REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA
EVALUACIÓN DE LA COLONIZACIÓN VIRAL DE LA BOLSA DE
FABRICIO E INMUNOCOMPETENCIA EN GALLINAS PONEDORAS
INMUNIZADAS CON UNA VACUNA VECTORIZADA CONTRA LA
ENFERMEDAD DE GUMBORO.
Trabajo de Grado presentado para optar al grado de
Magíster Scientiarum en Microbiología
Autor: MV. María Virginia Briceño.
Tutor: Francisco A. Perozo. MV. MS. PhD.
Evaluación de la colonización viral de la bolsa de Fabricio e inmunocompetencia en gallinas ponedoras inmunizadas con una vacuna vectorizada contra la enfermedad de Gumboro. Autor:
M.V. Maria V. Briceño A. C.I: 15.406.071
Dirección: Res. Villa Delicias. Edif. Villa Clara I, apto 1D. Sector El Naranjal Correo electrónico: [email protected]
Firma: _______________
Tutor:
MV. MS. PhD. Francisco A. Perozo Marín. C.I: 9.445.013 Dirección: Mara Norte II Transversal. C Casa 5-164. Teléfono:+584246834045
Correo electrónico: [email protected]
DEDICATORIA
A mi mama y papa por ser los mejores padres del mundo. A mi familia por siempre brindarme su apoyo.
AGRADECIMIENTOS
A todo el personal docente y administrativo de la Maestría en Microbiología por brindarme su apoyo cuando más lo necesite.
ÍNDICE DE CONTENIDO Pag. Dedicatoria Agradecimiento Índice de contenido iv Índice de figuras v Índice de cuadros vi Resumen vii Abstract viii Introducción 1 Objetivos 5 Marco Teórico Reseña histórica de IBD 6
Importancia económica 8
Agente etiológico 9
Replicación 10
Diferencias antigénicas 11
Base molecular de la variabilidad de IBDV 12
Inmunidad e inmunosupresión de IBDV 12
Susceptibilidad del hospedador 14
Periodo de incubación y signos clínicos 14
Lesiones macroscópicas 15
Lesiones microscópicas 16
Diagnóstico. Aislamiento e identificación 16
Vacunas recombinantes 18 Marco Metodológico Localización 20 Población de estudio 20 Vacunas 20 Diseño Experimental 21 Criterios de eficacia 22
Serología la enfermedad de Gumboro y Bronquitis Infecciosa 22
Evaluación microscópica de la bolsa de Fabricio 23
Preservación de ácidos nucleícos del IBDV 24
Detección y caracterización molecular 25
Extracción de ARN 25 Amplificación 25 Secuenciación 26 Análisis Estadístico 26 Resultados y Discusión 32 Conclusiones 59 Bibliografía 60
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Improntas de las bolsas de Fabricio en las tarjetas FTA®. 24 Figura 2. Electroforesis en gel mostrando la amplificación del IBDV a partir de las muestras en tarjetas FTA®.
32
Figura 3. Árbol filogenético indicando las cepas de IBDV identificadas entre sí, con cepas clásicas y variantes conocidas
37
Figura 4. Árbol filogenético indicando correspondientes al grupo TRADICIONAL en la semana 4.
38
Figura 5. Árbol filogenético indicando correspondientes al grupo TRADICIONAL
en la semana 7. 39
Figura 6. Árbol filogenético correspondientes al grupo VECTORIZADO en la semana 7.
40
Figura 7. Árbol filogenético correspondientes al grupo TRADICIONAL y VECTORIZADO en la semana 10.
41
Figura 8. Comparación de las medias corregidas del peso del bazo versus la curva de regresión.
47
Figura 9. Comparación de las medias corregidas del peso de la bursa versus la
curva de regresión. 47
Figura 10. Comparación de las medias corregidas del índice peso de la
bursa-peso corporal versus la curva de regresión. 48
Figura 11. Comparación de las medias corregidas del índice peso de la bursa-peso bazo versus la curva de regresión.
48
Figura 12. Relación peso bursa/peso bazo. 44
Figura 14. Porcentaje de las bolsas de Fabricio con un grado ≥2 de depleción linfoide colonizadas por la cepa S706 en los grupos evaluados.
50
Figura 15. Corte histológico referencial de una Bolsa de Fabricio normal
mostrando una lesión grado 0. 51
Figura 16. Corte histológico referencial de una Bolsa de Fabricio mostrando una
lesión grado 2. 52
Figura 17. Corte histológico referencial de una Bolsa de Fabricio mostrando una
lesión grado 3. 52
Figura 18. Gráfica de los títulos de anticuerpos contra la Enfermedad de Gumboro en las aves correspondientes a los dos grupos evaluados.
55
Figura 19. Gráfica de los títulos de anticuerpos contra la Enfermedad de Bronquitis Infecciosa en las aves correspondientes a los dos grupos evaluados.
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Cronograma de toma de muestreos. Cada día se seleccionaron al azar 10 aves por grupo. La X denota que se realizo el muestro correspondiente.
21
Cuadro 2.Prueba de esfericidad y la condición Huymh-Feldt de las variables peso del bazo, peso de la bursa, diámetro de la bursa, índice peso bursa-peso corporal, índice peso bursa-peso bazo, peso vivo.
29
Cuadro 3. Criterio de información de Akaike (AIC) y Bayesiano de Schwarz
(BIC) según la estructura de covarianza para la selección del modelo matricial. 30
Cuadro 4. Análisis de la varianza de las variables dependientes peso del bazo, peso de la bursa, diámetro de la bursa, índice peso bursa-peso corporal, índice peso bursa-peso bazo, peso vivo, de aves para las variables independientes tratamiento, semanas de vida y la interacción tratamiento x semanas de vida utilizando la estructura matricial de varianza-covarianza del error.
31
Cuadro 5. Reporte de la colonización de la Bolsa de Fabricio por IBDV mediante la prueba de RT-PCR La nomenclatura se corresponde a: FTA-2, FTA-3 y FTA-5 para el grupo TRADICIONAL. Mientras que los ítems FTA-1, FTA-4 y FTA-6 para el grupo VECTORIZADO.
32
Cuadro 6. Análisis de la secuencia de aminoácidos de las muestras evaluadas mostrando la cepa a la cual son más similares, así como también el porcentaje de similitud con otras cepas.
Cuadro 7. Porcentaje de identidad y divergencia de la secuencia predeterminada de aminoácidos de la región hipervariable de la proteína VP2 de las cepas de IBDV (+) identificadas de los grupos estudiados.
42
Cuadro 8. Valores de F de los contrastes ortogonales de las medias mínimas cuadráticas de las variables dependientes peso del bazo, peso de la bursa, diámetro de la bursa, índice peso peso corporal e índice peso bursa-peso bazo por los periodos de observación ajustada utilizando la estructura matricial de varianza-covarianza del error correspondiente a la toeplitz y autoregresiva heterogénea tipo 1 afectadas por el tratamiento.
Cuadro 9. Valores F de los contrastes ortogonales de las medias mínimas cuadráticas y ecuaciones de regresión de las variables dependientes peso del bazo, peso de la bursa, diámetro de la bursa, índice peso bursa-peso corporal e índice peso bursa-peso bazo por tratamiento durante el periodo de observación ajustada utilizando la estructura matricial de varianza-covarianza del error correspondiente a la a la toeplitz y autoregresiva heterogénea tipo 1.
Maria Virginia Briceño Álvarez. Francisco A. Perozo M. Evaluación de la colonización viral de la bolsa de Fabricio e inmunocompetencia en gallinas ponedoras inmunizadas con una vacuna vectorizada contra la enfermedad de Gumboro. Trabajo de Grado presentado para optar al grado de Magister Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de estudios para graduados. Maestría en Microbiología. Maracaibo, Venezuela, 2010. p.68
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la colonización viral de la Bolsa de Fabricio e inmunocompetencia en gallinas ponedoras vacunadas contra la enfermedad infecciosa de la bolsa IBD, (por sus siglas en ingles Infectious Bursal Desease) usando una vacuna vectorizada de herpesvirus de pavo (HVT) para expresar la VP2 del virus causante de la IBD. Se partió de una población total de 15.150 aves de la raza Isa Brown divididas en dos grupos de 7.575 aves alojados bajo igualdad de condiciones; difiriendo solo en el plan de vacunación contra IBD. A un grupo se les aplicó al día de edad por vía subcutánea la vacuna vectorizada (grupo VECTORIZADO) y fue comparado durante el período de cría con el grupo al que se le aplicó una vacuna viva intermedia los día 8 y 18 de edad (grupo TRADICIONAL). Se realizaron muestreos al día 1, semana 2, 4, 7 y 10 realizándose evaluaciones de los indicadores morfométricos de inmunocompetencia, de la respuesta serológica a las vacunaciones rutinarias contra virus respiratorios, así como el análisis histopatológico de las lesiones presentes en las bolsas de Fabricio y la caracterización molecular de los virus colonizando la misma en distintos momentos. Los indicadores morfométricos de inmunocompetencia del grupo VECTORIZADO fueron significativamente mayores en comparación con el grupo TRADICIONAL, efecto que correlaciona con el menor índice de las lesiones observadas en las bolsas, sugiriendo un mejor estatus inmunológico. En la cuarta semana se detectó molecularmente la colonización viral de la bolsa en el grupo TRADICIONAL hecho que no ocurrió en el grupo VECTORIZADO, sugiriendo protección conferida por la vacuna en un punto crítico de la patogenia del virus. Los resultados de esta primera evaluación del uso de una vacuna vectorizada contra IDBV en aves ponedoras comerciales en Venezuela, demostró la factibilidad del uso de éste organismo genéticamente modificado en programas de control contra la IDB.
