Trabajo Fin de Grado
Papel de los radicales libres en el
envejecimiento de las membranas celulares
Role of free radicals in the aging of cellular membranes
Autor
Jorge Collado Sáenz
Director
Joaquín García García
Facultad de Medicina
Departamento de Farmacología y Fisiología
Curso 2017-2018
Resumen
Desde que Harman (1956) propusiera el estrés oxidativo, derivado de la utilización del oxígeno en el metabolismo de los organismos vivos, como una de las principales causas del envejecimiento fisiológico, la investigación se ha focalizado en el estudio de sus efectos sobre las diferentes estructuras celulares. En el presente trabajo revisamos el efecto de las especies reactivas del oxígeno sobre los lípidos, principal componente estructural de las membranas biológicas, a través del mecanismo de peroxidación lipídica. Las numerosas investigaciones realizadas en este ámbito aportan una fuerte evidencia a favor de que las especies químicas derivadas del oxígeno están implicadas en la pérdida de fluidez de las membranas y la consiguiente pérdida de funcionalidad celular, constituyendo un importante factor en el proceso de envejecimiento.
Palabras clave: envejecimiento, radicales libres, peroxidación lipídica, membranas biológicas
Abstract
Since Harman (1956) proposed oxidative stress, product of the use of oxygen in the metabolism of living organisms, as one of the main causes of physiological aging, researching in this field has focused on the study of its effects on different cellular structures. In the present paper we review the effect of reactive oxygen species on lipids, main structural component of biological membranes, through the mechanism of lipid peroxidation. The numerous investigations carried out in this field provide strong evidence in favor of the fact that oxygen-derived species are involved in the loss of fluidity of the membranes and cell functionality, emerging as an important factor in the aging process.
Key words: aging, free radicals, lipid peroxidation, biological membranes
Índice de contenidos
-El proceso de envejecimiento
·Envejecimiento, longevidad, y enfermedades asociadas a la edad... 2
·Teorías del envejecimiento: del evolucionismo clásico a la biología molecular... 3
-Las membranas biológicas ·Origen y desarrollo del concepto de membrana biológica... 6
·Estructura y composición de las membranas biológicas... 9
·Fluidez de membrana... 12
·Balsas de membrana y compartimentalización celular... 15
-Estrés oxidativo ·Radicales libres y estrés oxidativo... 17
·Antioxidantes... 19
-Efectos de los radicales libres sobre las membranas biológicas y su papel en el envejecimiento ·La peroxidación lipídica... 23
·Consecuencias de la peroxidación lipídica sobre las membranas biológicas... 25
·Estrés oxidativo, fluidez de membrana y envejecimiento... 27
-Referencias bibliográficas... 29
El proceso de envejecimiento
Envejecimiento, longevidad, y enfermedades asociadas a la edad
El envejecimiento es un proceso que acompaña a la vida desde que esta se originó hace aproximadamente 3,5 millones de años (Harman, 1981). Desde una perspectiva puramente biológica, podemos definir el envejecimiento como la acumulación con la edad de diversos cambios deletéreos en las células y tejidos consistentes en una pérdida progresiva de sus funciones, con el consiguiente incremento del riesgo de enfermedad y muerte. Puede atribuirse a causas como los defectos genéticos, los procesos patológicos, el entorno y a un proceso inherente a todo organismo, el proceso de envejecimiento primario, consecuencia de las numerosas reacciones químicas que tienen lugar en el curso del metabolismo celular(Harman, 2001). Se puede afirmar que este es el mayor factor de riesgo productor de enfermedad y muerte en los países desarrollados a partir de los 28 años de edad, una vez mitigados los efectos de otras variables como el entorno y la enfermedad en la mortalidad, y es el responsable de que la esperanza de vida máxima en la especie humana sea de aproximadamente 122 años(Harman, 1998).
Los cambios que se producen en la vejez pueden ser entendidos de dos maneras diferentes.
En primer lugar, como la continuación del programa genético de la especie, y en segundo lugar como el resultado de las alteraciones debidas al azar en la integridad de las biomoléculas del organismo. Desde esta última perspectiva, el envejecimiento es un aumento en el desorden molecular debido al azar. Esta escalada en la pérdida de integridad molecular manifestada por daños en el ADN, formación de amiloide, alteraciones moleculares estructurales, precipitación y agregación proteica o cambios en la degradación de biomoléculas llega a sobrepasar los mecanismos de reparación y recambio celular, aumentando la vulnerabilidad del individuo a la patología y a las enfermedades asociadas a la edad. La selección natural ha favorecido el mantenimiento de esta integridad hasta la edad reproductiva, momento a partir del cual la supervivencia de la especie no se ve afectada por la del individuo (Hayflick, 2007).
Una cuestión a tener en cuenta es que los mecanismos que producen el envejecimiento son diferentes de aquellos que determinan la longevidad (Hayflick, 1995). Al contrario que en el envejecimiento, los procesos que determinan la longevidad están condicionados por el genoma, a través de mecanismos de síntesis y reparación molecular, que incrementan la reserva fisiológica del organismo hasta la maduración reproductiva, momento en el cual comienzan a decaer. Por lo tanto
el genoma sería necesario para el desarrollo y mantenimiento biológico en las primeras etapas de la vida, mientras que, a la vista de la evidencia actual, no sería tan determinante en el proceso de envejecimiento primario. En cualquier caso, los genes sí que estarían implicados en los niveles de capacidad fisiológica, reparación y recambio celular previos al comienzo del envejecimiento, por lo que indirectamente determinarían la longevidad potencial (Hayflick, 2007).
Otro aspecto a tener en consideración es la necesidad de distinguir el proceso de envejecimiento primario de las enfermedades asociadas a la edad. El envejecimiento en sí no es una enfermedad, aunque los cambios que conlleva puedan ser molestos e incluso limitantes para el individuo. Cuando estos cambios aparecen en las células de órganos vitales, pueden suponer un aumento de la vulnerabilidad a ciertas patologías. La falta de distinción entre estos dos conceptos conduce al pensamiento generalizado de que la curación de estas enfermedades permitirá alcanzar el conocimiento sobre el proceso primario de envejecimiento, lo cual supone una limitación al avance científico en este campo (Hayflick, 2007). En este sentido, se hace necesario hacer hincapié en la necesidad de avanzar en el estudio del envejecimiento como campo propio de investigación, al margen de los avances de la Geriatría.
Teorías del envejecimiento: del evolucionismo clásico a la biología molecular
Siguiendo a Hayflick, la pregunta “¿por qué envejecemos?”, la cual intenta indagar en el sentido biológico del envejecimiento y en qué forma beneficia a la evolución de la especie humana, es completamente diferente a la pregunta “¿cómo envejecemos?”, que hace referencia a los mecanismos responsables de este proceso. De acuerdo con esta separación conceptual, encontramos dos corrientes diferenciadas en el estudio del envejecimiento. Por un lado, las teorías evolutivas del envejecimiento tratan de encontrar un marco general desde el que entender el envejecimiento y, en estrecha relación con la genética, pretenden explicar las enormes diferencias observadas en cuanto a las tasas de envejecimiento y longevidad entre las distintas especies (Gavrilov y Gavrilova, 2002).
Las teorías biológicas del envejecimiento, por su parte, intentan responder a la segunda cuestión, analizando los aspectos moleculares y celulares que caracterizan el proceso de envejecimiento (Davidovic, 2010). En la figura 1 podemos ver representadas las teorías más representativas de ambas corrientes.
