Estudio comparativo de diferentes parámetros para la optimización del crecimiento de bifidobacterias y lactobacillus, como organismo probióticos, en un medio no láctico

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(1)IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. ESTUDIO COMPARATIVO DE DIFERENTES PARÁMETROS PARA LA OPTIMIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE BIFIDOBACTERIAS Y LACTOBACILLUS, COM O ORGANISMOS PROBIÓTICOS, EN UN MEDIO NO LÁCTICO. VERONICA JARAMILLO ARBELÁEZ. ANDREA DEL PILAR M ILLÁN OBANDO. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍM ICA BOGOTÁ, ENERO 2005.

(2) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Estudio comparativo de diferentes parámetros para la optimización del crecimiento de Bifidobacterias y Lactobacillus, como organismos probióticos, en un m edio no láctico. Verónica Jaramillo Arbeláez Andrea del pilar M illán Obando. Proyecto de grado como requisito parcial para optar al título de Ingenieros Químicos. Asesor. Ingeniero Edgar Mauricio Vargas Solano. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE NGENIERÍA QUÍM ICA BOGOTÁ, ENERO 2005.

(3) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Nota de Aceptación. ________________________________. ________________________________. ________________________________. ________________________________. Asesor. ________________________________. Jurado. ________________________________ Jurado. Bogotá, Enero 2005.

(4) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. A mis padres y hermanos, por estar siempre junto a mí guiándome y apoyándome. Gracias por todo…. A Vero por su valiosa amistad. A ndrea Millán Obando. Gracias a mi familia por la confianza y el apoyo. A Andre por brindarme una amistad incondicional siempre. Verónica Jaramillo A rbeláez.

(5) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. AGRADECIMIENTOS. El autor expresa su agradecimiento a: Edgar M. Vargas Solano, Ingeniero Químico, profesor de la Universidad de los Andes, y asesor de este proyecto, realización de esta investigación, y. por su gran apoyo durante la. orientación para lograr los objetivos. propuestos. A todos los profesores del departamento de Ingeniería Química por su sus enseñanzas, y por la formación académica. A Ingenios Manuelita, Incauca y Providencia, por su amabilidad y atención a todas nuestras dudas. Al Centro de Investigaciones de la facultad de ingeniería, CIFI, por su apoyo en la investigación de este proyecto de grado. A Clara Juliana Gómez, Ingeniera Química, por su inmensa asesoría en la experimentación del proyecto. A José María Robles, y a todo el personal del Centro de Innovación y Desarrollo Tecnológico CITEC, por su gran colaboración durante todo el proyecto. Al Centro de Investigación de Microbiología, CIMIC, por su ayuda y colaboración. Al centro de investigación en Ingeniería Ambiental, CIIA, por permitirnos acceder a sus instalaciones y equipos cuando se necesitaron. A Cristina Gómez y Marta Bonilla por toda su colaboración..

(6) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. TABLA DE CONTENIDO Página ABSTRACT............................................................................................................... 18 RESUMEN................................................................................................................ 19 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 21 2. OBJ ETIVOS ......................................................................................................... 24 2.1 Gener al ........................................................................................................... 24 2.2. Es pec ífic os.................................................................................................... 24 3. A NTECEDENTES ............................................................................................... 25 4. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 27 4.1. PROB IÓTICOS ............................................................................................ 27 4.1.1. Beneficios de pr obiótic os en la s alud ................................................ 30 4.1.2 BA CTERIAS PROB IÓTICA S............................................................... 33 4.1.2.1 BIFIDOBACTERIA S........................................................................... 33 4.1.2.1.1 Gener alidades ................................................................................. 33 4.1.2.1.2 Condic iones y Car acter ístic as de crecimiento ........................... 33 4.1.2.2 LACTOBACILLUS .............................................................................. 37 4.1.2.2.1 Generalidades ................................................................................ 37 4.1.2.2.2 Condic iones y caracter ístic as del crecimiento ........................... 39 4.2 FERMENTACIONES ACIDOLA CTICA S................................................... 40 4.3. FERMENTACIONES A NAEROBICAS ..................................................... 42 4.4 MELAZA DE CAÑA ...................................................................................... 45 4.5 CRECIMIENTO CINÉTICO DE MICROO RGANISMOS ........................ 49 4.5.1 Fas es de crec imiento micr obiano ....................................................... 50 4.5.2 Factor es que afectan el crecimiento................................................... 52 4.5.3 Ex pres iones c inétic as de cr ecimiento ................................................ 53 5. MATERIALES Y EXPERIMENTCIÓN ............................................................. 58 5.1 BIFIDOBA CTERIAS ..................................................................................... 58.

(7) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 5.1.1 Aislamiento ............................................................................................. 58 5.1.2 Conservac ión de la c epa...................................................................... 61 5.1.3 Identificac ión de la cepa ....................................................................... 62 5.1.4 Shaker ..................................................................................................... 64 5.1.5 Bioflo ........................................................................................................ 65 5.1.6 Dis eño de la exper imentac ión ............................................................. 65 5.2 LACTOBA CILLUS ......................................................................................... 68 5.2.1 Aislamiento e identificación.................................................................. 68 5.2.2 Cultiv o en medio líquid o ....................................................................... 70 5.2.3 Pr epar ación del inóc ulo ........................................................................ 71 5.2.4 Adaptación en s haker ........................................................................... 73 5.2.5 Fer mentac ión en Biorreactor Bioflo .................................................... 73 5.2.6 Dis eño de ex per imentac ión.................................................................. 75 6. RES ULTA DOS EXPERIMENTA LES Y A NÁ LISIS ....................................... 77 6.1. BIFIDOBA CTERIAS .................................................................................... 77 6.1.1 PRIMERA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON TRES MELAZA S ......................................................................................................... 78 6.1.1.1 Datos Exper imentales ........................................................................ 78 6.1.1.1.1 Melaz a manuelita............................................................................ 78 6.1.1.1.2 Melaz a Incauca ............................................................................... 79 6.1.1.1.3 Melaz a Pr ovidencia ........................................................................ 81 6.1.1.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO ............................... 82 6.1.1.2.1 Melaz a Incauca ............................................................................... 83 6.1.1.2.2 Melaz a Pr ovidencia ........................................................................ 86 6.1.1.2.3 Melaz a Manuelita............................................................................ 89 6.1.1.3 MEJOR MELAZA CO MO SUSTRA TO ........................................... 92 6.1.2 SEGUNDA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON DIFERENTES MEDIOS ............................................................................................................ 94 6.1.2.1 Datos Exper imentales ........................................................................ 95 6.1.2.1.1 Medio con 15 gr amos de Levadura por litro ............................... 95 6.1.2.1.2 Medio con 10 gr amos de Levadura por litro ............................... 97.

(8) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 6.1.2.1.3 Medio con 20 gr amos de Levadura por litro ............................... 98 6.1.2.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO SEGUNDA PA RTE............................................................................................................. 100 6.1.2.2.1 Medio con 10 gr amos de Levadura por litro ............................. 100 6.1.2.2.2 Medio con 15 gr amos de Levadura por litro ............................. 103 6.1.2.2.3 Medio con 20 gr amos de Levadura por litro ............................. 106 6.1.2.3 MEJOR MEDIO DE CRECIMIENTO ............................................. 109 6.1.3 TERCERA PARTE: VELOCIDADES DE AGITA CIÓ N.................. 111 6.1.3.1 Datos ex perimentales ...................................................................... 111 6.1.3.1.1 100 r pm........................................................................................... 111 6.1.3.1.2 150 r pm........................................................................................... 112 6.1.3.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO TERCERA PA RTE............................................................................................................. 114 6.1.3.2.1 100 r pm........................................................................................... 114 6.1.3.2.2 150 r pm........................................................................................... 117 6.1.3.3 ESCOG ENCIA MEJOR V ELOCIDA D DE AGITA CIÓN............. 120 6.2. LA CTOBA CILLUS...................................................................................... 123 6.2.1 PRIMERA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON LAS TRES MELAZA S ....................................................................................................... 123 6.2.1.1 Datos ex perimentales ...................................................................... 123 6.2.1.1.1Melaza Manuelita ........................................................................... 124 6.2.1.1.2 Melaz a Incauca ............................................................................. 125 6.2.1.1.3 Melaz a Pr ovidencia ...................................................................... 127 6.2.1.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO PRIMERA PA RTE................................................................................................................... ……………………………………………………………………………….. 128 6.2.1.2.1 Melaz a Manuelita.......................................................................... 129 6.2.1.2.2 Melaz a Incauca ............................................................................. 132 6.2.1.2.3 Melaz a Pr ovidencia ...................................................................... 135 6.2.1.3 MEJOR MELAZA CO MO SUSTRA TO ......................................... 138.