Palabras clave: enfermedad de Gumboro, colonización de la bolsa de Fabricio, aves ponedoras de huevos de consumo, caracterización molecular, vacunas vectorizadas.
Maria Virginia Briceño Álvarez. Francisco A. Perozo M. Evaluation of the Bursa of Fabricio viral colonization and inmunocompetence in commercial layers immunized with a vector vaccine against Gumboro disease. Work presented as a requirement for the Master in Microbiology program at experimental sciences graduate school in the Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela, 2010. p. 68
ABSTRACT
The objective of this work was to assess the viral colonization and the inmunocompetence of commercial layers vaccinated against infectious bursal disease (IBD) using a turkey herpesvirus (HVT) vector vaccine expressing the infectious bursal disease virus (IDBV) viral protein 2 (VP2). From an initial population of 15.150 ISA-Brown layers two groups of 7.575 birds were housed under equal conditions, differing only in the IBD vaccination program. One group, received at day one by the subcutaneous route the vector vaccine (VECTOR group) and compared along rearing and production with the same amount of birds vaccinated at days 7 and 18 with an intermediate live IBDV vaccine (TRADITIONAL). Samples were taken at day 1 and 2, 4, 7 and 10 weeks of age. The vaccination efficacy criteria included morphometric histopathology and molecular detection and characterization of viruses colonizing the Bursa at different time points. Significantly higher morphometric indexes, which correlated to lower bursal lesions, were observed in the VECTOR group when compared with the TRADITIONAL group, suggesting a better immune status when compared with the live vaccines programs. Molecular analysis at four weeks of age detected field strains only in the TRADITIOANL group, suggesting protection against field viruses at critical point for IDBV infection. The results of this first evaluation of an IDBV vector vaccine for commercial layers in Venezuela demonstrated the feasibility of using this genetically modified organism in the Gumboro disease vaccination and control programs for commercial layers.
Key words: infectious bursal disease, colonization of the bursa of Fabricius, molecular characterization, vector HVT-IBDV vaccines.
INTRODUCCIÓN
El sector avícola reconoce la inmunosupresión como un problema que parece ir en aumento en la producción intensiva de aves. Los virus que afectan el sistema inmune son los agentes infecciosos primarios responsables de los problemas de inmunosupresión en la avicultura comercial (Balamurugan y Kataria. 2006). La inmunosupresión en las aves es un síndrome clínico consistente con la disminución o ausencia de células linfoides, denominado depleción linfoide (Soto. 1996). Dicha condición es inducida por diferentes factores que se pueden clasificar entre otros como: a) agentes no infecciosos: drogas, antibióticos, temperatura ambiental, estrés en general, micotoxinas inmunosupresoras por excelencia; b) agentes infecciosos: virus, como el de las enfermedades de Marek, Gumboro, Reovirus, Anemia infecciosa aviar y/o Newcastle, o en su defecto toxinas bacterianas (Perozo y col. 2004).
Una disfunción temporal o permanente del sistema inmunitario afecta al ave en su capacidad de sintetizar anticuerpos, sustancias humorales (citocinas, interferon y proteínas del sistema complemento), afectando el número y funcionalidad de los glóbulos blancos, disminuyendo la capacidad quimiotáxica y fagocítica de heterófilos, monocitos y macrófagos (Dohms y col. 1983). Estas alteraciones disminuyen la capacidad de las aves de protegerse contra las enfermedades, comprometiendo la respuesta productiva del lote (Saume y col. 2001, Balamurugan y Kataria. 2006).
La enfermedad infecciosa de la Bolsa, IBD, (por sus siglas en inglés Infectious Bursal Disease), también conocida como enfermedad de Gumboro, es una enfermedad altamente contagiosa y endémica en nuestro país que afecta aves jóvenes. El agente etiológico de la enfermedad es un virus del género Avibirnavirus familia Birnaviridae, con tropismo selectivo por las células de la bolsa de Fabricio, órgano en el cual se produce diferenciación de los linfocitos B de las aves (Pulido y col. 2001). El genoma del virus es de ARN de doble cadena segmentado, dividido en dos segmentos. El segmento B se codifica la VP1 (polimerasa viral), mientras en el segmento A se codifican las proteínas estructurales como la VP3, VP4 y VP5, esta última es la responsable de la liberación y patogénesis del virus (Jackwood. 2006). Otra proteína
que se codifica en este segmento (VP2) es responsable del desarrollo de la inmunidad debido a que induce a la producción de anticuerpos neutralizantes (Perozo y col. 2008).
Desde que se reportó la enfermedad por primera vez, la IBD ha ganado la atención de la industria avícola en todo el mundo. El impacto económico de dicha enfermedad está influenciado por la cepa del virus, por la raza del ave y su susceptibilidad, infecciones primarias y secundarias recurrentes y por el factor ambiental y de manejo (Balamurugan y Kataria. 2006). Adicionado a las pérdidas productivas tangibles es importante el efecto inmunosupresor de la enfermedad. En pollos de engorde, la inmunosupresión se evidencia por una alta prevalencia de infecciones respiratorias y una elevada mortalidad por aerosaculitis y colisepticemia, entre la 6ta a 8va semana de edad. Tanto los pollos de engorde como las ponedoras comerciales se hacen resistentes a las vacunas vivas atenuadas contra las enfermedades respiratorias como bronquitis infecciosa y la enfermedad de Newcastle (Muller y col. 2003).
El control de la IBD y del proceso de inmunosupresión, asociada con la misma, es crítico para la industria avícola. En la actualidad, este control se lleva a cabo a través de la protección pasiva de la progenie mediante la hiperinmunización de las madres con vacunas vivas e inactivadas y/o mediante el uso de vacunas vivas del virus de la enfermedad de Gumboro en pollos, ponedoras o pollonas jóvenes para proporcionar protección activa contra la enfermedad (Muller y col. 2003). Como alternativa al uso de vacunas vivas para el control de las enfermedades infecciosas, la biotecnología ha permitido el uso de vectores virales, mediante la expresión transgénica de proteínas como fuente antigénica en el proceso de inmunización (Perozo y col. 2008). Algunos ejemplos de biológicos modificados utilizados para el control de la enfermedad de Gumboro incluyen la expresión de la proteína viral 2 en levaduras (Pitcovski y col. 2003), en el sistema bacuolovirus (Dybing y Jackwood. 1998) y vacunas recombinantes del virus de la enfermedad de Newcastle (Huang y col. 2004).
Un enfoque muy actual para mejorar la vacunación contra IBD es la inmunización de pollos con vectores virales que expresan la VP2 del virus. Debido al tamaño de su genoma, estabilidad y el potencial de replicaciones constantes (fenómeno de latencia)
los Herpesvirus son activamente utilizados en el desarrollo de vacunas vectorizadas en avicultura (Darteil y col. 1995; Huang y col. 2004). Las vacunas vectorizadas o recombinantes son seguras debido a que, no existe el riesgo de reversión de la cepa a virulenta, y a que las proteínas transgénicas producidas son menos susceptibles a la inactivación por los anticuerpos maternales anti-IBDV. Para el control de la IBD, ya se encuentran en el mercado o están en etapa experimental productos recombinantes basados en el virus de viruela aviar (Bayliss y col. 1991), en el herpesvirus de pavo HVT, por sus siglas en inglés HVT (Turkey herpesvirus) (Bublot y col. 2007, Darteil y col. 1995, Tsukamoto y col. 2002), y el virus adeno-asociado aviar (Perozo y col. 2008) y en adenovirus (Sheppard y col. 1998).