FIGURA 1. Principales teorías sobre el envejecimiento
Las teorías evolutivas o clásicas del envejecimiento fueron formuladas en la primera mitad del siglo XX. Al comienzo, el interés estaba focalizado en la cuestión de “por qué envejecemos”, tratando de responder a la conocida como paradoja evolutiva: “si la selección natural diseña los organismos para una supervivencia óptima y el éxito reproductivo, ¿por qué no previene en primer lugar el envejecimiento?” (Fabian, 2011). En su versión más radical, la hipótesis evolutiva considera que el envejecimiento se debe fundamentalmente a las fuerzas de la evolución, más que a caprichos bioquímicos o celulares (Rose, 1998). El primer acercamiento al estudio biológico del envejecimiento se debe al biólogo alemán Weismann en el siglo XIX, al formular su teoría de la muerte programada. Su idea inicial era que existe un mecanismo de muerte específico diseñado por la selección natural, que elimina a los miembros más envejecidos y desgastados de la población (Weismann, 1882). En cuanto al mecanismo específico que producía esta muerte programada, propuso que se debía a la existencia de un límite en el número de divisiones que pueden afrontar las células somáticas de cada especie. Este límite fue confirmado experimentalmente por Hayflick en 1994. Otra importante perspectiva es la teoría de la acumulación de mutaciones, propuesta por Medawar en 1946. De forma similar a Weismann, sostiene que el envejecimiento es un subproducto no adaptativo de la selección natural. Las mutaciones dañinas para el individuo expresadas en la juventud son negativamente seleccionadas, ya que tienen un impacto perjudicial en la supervivencia
de la especie que se traduce en una disminución del número de descendendientes. Sin embargo, las mutaciones dañinas expresadas con posterioridad a la madurez reproductiva tendrían un impacto neutral en la selección, ya que sus portadores ya habrían transmitido sus genes a la descendencia (Medawar, 1946). La tercera gran hipótesis en este campo es la teoría del pleiotropismo antagónico.
Asume que un gen particular puede tener un efecto no solo sobre uno, sino sobre varios rasgos de un organismo (lo que se conoce como pleiotropía), y que estos efectos -pleiotrópicos- pueden afectar la adaptación individual de maneras opuestas. Así, existen determinados genes que se mantienen en la población debido a su efecto positivo en la reproducción a edades jóvenes, a pesar de sus efectos negativos a una edad avanzada (Williams, 1957). Una extensión más concreta de esta hipótesis es la teoría del soma desechable, que propone que un aumento de la inversión de recursos en la reproducción resulta en una menor inversión en el mantenimiento del organismo, lo que reduce la esperanza de vida (Holliday, 2006).
Por otro lado encontramos las teorías biológicas modernas, que intentan explicar el fenómeno del envejecimiento a la luz de los más recientes avances en genética y en biología molecular. A grandes rasgos, podemos distinguir dos grandes grupos en estas explicaciones: (1) las teorías del envejecimiento programado y (2) las teorías del envejecimiento celular (del daño o del error) (Jin, 2010). Algunos autores han venido a denominar a estas dos corrientes como teorías deterministas y estocásticas, respectivamente.
Dentro del primer grupo vamos a encontrar diferentes perspectivas. Desde la teoría de la longevidad programada, se entiende el envejecimiento como la activación y desactivación secuencial de determinados genes. Los individuos más longevos poseerían unos genes más privilegiados y un material genético más estable (Davidovic, 2010). La teoría endocrina, por su parte, propone la existencia de rutas hormonales directamente implicadas en la regulación del envejecimiento, como la vía de señalización insulina/IGF-I (Van Heemst, 2010). Desde la teoría inmunológica, se sostiene que el sistema inmunitario está programado para decaer a partir de la pubertad .
Por otra parte encontramos, como ya hemos señalado, las teorías del error. La teoría del desgaste es heredera de los postulados de Weismann. Así, de manera similar a un automóvil viejo, las partes del cuerpo se deterioran con el uso repetido. La teoría de la tasa de supervivencia propone que cuanto más rápido es el metabolismo de un organismo, menor es su esperanza de vida (Hulbert et al., 2007). Desde la teoría de los enlaces cruzados, se propone que el envejecimiento es
el resultado del daño celular producido por proteínas con abundantes enlaces cruzados (Bjorksten, 1968). La teoría del daño en el ADN somático postula que las polimerasas y otros mecanismos de reparación del ADN no pueden corregir los daños en el material genético tan rápido como estos ocurren, lo que se traduce en el deterioro y la disfunción de las diferentes células del organismo. La teoría de los telómeros se basa en el hecho de que los telómeros se acortan con cada división celular sucesiva, proceso que es contrarrestado por el efecto de la telomerasa. Sin embargo, en la mayoría de las células adultas se pierde este mecanismo, lo que hace que los telómeros se acorten hasta alcanzar una longitud crítica en la que la célula deja de replicarse y muere (Flores et al., 2005).
Dentro de este grupo de teorías, la que más fuerza ha ganado estos últimos años es la teoría de los radicales libres (1956). Desarrollada por Harman a partir de las investigaciones de Gershman, propone que el radical superóxido y otros radicales libres producen alteraciones en los componentes macromoleculares de la célula, lo que en última instancia lleva a la pérdida de funcionamiento a nivel orgánico. El cuerpo, por su parte, posee sustancias antioxidantes que contrarrestan el efecto de estos radicales libres, y en cuya ausencia disminuiría la esperanza de vida (Harman, 1956). Esta señalización a través de las especies reactivas de oxígeno es probablemente la ruta enzima/gen más importante en el desarrollo de la senescencia celular y del envejecimiento orgánico (Afanas'ev, 2010). En el presente trabajo analizaremos el papel de los radicales libres en el envejecimiento, principalmente a través de sus efectos sobre las membranas biológicas.
Las membranas biológicas
Origen y desarrollo del concepto de membrana biológica
La membrana biológica es una estructura que delimita, a la vez que pone en comunicación, distintos compartimentos tanto en el interior de la célula como con el exterior. La estructura de las diferentes membranas biológicas es muy parecida, si bien varía en su composición en los diferentes orgánulos celulares de los que forma parte (membrana plasmática, mitocondria, retículo endoplasmático, aparato de Golgi… entre otros).
El estudio de las membranas biológicas se entremezcla en sus inicios con la investigación sobre el comportamiento de los lípidos en un medio acuoso. Las primeras referencias las encontramos en los escritos de Plinio el Viejo (año 77 d.C.) (Eichman, 1999). Sin embargo, tendremos que esperar hasta 1887 para que aparezca el concepto de membrana biológica, el cual se
adjudica al botánico alemán Pfeffer (Meza et al., 2010), quien a partir de sus descripciones sobre la similitud del comportamiento osmótico entre células vegetales y membranas artificiales, hipotetizó que alrededor de las células existía una capa de protoplasma con propiedades osmóticas.
Posteriormente, en 1895, Overton, botánico especializado en fisiología vegetal, estudiando la absorción y excreción de diferentes sustancias en la célula vegetal, observó que las sustancias lipofílicas penetraban en esta con mayor facilidad que aquellas que no lo eran. Por ello concluyó que la estructura que rodeaba la célula debía estar compuesta por lípidos (Meza et al., 2010). Serán Gorter y Grendel (1925) quienes constatarán que al extender sobre una superficie acuosa los lípidos extraídos de un número determinado de eritrocitos, estos ocupaban el doble de la superficie calculada para estas células. En conclusión, infirieron que esta capa tenía un espesor de dos moléculas, lo que les llevó a hablar de una estructura de doble capa de lípidos, como se puede apreciar en la figura 2 (Heimburg, 2007).
