Microgen TM Listeria -ID

Microgen

TM

_{Listeria -ID}

Instrucciones de Uso

MICROGEN Listeria-ID

Guía Rápida

PASO 1

SELECCIONAR UNA COLONIA INDIVIDUAL

AISLADA

EMULSIFICAR EN EL CALDO-SUSPENSIÓN LISTERIA

PASO 3

TRANSFERIR 4 GOTAS A CADA POCILLO

AÑADIR 1 GOTA DEL REACTIVO PARA HEMÓLISIS

(Pocillo 12)

PASO 4

INCUBAR A 35 –37

_{C DURANTE 18 – 24 HORAS}

LEER Y ANOTAR LOS RESULTADOS

INTERPRETAR CON EL SOFTWARE DE

IDENTIFICACIÓN MICROGEN

PASO 6

PASO 7

PASO 2

El sistema Microgen Listeria-ID ha sido diseñado para ser usado por personal de laboratorio cualificado que utilice técnicas asépticas y las precauciones microbiológicas apropiadas.

El sistema Microgen Listeria-ID utiliza 12 micropocillos con substratos estandarizados combinado con el Software de Identificación que permite identificar las especies del género Listeria:

Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria welshimeri Listeria grayi Listeria ivanovii Listeria seeligeri

Los microorganismos citados arriba pueden identificarse a partir de agar selectivo y no-selectivo con Microgen Listeria-ID.

Esta identificación se consigue usando todos los test recomendados en los métodos standard internacionales para la identificación de Listeria spp. sin necesidad de test confirmativos adicionales (1,2,3)

PRINCIPIO

Cada micropocillo de las tiras de Microgen Listeria-ID contiene 11 substratos deshidratados para llevar a cabo las reacciones de los hidratos de carbono, y un pocillo vacío donde tendrá lugar la reacción de hemólisis (4). La selección de los substratos incluidos en el test se basa en una combinación de los substratos recomendados en los métodos standard internacionales (1,2,3) y en tests adicionales que permiten la confirmación de las colonias aisladas como pertenecientes al género Listeria (hidrólisis de la esculina y fermentación de la Trealosa y el Arabitol(5,6)) y/ o potencian la diferenciación de varias especies de este mismo género.

La identificación de las colonias aisladas se obtiene anotando los resultados que se visualizan por un cambio de color después de 18-24 horas de incubación (no hace falta añadir ningún reactivo el Día 2). Estos resultados se analizan con el Software de Identificación de Microgen (MID-60)

Cada tira de micropocillos Microgen Listeria-ID consiste en doce pocillos que contienen los substratos para que tengan lugar las siguientes 11 reacciones bioquímicas:

Reacción Positiva Negativa

1 Esculina Hidrólisis Esculina Negro Color paja

2 Manitol 3 Xilosa 4 Arabitol 5 Ribosa 6 Ramnosa 7 Trealosa 8 Tagatose 9 Glucosa-1-Fosfato 10 Metil-D-Glucosa Fermentación de azúcares específicos produciendo productos finales ácidos que reaccionan con el indicador Púrpura de Bromocresol Amarillo Lila

11 Metil-D-Manosa pasando de lila a amarillo

12 Hemolisina Hemólisis de las

células rojas de la sangre de cordero Líquido homogéneo color paja-marrón, no hay precipitado de células rojas en el

fondo del pocillo

Sedimento de células rojas en el fondo del pocillo.

El pocillo número 12 está vacío y se utiliza para una reacción de hemólisis al

añadir el reactivo hemolisina a la suspensión bacteriana.

REACTIVOS

Contenido del Kit (20 tests)

Marco soporte para la tira de micropocillos Formulario de resultados

Instrucciones de uso

20 tiras de micropocillos en sobres individuales 20 botellas del medio de suspensión para Listeria 1 botella del reactivo Hemolisina

Material adicional necesario (no proporcionado en el kit)

Software de Identificación Microgen (MID-60) Asas bacteriológicas estériles

Pipetas pasteur estériles

Incubador (35 - 37°C), sin ventilación Nevera (2 - 8°C)

Rotulador para marcar Tiras Oxidasa (MID61G)

Peróxido de Hidrogeno, al 3% (w/w), para el test de la catalasa ver Referencia 1 Reactivos para tinción Gram

Microscopio y portaobjetos Incubador 25ºC, sin ventilación

ALMACENAMIENTO

Las tiras de pocillos en la bolsa intacta son estables a 2-8ºC hasta la fecha de caducidad indicada. El caldo de suspensión para Listeria y el reactivo hemolisina se deben

conservar a 2-8ºC. El reactivo hemolisina se debe volver a poner a 2-8ºC inmediatamente después de su uso.