(9) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 6.2.2 SEGUNDA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON DIFERENTES MEDIOS .......................................................................................................... 141 6.2.2.1 Datos ex perimentales ...................................................................... 141 6.2.2.1.1 Medio con 15 g/L de extracto de lev adur a................................ 141 6.2.2.1.2 Medio con 10 g/L de extracto de lev adur a................................ 143 6.2.2.1.3 Medio con 20 g/L de extracto de lev adur a................................ 144 6.2.2.3 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO SEGUNDA PA RTE............................................................................................................. 146 6.2.2.3.1 Medio con 10 g/L de extracto de lev adur a................................ 146 6.2.2.3.2 Medio con 15 g/L de extracto de lev adur a................................ 149 6.2.2.3.3 Medio con 20 g/L de extr acto de lev adura............................... 152 6.2.2.4 MEJOR MEDIO DE CRECIMIENTO ............................................. 155 6.2.3 TERCERA PARTE: VELOCIDADES DE AGITA CIÓ N.................. 157 6.2.3.1 Datos ex perimentales ...................................................................... 158 6.2.3.1.1 150 r pm........................................................................................... 158 6.2.3.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO TERCERA PA RTE............................................................................................................. 160 6.2.3.2.1 150 r pm........................................................................................... 160 6.2.3.3 ESCOG ENCIA MEJOR V ELOCIDA D DE AGITA CIÓN............. 162 7. DIS CUCIÓ N DE RESULTA DOS ................................................................... 166 8. ESTIMA CIÓN PRELIMINAR DE COS TOS ................................................. 170 9. CONCLUSIONES Y RECOMENDA CIONES ............................................... 171 10. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................ 174 11. ANEXOS ........................................................................................................... 180 ANEXO A : PROCEDIMIENTO TINCION DE GRAM ....................................... 180 ANEXO B: ANALISIS DE LAS MELAZAS DE CAÑA. LABORATORIO BIOCONTROL........................................................................................................ 182 ANEXO C: MEDIO MINIMO DE SALES ............................................................ 185 ANEXO D: PRUEBA S........................................................................................... 186 ANEXO E: PRUEBA ESTA DISTICA T PA RA BIFIDOBACTERIA S.............. 191 ANEXO F: PRUEBA ESTA DIS ITCA T PARA LA CTOBACILLUS ................. 193.

(10) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Lista de Figuras: Figura 1. Bac ter ias dominantes de la flor a intestinal ......................................... 28 Figura 2. Probióticos que tienen efecto terapéutico en las siguientes enfer medades. ................................................................................................. 31 Figura 3. Car acterísticas de subgrupos del género Lac tobacillus................... 38 Figura 4. Fases de cr ec imiento bacter iano ......................................................... 50 Figura 5. Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de crec imiento.............................................................................................. 54 Figura 6. Es quema Gener al de un pr oceso de Fer mentación ..................... 169. Lista de Imágenes: Imagen 1.Bifidobacterias ........................................................................................ 34 Imagen 2. Lactobacillus .......................................................................................... 37 Imagen 3. Cepas de Bifidobacterias en agar TPY ............................................. 61 Imagen 4. Bifidobacter ias vistas en el microscopio del CIMIC ........................ 62 Imagen 5. fer mentac ión en shaker con alimentación de Nitrógeno................ 65 Imagen 6. Ex per imentación fer mentaciones Bifidobac ter ias .......................... 65 Imagen 7. Apariencia de las colonias luego de hacer conteo en Agar MRS. .................................................................................................................. 70 Imagen 8. Fer mentación en el Bioflo................................................................... 74 Imagen 9. Exper imentac ió n para Lactobacillus .................................................. 75.

(11) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Lista de Tablas Tabla 1. Reacciones fer mentativas del genero Bifi dob acterium..................... 35 Tabla 2. Estudio de los efectos de las bifidobacterias en diversos estudios de c áncer . ....................................................................................................... 37 Tabla 3. Composición aproximada de la miel de caña (porcentaje en peso de la miel).......................................................................................................... 46 Tabla 4. Medio TPY ................................................................................................. 59 Tabla 5. Cantidad de melaza por litro par a Bifidobacterias .............................. 63 Tabla 6. Medio de cultiv o primer a par te.............................................................. 67 Tabla 7. Medios de c ultivo segunda par te ........................................................... 67 Tabla 8. Medio de c ult ivo tercer a parte................................................................ 67 Tabla 9. Cantidades de melaz a por litro par a Lactobacillus ............................. 72 Tabla 10. Medio de c ultivo pr imer a parte ............................................................ 76 Tabla 11. Medio de c ultivo s egunda parte........................................................... 76 Tabla 12. Medio de c ultivo terc er a par te.............................................................. 77 Tabla 13. Fer mentación Melaz a manuelita Pr imera Par te................................ 78 Tabla 14. Fer mentación Melaz a Incauca Pr imera Par te ................................... 80 Tabla 15. Fer mentación melaz a Pr ovidencia Pr imer a Parte............................ 81 Tabla 16. Velocidad es pec íf ica de cr ecimiento M. Incauc a.............................. 83 Tabla 17. Par ámetros cinéticos Melaza Incauca................................................ 84 Tabla 18. Velocidad es pec íf ica de cr ecimiento Melaza Pr ovidencia .............. 86 Tabla 19. Par ámetros Cinéticos Melaza Prov id encia........................................ 87 Tabla 20. Velocidad de Crecimiento Melaza Manuelita .................................... 89 Tabla 21. Par ámetros cinéticos Melaza Manuelita ............................................ 90 Tabla 22. Co mposición Peptona c aseína ............................................................ 94 Tabla 23. Co mposición extr acto de levadur a...................................................... 94 Tabla 24. Fer mentación con 15 gr amos de levadura por litro.......................... 96 Tabla 25. Fer mentación usando 10 gr amos de levadur a por litro ................... 97 Tabla 26. Fer mentación usando 20 gr amos de levadur a por litro ................... 99.