FIGURA 2. Modelo de membrana plasmática propuesto por Gorter y Grendel
Tras la constatación de que las proteínas eran un componente esencial en la estructura de las membranas biológicas (Danielli y Harvey, 1934), Danielli y Davson (1934) propusieron la teoría paucimolecular. Según esta, las membranas biológicas estarían compuestas por una región lipídica central (apolar e hidrófoba) bordeada a ambos lados por una monocapa de fosfolípidos con sus extremos polares orientados hacia el exterior, y una monocapa más externa de proteínas globulares.
De esta manera, la permeabilidad a los solutos se explicaría mediante las propiedades hidrófobas de las membranas. Años más tarde, en 1957, Robertson fue capaz de identificar mediante microscopía electrónica la estructura de la membrana (figura 3: Heimburg, 2007). De esta forma postuló la teoría unitaria, que confirmaba los avances realizados por las investigaciones anteriores presentando la membrana como una estructura trilaminar a modo de barrera al libre flujo de iones y moléculas hidrófilas, aunque sin descartar la posible presencia de canales acuosos para el transporte de estos materiales (si bien dedujo que se expresarían en muy baja densidad, ya que eran indetectables en las micrografías). Robertson hizo extensible esta estructura a todas las membranas biológicas, sin negar la posibilidad de que la composición presentara rasgos diferenciales en función
de su especificidad.
FIGURA 3. Imagen de microfotografía electrónica de la estructura trilaminar de la membrana
Los estudios de microfotografía en los años sesenta pusieron de manifiesto que las proteínas tienen un formato helicoidal, presentándose como un mosaico, y que las camadas lipídicas presentaban características más propias de líquidos que de sólidos. Así, comienza una nueva época en la investigación sobre las membranas biológicas marcada por un interés creciente por sus aspectos dinámicos. En esta línea, en 1972 Singer y Nicolson propusieron el modelo de mosaico fluido (figura 4). Desde este acercamiento, la membrana plasmática estaría constituida por una bicapa fluida de lípidos en la cual estarían situados diversos conglomerados proteicos, atravesando la bicapa parcial o totalmente, e incluso protruyendo desde ella. Así, los lípidos estarían compuestos por una extremo hidrofóbico, orientado hacia el lado interno de la bicapa, y otro hidrofílico, dirigido hacia los lados externos de la membrana, en contacto con el medio acuoso tanto intra como extracelular. Las proteínas estarían unidas a este polo hidrofílico de la bicapa. Este modelo también resalta las interacciones hidrofóbicas entre las proteínas y los lípidos que forman parte de la membrana, así como su distribución aleatoria en el plano de la membrana.
FIGURA 4. Modelo de mosaico fluido
La principal crítica a este modelo apareció al constatar que los parámetros intrínsecos de los materiales de la membrana mostraban diferencias significativas respecto a los observados en las bicapas lipídicas artificiales (Meza et al., 2010). En respuesta a estos cuestionamientos, se incorporó el concepto de asimetría en la composición de ambas monocapas (Rotman y Lenard, 1977), y se recalcó la selectividad de las interacciones moleculares entre sus elementos, lo que propiciaría su difusión y segregación lateral (Chapman, 1975). Este concepto de segregación de lípidos será retomado en 1988 por Simons y van Meer en su modelo de microdominios lipídicos.
Estructura y composición de las membranas biológicas
Las membranas biológicas se componen de una bicapa lipídica donde se encuentran inmersas diversas proteínas globulares, constituyendo lo que se ha venido a denominar mosaico fluido (Singer y Nicolson, 1972). También se asocian componentes glucídicos unidos tanto covalentemente a lípidos y proteínas como anclados a la membrana mediante radicales hidrófobos.
Constituyen el glicocálix, y realizan importantes funciones de reconocimiento y señalización celular.
Lípidos
Los lípidos son los componentes fundamentales de las membranas biológicas al definir sus propiedades físicas, regular su fluidez y grosor, determinar la asimetría entre las monocapas, contribuir en la creación de un gradiente eléctrico, modular la actividad de las proteínas de membrana, y producir la segregación de dominios específicos mediante las denominadas balsas de lípidos. El contenido en lípidos está bien establecido en distintos orgánulos, tipos celulares y tejidos. Si bien podemos encontrar más de 1000 tipos de lípidos en la membrana de una célula eucariota, esta diversidad se agrupa en tres grupos según su estructura y composición molecular (van Meer, Voelkner, y Feigenson, 2008):
(1) Glicerofosfolípidos: constituyen el principal componente estructural de las membranas de las células eucarióticas. Son lípidos como la fosfatidilcolina, que supone más del 50%
de todos los fosfolípidos de membrana, la fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol, o el ácido fosfatídico. Su parte hidrófoba es un diacilglicerol que contiene ácidos grasos saturados o insaturados de longitud variable. En medio acuoso, los fosfolípidos orientan sus cabezas hidrofílicas hacia el exterior, mientras que las
cadenas de los ácidos grasos evitan el contacto con el agua orientándose en el sentido opuesto. En el agua, estos lípidos forman espontáneamente bicapas lipídicas.
(2) Esfingolípidos: su parte hidrófoba es una ceramida. Los principales esfingolípidos en las células de mamíferos son la esfingomielina y los glucoesfingolípidos como los gangliósidos. Aunque son un componente minoritario de la membrana celular, tienden a acumularse en la monocapa externa de algunas células, como la vaina de mielina que recurre los axones de las células neuronales (Sonnino y Prinneti, 2013).
(3) Esteroles: el colesterol es el esterol más importante en las células animales. Su proporción respecto a los lípidos totales varía en torno al 25% en la membrana plasmática y el 3% en las membranas mitocondrial y del retículo endoplasmático. Se localiza en el interior de la bicapa lipídica, unido a otros lípidos (principalmente esfingolípidos). Sus funciones principales dentro de la membrana giran en torno a la modulación de la fluidez.
La composición de lípidos varía entre la membrana citoplasmática y los diferentes compartimentos endoplasmáticos de la célula. Por ejemplo, en cuanto al colesterol, el porcentaje respecto al total de lípidos que encontramos en la membrana plasmática (≈25%) es mayor que el que podemos cuantificar en el aparato de Golgi (≈8%), en el retículo endoplasmático rugoso (≈6%) o en la mitocondria (≈3%). Esto significa que deben existir mecanismos de segregación por compartimentos de los diferentes tipos de lípidos de membrana (Meza et al., 2010).