La identificación de las cepas de IBDV se ha facilitado en los últimos años. Debido al desarrollo de técnicas moleculares que permiten identificar la presencia de ácido nucléico del virus. Las pruebas de diagnóstico molecular son versátiles, sensibles y especificas para genotipificar y predecir el fenotipo del IBDV. La prueba se basa en la RT-PCR por sus siglas en inglés (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), en las que se amplifica una porción especifica del genoma del virus (Banda y Villegas. 2004; Banda. 2006). Esto se puede lograr mediante impresiones en tarjetas FTA® de la bolsa de Fabricio, las cuales son transportadas de un país a otro con su respectivo permiso de importación (Perozo y col. 2006, Purvis y col. 2006). Otra alternativa para la detección del virus en bolsas de Fabricio, es mediante la fijación de las mismas en formol e incluidas en bloques de parafina para su posterior análisis (Hamoud y Villegas. 2007).
Posterior a la prueba de RT-PCR, se utilizan diversos análisis para clasificar los virus. Una de estas, es el análisis de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (por sus siglas en Inglés RFLP), la cual a través del uso de enzimas de restricción permite agrupar los virus en base a patrones de restricción. (Jackwood, 2006). La técnica más reciente para la caracterización molecular es la secuenciación directa de nucleótidos. Los nucleótidos y las secuencias predichas de amino ácidos deducidas de las cepas de IBDV, constituyen los datos definitivos para el diagnóstico molecular; dichas secuencias pueden utilizarse para predecir la antigenicidad, la
ascendencia, el tropismo por cultivo celular y la atenuación (Hamoud y Villegas, 2006; Jackwood, 2006; Jackwood y Sommer-Wagner, 2007).
Los criterios de evaluación de la capacidad defensiva del sistema inmunitario, son variables y generalmente complementarios entre sí. Se puede lograr mediante evaluación clínica, macroscópica, microscópica y su correlación con la respuesta serológica. Mediante la evaluación clínica se puede determinar la frecuencia y severidad de los problemas infecciosos. En la evaluación macroscópica se determina el peso, tamaño y apariencia de los órganos linfoides (Pulido y col. 2001).La evaluación microscópica, permite la clasificación de las lesiones observadas para indicar la funcionalidad de los órganos estudiados. Adicionalmente, la evaluación serológica de la respuesta inmunológica a vacunaciones rutinarias permite inferir sobre la inmunocompetencia del ave (Saume y col. 2001, Li y col. 2001).
La utilización de la tecnología de punta, para el control de enfermedades infecciosas en las aves, es una necesidad debido a lo intensivo de los procesos de cría y levante implementados para las aves ponedoras comerciales. La transferencia de tecnología debe ir acompañada de una exhaustiva evaluación del rendimiento de la misma ante las características de los sistemas de producción a nivel nacional. Debido a esto, la información obtenida de la evaluación del efecto sobre la colonización viral de la Bolsa de Fabricio, y sobre la inmunocompetencia de las aves vacunadas con la primera vacuna vectorizada contra IBDV utilizada en Venezuela, permite evaluar el beneficio de la utilización de estas vacunas en los planes de vacunación y control del IBD en las ponedoras comerciales en Venezuela.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la colonización viral de la Bolsa de Fabricio e inmunocompetencia en gallinas ponedoras inmunizadas con una vacuna vectorizada contra la enfermedad de Gumboro.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Detectar y caracterizar molecularmente los virus de Gumboro que colonizan la bolsa de Fabricio en ponedoras comerciales vacunadas con un Herpesvirus recombinante expresando la VP2 del virus de Gumboro.
Evaluar los indicadores morfométricos de inmunocompetencia en aves ponedoras vacunadas con un herpes virus recombinante expresando la VP2 del virus de Gumboro
Evaluar macro y microscópicamente la bolsa de Fabricio en ponedoras vacunadas con un herpes virus recombinante expresando la VP2 del virus de Gumboro
Determinar los títulos de anticuerpos séricos obtenidos de las vacunaciones rutinarias contra la Bronquitis Infecciosa y la Enfermedad de Gumboro como indicadores del estatus inmunológico de las aves.
• Comparar los indicadores morfométricos y serológicos de inmunocompetencia, y la colonización viral de la bolsa de las aves vacunadas con un Herpesvirus recombinante, con los que se obtendrán de un plan de vacunación tradicional contra la enfermedad de Gumboro (primo y revacunación a virus vivo), a fin de determinar las ventajas y fortalezas de ambos planes.
MARCO TEÓRICO
Reseña histórica
La IBD fue descrita por primera vez por Cosgrove en el año 1962, la enfermedad se conoce con el nombre de enfermedad de Gumboro por haber aparecido en la vecindad de un pueblo del mismo nombre en el Sur del Estado de Delaware, U.S.A. Cosgrove la denominó "Nefrosis aviar", por haberle dado más importancia a las lesiones renales que a las descritas en la bolsa de Fabricio de los pollos afectados. Winterfield e Hitchner en 1962, describen el "Síndrome Nefrotico" caracterizado por lesiones similares a las descritas por Cosgrove. El consenso temprano era que la nefrosis aviar o la enfermedad de Gumboro era causada por la cepa gris del virus de la bronquitis infecciosa (IBV) debido a los grandes cambios observados en el riñón. Esta falsa idea se presentó debido a la concurrencia de las dos infecciones en muchos casos y a que el IBDV era difícil de aislar con los métodos disponibles (Lasher y Davis. 1997).
En 1970, para evitar confusiones, Hitchner propuso el nombre de "Enfermedad Infecciosa de la bolsa", con el cual se le conoce en la actualidad, ya que el virus se caracteriza por lesionar el tejido linfoide y en especial a la bolsa de Fabricio. El virus al destruir el tejido linfoide de los pollos, altera el mecanismo inmunogenerador actuando como un agente inmunosupresor (Quiroz y col. 1984).
En 1976, en granjas del oriente venezolano, se presentó en pollos jóvenes una enfermedad que por sus características se asemejaba a la IBD. Los pollos sospechosos de la IBD presentaban síntomas y lesiones que correspondían a la enfermedad, pero no fue posible aislar el agente causal. En mayo de 1979, procesando bolsas de Fabricio de pollos jóvenes de 3 y 4 semanas, provenientes de una granja del estado Monagas, fue cuando se logró el primer aislamiento en Venezuela del virus causante de la IBD. La cepa del virus fue aislada por inoculación del material de la bolsa sobre la membrana corioalantoides de huevos embrionados y se denominó P.2577, con ella se reprodujo la enfermedad en pollitos susceptibles por inoculación ocular. Las bolsas de pollos sospechosos de la enfermedad, así como las membranas corioalantoideas de huevos
embrionados con la cepa aislada, presentaron lesiones características de IBD. Para la identificación del virus aislado, se usó la prueba de seroneutralización, empleándose huevos embrionados SPF, con suero hiperinmune traído del Instituto zooprofiláctico experimental de Lombardía y Emilia (Brescia Italia) y sueros hiperinmunes preparados en el Instituto de Investigaciones Veterinarias de Venezuela (Quiroz y col. 1984).
En los años 1984 y 1985, la tasa de mortalidad en el sector de la cría de pollos de engorde en la Península de Delmarva, USA, experimentó un considerable aumento. El síndrome clínico era a menudo de carácter respiratorio y se atribuía a la infección por E.
coli. En el área se aislaron cuatro cepas señaladas como A, D, G, y E que diferían
antigénicamente de las cepas estándares y que producían una atrofia de la bolsa muy rápida, asociada a una respuesta inflamatoria mínima. Las vacunas muertas disponibles no proporcionaban protección completa frente a estos cuatros nuevos aislamientos. Dichos aislamientos son conocidos como variantes antigénicas (Banda. 2006).
A partir de 1987 aparecieron en Europa brotes de IBD virulentos con un 30% y un 60% de mortalidad en lotes de pollos de engorde y pollitas, respectivamente. En el año 1989, informaron de la presencia de nuevos brotes agudos en Inglaterra citados por Chetle y col. al igual que Van den Berg y Meulemans en 1991, informaron casos similares en Bélgica. Algunos de estos brotes se originaron en lotes de pollo de engorde que habían sido objeto de las medidas higiénicas y de prevención correspondientes. Dichos reportes indicaban un aumento de la virulencia de las nuevas cepas de IBDV, con el subsiguiente cambio en la situación de campo. Aunque, con las técnicas disponibles para el momento no se detectó ningún cambio antigénico importante, dichas cepas fueron identificadas como cepas de IBDV muy virulentas (vvIBDV). En Europa la situación estuvo dominada durante más de una década por la emergencia de cepas de vvIBDV. Actualmente, estas cepas se han extendido por todo el mundo. A partir de la aparición de los brotes de vvIBDV en Europa, dichos virus se extendieron rápidamente por Rusia y por toda Asia (Jackwood y Summer-Wagner. 2007). También se registraron brotes similares en Oriente Medio, África y América Latina (Hassan. 2004; Banda. 2006; Hamoud y Villegas. 2007).