(12) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Tabla 27. Velocidad específica de crecimiento con 10 gr/l de levadura por litro.................................................................................................................... 100 Tabla 28. Par ámetros cinéticos us ando 10gr /l de levadur a por litr o............. 101 Tabla 29. Velocidad específica de crecimiento usando 15 gramos/l de levadura por litr o .................................................................................. 103 Tabla 30. Par ámetros cinéticos us ando 15gr /l de levadur a por litr o............. 104 Tabla 31. Velocidad específica de crecimiento con 20 gramos de levadura por litr o............................................................................................................. 106 Tabla 32. Par ámetros Cinéticos 20 gr/l de levadur a........................................ 107 Tabla 33. Fer mentación a 100 r pm..................................................................... 111 Tabla 34. Fer mentación a 150 rpm.................................................................... 113 Tabla 35. Velocidad es pec íf ica de cr ecimiento 100 r pm................................. 114 Tabla 36. Par ámetros cinéticos a 100 rpm........................................................ 115 Tabla 37. Velocidad es pec íf ica de cr ecimiento a 150 rpm ............................. 117 Tabla 38. Par ámetros cinéticos a 150 rpm........................................................ 118 Tabla 39. Mejor medio de c ultivo par a Bifidobac ter ias.................................... 123 Tabla 40. Fer mentación melaz a Manuelita pr imera parte .............................. 124 Tabla 41. Fer mentación melaz a Incauca, pr imera parte................................. 126 Tabla 42. Fer mentación melaz a Pr ovidencia primer a par te........................... 127 Tabla 43. Datos c in étic os, melaza Manueli ta, primera par te. ........................ 129 Tabla 44. Par ámetros cinéticos , melaza Manuelita, pr imera parte. .............. 130 Tabla 45. Datos c in étic os, melaza Inc auca, primer a parte............................. 132 Tabla 46. Par ámetros cinéticos , melaza Inc auc a, pr imera parte................... 133 Tabla 47. Datos c in étic os, melaza Pr ovidencia, pr imera parte. ..................... 135 Tabla 48. Par ámetros cinéticos , melaza Providenc ia, primer a parte............ 136 Tabla 49. Fermentación melaza Manuelita con 15 g/L de extracto de lev adura........................................................................................................... 141 Tabla 50. Fermentación de melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adura........................................................................................................... 143 Tabla 51. Fermentación melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adura........................................................................................................... 145.

(13) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Tabla 52. Datos cinéticos melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adura........................................................................................................... 146 Tabla 53. Par ámetros cinéticos con 10 g/L de ex tracto de lev adur a. ........... 147 Tabla 54. Datos c in étic os c on 15 g/L de extr acto de lev adura. ..................... 149 Tabla 55. Par ámetros cinéticos con 15 g/L de ex tracto de lev adur a. ........... 150 Tabla 56. Fer mentación de con 20 g/L de ex trac to de lev adur a. .................. 152 Tabla 57. Par ámetros cinéticos con 20 g/L de ex tracto de lev adur a. ........... 153 Tabla 58. Fer mentación con 15 g/L de extracto de lev adur a y 150 r pm. ..... 158 Tabla 59. Datos c in étic os c on 15 g/L de extr acto de lev adura y 150 r pm. .. 160 Tabla 60. Parámetros cinéticos con 15 g/L de extracto de levadura y 150 rpm. .................................................................................................................. 161 Tabla 61. Mejor medio de c ultivo par a Lactobacillus....................................... 166 Tabla 62. Es timación pr eliminar de c ostos de dos medios diferentes .......... 170 Tabla 63. Datos c urva calibr ac ión DNS ............................................................. 188. Lista de Gráficas Gr áfic a 1. Concentr ación Vs Tiempo Melaza manuelita Pr imer a Parte ......... 79 Gr áfic a 2. Concentr ación Vs Tiempo Melaza Incauc a primer a par te.............. 80 Gr áfic a 3. Concentr ación Vs Tiempo Melaza Providenc ia Primer a parte ...... 82 Gr áfic a 4. Veloc idad Es pecific a de cr ecimiento M. Inc auca ............................. 84 Gr áfic a 5. Veloc idades de crec imiento en Melaz a Incauca .............................. 85 Gr áfic a 6. Modelo Gompertz Vs Datos exper imentales Melaz a Incauca ...... 85 Gr áfic a 7. Veloc idad es pec ific a de crecimiento melaza pr ovidencia .............. 87 Gr áfic a 8. Veloc idad de cr ecimiento Melaza pr ovidencia ................................. 88 Gr áfic a 9. Modelo Gompertz Vs Experimental Melaza providenc ia............... 88 Gr áfic a 10. V eloc idad de crec imiento Melaz a Manuelita .................................. 90 Gr áfic a 11. V eloc idades de cr ecimiento Melaza manuelit a .............................. 91 Gr áfic a 12. Modelo Gompertz Vs Exper imental Melaz a manuelita ................. 91 Gr áfic a 13. Crec imiento de células en las 3 melaz as........................................ 92.

(14) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Gr áfic a 14. Curv a de cr ecimiento en las 3 melaz as .......................................... 93 Gráfica 15. Concentración Vs Tiempo usando 15 gramos de levadura por litro...................................................................................................................... 96 Gr áfic a 16. Conc entrac ión Vs tiempo us ando 10 gr amos de levadur a .......... 98 Gráfica 17. Concentración Vs tiempo usando 20 gramos de levadura por litro. .................................................................................................................... 99 Gráfica 18. Velocidad de crecimiento usando 10 gramos/l de levadura por litro.................................................................................................................... 101 Gráfica 19. Velocidad de crecimiento Vs Tiempo con 10 gramos de lev adura por li tro ............................................................................................ 102 Gráfica 20. Modelo Gompertz Vs Experimental usando 10 gramos de lev adura por li tro ............................................................................................ 102 Gráfica 21. Velocidad específica de crecimiento con 15 gramos/l de lev adura por li tro ............................................................................................ 104 Gráfica 22. Velocidad de crecimiento Vs Tiempo con 15 gramos/l de lev adura por li tro ............................................................................................ 105 Gráfica 23. Modelo Gompertz Vs Experimental usando 15 gramos/l de lev adura........................................................................................................... 105 Gráfica 24. Velocidad de crecimiento Vs sustrato con 20 gramos de lev adura por li tro ............................................................................................ 107 Gráfica 25. Velocidad de crecimiento Vs Tiempo con 20 gramos/l levadura por litr o............................................................................................................. 108 Gráfica 26. Modelo Gompertz Vs Experimental con 20 gramos/l de lev adura por li tro ............................................................................................ 108 Gr áfic a 27. Conc entrac ión Vs tiempo de los 3 medios .................................... 109 Gr áfic a 28. Curv a de cr ecimiento par a los 3 medios ....................................... 109 Gr áfic a 29. Conc entrac iones Vs Tiempo a 100 r pm ........................................ 112 Gr áfic a 30. Conc entrac ión Vs tiempo a 150 rpm.............................................. 113 Gr áfic a 31. V eloc idad de crec imiento a 100 rpm.............................................. 115 Gr áfic a 32. V eloc idad de crec imiento Vs Tiempo 100 r pm............................. 116 Gr áfic a 33. Modelo Gompertz Vs Exper imental a 100 rpm ............................ 116.

(15) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Gr áfic a 34. V eloc idad de crec imiento a 150 rpm.............................................. 118 Gr áfic a 35. V eloc idades de cr ecimiento Vs Tiempo a 150 r pm ..................... 119 Gr áfic a 36. Modelo Gompertz Vs experimental a 150r pm.............................. 119 Gr áfic a 37. Conc entrac ión de c élulas par a ambas agitaciones ..................... 120 Gr áfic a 38. Curv a de cr ecimiento ambas agitac iones ..................................... 120 Gr áfic a 39. Peptona Vs Medio con Levadur a ................................................... 122 Gr áfic a 40. UFC/gr par a peptona Vs medio c on lev adur a.............................. 122 Gr áfic a 41. Conc entrac ión vs Tiempo, melaza Manuelita, primer a parte. ... 125 Gr áfic a 42. Conc entrac ión vs Tiempo, melaza Incauca, pr imer a parte........ 126 Gr áfic a 43. Conc entrac ión vs Tiempo, melaza Prov idencia, primera parte. 128 Gráfica 44. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato, melaz a Manuelita........................................................................................... 130 Gr áfic a 45. Modelo de Monod, melaza Manuelita, primer a parte.................. 131 Gr áfic a 46. Modelo de Gompertz, melaza Manuelita, pr imera parte. ........... 131 Gráfica 47. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato, melaz a Incauca .............................................................................................. 133 Gr áfic a 48. Modelo de Monod, melaza Incauca, pr imer a parte..................... 134 Gr áfic a 49. Modelo de Gompertz, melaza Incauca, pr imer a parte................ 134 Gráfica 50. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato, melaz a Providencia ....................................................................................... 136 Gr áfic a 51. Modelo de Monod, melaz a Providencia, pr imera parte. ............ 137 Gr áfic a 52. Modelo de Gompertz, melaza Prov idencia, primer a par te......... 137 Gráfica 53. Comparativo de concentración celular de las melazas, primera parte................................................................................................................. 139 Gráfica 54. Comparativo de unidades formadoras de colonias de las melaz as, pr imer a parte................................................................................. 139 Gráfica 55. Concentración vs Tiempo melaza Manuelita con 15 g/L de extracto de lev adur a...................................................................................... 142 Gráfica 56. Concentración vs Tiempo melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adur a...................................................................................... 144.