La distribución de los lípidos en las membranas biológicas es fundamentalmente asimétrica (figura 5: Meza et al., 2010). Mientras que la monocapa externa de la membrana plasmática está compuesta principalmente por fosfatidilcolina y esfingomielina, la monocapa interna se constituye preferentemente por fosfatidilserina y fosfatildiletanolamina. Esta asimetría es posible gracias a la transferencia espontánea de lípidos entre las monocapas, la actividad de ATP-asas transportadoras de lípidos y la retención específica de especies en una u otra monocapa. La distribución característica de los lípidos dentro de la bicapa crea un reparto desigual de cargas entre ambas superficies, lo que será determinante en la aparición del potencial de membrana. Podemos destacar también otras consecuencias de esta asimetría, como el uso citoplasmático del fosfatidilinositol como segundo mensajero, al ser escindido por ciertas fosfolipasas en la capa interna de la membrana, o la mayor predisposición de la monocapa interna a formar vesículas hacia el citosol,
dada su curvatura. La distribución asimétrica de los lípidos es especialmente relevante en el aparato de Golgi, mientras que no se aprecia en otros compartimentos como el retículo endoplásmico (van Meer et al., 2008). La distribución del colesterol no está claramente definida, y puede que su aparente homogeneidad sea consecuencia de su rápida transferencia entre ambas monocapas (Ikonen, 2008).
FIGURA 5. Asimetría lipídica en la membrana plasmática
Proteínas
Las proteínas son otro de los componentes esenciales de las membranas biológicas.
Generalmente presentan un ratio molecular proteínas-lípidos de 1:40 (Dupuy y Engelman, 2008), aunque es muy variable entre las diferentes estructuras celulares. Así, encontramos una composición del 75% de proteínas en la membrana mitocondrial interna, mientras que en la membrana mielínica no alcanza el 20% (Reiner et al., 2010). Debido a la gran complejidad de las proteínas de membrana, una tercera parte de nuestros genes se encargan de su codificación (Honigmann y Pralle, 2016).
En función de su grado de inclusión en la membrana, podemos distinguir proteínas integrales y proteínas periféricas. Las primeras están completamente embebidas en la membrana y realizan diversas funciones como adhesión, intercambio de iones, transporte activo o comunicación celular. Las proteínas periféricas, por su parte, están parcialmente unidas a una de las monocapas, bien a la externa mediante anclas lipídicas de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o la integración de su
secuencia de aminoácidos entre los fosfolípidos de la monocapa, bien a la monocapa interna a través de procesos de acilación y prenilación en los que intervenienen los ácidos grasos o la interacción eléctrica con las cabezas lipídicas (Zacharias et al., 2002).
Hidratos de carbono
Los glúcidos son el tercer componente esencial de las membranas biológicas, siendo más abundantes en la membrana plasmática, concretamente en su monocapa externa formando el glicocálix. Se unen covalentemente a lípidos y a proteínas dando lugar respectivamente a glicolípidos y a glicoproteínas. Los glicoesfingolípidos son los glicolípidos más abundantes en las células, aunque suponen apenas un 5% del total de lípidos. Por su parte, la práctica totalidad de las proteínas contienen glúcidos unidos. También podemos encontrar proteoglicanos que insertan sus cadenas de aminoácidos en la membrana, quedando los polímeros de glicosaminoglucanos hacia el exterior. Las principales funciones de los hidratos de carbono son el reconocimiento y la unión intercelular, además de contribuir a la estructura celular.
Fluidez de membrana
Desde la conceptualización de la membrana plasmática como mosaico fluido por Singer y Nicolson en 1972, la fluidez de membrana se convirtió en uno de los ejes centrales de la investigación en este ámbito. Este parámetro es uno de los más relevantes en el estudio del papel de las membranas biológicas en el envejecimiento celular (García et al., 2014).
La fluidez de una membrana es la capacidad de movimiento de las moléculas que la forman para desplazarse en ella. La viscosidad, por su parte, representa la característica opuesta, y nos proporciona información sobre el orden molecular. La fluidez es mayor en la monocapa externa que en la interna, y presenta en ambas un gradiente creciente de la periferia hacia el centro (Schachter et al., 1983).
Los fosfolípidos de la membranas biológicas pueden realizar diferentes tipos de movimientos dentro de la bicapa, representados en la figura 6 (García et al., 2014), aunque están sometidos a restricciones como las interacciones con otras moléculas de la membrana.
Principalmente pueden desplazarse mediante difusión lateral en el plano de membrana y flip-flop o desplazamiento saltatorio a la monocapa enfrentada. También se producen movimientos de rotación
sobre el eje longitudinal y de flexo-extensión respecto a las cabezas. El mecanismo de flip-flop es relativamente infrecuente, debido a la dificultad de la cabeza polar de los fosfolípidos para atravesar el núcleo hidrofóbico de la bicapa. Sin embargo, el colesterol puede realizar este movimiento con relativa facilidad (García et al., 2014; Honigmann, 2016).
FIGURA 6. Movimientos de los fosfolípidos en la bicapa lipídica. A. Flip-flop. B. Difusión lateral.
C. Rotación. D.Flexo-extensión.
El colesterol es el principal lípido modulador de la fluidez de membrana, y en función de la fase en la que se encuentren las cadenas aciladas a las que se incorpora, puede actuar en un doble sentido. Según el estado de las cadenas aciladas, se distinguen diferentes fases en las que se pueden empaquetar los lípidos de la membrana: fase líquido ordenado (cadenas aciladas ordenadas, fluidez intermedia), fase líquido desordenado (cadenas aciladas desordenadas, fluidez alta) y fase cristalina (cadenas aciladas en estado sólido, fluidez baja). Si el colesterol se incorpora a regiones en fase líquido desordenado aumentará la viscosidad del conjunto, mientras que si lo hace sobre fases cristalinas, se producirá una disminución de la misma (Simons y Val, 2004). Las moléculas de colesterol se sitúan intercaladas entre los fosfolípidos, paralelas a su eje transversal con sus cabezas polares orientadas hacia a región hidrofílica de la barrera lipídica. Las principales consecuencias del aumento de viscosidad de la membrana son el incremento de su grosor, la reducción de su permeabilidad a compuestos hidrofílicos y la segregación de algunos de sus componentes (Meza et al., 2010).
El grado de saturación de las cadenas aciladas que conforman los fosfolípidos es otro factor determinante en la fluidez de membrana. La parte hidrofóbica de este tipo de lípidos se compone de dos cadenas hidrocarbonadas que habitualmente son ácidos grasos, de igual o diferente longitud.
Generalmente una de las cadenas es insaturada, presentando dobles enlaces cis, siendo la otra
saturada, sin dobles enlaces. La presencia de dobles enlaces dificulta el establecimiento de interacciones de la cadena insaturada con los ácidos grasos contiguos, lo que se traduce en un aumento de la fluidez de la membrana. La longitud de la cadena hidrocarbonada también influye en la fluidez. Así, una cadena larga facilitará el empaquetamiento junto a los lípidos colindantes y producirá un descenso en la fluidez de membrana. Tanto la relación ácidos grasos saturados/insaturados como colesterol/fosfolípidos se han utilizado como indicadores de la fluidez de membrana en diferentes estudios (Shinitzky, 1984). En la figura 7 se observa la diferente estructura que presentan los ácidos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados (Lehninger, 2006).
FIGURA 7. Estructura de los ácidos esteárico (A), saturado, oleico (B) y linoleico (C ), monoinsaturado y poliinsaturado respectivamente (Lehninger, 2006)
Otros factores que influyen en la fluidez de membrana son la densidad proteica de la membrana, que aumenta la viscosidad de la misma, o la presencia de moléculas anfipáticas como esteroides, vitaminas, anestésicos o barbitúricos. Cabe destacar el papel de la temperatura, implicada en las transiciones de fase. El descenso en la misma produce el paso de la fase líquido desordenado a cristalina, con la consiguiente pérdida de fluidez de la membrana. A menor longitud e insaturación de las cadenas hidrocarbonadas, menor es la temperatura a la que se produce la transición de fase (García et al., 2014; Shinitzky, 1984).