La epidemiología molecular indica que todas las cepas de vvIBDV pertenecen al mismo linaje y quizás compartan también la misma ascendencia (Hamoud y Villegas, 2007; Jackwood y Summer-Wagner. 2007). Dichas cepas de vvIBDV se extendieron por casi todos los continentes, sin embargo, aun no han sido identificadas en Australia y Nueva Zelanda (Banda. 2006). En América del Sur se han detectado y reportado varios brotes agudos de IBD debidos a cepas de vvIBDV: Brasil, República Dominicana y Venezuela (Banda y Villegas. 2004; Banda y col. 2003; Hamoud y Villegas. 2007).
Importancia económica
IBD es una enfermedad viral inmunosupresora de gran importancia en la cría de pollos que ha sido descrita a través del mundo, su significancia socioeconómica es reconocida mundialmente. Aunque fue observada por primera vez hace cuatro décadas, esta enfermedad continúa planteando una amenaza importante a la industria comercial de las aves de corral. (Lukert y Saif. 2003). El principal problema que representa las infecciones causadas por IBDV es que pueden exacerbar infecciones con diferentes agentes etiológicos y reducir la capacidad de respuesta de los pollos a la vacunación. La cepa del virus, la susceptibilidad y raza de la parvada, la recurrencia de patógenos primarios y secundarios, y factores ambientales y de manejo influyen en el impacto económico de IBD (Balamurugan y Kataria. 2006).
La importancia económica de esta enfermedad se manifiesta de dos formas: la primera es por la alta mortalidad que pueden causar algunas cepas del virus, alcanzando valores que oscilan entre 20 y 40 % en pollos mayores de 3 semanas de edad (Hassan. 2004; Lukert y Saif. 2003). En la cual las pérdidas económicas son usualmente resultado de una alta mortalidad, pobre conversión de alimentos y una baja eficiencia de los antibióticos (Campo y col. 2004). La segunda, es la forma subclínica de la enfermedad, la cual se presenta en pollos menores de tres semanas de edad, y como consecuencia provoca una marcada inmunosupresión por destrucción las células linfoides, fundamentalmente de la bolsa de Fabricio. Esta última patología es la económicamente más importante de la enfermedad, pues que hace al pollo joven más
susceptible a una gran variedad de agentes infecciosos, particularmente, los virus respiratorios, la E.coli y el virus de la Anemia Infecciosa (Noda y col. 2003; Muller y col. 2003; Balamurugan y Kataria. 2006).
Agente etiológico
El virus de la enfermedad infecciosa de la Bolsa es un miembro de la familia
Birnaviridae, esta familia tiene tres géneros designados Aquabirnavirus, el cual infecta a
peces, moluscos y crustáceos; Avibirnavirus el cual infecta aves; y Entomobirnavirus que infecta insectos. Los virus en esta familia tienen genomas que consisten en dos segmentos de doble cadena de ARN (Muller y col. 1979). Se han reconocido mundialmente dos serotipos de IBDV. El serotipo 1 de IBDV infecta y causa enfermedad clínica en pollos, mientras que los virus del serotipo 2 son no patogénicos (Ashraf y col. 2006).
El virus está formado por una única capa proteica, sin envoltura y un diámetro de 55 a 65 nm. El virus es de simetría icosaédrica, con un número de triangulación T=13. La densidad de las partículas en gradientes de cloruro de Celsio ha sido reportado en un rango de 1.31 a 1.34 g/ml (Lukert y Saif. 2003).
Las dos cadenas de ARN del genoma de IBDV tienen dos segmentos designados A y B. El peso molecular de cada segmento es 2.2 x 106 y 1.9 x 106 KDa, respectivamente (Müller y Nitschke. 1987). La longitud de ambos segmentos es 3.2 kb y 2.8 kb, respectivamente (Hudson y col.1986). El segmento pequeño del genoma del IBDV (B) codifica para VP1, mientras que el segmento grande (A) codifica el resto de las proteínas virales. Se reconocen cinco proteínas virales designadas VP1, VP2, VP3, VP4 y VP5. Los pesos moleculares aproximados de las cinco proteínas son 90 kD, 41 kD, 32 kD, 28 kD y 21 kD, respectivamente. La VP2 y VP3 son las principales proteínas. En el virus serotipo 1, ellas constituyen el 51% y 40% de las proteínas del virus, respectivamente. Mientras que VP1 (3%) y VP4 (6%) son proteínas de menor importancia. La VP1 es la RNA polimerasa viral y la VP4 es una proteasa viral.
Las cuatro proteínas estructurales virales maduras denominadas VP1, VP2, VP3 y VP4 se detectan en las células infectadas. La proteína VP2 es el componente de la cápside del virus (Lukert y Saif. 2003). En la misma están presentes epitopes conformacionalmente dependientes que inducen la producción de anticuerpos neutralizantes (Ashraf y col. 2005). La transición del precursor de VP2 (pVP2) a VP2 implica la proteólisis del pVP2 cerca de su término carboxílico. La VP3 es una proteína estructural y se estima que constituye el 40% de las proteínas del virión y se encuentra solamente en la superficie interna del virus. Esta proteína desempeña un papel en el ensamblaje de partículas virales y empaquetado del genoma viral. La VP4 es la proteasa viral implicada en el proceso de proteólisis del precursor de la VP2. Se ha sugerido que VP4 juega un papel en la activación de VP1 (Muller y col. 2003). La VP5 fue la última proteína del IBDV identificada. Esta proteína no es esencial para la replicación in vitro o in vivo del virus, sin embargo, desempeña un papel importante en la patogénesis viral. Se ha demostrado que tiene características citotóxicas y se ha sugerido que esta proteína también desempeña un papel en la liberación de la progenie de IBDV (Macreadie y Azad. 1994).
Replicación
En general poco se sabe sobre los eventos bioquímicos asociados con la replicación de los Birnavirus (Nagarajan y Kibenge 1997). Se ha demostrado que el virus ataca las células del riñón de embriones de pollo en máximo de 75 minutos después de la inoculación (Lukert y Saif. 2003). El ciclo de multiplicación en células de embriones de pollo es de 10 a 36 horas y el periodo de latencia es de 4 a 6 horas. Polipéptidos virales han sido detectados en células linfoides de la bolsa de pollos en crecimiento in vitro y en su medio de cultivo a los 90 minutos y 6 horas post-infección, respectivamente (Lukert y Davis. 1974)
Se desconoce el sitio de reconocimiento que permite la interacción del virus con el receptor de la célula. Se ha demostrado la presencia de proteínas asociadas al genoma que indican que los ácidos nucleícos virales se replican por un mecanismo
(semiconservativo) de sustitución de hebra. La actividad de la ARN polimerasa puede ser demostrada sin el pre-tratamiento del virus, indicando que la trascripción y replicación ocurren seguido de la penetración celular sin que el virus pierda su capsula.
Diferencias antigénicas
Debido al alto índice de mutaciones características de los virus ARN y la consecuente variabilidad genética, las cepas de IBDV presentes en el campo exhiben características antigénicas y patogénicas diversas. Desde 1980 se ha reconocido la diversidad antigénica entre los virus de Gumboro basándose en las fallas de neutralización cruzada en las pruebas in vitro (Jackwood. 2006; Ashraf y col. 2006). Dentro del serotipo 1 también se han demostrado diferencias antigénicas, se ha sugerido que los aislamientos de las cepas virales reportadas en los Estados Unidos pueden haber sufrido recombinaciones genéticas que indujeron los cambios antigénicos (Jackwood y Sommer-Wagner. 1999). Los virus de Gumboro se agruparon antigénicamente en base a la reactividad con un panel de anticuerpos monoclonales contra virus clásicos o estándar y variantes GLS, DS326 y Delaware (Lukert y Saif. 2003). A pesar de las diferencias en patogenicidad las cepas muy virulentas se consideran en el mismo grupo de las vacunas clásicas como la cepa Faragher 52/70 en base a altos índices de reactividad cruzada en las pruebas de neutralización. Actualmente, la caracterización molecular que permite predecir la secuencia de aminoácidos en segmentos importantes para los epitopes antigénicos facilitando la diferenciación de las cepas sin la necesidad de los procedimientos in vitro.