(16) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Gráfica 57. Concentración vs Tiempo melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adur a...................................................................................... 145 Gráfica 58. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 10 g/L de ex trac to de levadura. ........................................................................ 147 Gr áfic a 59. Modelo de Monod c on 10 g/L de extr acto de levadura. ............. 148 Gr áfic a 60.Modelo de Gomper tz c on 10 g/L de extr acto de lev adura. ......... 148 Gráfica 61. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 15 g/L de ex trac to de levadura. ........................................................................ 150 Gr áfic a 62. Modelo de Monod c on 15 g/L de extr acto de levadura. ............. 151 Gr áfic a 63. Modelo de Gompertz c on 15 g/L de extr acto de levadura......... 151 Gráfica 64. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 20 g/L de ex trac to de levadura. ........................................................................ 153 Gr áfic a 65. Modelos de Monod con 20 g/L de extr acto de levadura. ........... 154 Gr áfic a 66. Modelo de Gompertz c on 20 g/L de extr acto de levadura......... 154 Gráfica 67. Comparativo de concentración celular con 10, 15 y 20 g/L de extracto de lev adur a...................................................................................... 155 Gráfica 68. Comparativo de unidades formadoras de colonias con 10, 15 y 20 g/L de extracto de levadur a. ................................................................... 155 Gráfica 69. Comparativo unidades formadoras de colonia con peptona caseína y con 15 g/L de extracto de levadura. ......................................... 156 Gráfica 70. Concentración vs Tiempo con 15 g/L de extracto de levadura y 150 r pm. .......................................................................................................... 159 Gráfica 71. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 15 g/L de ex trac to de levadura y 150 r pm....................................................... 161 Gráfica 72. Modelos de Monod con 15 g/L de extracto de levadura y 150 rpm. .................................................................................................................. 162 Gráfica 73. Modelo de Gompertz con 15 g/L de extracto de levadura y 150 rpm. .................................................................................................................. 162 Gráfica 74. Comparativo de concentración celular con 15 g/L de extracto de lev adura a 100 y 150 r pm. ...................................................................... 163.

(17) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Gráfica 75. Comparativo de unidades formadoras de colonias con 15 g/L de ex trac to de levadura a 100 y 150 rpm. ................................................. 163 Gráfica 76. Comparativo de concentración celular con peptona caseína y con 15 g/L de extr acto de lev adur a a 150 r pm. ........................................ 164 Gráfica 77. Comparativo de unidades formadoras de colonia con peptona caseína y con 15 g/L de extracto de levadura a 150 r pm. ...................... 165 Gr áfic a 78. Curv a c alibr ación DNS ..................................................................... 189. Lista de ecuaciones Ec uac ión 1. V elocidad especifica de crec imiento .............................................. 53 Ec uac ión 2. Modelo de Monod Simple................................................................. 54 Ec uac ión 3. Modelo Inhibic ión no c ompetitiv a por formación de producto.... 56 Ecuación 4. Coeficiente de rendimiento de utilización de sustrato para el crecimiento celular ........................................................................................... 56 Ecuación 5. Coeficiente de rendimiento de utilización de sustrato para la producción ........................................................................................................ 56 Ec uac ión 6. Coeficiente de mantenimiento c elular ............................................ 57 Ec uac ión 7. Tiempo de generación celular ......................................................... 57 Ec uac ión 8. Constante de velocidad de muerte ................................................. 57 Ec uac ión 9. Modelo de Gompertz ......................................................................... 57.

(18) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. ABSTRACT. This thesis w ork is the continuation of. the w ork done by Clara Juliana. Gomez named: “Obtention of probiotic microorganisms in a non dairy medium”, w here w as studied a good medium made by cane molasse, 10 gr/l. of. casein peptone. and. 5gr/l of. yeast. extract, obtaining high. concentrations (CFU/gr) of Lactobacillus and Bifidobacteria; how ever, this medium w as really expensive due to the casein peptone cost, making more difficult the economical viability of the final product. The investigation done in this project complements the w ork named above, searching an inexpensive medium, studying three parameters: Agitation. speed,. three. types. of. molasses. (Incauca, Providenia and. Manuelita), and Caseine peptone and yeast extract concentration. It w as found that the best molasse w as Manuelita w ith an agitation speed of 150rpm, and a yeast extract concentration of 15gr/l for Bifidobateria as w ell as Lactobacillus avoiding the use of caseine peptone, reducing quite a lot the culture medium total costs, and obtaining up to 1010 CFU/gr, overcoming the 107 limit necessary for being healthy to the host. The grow th kinetics follow ed the simple Monod model w ithout product inhibition, understanding as product only the lactic acid..

(19) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. RESUMEN. Este trabajo es la continuación del proyecto de grado “O btención. de. microorganismos probióticos en un medio no láctico”, realizado por la Ingeniera Química Clara Juliana Gómez, que surgió como iniciativa para el reemplazo del uso de antibióticos en la alimentación animal, por un concentrado para ganado vacuno que incluya bacterias benéficas para la salud (probióticos), usando como sustrato. melaza de caña. Tal trabajo. arrojó excelentes resultados de crecimiento tanto para Lactobacillus como para. Bifidobacterias. usando. melaza. de. caña. Incauca,. con. una. concentración de 10gr/l de peptona caseína y 5gr/l de extracto de levadura;. sin embargo, aunque la peptona caseína es un excelente. agente de crecimiento,. tiene un costo elevado, lo cual dificulta la. viabilidad económica del producto terminado. La investigación desarrollada en este proyecto complementa el trabajo anteriormente mencionado buscando un medio óptimo de crecimiento, evaluando nuevos parámetros de cultivo de Lactobacillus y Bifidobacterias como son: velocidad de agitación, tipos de melaza (Incauca, Providencia y Manuelita), y concentración de peptona caseína y/o extracto de levadura como fuente de nitrógeno, con el fin de economizar la producción sin que ello disminuya significativamente el crecimiento de los microorganismos. Se encontró que para ambas bacterias la. melaza bajo la cual crecían. favorablemente fue Manuelita con una velocidad de agitación en el Biorreactor de 150 rpm, y que la peptona caseína fue reemplazada por el extracto de levadura en su totalidad sin presentar efectos negativos sobre el. crecimiento, obteniendo aproximadamente. Lactobacillus. 1010 UFC/gr tanto para. como para Bifidobacterias, superando el límite de 107.

(20) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. UFC/gr necesario para colonizar el intestino de los animales una vez sea ingerido1. La concentración celular máxima para Lactobacillus fue de 7.9 gr/lt que es un 63% mayor que el máximo reportado por la investigación de la Ingeniera Clara Gómez, y para Bifidobacterias fue de 5.1 gr/lt, siendo un 68% superior. Las cinéticas de crecimiento siguieron el modelo de Monod Simple sin inhibición por la generación de producto representado por el ácido láctico, confirmando la similitud de comportamientos reportado por Clara Gómez.. 1. Referencia [1] Página 1.