INSTRUCCIONES DE USO

(Antes de usar este producto, ver las Precauciones y Limitaciones) 1. Selección de las colonias para su identificación

1.1. Se pueden usar colonias aisladas tanto de medio selectivo como

no-selectivo.

1.2. Antes de la incubación en Microgen Listeria ID, las colonias aisladas se

deben chequear para asegurarse que pertenecen al género Listeria. (Bacillus Gram positivos, oxidasa negativos, catalasa positivos, móviles a 25°C pero no móviles a 37°C (recomendamos que la movilidad se determine por el método de microscopía descrito en la Referencia 1) Alternativamente se debe usar el test de Látex Microgen Listeria (F48).

2. Preparación del inóculo

2.1. Dejar atemperar el caldo suspensión a temperatura ambiente antes de

inocular las tiras de micropocillos.

2.2. Seleccionar una colonia individual bien aislada de un cultivo de 18-24

horas y emulsificar con un vial del medio de suspensión para Listeria (2.5ml).

2.3. Mezclar bien hasta obtener una suspensión homogénea.

3. Inoculación e Incubación

3.1 Sacar una tira de micropocillos de su envase individual, ponerla en el

marco y sacar el precinto.

3.2 Con una pipeta Pasteur estéril, transferir 4 gotas (aproximadamente 100µl) de la suspensión bacteriana a cada pocillo de la tira.

3.3 Como control de pureza, transferir 1 gota de la suspensión en una placa

de agar no selectivo. Incubar la placa aeróbicamente a 35 - 37°C durante 18 - 24 horas.

3.4 Añadir 1 gota del reactivo hemolisina al pocillo 12.

3.5 Volver a sellar la tira e incubar a 35 - 37°C durante 18- 24 horas.

4. Interpretación

4.1 Después de la incubación eliminar el sello y anotar los resultados en la hoja de resultados proporcionada para tal efecto.

4.3 La reacción de la hemolisina se debe analizar como se indica:

4.3.1 Examinar el fondo del pocillo para la presencia de una capa diferenciada o un sedimento de glóbulos rojos. En caso positivo, se interpreta como test NEGATIVO. La ausencia de una capa diferenciada o del sedimento de glóbulos rojos se interpreta como resultado POSITIVO.

4.3.2 Examinar el inóculo en el pocillo. La presencia de una solución clara encima de una capa diferenciada de glóbulos rojos en el fondo del pocillo debería ser interpretada como test NEGATIVO. La presencia de una solución homogénea de color marrón-paja con ausencia del sedimento de glóbulos rojos se debe interpretar como test POSITIVO. 4.3.3 Si los test son difíciles de leer, se sugiere poner el pocillo bajo una

fuente de luz.

4.4 Examinar la pureza de la placa para comprobar la viabilidad y pureza

del organismo.

4.5 Los test, en la hoja de resultados, se han organizado en tripletes (sets de 3 reacciones), a cada test se le asigna un valor numérico (1,2 o 4). La suma de las reacciones positivas para cada triplete da un dígito del Perfil numérico (Código octal) que se utilizará para determinar la identidad del la Listeria spp. a identificar. El Perfil numérico (Código Octal) se introduce en el Software Microgen Identification, que generará un informe de los 5 organismos más probables basándose en una base de datos seleccionada (7).

TEST HEMOLISIS POSITIVO -

Solución marrón-paja con ausencia del sedimento de glóbulos rojos

TEST HEMOLISIS NEGATIVO -

Solución clara por encima de una capa diferenciada o un sedimento de glóbulos rojos en el fondo del pocillo

Informe de resultados

PRECAUCIONES

1. El sistema Microgen Listeria-ID ha sido desarrollado para ser utilizado por personal de laboratorio cualificado utilizando técnicas asépticas y precauciones microbiológicas apropiadas.

2. El material utilizado se debe autoclavar, incinerar o hacer inmersión en un desinfectante adecuado antes de eliminarlo.