Base molecular de la variabilidad de IBDV
Los estudios sobre la base molecular de la variabilidad antigénica del IBDV se han concentrado en la región hipervariable de la proteína viral VP2, debido a que los cambios de aminoácidos que diferencian las cepas no están distribuidos uniformemente sobre la proteína, se agrupan formando puntos calientes que permiten un análisis más sencillo. La mayoría de los cambios que ocurren en la VP2 se localizan entre los
aminoácidos 239 y 332 (Banda. 2006). Estudios sobre el perfil de hidrofobicidad de esta región han demostrado que existen dos picos hidrofílicos en cada extremo de esta región. El pico más largo va desde el aminoácido 212 al 224 y el otro del 314 al 324. Estas regiones son importantes para la unión con anticuerpos neutralizantes (Muller y col. 2003). Más aun, la mayoría de los cambios importantes de amino ácidos caen dentro de estos dos picos, demostrándose que las variaciones en antigenicidad de los virus de Gumboro dependen de cambios en esos picos (Nagarajan y Kibenge. 1997).
Inmunidad e inmunosupresión de IBD
Los virus de ambos serotipos de IBD comparten antígenos de grupo comunes, la VP2 también tiene antígenos de grupo específicos a serotipos que inducen anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos contra VP3 no tienen algún efecto protector. Estudios in
vivo, lo corroboran, ya que los pollos que tienen anticuerpos contra virus del serotipo 2
no están protegidos contra el virus del serotipo 1 (Ismail y Saif. 1990).
Las variantes del serotipo 1 se aislaron originalmente de pollos que tenían anticuerpos neutralizantes contra el serotipo 1. Las vacunas inactivadas y una vacuna viva hecha de cepas variantes protegieron a pollos de la enfermedad ocasionada tanto por cepas variantes como estándar, mientras que las vacunas inactivadas hechas de cepas estándar no protegieron o solo lo hicieron de manera parcial contra el desafío con cepas variantes. Se sugiere que todos los subtipos del serotipo 1 comparten uno o varios antígenos menores que originan anticuerpos protectores (Muller y col. 2003).
La exposición de campo o la vacunación, ya sea con vacunas vivas o muertas, estimulan inmunidad activa. Las concentraciones de anticuerpos normalmente son muy elevadas después de la exposición en campo o vacunación. Las aves adultas son resistentes a la exposición oral al virus, pero producen anticuerpos después de la inoculación intramuscular o subcutánea de IBDV evidenciando la importancia vía de inoculación para la generación de la respuesta inmunológica (Rauw y col. 2006). Los anticuerpos transmitido de la madre a través de la yema del huevo, puede proteger a
los pollitos contra infecciones tempranas con IBDV, resultando en protección contra el efecto inmunosupresor del virus. La vida media de los anticuerpos maternos contra IBDV es de tres a cinco días (Lukert y Saif. 2003).
La destrucción de la bolsa causada por el virus produce un estado de inmunosupresión, que será más grave cuanto más joven sea el ave infectada. Siendo más grave y más duradera tiene lugar cuando las aves de un día de vida se infectan con el IBDV y del tipo de cepa inféctate (virulenta o muy virulenta). En las condiciones particulares de campo, esto raramente se produce; los pollos tienden a resultar infectados hacia las dos o tres semanas de edad, cuando el nivel de anticuerpos maternales desciende. Existen numerosos reportes de que el virus tiene su efecto inmunosupresor hasta las 6 semanas de edad (Rauw y col. 2006).
A la recuperación de la enfermedad o a la infección subclínica le sigue la inmunosupresión. Una paradoja que se relaciona con las infecciones por IBDV es que mientras que hay inmunosupresión contra múltiples antígenos, la propia respuesta contra IBDV es normal, aun en pollos susceptibles de un día de edad, parece haber una estimulación de la proliferación de células B comprometidas con la producción de anticuerpos contra IBDV (Rosenberger y col. 1998).
El IBDV es un potente inductor de producción de IFNγ y se ha demostrado que inhabilita la proliferación mitogénica in vitro de los linfocitos T, con una clara reducción de la capacidad de activación de los linfocitos T tras la infección de IBDV, independientemente del tipo de cepa infecciosa (Muller y col. 2003). El virus se replica principalmente en los linfocitos B de pollos, teniendo una predilección por las células en proliferación activa y se ha sugerido que el virus afecta a linfocitos B inmaduros o precursores en un grado mayor que a los linfocitos B maduros (Lukert y Saif. 2003).
Susceptibilidad del hospedador
Las aves domésticas son el hospedador natural del IBDV (Hemboldt y Garner. 1964), se ha observado que las razas Leghorn blancas exhiben los problemas más severos y tienen la tasa de mortalidad más alta (Lukert y Saif. 2003). Los pavos pueden ser infectados con los serotipos 1 y 2 pero no muestran signos clínicos de la enfermedad, sin embargo, existe un potencial considerable de inmunosupresión o interacción con otras enfermedades bajo condiciones del campo (Lasher y Shane. 1994). Los patos pueden desarrollar anticuerpos contra IBD que pueden ser detectados por anti-anticuerpos neutralizantes en suero contra el virus, pero no se observan lesiones macroscópicas, ni microscópicas después de la infección. Se han detectado anticuerpos en algunas aves silvestres, tales como tejedores (Ploceus cucullatus) y en pinzones (Uraeginthus bengalus) sorprendentemente se detectó evidencia serológica en pingüinos antárticos; la forma de transmisión del IBDV no se ha definido (Nawathe y col. 1978; Gardner y col. 1997).
Periodo de incubación y signos clínicos
El periodo de incubación es muy corto y los signos clínicos aparecen de 2 a 3 días después de la exposición. Uno de los signos clínicos iniciales de infección en una parvada, es la tendencia de algunas aves de picar sus propias cloacas. Cosgrove en 1962, (citado por Lukert y Saif. 2003), describió cloacas empastadas, diarrea acuosa, anorexia, depresión, plumas rizadas, temblores, postración severa y finalmente muerte. Las aves afectadas mostraron deshidratación y en la fase terminal de la enfermedad temperatura subnormal.
Lesiones macroscópicas
Las aves afectadas están deshidratadas y muestran decoloración de los músculos pectorales y hemorragias en los muslos. Se observa incremento de mucus en el intestino y cambios renales pueden evidentes en aves que mueren o que están en una
fase avanzada de la enfermedad. Tales lesiones son muy probablemente una consecuencia de la deshidratación severa (Muller y col. 2003). Es importante entender la secuencia de cambios cuando se examinan aves para diagnóstico. En el día tres postinfección, la bolsa empieza a incrementarse en tamaño y peso debido al edema e hiperemia. Para el día cuatro ha duplicado el peso y el tamaño, pero luego empieza a retroceder. Para el día cinco, la bolsa retorna a su peso normal pero continúa hacia la atrofia y desde el día ocho en adelante presenta aproximadamente un tercio de su peso original. Entre los días dos y tres post-infección, la bolsa presenta un transudado gelatinoso, amarillento, cubriendo la superficie serosa. Las estriaciones longitudinales de la superficie se hacen prominentes y el color blanco normal se torna color crema. El transudado desaparece mientras la bolsa va retornando al tamaño normal y el órgano se torna gris hacia y durante el periodo de atrofia (Lukert y Saif. 2003).
Se ha reportado que las cepas muy virulentas de IBDV no inducen respuesta inflamatoria. La bolsa infectada suele mostrar focos necróticos y algunas veces hemorragias petequiales o equimoticas en la superficie de la mucosa. Ocasionalmente, se observa una hemorragia extendida en toda la bolsa; en estos casos las aves presentan deposiciones con sangre. El bazo puede estar ligeramente aumentado de tamaño con la presencia de pequeños focos grisáceos diseminados uniformemente por la superficie del órgano. Ocasionalmente, se observan hemorragias en la mucosa de la unión proventrículo-ventrículo (Noda y col. 2003). Comparado con una cepa del virus moderadamente patogénica, las cepas muy virulentas (vvIBDV) causan una gran disminución en el índice de peso del timo y lesiones muy severas en las tonsilas cecales, bazo y medula ósea, pero las lesiones en la bolsa son similares. La patogenicidad puede estar asociada a la distribución de antígeno en otros órganos linfoides (Hassan. 2004).