(21) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 1. INTRODUCCIÓN. El uso de antibióticos para la prevención y tratamiento de enfermedades en los animales, es una buena alternativa para la preservación de la salud y. protección. ante. la. presencia. de microorganismos. patógenos, sin. embargo trazas de estos antibióticos no son asimiladas por el organismo del animal y se acumulan en la carne y en la leche, productos que después serán consumidos por el hombre, y que en el momento de ser ingeridos hacen que este sea más propenso a enfermedades bacterianas, presentándose un problema de salud pública. Por esta razón países de Europa, Asia. y Norte América están generando una tendencia a restringir. tanto la producción como la importación de carnes y productos lácteos provenientes de animales que fueron tratados con antibióticos. Los. antibióticos. además. de actuar sobre microorganismos patógenos,. también afectan la flora intestinal destruyendo las bacterias benéficas que posee el organismo y las cuales son las que influyen en el equilibrio digestivo e inmunológico del huésped en que se encuentren. Es por esta razón que últimamente el desarrollo de alimentos funcionales está en auge. Estos alimentos se definen como aquellos a los cuales se les incluye algún compuesto, como vitaminas, calcio, minerales, agentes antioxidantes, fibra, betacarotenos, probióticos, etc, con el fin de cumplir una función benéfica en la salud del consumidor, reemplazando los aditivos y químicos por compuestos naturales..

(22) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. La gran mayoría de estudios que se están realizando sobre estos alimentos,. son. aquellos. que. contengan. una. alta. concentración. de. probióticos, además que estos microorganismos sean capaces de llegar vivos al tracto digestivo para que puedan cumplir con sus beneficios. Las principales bacterias. denominadas probióticos, corresponden a los. Lactobacillus, Bifidobacterias y Streptococos. Estos microorganismos son bacterias acido lácticas, que se encuentran principalmente en productos lácteos, usando la lactosa como sustrato, transformándola en ácido láctico y energía. Esto no quiere decir que la lactosa sea la única fuente de carbono que estos puedan usar, es por eso que se busca una alternativa más económica y. que pueda ser posteriormente consumida por el. ganado vacuno, como es el caso de la melaza de caña, un subproducto de la industria azucarera de muy bajo costo y que en Colombia es un alimento frecuente para el ganado. En este orden de ideas,. se escogieron 3 melazas de los principales. ingenios azucareros del país como son, Incauca S.A., Providencia S.A., y Manuelita, con el fin de encontrar si existe alguna incidencia en el crecimiento de los probióticos al variar la melaza y poder escoger la de mejores rendimientos. Un medio adecuado de sustrato (fuente de carbono), nitrógeno ya sea suministrado por la peptona caseína o por extracto de levadura y una adecuada. agitación. en. el. biorreactor. lleva. a. obtener. los. mejores. parámetros de crecimiento de estos microorganismos.. Es importante que el medio en el que los mircroorganismos van a ser cultivados sea económico sin bajar la calidad, para que así en un futuro al.

(23) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. tener estos probióticos en un concentrado, este se vuelva una excelente alternativa de nutrición para el ganado vacuno, y así aumentar las exportaciones de carne, las cuales han disminuido en la actualidad por las razones mencionadas en un comienzo sobre el uso de los antibióticos..

(24) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 2. OBJETIVOS. 2.1 General Estudiar diferentes parámetros para la optimización. del crecimiento de. Bifidobacterias y Lactobacillus como organismos probióticos en un medio no láctico.. 2.2. Específicos •. Realizar el aislamiento de las Bifidobacterias y Lactobacillus de medios lácticos comerciales y caracterizar las cepas.. •. Estudiar el efecto de diferentes sustratos para. fomentar el. crecimiento de las Bifidobacterias y Lactobacillus a escala de laboratorio. •. Estudiar. el. crecimiento. cinético. de. las. Bifidobacterias. y. Lactobacillus variando la agitación en un medio no láctico. •. Seleccionar la mejor combinación de los parámetros mencionados anteriormente para el crecimiento óptimo de estas bacterias..

(25) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 3. ANTECEDENTES. Los probioticos se definen como células microbianas vivas que tienen efectos benéficos en la salud sin causar daños en el organismo que los posee.2 Desde que sus propiedades benéficas fueron encontradas, como son la disminución. de. desconjugación. del. diarreas,. estimulación. del. colesterol,. inhibición. crecimiento. del. sistema de. inmune, agentes. patógenos, alivio de la respuesta inflamatoria del intestino, prevención de tumores etc, se comenzaron a usar como parte de la alimentación de las personas y posteriormente de los algunos animales. Existen alimentos como la leche y el yogurt que ya vienen naturalmente con una cierta cantidad de estos. microorgasnismos. probióticos, sin. embargo es tan poca la cantidad de ellos que sería necesario tomar muchos litros de estas bebidas para poder tener el efecto benéfico que ellos aportan. Debido a esto, ya existe en el mercado los yogures probioticos,. a. los. cuales. se les. adiciona una mayor cantidad de. probióticos, también se encuentran leche, queso, helados con probióticos para consumo humano, y se están realizando más investigaciones para incluirlos en una mayor cantidad de alimentos. En Colombia la producción de probióticos es muy reducida, siendo el yogurt la principal fuente de probioticos para consumo humano. Respecto al consumo animal, diferentes productos ya pueden ser conseguidos a 2. Referencia [2] Página 711.

(26) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. nivel comercial como son, Probiomin, Prokura rumicell y Prokura pasta probiótica, sin embargo estos productos son costosos y tienen un máximo de 7x108 UFC/gr de Lactobacillus y Bifidobacterias..

(27) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 4. MARCO TEÓRICO. 4.1. PROBIÓTICOS Los probióticos son células microbiales que tienen un efecto benéfico en la salud y bienestar del huésped donde se encuentran3, pueden ser llamados también agentes terapéuticos ya que se han realizado estudios en el que se han usado para el tratamiento de algunas enfermedades gastrointestinales. Estos microorganismos son habitantes del tracto digestivo, colonizando la parte final del intestino grueso y delgado, constituyen. la flora intestinal,. ayudando a la digestión ya sea descomponiendo la comida en sus diferentes compuestos para que sean absorbidos con mayor facilidad por el cuerpo. Mientras que las bacterias malas o patógenas. crean un. 4. desbalance en la microflora causando enfermedades . En el momento en que nacemos, y mientras se es alimentado con. leche. materna, se tiene una gran cantidad de estas bacterias buenas, sin embargo el estilo de vida, el stress, la ansiedad, el alcohol y en general los malos hábitos conllevan a que esta cantidad de bacterias buenas disminuyan haciendo que las malas se aprovechen y comiencen a causar estragos, como son flatulencia, estreñimiento o diarrea. En la figura 1 se muestra la cantidad de bacterias que se encuentran en la flora intestinal.. 3 4. Referencia [2] Página 1 Referencia [4].

(28) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Figura 1. Bacterias dom inantes de la flora intestinal5 El ácido gástrico y el flujo peristáltico normal del intestino delgado limitan la población bacteriana del tracto gastrointestinal alto. Algunos de los efectos de la flora intestinal son6: -. Su papel sobre la degradación de los nutrientes.. -. La modificación cualitativa del intestino.. -. La síntesis de vitaminas. -. La producción de ácidos grasos volátiles y la reabsorción de metabolitos bacterianos.. 5 6. -. Síntesis de aminas activas y poliaminas.. -. El papel sobre los productos de secreción endógena.. -. La producción de gases.. -. La acción sobre el metabolismo de los xenobioticos. Referencia [7] Referencia [5].