3. El sello de la tira no sella completamente los micropocillos de modo que las tiras no

se deben incubar en un incubador de CO2 (debido a efectos de un pH erróneo) o

con ventilación (exceso de evaporación)

4. El reactivo hemolisina se debe manipular usando buenas practicas de manipulación para evitar contaminación:

• Siempre conservar a 2-8°C

• Evitar que el gotero entre en contacto con la tira o con cualquier otra superficie durante su uso, y tapar inmediatamente

El reactivo hemolisina no trabajará correctamente si se ha deteriorado debido, por ejemplo, a una alta contaminación. El reactivo deteriorado no se debe usar. Los signos de deterioro son una hemólisis significativa del contenido del vial o que el reactivo tiene una coloración marrón-vino oscuro.

Si el resultado del test de hemólisis es dudoso, la colonia aislada se debe inocular en una placa de Agar Sangre y comprobar si tras 18-25 horas de incubación a 35-37ºC ha habido hemólisis.

LIMITACIONES

1. Aunque los medios selectivos para aislamiento de Listeria spp. se han formulado para inhibir el crecimiento de un amplio rango de flora contaminante, los organismos parecidos a la Listeria spp. también pueden crecer en ese medio (Bacillus spp., Enterococcus spp. y Staphylococcus spp.).

2. El sistema Microgen Listeria ID ha sido diseñado para identificar organismos que pertenecen al género Listeria y no a ningún otro genero. Si la colonia aislada que se quiere identificar no hidroliza la esculina o fermenta la trealosa o el arabitol, se deben comprobar la tinción gram, la movilidad y los test de oxidasa y catalasa. 3. Las muestras pueden contener una mezcla de especies y no una colonia individual.

la selección de una única colonia bien aislada es crítica para obtener un buen resultado.

4. Se recomienda inocular en una placa para confirmar si el inóculo de las tiras de identificación contenían una única especie.

CONTROL DE CALIDAD

Se debe controlar el funcionamiento del sistema Microgen Listeria ID usando cepas de control apropiadas. Se recomiendan las siguientes cepas para asesoramiento del laboratorio: E S C M A N X Y L A R L R I B R H A T R E T A G G 1 P M D G M D M H E M L.monocytogenes (ATCC 35152, NCTC 7973) + - - + - + + - - + + + L.inoccua (ATCC 33090, NCTC11288) + - - + - + + - - + + - L..grayi (ATCC 19120, NCTC 10815) + + - + + - + - - - + -

BASE DE DATOS

ESC MAN XYL ARL RIB RHA TRE TAG G1P MDG MDM HE

M L.monocytogen es 100 0 0 97 0 98 97 0 2 99 98 99 L.inoccua 100 0 1 100 0 70 100 0 0 100 100 0 L.welshimeri 100 0 95 100 0 87 100 94 0 98 94 0 L.seeligeri 100 0 100 100 0 0 97 0 0 100 5 93 L.ivanovii 100 0 97 100 42 5 86 0 92 95 0 90 L.grayi 100 97 0 100 100 0 98 0 0 30 94 0

Estos datos denotan el porcentaje de cepas positivas

Se han marcado las reacciones que son confirmativas para Listeria spp. REFERENCIAS

1. On Line Bacteriological Analytical Manual -

www.FDA/CFSAN

monocytogenes in Foods.

2. Confirmation of Listeria species Method 11.3:1995 CCRFA Microbiological Methods Manual

3. AS/NZS 1766.2.15:1998 Examination for specific organisms – Listeria monocytogenes in dairy products.

4. Rodriguez L.D., J.A. Vazquez Boland, j.f. Fernandez Garayzabal, P. Echalecu Tranchant, E. Gomez-Lucia, E.F. Rodriguez Ferri and G. Suarez Fernandez. 1986 A Microplate Technique to Determine Hemolytic Activity for Routine Typing of Listeria Strains. 24:99 – 103.

5. Mira-Gutierrez J. and C.Perz De Lara and M.A. Rodriguez-Igesias. 1990. Identification of species of the genus Listeria by fermentation of carbohydrates and enzymatic patterns. Acta Microbiologica Hungarica 37:123 – 129.

6. Wilkinson B.J. and D.Jones. 1977. A Numerical Taxanomic Survey of Listeria and Related Bacteria. J.Gen. Microbiol. 98: 399 – 421.

7. Lapage S.P, S.Bascombe, W.R. Willcox and M.A.Curtis. 1973 Identification of Bacteria by Computer: General Apects and Perspectives J.Gen. Microbiol. 77: 273 -290

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