Lesiones microscópicas
Las lesiones microscópicas causadas por el IBDV ocurren principalmente en las estructuras linfoides (bolsa, glándula harderiana y tonsilas cecales). Los cambios más
severos son en la bolsa cloacal, esto debido a que las células blanco son los linfocitos B inmaduros. Al primer día postinfección hay degeneración y necrosis de linfocitos en el área medular de los folículos de la bolsa. Los linfocitos son prontamente reemplazados por heterófilos, núcleos picnóticos y células reticuloendoteliales hiperplasicas. Frecuentemente aparecen hemorragias, pero no son una lesión consistente. Todos los folículos linfoides se muestran afectados para el tercer y cuarto día post-infección (Rosenberger y col. 1998)
El incremento del peso de la bolsa es causado por edema severo, hiperemia y marcada acumulación de heterófilos. Como la reacción inflamatoria disminuye, se desarrollan cavidades quísticas en el área medular de los folículos; ocurre necrosis y fagocitosis de heterófilos y células plasmáticas; aparece fibroplasia en el tejido conectivo interfolicular. La proliferación del epitelio de la bolsa produce una estructura columnar de células epiteliales conteniendo glóbulos de mucina. Durante la fase supurativa, algunos focos de linfocitos aparecen pero no forman folículos sanos durante los primeros 18 días posteriores a la infección (Lukert y Saif. 2003).
Diagnóstico, aislamiento e identificación
La bolsa de Fabricio y el bazo son los tejidos idóneos para el aislamiento del IBDV, pero se utiliza la bolsa con mayor frecuencia. El virus infecta otros órganos, pero a concentraciones más bajas y probablemente debido a causa de la viremia. Para el diagnóstico, aislamiento e identificación los tejidos deben macerarse en un caldo o solución salina tratados con antibióticos y centrifugarse para eliminar las partículas grandes de tejido. El líquido sobrenadante se usa entonces para inocular huevos embrionados o cultivos celulares (Lukert y Saif. 2003).
La membrana corioalántoidea de embriones de 9 a 11 días de edad es la vía de aislamiento de virus más sensible. La muerte de los embriones infectados suele suceder en 3 a 5 días. Las cepas variantes del IBDV difieren de los virus estándar en que inducen esplenomegalia y necrosis hepática en embriones y producen baja
mortalidad. El huevo embrionado puede ser el sustrato más sensible para el aislamiento del virus (Lukert y Saif. 2003). Se han adaptado muchas cepas de IBDV a cultivos celulares de origen de embrión de pollo y se han observado efectos citopáticos. Además de las células de origen del pollo, el virus se ha desarrollado en células de embrión de pavo y pato, líneas celulares de mamíferos derivadas de riñones de conejo y células de riñón de mono Grivet lactante (Lukert y Davis. 1974).
Un aspecto que se debe considerar en lo referente a la replicación in vitro del virus es la posibilidad del desarrollo de partículas defectuosas. Pases seriados de virus no diluidos en células de embrión de pollo, han resultado en fluctuaciones en infectividad y desarrollo de virus formadores de pequeñas placas estables que interfieren con la replicación del virus estándar y favorece a la generación de partículas defectuosas, estás pierden el segmento grande de la doble cadena de RNA. El pasaje del virus en células de riñón de mono Grivet lactante durante seis ocasiones, ha causado perdida de patogenicidad, no obstante, pasajes similares en embriones de pollo no han afectado la patogenicidad del virus (Lukert y Saif. 2003)
Para una rápida detección del virus en el campo, son útiles las sondas de acido nucleico y ELISA con captura de antígeno, utilizando anticuerpos para detectar IBDV de manera directa en tejidos. Sin embargo, se ha encontrado que los anticuerpos policlonales han sido más sensibles para detectar virus que los anticuerpos monoclonales, y que la inoculación en embriones es más sensible que ELISA con captura de antígeno. También se ha descrito la utilización de PCR con trascripción reversa, seguida de análisis de restricción de endonucleasa, para diferenciar entre las cepas clásicas y variantes del serotipo 1 (Nagarajan y Kibenge. 1997).
Las vacunas recombinantes
Los virus de viruela, son virus que se han utilizado como vectores de genes exógenos, como se propuso por primera vez en 1982 (Paoletti. 1996.), tanto para la “entrega” de antígenos vacunales, como para la terapia génica humana. Los virus de viruela pueden
incorporar grandes cantidades de genes ajenos y pueden infectar a las células de mamíferos, dando lugar a la expresión de grandes cantidades de proteína la codificada, por lo cual son muy útiles para la investigación.
La enfermedad de Marek (MDV) es una enfermedad neoplásica altamente contagiosa de aves de corral causada por un herpesvirus tipo 2, mientras que IBDV se replica en la bursa de Fabricio, el principal órgano linfoide en las aves, causando una inmunosupresión en las aves de corral en todo el mundo. El herpesvirus de pavo (HVT) es apatógeno en pollos, pero confiere protección cruzada contra MDV y ha sido tradicionalmente utilizado en las vacunas contra MDV. La nueva vacuna se basa en una matriz recombinante del virus HVT que expresa el gen VP2 de la IBDV (da Silva y col. 2000) y se puede aplicar en huevos embrionados o en pollitos de un día sin interferir con los anticuerpos procedentes de la madre.
La tecnología recombinante, es la técnica mediante la cual se aíslan y transfieren secuencias de ADN altamente específicas (genes) de un organismo y se recombinan con el ADN de otro, y ha sido reconocida en todo el mundo como uno de los avances científicos más significativos del último siglo. Durante los últimos 10 años, los médicos y veterinarios han visto cómo se ha utilizado la tecnología recombinante en el desarrollo y aprobación de una generación de vacunas verdaderamente novedosas, que han desarrollado protección y eficacia sin precedentes al ejercicio de la clínica (Meeusen y col. 2007)
La replicación competente de vectores de herpesvirus pueden expresar múltiples antígenos. La respuesta inmune tanto humoral como celular puede ser inducida en las aves gracias a la persistencia de la infección del vector viral (Tsukamoto y col. 1999).Una de las ventajas de la tecnología recombinante se puede describir como una respuesta inmune dirigida, eficaz y con una seguridad sin precedentes, respuesta que no induce las vacunas convencionales, evitando la necesidad de inyectar al paciente organismos completos, muertos o modificados. Más aún, la ausencia de adyuvantes, que es una característica de las vacunas recombinantes utilizadas en medicina veterinaria, es considerada por muchos oncólogos e internistas como un factor
importante para reducir los riesgos de reacciones adversas asociadas a las vacunas, como los granulomas y sarcomas en los sitios de inyecciones en los gatos (Meeusen y col. 2007).
MARCO METODOLÓGICO
Localización
El estudio se realizó en la Granja Rio Bio-Bio C.A. que es una empresa avícola independiente dedicada a la producción y comercialización de huevos de consumo. La granja se encuentra ubicada en la vía al Moján en el km 22, Sector Las Cruces, del Municipio Mara, estado Zulia, Venezuela. Esta es una zona agro-ecológica catalogada como bosque muy seco tropical (Ewel y col. 1968).
Población de estudio
Se partió de una población total de 15.150 gallinas ponedoras de la raza Isa Brown divididas en dos grupos iguales y alojadas en galpones idénticos, bajo igualdad de condiciones. En distintos momentos durante la cría de las aves (día 1, semanas 2, 4, 7, 10) se realizaron muestreos de la población inicial para evaluar los criterios de eficacia que se describen a continuación.
Vacunas.
La vacuna vectorizada que se evaluó fue un herpesvirus de pavo (HVT por sus siglas en inglés), modificado genéticamente (cepa FC126), el genoma contiene el gen VP2 del 52/70 Faragher cepa de IBDV, generando la cepa vHVT013-69 que se distribuye comercialmente como VAXXITEK ® (Merial Select, Gainesville, GA, EE.UU). La vacuna viva evaluada es de tipo clásica intermedia., distribuida comercialmente bajo el nombre de UNIVAX PLUS, por Schering-Plough Animal Health.
Diseño experimental
El manejo y tratamiento profiláctico de las aves fue idéntico, salvo por la vacunación contra la IBD. Uno de los grupos experimentales se designó como VECTORIZADO, en este grupo a las aves se les realizó una aplicación única al día 1 por vía subcutánea de 0,2 mL. Contentivos de 3,0 log10 unidades formadoras de colonia de la cepa recombinante vHVT013-19. El otro grupo experimental se designó como TRADICIONAL, pues se aplicó el plan de vacunación estándar de la zona de explotación, que consiste en dos dosis de un virus vivo de cepa clásica de patogenicidad intermedia a los 8 y 18 días de edad. Una vez establecidos los grupos a evaluar, se siguió un cronograma de muestreos consistente en cinco tomas, en los que se evaluaron 10 aves por cada grupo (VECTORIZADO y TRADICIONAL). Las aves fueron seleccionadas al azar en distintos puntos a lo largo de la cría. El cronograma de muestreos se muestra en la cuadro 1.
