas de 24 pozos al 100% de confluencia de células HEp-2 (cáncer laringeo humano), crecidas sobre un cubreobjetos estéril. Se lavaron 3 veces con PBS estéril.
2. Se colocaron en cada pozo 975 L de medio MEM + 25 L de la suspensión bacteriana. Se incubaron a 37°C con 5 % de CO2 durante 1.5 horas (para determinar este tiempo se hizo una cinética previa).
3. Se eliminó el medio con una pipeta Pasteur y se lavó 3 veces con PBS estéril.
4. Las células se fijaron con metanol durante 1 minuto y se lavaron 3 veces con PBS estéril.
5. A continuación se tiñeron con Giemsa durante 20 minutos y se lavaron los pozos con agua destilada hasta que el agua de enjuague no tuviera colorante.
6. Se desmontaron los cubre objetos y se deshidrataron, colocándose 1 min. en acetona, 1 min. en acetona-xilol (1:1) y 1 min. en xilol.
7. Se montaron las preparaciones en portaobjetos y se sellaron con una gota de resina de Permount.
8. Se observó al microscopio con en el objetivo de inmersión (100x).
Sí al menos el 40% de las células tenían bacterias adheridas, la cepa se considera adherente (Baffone et al ,.2001),
III RESULTADOS
En las cepas estudiadas se encontraron varios fenotipos y genotipos (hemolisinas, sideróforos, cápsula, genes de regulación de la virulencia, citotoxicidad y adherencia), factores que pueden estar involucrados en la patogénesis de este microorganismo (Cuadro 10).
III.1 Hemolisina y vmhA
La presencia de hemolisinas se demostró en el 100% (20/20) de las cepas, a través de la hemólisis de eritrocitos de carnero y conejo en gelosa sangre (Figura. 8), en donde se observó actividad hemolìtica del tipo .
Figura 8. - hemólisis en agar sangre. A. Eritrocitos de carnero. B Eritrocitos de conejo
Se amplificó el gen de la hemolisina vmhA, obteniéndose un fragmento de 389 pb en todas las cepas estudiadas (Figura. 9).
Figura 9. Electroferograma del producto amplificado del gen vmhA. M= marcador de talla molecular 100pb, 1 V.
mimicus ATCC, 2-17 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba
M M 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 1144 1155 1166 1177 OO II MM 3 38899 ppbb 3 30000 ppbb
A
B
La literatura indicaba que estos iniciadores amplifican un producto de 289 pb. Al hacer la reacción de PCR se encontró un fragmento cercano a las 400 pb. Se descargó de las bases de datos la secuencia del gen vmhA y se buscó en qué posición del gen se alineaban los iniciadores, encontrandose que los iniciadores abracan desde la posición 2110 hasta la 2499 y que el tamaño esperable del amplificado era realmente de 389 pb y no el indicado en la literatura.
Figura 10. Confirmación del tamaño del amplificado para el gen vmhA
La amplificación de este gen permitió demostrar la presencia del gen que codifica para la hemolisina VMH en las cepas, característica que se usa como rasgo distintivo para la identificación a nivel molecular de Vibrio mimicus.
III.2 Presencia de la VPI-1 y del bacteriófago CTX
Se ajustaron las reacciones hasta condiciones óptimas y se encontró que en ninguna de las cepas se amplificaron productos correspondientes a los genes toxT y tcpA, presentes en la VPI-1 (corresponden a un regulador transcripcional y a la proteína estructural del pili TCP, respectivamente) ni a los genes ctxA y zot presentes en el bacteriófago CTX (en este caso corresponden respectivamente a la subunidad A de la toxina del cólera y a una proteína implicada en el ensamble del virus, a la que también se le han atribuido propiedades citotóxicas) (Figuras 11 y 12). Si se observó amplificación en esas condiciones en los controles positivos utilizados.
M
M 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 111111221133 11441155 1166 1177 1188 11992200NNoo OO II VVmm MM
500 pb
Figura 11 Búsqueda de la VPI1. A Electroferograma del producto amplificado del gen toxT. B. Electroferograma del producto amplificado del gen tcpA. M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V. mimicus ATCC, 1-20 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba, No= Vo cholerae No O1 CECT 557
M M 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 11331144 1155 1166 11771188 1199 2200VVmmNNooOO II MM 600 pb 581 pb A 47 2 B 452pb
Figura 12 Búsqueda del fago CTX A. Electroferograma del producto amplificado del gen ctxA B. Electroferograma del producto amplificado del gen zot. M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V. mimicus ATCC 1-20 V.
mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba, No= Vo cholerae No O1 CECT 557*
III.3 toxR
Este gen implicado en la regulación se encontró en el 100% (20/20) de las cepas estudiadas. El tamaño del fragmento amplificado fue de 221 pb (Figura. 13).
M M 11 22 33 44 55 66 77 88 99 11001111 11221133 11441155 1166 117711881199 2200VVmmOO II NNooMM 900 pb 947 pb B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Vm No O I M 301 pb 300 pb A
Figura 13 Electroferograma del producto amplificado del gen toxR M= marcador de talla molecular 100pb, Vm V.
mimicus ATCC 1-20 V. mimicus, O= V. cholerae O1 Ogawa, I= V. cholerae O1 Inaba Vv= V.vulnificus ATCC
III.4 Búsqueda de sideróforos
En esta prueba, el 40% (8/20) de las cepas fueron capaces de producir sideróforos del tipo hidroxamato, lo cual se observa por el cambio de color (amarillo) en el medio CAS (Figura. 14).
Figura 14 Producción de Sideróforo tipo hidroxamato en agar CAS
Posteriormente, se busco en ´la base de datos GenBank la secuencia reportada del operón de aerobactina de V. mimicus y se diseñaron iniciadores específicos para amplificar parte de los genes iucC, ,iucD e iutA, implicados en la síntesis y transporte de este sideróforo (Figura. 2). Se buscaron las condiciones óptimas de amplificación y se encontró que el producto esperado, de aproximadamente 1500 pares de bases amplifico en el 100% (20/20) de las cepas (Figura, 15).
M
M 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122 1133 11441155 1166 1177 1188 1199 2200 VVmmOO II VVvv MM
2
20000ppbb 221 pb