(29) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Es por esto que las bacterias prebióticas se deben tener en cuenta como alimento diario para que siempre haya en nuestro organismo una cantidad adecuada. que. prevenga. estas. enfermedades,. y. mantenga la flora. intestinal balanceada para que pueda cumplir con sus funciones sin problemas. Para que un microorganismo pueda ser considerado probiótico debe cumplir con varios de estos criterios 7: 1. Saludable para el huésped. 2. Resistencia a la acidez gástrica y secreciones pancreáticas 3. Adhesión a las células epiteliales 4. Actividad antimicrobial 5. Inhibición a la adhesión de bacterias patógenas 6. Resistencia a los antibióticos 7. Resistencia a los aditivos de las comidas Los microorganismos más estudiados y que cumplen con la mayoría de estos. criterios. son:. Lactobacillus,. Bifidobacterium,. y. Streptococos,. nombrados bacterias acido lácticas, las cuales ayudan a la inhibición del crecimiento typhimurium,. de. varios. agentes. Staphylococcus. patógenos aureus,. como. Escherichia. son la Salmonella coli,. Clostridium. perfringens and C. Saccharomyces boulardii. La cantidad adecuada que se deben tener de estos microorganismos en el cuerpo para que desarrollen los beneficios que estos dan, es de 109 – 1010 organismos por día, lo que correspondería a tomar aproximadamente. 7. Referencia [2] Página 2.

(30) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. 3 tazas y media de yogurt, ya que típicamente están formulados con 106 UFC/ml8.. 4.1.1. Beneficios de probióticos en la salud El. consumo. regular de los microorganismos probióticos, trae un. sinnúmero de beneficios, ya sea para consumo humano o para consumo animal según las investigaciones que se han hecho.. Beneficios en humanos Sistema Inmune9 Los probióticos aumentan la respuesta inmune específ ica y no específica, activando macrófagos que aumenten el nivel de inmunoglobinas, el nivel de citokinas, o la actividad de muerte celular natural.. Intolerancia a la Lactosa Especies de Lactobacillus como. el L. Bulgaricus y algunos otros que se. encuentran en leches fermentadas ayudan a las personas que no toleran la lactosa proporcionando lactasa al intestino y al estomago.. Alergias Los probióticos podrían proteger contra las alergias al mejorar la función de las barreras mucosas.. Cáncer:. 8 9. Referencia [7] Referencia [6] Página 2.

(31) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. La influencia de los probióticos en el cáncer es promisoria, hasta ahora se han hecho estudios sólo in-vitro y en animales donde parece que estos microorganismos reducen el riesgo de cáncer de colon al disminuir la incidencia del número de tumores.. Figura 2. Probióticos que tienen efecto terapéutico en las siguientes enfermedades 10. Otros beneficios son los siguientes:. 10. -. Resistencia a la Salmonella. -. Inhibición de invasividad y crecimiento bacteriano. -. Prevención de la pérdida de densidad ósea por descalcificación. -. Desconjugación del Colesterol. Referencia [9].

(32) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Beneficios en animales En. animales. de. experimentación se ha visto que el. consumo de. probióticos reduce en la masa fecal la cantidad de enzimas microbianas como la b-glucuronidasa, nitroreductasa y ureasa que parecen estar involucradas. en. la. producción. de. sustancias. cancerígenas. y. mutagénicas11. Otros beneficios que se han estudiado son12: -Prevención de las diarreas por inhibición de la flora causante. -Disminución de la mortalidad que estas diarreas provocan en animales de corta edad. -Prevención de las enfermedades pulmonares, anorexias, etc, ligadas al estado sanitario deficiente del animal con tránsito intestinal acelerado o que ha padecido diarreas. -Mejor absorción de los nutrientes de los formulados alimenticios con el consiguiente. aumento. del. índice. de. conversión. y. su. signif icado. económico en ganancia de peso. -Correctas fermentaciones intestinales, se logra homogeneizar y mejorar la textura y olor de las heces siendo estas aptas como fertilizantes. - Al mejorar la resistencia inmunológica del animal, se disminuye la utilización abusiva de antibióticos, su costo y dificultad de administración. 11 12. Referencia [8] Página 2 Referencia [10].

(33) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Y muchos más beneficios que se pueden ver a continuación, según cada microorganismo probiótico estudiado en este proyecto.. 4.1.2 BACTERIAS PROBIÓ TICAS. 4.1.2.1 BIFIDO BACTERIAS 4.1.2.1.1 G eneralidades Las Bifidobacterias son microorganismos que miden entre 0.5-1.3 x 1.5-8 µm, usualmente son ligeramente bifurcados (forma de Y) y a menudo son ramificados; estas bacterias pueden arreglarse en forma solitaria, en parejas, en arreglos de V, y algunas veces en cadena13.. 4.1.2.1.2 Condiciones y Características de crecimiento Son bacterias gram positivas, inmóviles, no esporuladas y no presentan ningún crecimiento bajo pH menores a 4.5 o mayores a 8.5; la mayoría de las especies son anaerobias, sin embargo hay especies que pueden crecer en aire mientras haya presencia de CO2. Su temperatura de óptimo crecimiento se encuentra en un rango de 37 – 41ºC, y mínimo crecimiento entre 25-28ºC.14 En la imagen 1 se aprecian las bifidobacterias:. 13 14. Referencia [11] Página 573 Referencia [12] Página 1418.

(34) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Im agen 1.Bifidobacterias Se encuentran 24 especies de Bifidobacterias, en la tabla 1 se pueden observar cuales son y algunas de sus reacciones fermentativas que las distinguen:.

(35) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Tabla 1. Reacciones fermentativas del genero Bifidobacterium15 Las bifidobacterias son habitantes normales del tracto gastrointestinal, y son los microorganismos abundantes en la materia fecal de bebés recién nacidos alimentados con leche materna, ejerciendo actividad probiótica en el huésped.. Varios de sus beneficios son16: •. Metabolizan azúcares a ácido láctico y ácido acético, mejorando el peristaltismo intestinal, aliviando así el estreñimiento.. •. Favorecen la normalización de la flora intestinal después de un tratamiento con antibióticos.. •. Renueva la flora después de una diarrea. •. Inhiben el crecimiento de bacterias patógenas, y. la producción y. absorción de amonio, lo cual ayuda a la detoxif icación hepática. •. Sintetizan vitaminas: B1, B2, B6, B12, ácido fólico y biotina.. Debido a que con el paso del tiempo y el estilo de vida que se lleve la cantidad. de. bifidobacterias. va. diminuyendo,. y. sabiendo. todos. los. beneficios que estos traen a la salud, ya existen varios alimentos que las traen incluidas en ellos como leches, quesos y helados. Las leches fermentadas por bifidobacterias se han desarrollado en varias partes del mundo, como son norte y Suramérica, Asia, y Europa, Estos productos contienen con frecuencia B. bifidum, B. longum,B. lactis, B. breve, o B. infantis; algunos utilizan Bifidobacterium sp.17 15. Referencia [12] Página 1430 Referencia [13] 17 Referencia [14] 16.

(36) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Otros de los beneficios que estas presentan son: •. Reducción del riesgo de cáncer de colon. •. Actividad Antimicrobiana. •. Efectos inmunomodulantes. •. Aumentan las defensas del cuerpo. En la tabla 2 se puede observar algunos de los estudios sobre la prevención del cáncer relacionado con las bifidobacterias que se hecho ya sea en animales o en humanos:. han.

(37) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Tabla 2. Estudio de los efectos de las bifidobacterias en diversos estudios de cáncer 18.. 4.1.2.2 LACTO BACILLUS. 4.1.2.2.1 G eneralidades Los lactobacillus son bacterias acidolácticas anaerobias facultativas de tipo Gram positivo en forma de bastones alargados y en ocasiones como cocobacilos y sin movilidad y en muy raras ocasiones, aunque en realidad es casi nulo su efecto patógeno. En la imagen 2 se pueden observar los Lactobacillus al microscopio:. Im agen 2. Lactobacillus Cuando una bacteria es. gram positiva quiere decir que tiene una. membrana celular interna rodeada de peptidoglicano confiriendo rigidez y forma a la célula. Al momento de llevar a cabo la tinción de gram (Ver 18. Referencia [14] Página 11.