CRITERIOS A EVALUAR MUESTREOS (semanas) 0 (día 1 ) 2 4 7 10 Indicadores morfométricos de inmunocompetencia X X X X Indicadores serológicos de inmunocompetencia X X X X X Preservación de la Bolsa de
Fabricio para Histopatología X X X X
Preservación de la Bolsa de Fabricio para Detección y
Caracterización Molecular. X X X
Cuadro 1. Cronograma de toma de muestreos. Cada día se seleccionaron al azar 10 aves por grupo. La X denota que se realizó el muestro correspondiente.
Criterios de eficacia.
Para la determinación de los indicadores morfométricos se comenzó con una evaluación visual de los órganos linfoides primarios y secundarios. El procedimiento realizando el pesaje del ave viva utilizando una balanza electrónica de precisión. Una vez sacrificadas las aves por dislocación cervical, se registraron los hallazgos de necropsia observados. Posteriormente seleccionadas en cada ave se extrajo la bolsa, se determinó su peso y diámetro usando una balanza electrónica de precisión y un bursometro®, respectivamente. Adicionalmente, se calculó la relación entre el peso de la bolsa y el peso corporal de cada ave (índice bursal), utilizando la fórmula peso bolsa/peso corporal x 100. Además se determinaron la razón entre el peso del bazo y el peso de la bolsa como un indicador relacionado con la capacidad inmunológica del ave.
Serología de la Enfermedad de Gumboro y Bronquitis infecciosa
La medición de la respuesta serológica a la vacunación para evaluar planes de vacunación es una práctica difundida que también ha sido utilizada para inferir sobre el estatus inmunológico e inmunocompetencia de las aves (Perozo y col. 2004). Para este análisis las muestras de sangre para la obtención de suero fueron tomadas por punción cardiaca al día 1 y las semanas 2, 4, 7 y 10. La muestra del día 1 permite establecer parámetros comparativos de la inmunidad pasiva (anticuerpos maternales) con las que las aves llegaron a la granja.
En el presente estudio, se aplicó la técnica de ELISA para determinar la respuesta serológica a las vacunaciones contra la Enfermedad Gumboro y Bronquitis Infecciosa, midiendo la presencia y niveles de anticuerpos generados por las aves en respuesta a las vacunas antes mencionadas (medición cuantitativa). Para esto se utilizó un kit comercial de marca IDEXX, para la evaluación de ambas enfermedades. El procedimiento se describe brevemente a continuación: se procedió a diluir los sueros, obteniendo una dilución de 1:500 con el diluyente de las muestras (1µl de la muestra en 500 µl del diluyente). Una vez que se anotaron las posiciones de los sueros en la hoja de trabajo, y previamente diluidos, se procedió a colocar las muestras (100 µl) en los pocillos correspondientes, así como también los controles positivos y negativos (todos
por duplicados) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La placa se incubó a temperatura ambiente por 30 minutos. Se procedió a aspirar y descartar todo el contenido de los pocillos en un recipiente adecuado y destinado solo para esto; la placa fue lavada cinco veces con agua destilada y secada completamente. Se vertió 100 µl de conjugado (de cabra) anti-pollo:peroxidasa de rábano a cada pocillo, y se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez transcurrido el tiempo, se repitió el procedimiento de aspirado y lavado de la misma. A continuación, se agregaron 100 µl de la solución de sustrato TMB en cada pocillo y se dejo a temperatura ambiente por 15 minutos. Para finalmente colocar 100 µl de la solución de stop en cada pocillo, y realizar la lectura en el lector a una absorbancia de 650 nm.
Evaluación microscópica de la bolsa de Fabricio
La evaluación microscópica consistió en la clasificación de las lesiones observadas para correlacionarlas con la funcionabilidad de los órganos evaluados (Muñoz, 1998). Las bolsas de las aves de cada grupo, obtenidas de los muestreos correspondientes a las semanas 2, 4, 7 y 10; fueron seccionadas y la mitad fue sumergida en formalina buferada al 10% (Figura 9), durante por lo menos 24 horas para ser procesadas en el laboratorio de diagnóstico patológico siguiendo los procedimientos rutinarios para la preparación de tejidos (Perozo y col. 2004). La evaluación histopatológica proporcionó una gradación de las bolsas de Fabricio según la escala ordinal reportada por Henry y col. 1980, donde el rango establecido va desde 0 para la bolsa normal hasta 4 para la bolsa severamente afectada.
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Detección y caracterización molecular
La detección y caracterización molecular incluye la extracción de ARN, la amplificación de la secuencia de la VP2 y la posterior secuenciación de los productos génicos obtenidos de las muestras, los procesos se describen a continuación:
Extracción del ARN
Cinco discos de 2 mm fueron cortados con un sacabocados (Harris Micro-Punch) del papel de filtro FTA® (Figura 11a), para ser resuspendidos en 200 μL del buffer de extracción (Whatman International, Ltd. Reino Unido) (Figura 11b) y colocados en hielo por 20 minutos, mezclando vigorosamente cada 5 minutos manualmente (Purvis y col. 2006). La fase líquida obtenida fue sometida a un proceso de extracción de ARN empleando Trizol (Life Technologies Inc., Grand Island, NY, EUA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. El precipitado final fue diluido en 50 μL de agua estéril y libre de ARNasas (Qiagen Sciences. Maryland, EUA) (Perozo y col. 2006).
Amplificación
La presencia de ácidos nucleícos de IBDV en las muestras fue detectada por la amplificación de una región de 698-bp del gen VP2 que contiene la región hipervariable (entre los nucleótidos 567 y 1264) usando el siguiente par de iniciadores: 5’-TCTGCAACAGCCAACATCAACG-3’ y 5’-TCAGGATTTGGGATCAGCTCGA-3’ (Purvis y col. 2006). La prueba de RT-PCR fue utilizada para la amplificación del segmento del gen VP2 utilizando el paquete SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA), siguiendo las recomendaciones del fabricante (Figura 12). La transcripción reversa se realizó a una temperatura de 55ºC por 30 minutos. La reacción de PCR se realizó en 40 ciclos consistentes, en desnaturalización a 94ºC por 30 segundos, unión de iniciadores a 50ºC por 30 segundos y extensión a 72ºC por 1 minuto; seguido por una extensión final a 72 ºC por 7 minutos (Purvis y col. 2006). Las muestras amplificadas fueron sometidas a análisis por electroforesis en un gel de 1.5% de agarosa y visualizadas en una cámara
de luz ultravioleta, empleando bromuro de etidio a una concentración de 0.5 µg/ml. (Perozo y col. 2006).
Secuenciación
Posterior a la prueba de RT-PCR se utilizó el análisis de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción, por sus siglas en Inglés RFLP para clasificar los virus. Mediante la utilización de enzimas de restricción, se puede agrupar los virus en base a patrones de restricción que se asocian con fenotipo (Jackwood. 2006). La técnica más reciente para la caracterización molecular es la secuenciación directa de nucleótidos. Los nucleótidos y las secuencias predichas de amino ácidos deducidas de las cepas de IBDV, constituyen los datos definitivos para el diagnóstico molecular; dichas secuencias pueden utilizarse para predecir la antigenicidad, la ascendencia, el tropismo por cultivo celular y la atenuación (Hamoud y Villegas. 2007; Jackwood. 2006; Jackwood y Sommer-Wagner. 2007).
Los productos amplificados de 698 pares de bases, fueron escindidos del gel y purificados, empleando el paquete comercial QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos purificados fueron secuenciados empleando el paquete comercial de secuenciación BigDye Terminador v3.1 y el secuenciador ABI PRISM 310 Genetic Analizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Las secuencias de nucleótidos y patrón de aminoácidos inferido del gen VP2 de IBDV fueron analizados con la ayuda del programa DNAStar (DNAStar, Inc., Madison, WI, USA).
Análisis estadístico
Los datos fueron obtenidos de los registros de mediciones de las variables independientes de los tratamientos durante el periodo de estudio. Los datos fueron transcritos, codificados, seleccionados y tabulados en una hoja de Excel del sistema operativo Windows® diseñada para tal fin. El modelo lineal es el siguiente (Montgomery. 1991):
Yink = μ + ρk + τi + β(τ)n(i) +τρjk+ εink Donde:
Yink = Peso del bazo, peso de la bursa, índice peso bursa-peso corporal, índice peso bursa-peso bazo, peso vivo del ave, porcentaje de producción y porcentaje de mortalidad acumulada medido en el k-esimo periodo y i-esimo tratamiento. μ = media general de la población.