Los cambios en la fluidez de membrana están fuertemente implicados en multitud de funciones celulares como la supervivencia, la diferenciación, la muerte celular o la actividad de las proteínas de membrana (García et al., 2014).
Balsas de membrana y compartimentalización celular
Como consecuencia de la fluidez de la bicapa lipídica, los componentes de las membranas biológicas se disponen en una distribución lateral heterogénea. Esto lleva a la aparición de estructuras que difieren en cuanto a su composición lipídica y/o proteica de la membrana circundante, denominados dominios de membrana (Linder y Naim, 2009). La existencia de estas áreas de diferenciación con respecto a la composición y arquitectura moleculares está en conexión con las múltiples funciones de la membrana biológica, que además de actuar como frontera entre diferentes compartimentos, debe servir como un andamio para organizar interacciones moleculares diversas, conectar los diferentes espacios que ella misma compartimenta, o intervenir en la transducción de señales (Sonnino y Prinetti, 2013).
Esta idea de que los lípidos organizan dominios en las membranas biológicas fue desarrollada por Simons y van Meer para explicar la diferente composición de las membranas apical y basolateral de las células epiteliales polarizadas, proporcionándoles las bases para la hipótesis de las balsas o microdominios lipídicos. En este modelo se plantea la constitución de microdominios de esfingolípidos en la monocapa luminal del aparato de Golgi, donde se encargarían del reclutamiento de proteínas destinadas a incorporarse a la monocapa externa de la membrana apical de dichas células (Simons y van Meer, 1988). Posteriormente, será incluido el papel del colesterol, de manera que los complejos esfingolípidos-colesterol se mantendrían empaquetados, comportándose como balsas lipídicas o unidades dentro de la monocapa externa de la membrana plasmática (Simons e Ikonen, 1997). Esta organización especializada se demostrará más adelante en la monocapa citoplasmática.
Hoy en día se prefiere hablar de balsas de membrana, cuya definición fue consensuada en el Simposio de Keystone (2006) de la siguiente manera: Las balsas de membrana son dominios pequeños (10-200 nm), heterogéneos, altamente dinámicos, ricos en esteroles y esfingolípidos, que compartimentan procesos celulares. Estas pequeñas balsas pueden ser a veces estabilizadas para formar plataformas de mayor tamaño a través de interacciones proteína-proteína y proteína-lípido (Pike, 2006). En esta nuevo concepto es importante destacar que tanto proteínas como lípidos contribuyen en conjunto a la formación de estos microdominios y que estos aparecen no solo en la membrana citoplasmática, sino en otras estructuras como la membrana mitocondrial. Además, aunque se acepta la riqueza en colesterol y esfingolípidos como una característica de las balsas de membrana, es posible encontrar bajas concentraciones de colesterol en algunas membranas
intracelulares (Pike, 2006).
FIGURA 8. Tipos de balsas de membrana
Se conocen dos tipos de balsas de membrana: las balsas planas y las cavéolas (figura 8:
Meza et al., 2010). Las primeras se sitúan en el plano de la membrana, y se caracterizan por su pequeño tamaño (10-200 nm) y gran dinamismo. Las cavéolas, a su vez, son invaginaciones de la membrana plasmática (de 50-100 nm de diámetro) asociadas a las caveolinas, unas proteínas de soporte que estabilizan su estructura y sirven de andamiaje para diversos mecanismos de señalización y como transportadores de colesterol del retículo endoplasmático a la membrana. En las neuronas se han detectado unas proteínas que podrían ser análogas a las caveolinas, las flotilinas (Allen et al., 2007).
En cuanto al papel que pudieran tener las proteínas transmembrana en la segregación de estos dominios específicos, se han propuesto varias hipótesis, desde argumentos termodinámicos señalando la baja probabilidad de encontrarlas insertas en las balsas de membrana (Fastenberg et al., 2003), hasta ser consideradas un factor clave en la distribución de estos microdominios, como una condición indispensable para promover su funcionalidad (Simons y Vaz, 2004). Otra posibilidad es que estas proteínas transmembrana se localicen en la frontera común entre las regiones desordenadas y las balsas de membrana (Meza et al., 2010).
1 Fosfolípidos 2 Colesterol
3 Proteínas ancladas a GPI
4 Esfingomielina 5 Proteínas periféricas aciladas
6 Proteínas transmembranales aciladas
7 Proteínas preniladas
8 Proteínas
transmembranales 9 Caveolina
Estrés oxidativo
Radicales libres y estrés oxidativo
El oxígeno es una molécula esencial en la vida de los organismos aerobios requerida en el metabolismo mitocondrial. Dentro de las células, más del 90% del oxígeno se utiliza en la cadena respiratoria por la enzima citocromo-oxidasa mitocondrial para producir adenosín trifosfato (ATP), principal fuente de energía celular. A pesar de esto, el oxígeno es potencialmente tóxico, ya que debido a su estructura atómica un pequeño porcentaje del mismo es responsable de la producción de sustancias que interaccionan de manera perniciosa con las biomoléculas de nuestro organismo causando lesión celular. Es lo que se conoce como paradoja del oxígeno. Estas sustancias derivadas del metabolismo aerobio se denominan radicales libres (Reiter, 1995).
Desde un punto de vista puramente químico, los radicales libres son aquellas especies químicas que presentan en su estructura atómica un electrón desapareado en su orbital más externo, lo que les confiere una gran inestabilidad electrónica. Son muy reactivos, tienen una vida media muy corta y actúan cerca del sitio en que se forman, lo que dificulta su estudio (Cheesman y Slater, 1998). Las reacciones que involucran radicales libres se clasifican en reacciones de iniciación, en cuyo transcurso se genera un radical libre o centro de reacción; de propagación, donde se conserva el número de radicales libres con formación de producto; de inhibición, en las que se conserva el número de radicales libres con desaparición de producto; y de terminación, en las cuales desaparecen dos radicales libres al combinar sus dos electrones desapareados (Rice y Herzfeld, 1934). Michaelis (1946) describió la reducción univalente secuencial del oxígeno como un mecanismo molecular de transferencia electrónica en cuatro pasos, con la formación de agua como producto final y de radical superóxido (O2·-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (·OH) como productos intermediarios (Boveris, 2005) [1].
[1] O2 → O2- → H2O2 → ·OH → H2O
A pesar de estos efectos negativos, también presentan diferentes funciones adaptativas en la fisiología humana, entre las cuales están la destrucción bacteriana, favorecer la síntesis de colágeno y de prostaglandinas, disminuir la síntesis de catecolaminas en las glándulas suprarrenales o favorecer la quimiotaxis (Venereo, 2002).
Especie reactiva de oxígeno (ERO) es un término más amplio que incluye tanto el concepto de radical libre como a otras especies químicas como peróxidos e iones derivados del oxígeno, que se forman de manera natural como subproducto del metabolismo normal del oxígeno en las células y que son precursores de los radicales libres. Las principales especies reactivas de oxígeno implicadas en el estrés oxidativo son el O2·-, el ·OH, el H2O2, el radical perhidroxilo (HO2-), el radical alcoxilo (·RO), el radical peroxilo (·ROO), el anión peroxinitrito (ONOO-), el oxígeno singlete (1O2), el ácido hipocloroso (HClO), el óxido nítrico (NO), el ozono (O3) o la semiquinona (Q).