(38) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. ANEXO A), las bacterias gram positivas absorben el violeta el cual no puede ser después removido por la adición del alcohol observándose en el microscopio los microorganismos coloreados de morado19. El. género. Lactobacillus. se. ha. divido. en. tres. grandes. grupos. (Homofermentativos que crecen a 45 ºC, Homofermentativos que crecen a 15 ºC y Heterofermentativos) y cerca de 70 especies se han reconocido hasta el momento20. Los homofermentativos llevan a cabo fermentaciones homolácticas usando la ruta Embden-Meyerhof y en la que se tienen pocos productos secundarios y los heterolácticos por la ruta de la pentosa fosfato. Estas rutas metabólicas se explicarán más a fondo en el capítulo 4.4. En la. figura 3 se aprecia algunas características de los subgrupos del. género Lactobacillus:. Figura 3. Características de subgrupos del género Lactobacillus.21. 19. Referencia [16]. Referencia [17]. Página 542. 21 Referencia [17] Página 724 20.

(39) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Por lo general son más resistentes a condiciones de acidez que las otras bacterias acidolácticas, lo que permite que sigan creciendo durante las fermentaciones lácticas normales cuando el pH ha decaído hasta un nivel muy bajo que otras bacterias no podrían resistir. Se encuentran principalmente en productos lácteos como leche, yogures o quesos, en granos, carne, cerveza, vegetales, entre otros productos alimenticios. Igualmente, hacen parte de la flora normal de animales monotérmicos, incluyendo al humano, encontrándose en la boca, el tracto intestinal y vagina.. 4.1.2.2.2 Condiciones y características del crecimiento Pueden. crecer. óptimamente. bajo. condiciones. microaerofílicas. con. cantidades de oxígeno entre un 2 y un 10%. Las condiciones adecuadas de pH son medios ligeramente ácidos en un rango de 4.5 a 6.422 bajo condiciones de temperatura entre los 30 y los 40ºC. Cuando el medio de cultivo ha alcanzado la neutralidad o incluso la alcalinidad, la tasa de crecimiento disminuye23. Debido a que tienen limitadas capacidades biosintéticas, no es suficiente proveer a los lactobacillus con carbohidratos fermentables para dar paso al crecimiento. Son necesarios medios complejos y ricos en minerales, nitrógeno, fósforo,. azufre, aminoácidos, péptidos, derivados de ácido. nucleicos, vitaminas (principalmente la riboflavina), sales, ácidos grasos, entre otros nutrientes los cuales son vitales para su bienestar24.. 22. Referencia [18[. Página 529. Referencia [12]. Página 1210. 24 Referencia [12]. Página 1209. 23.

(40) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. El fósforo es necesario para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos. El azufre tiene un importante rol estructural a nivel de ciertos aminoácidos y vitaminas. El potasio es requerido por todos los organismos y gran variedad de enzimas. El magnesio tiene la función de estabilizar los ribosomas, la membrana celular y ácidos nucleicos25. A nivel comercial es posible encontrar medios de cultivo ya preparados que tengan todas los compuestos necesarios para tener condiciones nutritivas de crecimiento, como es el caso específico del medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe), el cual puede encontrarse en agar (para cultivos sólidos) o en caldo (cultivos en medio líquido). Este medio contiene carbohidratos, nucleótidos, aminoácidos, vitaminas, extracto de peptona, extracto de levadura y de carne, manganeso, Tw een 80, los cuales son estimulantes del crecimiento de los lactobacillus. En medio sólido las colonias son pequeñas, redondas y lechosas. El crecimiento. de. los. lactobacillus. en. medio. líquido. se. caracteriza. principalmente por la presencia de un polvo suave, homogéneo y blanco a través de todo el líquido, encontrándose un sedimento cuando las células han dejado de crecer26. Esta característica ayuda al momento de la experimentación. a. tener. un. indicio. del. crecimiento. que. se. está. observando del microorganismo, y en cierta forma es un indicativo de la pureza del medio. 4.2 FERMENTACIONES ACIDOLACTICAS Las fermentaciones ácidolácticas son llevadas a cabo principalmente por bacterias. ácido. lácticas,. principalmente. Streptococcus,. Enterococcus,. Lactococcus, Lactobacillus y Leuconostoc, entre otros, que por lo general 25 26. Referencia [17]. Página 113. Referencia [18]. Página 128..

(41) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. son bacterias gram positivas, no esporuladas, no mótiles 27 las cuales consiguen la energía necesaria para su crecimiento a partir de la fermentación. de. carbohidratos. láctico28, aunque también es. produciéndose. principalmente. posible encontrar etanol y. ácido. dióxido de. carbono. Prácticamente cualquier carbohidrato o alguno de sus derivados pueden hacer las veces de fuente de carbono para la generación de energía por parte de los microorganismos aquí mencionados. Entre ellos se encuentra almidón, celulosa, lactosa, sacarosa, glucosa, fructosa, entre otros 29. Es muy probable encontrar un sinnúmero de bacterias activas en pequeño trozo de vegetal, pero particularmente las bacterias acido lácticas tienen la capacidad de instalarse con prioridad en el vegetal puesto que gracias a la fermentación de la glucosa y posterior transformación en ácido láctico el. pH disminuye. inadecuado. para. convirtiendo el. el. crecimiento. medio de. los. en. el. otros. que se encuentran microorganismos. allí. presentes. Luego, el crecimiento de las bacterias ácido lácticas se da en forma continua hasta que la fuente de carbohidratos se agote o las condiciones de temperatura o pH no sean las adecuadas para continuar con su crecimiento. La ruta Embden-Meyerhof. es. la ruta glicolítica más común para la. degradación de la glucosa en piruvato que se lleva a cabo en la matriz citoplasmática.. También. conocida. como. fermentación. homoláctica,. requiere de dos moléculas de ADP por cada molécula de hexosa y se 27. Referencia [18]. Página 529. Referencia [19]. Página 109. 29 Referencia [20]. 28.

(42) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. producen dos moléculas de piruvato y dos de ATP30, y tal piruvato posteriormente se transforma en ácido láctico.. Glucosa + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ Ruta Embden-M eyerhof31 La ruta heteroláctica o la ruta de glucosa 6-fosfato en la que por cada mol de hexosa se producen una mol de gas carbónico, una mol de etanol o ácido acético y una mol de ácido láctico32, siendo un producto intermedio el piruvato. 3 glucosa 6-fosfato + 6NADP+ + 3H2O → 2 fructosa 6-fosfato + gliceraldehído 3-fosfato + 3CO2 + 6NADPH + 6H+ Ruta glucosa 6-fosfato33.. 4.3. FERMENTACIONES ANAEROBICAS34 Las. fermentaciones. anaerobias han sido usadas desde hace mucho. tiempo atrás para muchas fermentaciones industriales importantes como son: la producción de etanol mediante las levaduras, preservación ácido láctica de las comidas, y digestión anaeróbica de polisacáridos, proteínas y tratamiento de desechos.. 30. Referencia [18]. Página 177. Referencia [18]. Página 177. 32 Referencia [12]. Página 1212. 33 Referencia [18]. Página 177. 34 Referencia [15]. Páginas 139 - 145 31.