Podemos definir el estrés oxidativo como la exposición de las células y tejidos del organismo a diversas fuentes que alteran el equilibrio entre factores oxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de eliminar las EROs, ya sea por un aumento exagerado de estas o por un déficit de las defensas. En consecuencia, se produce un daño estructural y funcional a nivel molecular, celular y tisular. De hecho, está ampliamente demostrada la contribución de las reacciones radicálicas, características de este daño oxidativo, en la patogénesis de enfermedades como la arteriosclerosis, la artritis reumatoide, el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas, la úlcera péptica e incluso el proceso de envejecimiento fisiológico (Paredes y Roca, 2002).
Las EROs proceden tanto del interior como del exterior celular. Dentro de las principales fuentes endógenas de estas especies químicas encontramos la cadena respiratoria, el metabolismo de los fagocitos (proteasas, lipasas, nucleasas), el sistema del citocromo P-450, y la acción de enzimas oxidantes como la xantina oxidasa, la indolamindioxigenasa, la ciclooxigenasa, la mieloperoxidasa, la galactosa oxidasa, la triptófano-dioxigenasa, la lipoxigenasa, la monoamino- oxidasa y la NADPH oxidasa. Dentro de las fuentes externas implicadas en la formación de ERO encontamos el tabaquismo (óxidos de nitrógeno y azufre del humo del tabaco), la exposición a las radiaciones ionizantes y a la luz solar, la contaminación ambiental (hidrocarburos, óxidos de nitrógeno) y el shock térmico (Harman, 2001; Venereo, 2002). A pesar de las múltiples fuentes de las que pueden provenir estas sustancias, la principal vía de producción de radicales libres en los sistemas biológicos es la respiración celular mitocondrial (McCord y Ormar, 1993).
Podemos clasificar las especies reactivas del oxígeno de la siguiente forma (Diplock, 1991):
• Radicales libres inorgánicos o primarios: se originan al transferir un electrón sobre el átomo de oxígeno (O2·-, ·OH).
• Radicales libres orgánicos o secundarios: el electrón se transmite de un radical primario a un átomo de una molécula orgánica, o bien dos radicales primarios reaccionan entre sí (átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre que forman parte de las biomoléculas).
• Intermediarios estables relacionados con los radicales libres de oxígeno: incluimos aquí a aquellas especies químicas generadoras de radicales libres o resultantes de su metabolismo (H2O2, 1O2, HClO).
Las sustancias oxidantes pueden actuar sobre cualquier molécula del organismo, aunque algunas presentan una mayor sensibilidad que otras a esta acción. Así, encontramos que los lípidos de membrana, las proteínas y los ácidos nucleicos son las biomoléculas más proclives a los efectos de las especies reactivas.
• Los lípidos son las macromoléculas más fácilmente afectadas, y pueden sufrir un proceso conocido como peroxidación lipídica, principalmente en las estructuras ricas en ácidos grasos poliinsaturados. En estas zonas se altera la permeabilidad de la membrana celular produciéndose edema y muerte celular. Una vez iniciado el proceso, se produce una reacción en cascada que lleva a la formación de peróxidos orgánicos a partir de los ácidos grasos insaturados, altamente tóxicos para la célula (Cadenas, 1997).
• En las proteínas se produce la oxidación de determinados aminoácidos (fenilalanina, tirosida, metionina, histidina), además de entrecruzamientos de cadenas peptídicas y formación de grupos carbonilos (Venereo, 2002).
• El ADN, por su parte, sufre mutaciones, pérdida de expresión proteica por el ataque a genes específicos, delecciones, reordenamientos cromosómicos, activación de genes por desmetilación de citosinas, fragmentaciones, o modificaciones de las bases (Fraga et al., 1990).
Antioxidantes
En el medio interno de los organismo aerobios encontramos diferentes sustancias que tienen por objeto neutralizar los efectos perjudiciales que las EROs producen sobre los tejidos. Son los
antioxidantes. Su principal función es interactuar más rápido con los radicales libres que las biomoléculas del organismo. Así, sacrifican su propia integridad molecular para evitar la modificación dañina de otras moléculas funcionalmente imprescindibles (Reiter, 1995). Pueden ejercer su acción a nivel intracelular (superóxido dismutasa, catalasa), extracelular (ceruloplasmina, vitamina C), o en la membrana plasmática (vitamina E, betacarotenos), y su origen puede ser tanto endógeno como exógeno (Venereo, 2002). Los principales antioxidantes endógenos pueden ser enzimáticos, como la catalasa, la superóxido dismutasa (SOD), el sistema glutation, y la glucosa fosfato deshidrogenasa (NADPH-asa), o no enzimáticos, como el glutation, el NADPH, los tocoferoles (vitamina E), el ácido ascórbico (vitamina C), los carotenos (albúmina, ceruloplasmina y ácidos grasos) y la melatonina. Los antioxidantes exógenos son principalmente el etanol, la etildilmetililourea, el dimetilsulfóxido (DSO), o la N-acetilcisteína (Paredes y Roca, 2002).
Dado que el principal lugar de producción de EROs dentro del organismo humano es la cadena respiratoria mitocondrial, resulta evidente concluir que los principales mecanismos antioxidantes deberán localizarse en el interior de la célula. Allí encontramos importantes sistemas enzimáticos que neutralizan la toxicidad del oxígeno:
• Superóxido dismutasa (SOD). La SOD es una familia de metaloproteínas encargadas de acelerar la conversión del O2·- en H2O2 [2]. De esta forma, se evita tanto la acción directa del radical sobre las moléculas biológicas como su interacción con metales como el hierro (Fe), que catalizan el aumento en la producción de ·OH (Fridovich, 1983). Las isoformas que contienen cobre y cinc en su sitio activo (Cu-SOD y Zn-SOD, respectivamente) se encuentran en el citosol y en el espacio intermembranoso mitocondrial, mientras que la que contiene manganeso (Mn-SOD), es detectable en la matriz mitocondrial (Venereo, 2002).
[2] 2 O2- + 2 H+ → H2O2 + O2
• Catalasa (CAT). La podemos encontrar en la mitocondria, los peroxisomas e incluso en el citosol de algunas células. La CAT está involucrada en la descomposición del peróxido de hidrógeno (H2O2) mediante sus funciones catalítica [3] y peroxidativa [4] (Céspedes, Hernández y Llópiz, 1996).
[3] 2 H2O2 → 2 H2O + O2
[4] H2O2 + H2R → 2 H2O + R
La importancia de la superóxido dismutasa y la catalasa fue puesta de manifiesto en el denominado dogma de Fridovich, que afirma que ambas constituyen el principal mecanismo de defensa antioxidante de las células aerobias contra la toxicidad del oxígeno, produciendo un efecto sinérgico al eliminar el O2·- y el H2O2 de los sistemas biológicos (Fridovich, 1975). El dogma de Fridovich, aplicado al metabolismo bacteriano, dio lugar a la distinción entre bacterias aerobias (contienen SOD y CAT), anaerobias (no continen ni SOD ni CAT) y micro-aerófilas (contienen SOD pero no CAT) (McCord et al., 1971).
• Glutation peroxidasa (Gpx). La GPx es una enzima selenio-dependiente que cataliza la reducción del H2O2 y de los lipoperóxidos (L-OOH), utilizando para ello el glutation reducido (GSH). Parece tener una distribución ubicua, y existe en sus formas intracelular (GPx-c), extracelular (Gpx-p) [5], y con actividad específica sobre la membrana (Gpx-PH) [6] (Cisneros, Pupo y Céspedes, 1997).
[5] H2O2 + 2 GSH → GSSG + 2H2O
[6] PHL-OOH + 2GSH → PHL-OH + H2O + GSSG
• Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). Se encuentra en el citoplasma de todas las células del organismo, siendo su déficit más marcado en algunas células como los eritrocitos (favismo). Su principal función es la génesis de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH), imprescindible para el mantenimiento de los niveles de glutation reducido (GSH) y para la actividad de la enzima metahemoglobina reductasa. El NADPH también interviene en la síntesis del colesterol y los ácidos grasos (Bonilla et al., 2007).
También encontramos mecanismos antioxidantes no enzimáticos, tanto endógenos como exógenos:
• Vitamina E. Es un lípido isoprenoide sustituido que forma parte de la familia de los tocoferoles. Constituye una de las primeras barreras en la peroxidación de los ácidos grasos poliinsaturados, y se encuentra de manera abundante en las membranas plasmática, mitocondrial y del retículo endoplasmático. Interrumpen la cadena radicálica al transferir el átomo de hidrógeno de su grupo fenólico a un radical peroxilo libre, dando lugar a un radical fenoxilo [7] que participará en reacciones intermedias hasta dar lugar a un producto final no tóxico [8]. Actúa sinérgicamente con el selenio (Benítez, 2006).
[7] ROO· + Tocoferol-OH → ROOH + tocoferol-O [8] ROO· + Tocoferol-O → ROOH + radical no libre
• Vitamina C. También denominada L-ascorbato, es un derivado ácido de la glucosa. Entre sus acciones esenciales se encuentran la inhibición de radicales superóxido durante la digestión y la reducción de los radicales fenoxilo resultado de la actividad de la vitamina E (Benítez, 2006).
• Melatonina. En los últimos años ha aumentado el interés por el estudio del papel antioxidante de esta molécula, una indolamina producida mayoritariamente en la glándula pineal, pero que se encuentra y genera en múltiples tejidos del organismo como los ovarios, los testículos, la médula ósea, el intestino, la placenta o el hígado. La melatonina reduce el estrés oxidativo a través de distintos mecanismos. Principalmente es capaz de neutralizar una gran variedad de especies reactivas de oxígeno en una cascada de interacciones que comienzan con su acción sobre el ·OH. En esta cascada de reacciones se producen diferentes metabolitos que neutralizan otros radicales libres. Además, neutraliza el ONOO-, el H2O2, el O2··, el 1O2 y otras especies reactivas, y puede actuar como un antioxidante indirecto al estimular o inhibir la expresión y la actividad de enzimas antioxidantes y pro-oxidantes, respectivamente.
FIGURA 9. Cascada antioxidativa de la melatonina
En la cadena respiratoria, estimula los complejos I y IV, reduciendo la pérdida electrónica y, por consiguiente, la producción de radicales libres, y contribuye a la produción de ATP en la mitocondria manteniendo unos altos niveles de GSH. Una sola molécula de melatonina es capaz de neutralizar más de 8 radicales libres por sí sola (figura 9: García et al., 2014).
Efectos de los radicales libres sobre las membranas biológicas y su papel en el envejecimiento
Las especies reactivas de oxígeno pueden actuar sobre todo tipo de biomoléculas del organismo. A pesar de que todos estos resultados son relevantes en la producción de daño y senescencia celular, en el presente trabajo nos centraremos en los efectos que estas sustancias producen sobre las membranas biológicas.
Respecto a la acción sobre la membrana, podemos destacar como elemento primordial en este binomio interactivo ERO-membrana el concepto de fluidez. La acción de los radicales libres se concretará en la modificación de la fluidez de las membranas biológicas de la célula, principalmente mediante un proceso conocido como peroxidación lipídica (García et al., 2014). Dada la evidencia que señala la pérdida de fluidez en las membranas como un factor determinante en el envejecimiento, podemos concluir que la peroxidación lipídica tendrá un importante papel en el envejecimiento fisiológico.
La peroxidación lipídica
Este proceso comienza con la sustracción de un átomo de hidrógeno de un ácido graso insaturado, generalmente por la interacción de este con un ·OH. Sin embargo, el proceso puede ser también iniciado por un O2·-, un HO2-, el H2O2, un ·OH, el 1O2 o el O3 (Kanner et al., 1987). Esta parte se denomina iniciación [9], y culmina con la formación de un radical lipídico alquilo centrado en el carbono (R·). A continuación se produce un reordenamiento de los dobles enlaces de la molécula lipídica, que pasan a estar conjugados, dando lugar a un dieno conjugado. Esto quiere decir que dejan de ser estructuras lipídicas naturales no conjugadas, es decir, con los dobles enlaces separados por un carbono intermedio que no participa de la estructura de insaturación (Sanhueza et al., 2002).
[9] RH + X· → R·
El siguiente paso en este proceso de denomina propagación [10] [11]. En este punto, el dieno conjugado interacciona con una molécula de oxígeno (O2) para formar un radical peroxilo (ROO·). Además de actuar directamente sobre receptores y enzimas intracelulares, los radicales peroxilo son capaces de sustraer un átomo de hidrógeno en las cadenas laterales de otros ácidos grasos poliinsaturados próximos, transformando a estos en nuevos radicales lipídicos alquilo (R·) y a sí mismos en hidroxiperóxidos lipídos (ROOH·).
[10] R· + O2 → ROO·
[11] ROO· + RH → ROOH + R·
Este proceso se retroalimenta y continúa en el tiempo, pudiendo afectar a gran cantidad de lípidos de membrana que se transforman en peróxidos lipídicos. El ciclo termina cuando dos ROO·
interaccionan entre sí en la fase de terminación [12], dando lugar a un producto no radical, generalmente un peróxido lipídico (García et al., 2002; Reiter, 1995). La terminación puede darse también por la interacción del radical lipídico con una molécula antioxidante (Kanner et al., 1987).
[12] 2 ROO· → polímeros no radicales
Merece especial interés el papel del hierro (Fe) y el cobre (Cu) en la peroxidación lipídica, ya que ambos iones catalizan la formación de especies reactivas como el ·OH, con capacidad para iniciar el proceso. En la denominada reacción de Fenton [13], el hierro en estado ferroso interacciona con una molécula de peróxido de hidrógeno en un proceso que da lugar a la producción de ·OH. Además, estos metales pueden reaccionar con los hidroxiperóxidos lipídicos estables resultantes y descomponerlos en radicales peroxilo (ROO·) y alcoxilo (RO·), iniciando una nueva cascada de peroxidación lipídica (Niki et al., 1993).