(43) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Este último esta cogiendo gran auge en los últimos años ya que esta incrementando. el. rol. de. detoxificación. de. desechos. peligrosos. y. contaminantes a través de digestión anaeróbica. Los. microorganismos. anaerobios. biosíntesis, ni son capaces. no utilizan oxígeno molecular en la. de usar oxígeno como un aceptor de. electrones, en cambio sí usan varios donores y aceptores. de electrones. de compuestos orgánicos e inorgánicos para su metabolismo. Debido. a. patrones. que. los. microorganismos. metabólicos,. las. anaerobios. fermentaciones. presentan. anaerobias. diversos. tienen. varias. propiedades que no se encuentran en los procesos aerobios. Esto hace que existan ventajas y desventajas en las fermentaciones anaerobias. Ventajas de las fermentaciones anaerobias: •. La producción de producto puede ser más alta. •. Se requiere de menor entrada de masa y energía que en los procesos aerobios haciéndolo más económico.. •. Los. anaerobios. catabolizan. sustratos. complejos. y. producen. productos únicos. Desventajas de las fermentaciones anaerobias: •. Varias fermentaciones anaeróbicas que envuelven cultivos puros son. más. propensos. a. contaminarse,. a. tener. una. infección. bacteriófaga o a degenerarse espontáneamente. •. Comunidades. microbiales. pueden ser inestables.. requeridas. para. procesos. industriales.

(44) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. •. Se. necesitan. de. medios. especializados. al. igual. que. de. instrumentación para cultivar los anaerobios a nivel de laboratorio o industrial. •. Muchos anaerobios son difíciles de manipular genéticamente. •. La inhabilidad de los anaerobios a utilizar oxigeno en la biosíntesis limita la producción de algunos metabolitos primarios y de algunos secundarios.. •. Los. anaerobios pueden formar compuestos nocivos y tóxicos. como algunas aminas putrefactas o compuestos de sulfuro. Dentro de los microorganismos anaerobios se encuentran los que son obligados, los facultativos, o microaerofílicos; los anaerobios obligados tiene una energía del metabolismo que es independiente del oxígeno, y pueden cumplir su ciclo de vida en ausencia de oxígeno; los anaerobios facultativos pueden crecer por fosforilación oxidativa o en ausencia de oxígeno, y los organismos microaerofílicos necesitan de poco oxígeno para crecer. Durante el proceso de la fermentación se utiliza sustratos orgánicos y aceptores de electrones orgánicos, y se producen sustancias orgánicas reducidas. ATP es obtenido por fosforilación y este es influenciado por los productos finales de la fermentación; en las fermentaciones de bacterias acido lácticas, específicamente las homolácticas, donde se producen 2 moléculas. de lactato,. se produce 2 moléculas de ATP de hexosa. fermentada. Para. lograr. una. buena. fermentación. de. estos. microorganismos. anaerobios, es importante tener mucho cuidado durante todo el proceso de. aislamiento,. cultivación,. etc.,. por. ejemplo,. es. importante. usar. materiales que sean impermeables al aire evitando así que el oxígeno.

(45) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. llegue a contacto con los microorganismos, usar agentes reductores bajando así el potencia redox, también es posible remover el oxígeno de los gases, usar cámaras anaeróbicas, medios específicos para cultivar anaerobios, y. usar aparatos. especializados o fermentadores a gran. escala que sean adecuados para anaerobios estrictos.. 4.4 MELAZA DE CAÑA La melaza se define como el subproducto o como uno de los “desechos” del proceso de producción de azúcar ya que no se le puede extraer más azúcar para ser cristalizada y tratada por los métodos convencionales de la industria azucarera.. Composición De tal forma que en la melaza de caña es posible encontrar muchos de los constituyentes de la caña en términos de azúcar, materia orgánica e inorgánica en solución acuosa35. En la tabla 3 se observan los principales componentes de la melaza de caña.. 35. Referencia [21]. Página 1..

(46) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. CONSTITUYENTE PRINCIPAL. COMPONENTES. PORCENTAJES. Agua. 17-25 Sacarosa. Azúcar. 30-40. Glucosa (dextrosa). 4-9. Fructosa (levulosa). 5-12. Otras sustancias reductoras (como 1-4 invertidos) Total sustancias reductoras (como 10-25 invertidos) Gomas,. Otros carbohidratos. almidón,. pentosanas,. trazas de hexitoles, D-manitol. 7-15. Como carbonatos % de ceniza. Cenizas. K2 O. 30-50. CaO. 7-15. Mg O. 2-14. Na2 O. 0.3-9. R 2 O3 (Fe). 0.4-2.7. SO3. 7-27. Cl. 12-20. P2 O5. 0.5-2.5. SiO2 e insolubles. 1-7. Proteína cruda. 2.5-4.5. Proteína verdadera. 0.5-1.5. Aminoácidos Compuestos nitrogenados. (ácido aspártico y 0.3-0.5. g lutámico, alg una pirrolidina) Compuestos. nitrog enados. sin 1.5-3.0. identificar Acido Acidos no nitrog enados. aconítico,. cítrico,. málico, 1.5-6.0. oxálico, g licólico. Mesacónico,. succínico,. fumárico, 0.5-1.5. tartárico. Cera, esteroles y fosfátidos. 0.1-1.0 Vitamina A, biotina, niacina, ácido Cantidades variables. Vitaminas. pantoténico, riboflavina, tiamina.. Tabla 3. Composición aproxim ada de la miel de caña (porcentaje en peso de la miel)36. 36. Referencia [22]. Página 473..

(47) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Como se pudo ver en la tabla 3, uno de los principales componentes es la sacarosa, la cual se convierte en glucosa y fructosa por hidrólisis. Los microorganismos de tal forma pueden usar todo este tipo de azúcar para sus procesos metabólicos, así sean complejos. La composición de la melaza de caña no es siempre constante puesto que varía con la variedad y su grado de madurez, los suelos o el clima. También depende del proceso de cristalización del azúcar en sí ya que si se tiene un proceso de molienda y extracción de la caña de azúcar eficiente, es posible tener niveles bajos de sacarosa en la miel final. En la melaza de caña es posible encontrar entre un 2 y un 4 % de azúcares reductoras que no son fermentables. Estas azúcares tienen el mismo. valor. alimenticio. para. la. nutrición. animal. que los. azúcares. reductores fermentables pero no pueden cumplir una función fermentativa para microorganismos. Uno de los compuestos inorgánicos más significativos en la composición de la melaza de caña son el fósforo, el calcio y el potasio, siendo éste último el más influyente en la alimentación animal Pasando a los. compuestos nitrogenados, estos se encuentran en la. melaza de caña en pequeñas cantidades entre ellos aminoácidos, amidas y otros compuestos simples de nitrógeno. Los aminoácidos tienen una pequeña relevancia en la alimentación animal y son los responsables del color característico de la miel final37.. 37. Referencia [21]. Página 10..

(48) IQ-2004-II-11 IQ-2004-II-14. Las. vitaminas. también tienen pequeña relevancia en la alimentación. animal. La biotina está presente en cantidades suficientes de tal forma que tiene gran importancia en los procesos de fermentación. Las melazas han sido usadas durante mucho tiempo como ingrediente para. la. alimentación. animal. debido. a. su. valor. energético. y. sus. propiedades físicas. De tal forma que la alimentación animal con melaza de caña ha sido aceptada en todo el mundo, tanto que aproximadamente el 60% de las melazas de caña se usan para tal fin, siendo la materia orgánica total y los azúcares considerados formas importantes de energía en la alimentación animal, mucho más económica que otros productos usados como cereales 38. La alimentación animal con melaza de caña en animales aumenta el consumo de agua, mayores vitaminas, sales minerales y proteínas lo que hace posible que los animales tengan una dieta balanceada favoreciendo sus niveles de nutrición y alimentación. La melaza de caña es agradable para los animales debido a su sabor y olor con lo que se promueve el apetito del animal, de tal forma que con la melaza se puede mezclar y enmascarar otros productos usados para la alimentación animal de sabores desagradables o simplemente que no tienen un sabor particular como son por ejemplo ciertos minerales,. vitaminas,. medicinas. o. urea.. Además. debido. cereales, a. sus. propiedades físicas, la melaza de caña es comúnmente usada para formar bloques de alimento para animales, lubricando los compuestos que abarca y manteniendo una estructura física estable con lo que el producto se puede almacenar con mayor facilidad.. 38. Referencia [21]. Página 36..