[13] Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + ·OH
Los hidroxiperóxidos lipídos son también degradados en hidrocarburos, alcoholes, éteres, epóxidos y aldehídos, algunos de los cuales producen por sí mismos efectos perjudiciales sobre diferentes biomoléculas del organismo. Así, podemos señalar el papel del malondialdehído (MDA) o del 4-hidroxi-alqueno (4-HDA), con capacidad para crear enlaces cruzados en fosfolípidos, proteínas y el ADN (Enterbauer y Cheeseman, 1990). Cabe destacar que los radicales lipídicos pueden sustraer átomos de hidrógeno de proteínas adyacentes, modificando así la estructura y la
función de las proteínas de membrana (García et al., 2014). En definitiva, este proceso de peroxidación lipídica de las membranas celulares desata una cascada de reacciones que llevan al aumento de la concentración de radicales peroxilo e hidroxiperóxidos lipídicos así como de subproductos del metabolismo de estas sustancias, como el MDA y el 4-HDA, altamente tóxicos para las macromoléculas celulares. En la figura 10 se presenta un resumen del proceso de peroxidación lipídica (Mimica-Dukić, 2012)
FIGURA 10. Proceso de peroxidación lipídica
Para evitar la oxidación y descomposición de los hidroperóxidos lipídicos, las células poseen un complejo sistema de reducción de estas moléculas compuesto por diversas enzimas antioxidantes. Entre ellas destaca la glutation peroxidasa (Gpx), que reduce los hidroperóxidos residuales tanto a nivel intracelular como extracelular a expensas del glutation. A nivel intracelular están implicadas también la tioredoxin reductasa (TR), la peroxiredoxina 6 (Prx 6) y la glutation transferasa (GST). A nivel extracelular, destaca el papel de la selenoproteína P, la albúmina o las apolipoproteínas A-I, A-II y B-100 (Niki et al., 2005).
Consecuencias de la peroxidación lipídica sobre las membranas biológicas
Existe una amplia evidencia sobre el papel del estrés oxidativo en la pérdida de fluidez de las membranas biológicas. Para explicar este fenómeno se han propuesto varios mecanismos responsables (García et al., 2014; Curtis et al., 1984):
(1) Existe una reducción en el número de ácidos grasos poliinsaturados respecto al de saturados, dada la mayor afinidad de los radicales libres por los enlaces covalentes ricos en electrones
de las cadenas hidrocarbonadas insaturadas.
(2) La movilidad está limitada por el establecimiento de enlaces cruzados entre las moléculas lipídicas adyacentes de la membrana.
(3) El aumento de viscosidad se debe, entre otras cosas, a un aumento en la proporción de ácidos grasos de cadena corta.
Estas alteraciones bioquímicas en los ácidos grasos van acompañadas de cambios físicos en el orden molecular de las cadenas hidrocarbonadas de los fosfolípidos de membrana. Por lo tanto, los cambios producidos en la membrana biológica por la peroxidación lipídica llevarían a su disfunción a través de cambios en la fluidez. Se han documentado varias funciones de la membrana que estarían influenciadas por el orden molecular o fluidez de la bicapa, como son la permeabilidad selectiva, la actividad enzimática, la disponibilidad de receptores y el transporte iónico (Curtis et al., 1984).
Para determinar los cambios en el orden molecular que acompañan al proceso de peroxidación lipídica se ha utilizado, entre otras técnicas, la espectroscopia de resonancia de espín electrónico (ESR). El orden molecular se cuantifica con el parámetro S, relacionado indirectamente con el movimiento anisotrópico de un electrón desapareado de un marcador de espín de nitróxido sobre el eje perpendicular a la superficie de la membrana (Hubbel y McConnel, 1971). Se trata de cuantificar la desviación angular de las cadenas aciladas sobre dicho plano. En las bicapas lipídicas la simetría axial impuesta por las cadenas hidrocarbonadas es perturbada por la simple aparición de dobles enlaces. En estudios que han utilizado la espectroscopia ESR (Curtis et al., 1984) se ha evidenciado la depleción preferencial de ácidos grasos poliinsaturados y el aumento del porcentaje de ácidos grasos de cadena corta tras someter membranas microsomales de hígado de rata a una peroxidación NADPH-dependiente en presencia de ADP-Fe3+ como quelante. El ratio colesterol/fosfolípido no habría cambiado tras la peroxidación. El aumento en el orden molecular de las membranas microsomales fue atribuido a la formación de enlaces covalentes entre cadenas aciladas adyacentes. Otros estudios (Barton y Gunstone, 1975) han mostrado que las cadenas insaturadas son más móviles que las saturadas, y que en las membranas con ácidos grasos insaturados existe menos orden molecular que en las saturadas. También se ha evidenciado el papel lesional directo de aldehídos derivados de la peroxidación lipídica como el HNE y el MDA en el aumento de rigidez de la membrana (Chen y Yu, 1993).
El uso de otras técnicas para determinar la fluidez de membrana como el método de Yu ha generado resultados similares (Yu et al., 1992).
Estrés oxidativo, fluidez de membrana y envejecimiento
Una vez documentada la relación entre la peroxidación lipídica y las lesiones en los lípidos de las membranas biológicas que dan lugar a una pérdida en la fluidez de esta estructura, se hace necesario demostrar la relación entre el envejecimiento y el proceso de peroxidación, que estaría mediado por las alteraciones físico-químicas acaecidas en la membrana.
Para el estudio experimental del envejecimiento habitualmente se han utilizado modelos animales, debido a que el proceso de envejecimiento humano comparte muchas características con el de algunas especies. Así, el modelo basado en ratones de crecimiento acelerado (SAM) cumple con la mayoría de los criterios propuestos por Masoro (1990) para la utilización de modelos animales en el estudio del envejecimiento, como esperanza de vida corta, condiciones ambientales bien definidas, información sobre enfermedades relacionadas con la edad o características genéticas. Los SAM se diferencian en ratones propensos al envejecimiento acelerado (SAMP), con una esperanza de vida corta y signos de envejecimiento como pérdida de pelo, daños perioftálmicos o lordocifosis; y en ratones resistentes al envejecimiento acelerado (SAMR), con un proceso de envejecimiento normal (Takeda, 1999). Aunque no se conocen las causas por las que se acelera el envejecimiento en las cepas SAMP, se ha constatado que el estrés oxidativo incrementa los cambios degenerativos celulares asociados a la edad (Butterfield et al., 1998). Cabe destacar que para este tipo de estudios se ha tomado como referencia de estudio principalmente la membrana mitocondrial, debido a su mayor implicación en la producción de radicales libres durante el envejecimiento (Miquel, 1992).
El envejecimiento en sí mismo se ha asociado a incrementos estadísticamente significativos en los niveles malondialdehído (MDA) y de 4-hidroxialquenos (4-HDA), marcadores de estrés oxidativo, principalmente en el pulmón, el riñón y la piel en ratas SAMP, mientras que este aumento no ha aparecido en otros órganos como el páncreas, los testículos, el músculo o el cerebro de estos animales. Esto podría deberse a una mayor sensibilidad de determinadas células al daño oxidativo, y podrían existir diferencias entre órganos respecto a su capacidad antioxidativa (Reiter et al., 1999).
Utilizando el modelo SAM, se ha evidenciado que se produce un descenso en la fluidez de la
membrana mitocondrial en los ratones propensos al crecimiento acelerado (SAMP). También han sido identificados cambios en el ratio ácidos grasos insaturados/saturados en el envejecimiento, además de en enfermedades como el cáncer, la diabetes y diferentes patologías neurológicas y vasculares (García et al., 2011).
Todos estos resultados apoyan la teoría de Harman (1981, 1998, 2001) de que la degeneración que aparece con la edad es consecuencia del daño oxidativo en las macromoléculas del organismo. La peroxidación lipídica, desencadenada por especies reactivas producto de la utilización del oxígeno, tendría un importante papel en este proceso produciendo un marcado aumento de la rigidez de las membranas y alterando así una gran variedad de funciones celulares.
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