ρk = Efecto de la k-esimo periodo (k = 2, 4, 6, 8 y 10 semana. τi = Efecto del i-esimo tratamiento (i = 1 y 2).
β(τ)n(i) = Efecto anidado del n-esimo ave anidado sobre el i-esimo tratamiento (n = 1, 2,...10; n = 1,….60).
τρik= Efecto de la interacción del k-esimo periodo entre el i-esimo tratamiento. εik = Efecto de los factores no controlados sobre las unidades experimentales.
Como parte del análisis estadístico, se efectuó el estudio del modelo mixto para las variables estudiadas y un análisis de la varianza no parametrico de Kruskal-Wallis (Montgomery. 1991). Se utilizó el procedimiento Proc Mixed con la opción Repeated y en el modelo con la opción Satterth del paquete estadístico SAS (S.A.S. 2002; S.A.S. 2008). Adicionalmente se aplicó la prueba de esfericidad (Cuadro 5) que se efectuó con el procedimiento PROC GLM y la opción REPEATED (Hamer y Simpson. 2000), la selección de la estructura de covarianza se utilizó el criterio de información de Akaike (AIC) o el criterio Bayesiano de Schwar, seleccionando la estructura que presenta el
valor más cercano a cero. Cuando se detectaron diferencias significativas entre los factores (Cuadro 6), se aplicó el procedimiento de los contrastes ortogonales por comparación de las medias de los variables (Cuadro 7) y utilizando el procedimiento PROC REG para las regresiones como predictores de tendencia para cada una de los variables dependientes (Littell y col. 1998; Littell y col. 2000; S.A.S. 2008). Además, del procedimiento Proc Npar1way Wilcoxon (S.A.S. 1988; S.A.S. 1999).
El análisis de los datos de las variables de estudio se les efectúo la prueba de esfericidad de tipo Huynh-Feldt se observa en el Cuadro 2, donde se encuentran los valores de los componentes ortogonales con los grados de libertad, el criterio Mauchly y Ji-cuadrado, con la probabilidad altamente significativo (P<0,0001). Tomando que todas las variables estudiadas no presentan valores perdidos, excepción de la variable peso vivo la cual se encuentra desbalanceado el numero de datos. De esta forma queda demostrado que no todas las variables cumplen con la condición de esfericidad de tipo Huynh-Feldt de ortogonalidad de los componentes. Con este resultado, el procedimiento que se ajusta para el análisis de datos de las variables en estudio es el modelo mixto con efectos fijos (Hamer y Simpson, 2000.; Littell, et al., 1998).
Conforme con la anterior, se procedió a seleccionar la estructura del modelo mixto con efectos fijos que se ajusta según con los criterios Bayesiano de Schwarz y de información de Akaike (Cuadro 3), y se seleccionό la estructura que presente el valor más cercano a cero (Littell, et al., 1998; Littell, et al., 2000; Wolfinger y Chang, 1995).
Una vez realizado lo anterior, se procedió a evaluar la varianza de las variables dependientes, siendo estas: peso del bazo, peso de la bursa, diámetro de la bursa, índice peso bursa-peso corporal, índice peso bursa-peso bazo, peso vivo, de las aves para las variables independientes tratamiento, semanas de vida y la interacción tratamiento con semanas de vida, utilizando la estructura matricial de varianza-covarianza del error (Cuadro 4).
Cuadro 2. Prueba de esfericidad y la condición Huymh-Feldt del procedimiento Proc GLM con la opción REPEATED de las variables peso del bazo, peso de la bursa, diámetro de la bursa, índice peso bursa-peso corporal, índice peso bursa-peso bazo, peso vivo.
Prueba de esfericidad
Variable Gl Criterio de
Mauchly Jicuadrado**** Peso del Bazo 9 0,0014831 106,931470 Peso de la Bursa 9 0,0273097 59,108444 Diámetro de la Bursa 9 0,0574106 46,911060 Índice Peso Bursa-Peso Corporal 9 0,0421565 51,981197 Índice Peso Bursa-Peso Bazo 9 0,0018888 102,961980 Peso Corporal de las Aves 14 0,0058938 82,655129
Modelo Peso del Bazo Peso de la Bursa Diámetro de la Bursa Índice Peso Bursa‐Peso Corporal Índice Peso Bursa‐Peso Bazo Peso vivo Producción Mortalidad Acumulada Criterio
AIC BIC AIC BIC AIC BIC AIC BIC AIC BIC AIC BIC AIC BIC AIC BIC
CV 58,2 60,1 174,5 176,9 391,1 393 292,8 294,8 246,4 247,4 5533,1 5535,7 472,4 473,6 ‐131,8 ‐130,5 AR(1) 22,6 24,6 141,4 143,4 373,4 375,4 285,9 289,9 248,4 250,4 5531,4 5536,7 468,3 469,6 ‐135,3 ‐133,3 CS 60,2 63,1 176,9 179,9 393,1 396 294,8 300,8 250 253 5530,2 5538 474,7 476,3 ‐129,8 ‐127,9 CSH ‐15,9 ‐9,9 132,8 138,8 380,2 386,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 346,3 349,5 ‐ ‐ ARH(1) ‐ ‐ 116,4 122,3 367,1 373,1 280,1 294 180,1 187,1 5511,2 5432,1 328,9 332,1 ‐ ‐ TOEP 3,9 9,9 123,5 129,4 368,4 374,4 290,2 300,2 255,8 261,8 5538 5556,3 455,4 458,8 ‐189,5 ‐194
CV: Componentes de la varianza, AR(1): Autoregressive, CS: Compuesta simetrica, CSH: Compuesta simetrica heterogenea, ARH(1): Autoregresiva heterogenea (1), TOEP: Toeplitz.
Cuadro 3. Criterio de información de Akaike (AIC) y Bayesiano de Schwarz (BIC) según la estructura de covarianza para la selección del modelo matricial.
Peso del Bazo Peso de la Burza Diametro de la Bursa Indice Peso Bursa‐Peso Corporal Indice Peso Bursa‐Peso Bazo Peso vivo Efecto Valor de F Tramiento 7,06* 13,52** 4,36* 5,07* 0,77NS 17,09**** Semana 124,97**** 40,7**** 31,14**** 31,32**** 27,84**** 5501,66**** Interacción Tratamiento*Semana 9,12**** 8,36*** 8,66**** 4,63** 6,8*** 2,57****
R= 0.1042 ARH(1)=0.6074 ARH(1)=0,4969 ARH(1)=0,4509 ARH(1)=0,2516 ARH(1)=‐0,06508
NS: No significativo. R: Residual. * = P < 0.05; ** = P < 0.01; *** = P < 0.001; **** = P < 0.0001.
Cuadro 4. Análisis de la varianza de las variables dependientes peso del bazo, peso de la bursa, diámetro de la bursa, índice peso bursa-peso corporal, índice bursa-peso bursa-bursa-peso bazo, bursa-peso vivo, porcentaje de aves en producción y porcentaje de mortalidad acumulada de aves para las variables independientes tratamiento, semanas de vida y la interacción tratamiento x semanas de vida utilizando la estructura matricial de varianza-covarianza del error.
En es obten la reg que t bolsas se mu Figura FTA®. MU F F F F F F Cuadro nomen ítems F ste trabajo, idas en tar gión híperv todas las s provenien uestran en 2. Electrofor ESTRA TA-1 TA-2 TA-3 TA-4 TA-5 TA-6 o 5. Reporte d nclatura se co FTA-1, FTA-4 , se realizó rjetas FTA® ariable de aves mues ntes del gru la el cuadro resis en gel m GR VECTO TRADI TRADI VECTO TRADI VECTO de la coloniza orresponde a 4 y FTA-6 par RESULT ó la prueba ®, así como la proteína streadas re upo VECTO o 5. mostrando la RUPO ORIZADO CIONAL CIONAL ORIZADO CIONAL ORIZADO ación de la Bo : FTA-2, FTA ra el grupo VE ADOS Y D a de RT-PC o la secuen a viral 2 (F esultaron p ORIZADO e amplificación EDAD 4 4 7 7 10 10 olsa de Fabric A-3 y FTA-5 p ECTORIZADO DISCUSION CR de imp nciación y a Figura 2), o positivas p evaluado en n del IBDV a D (Sem) Sem Sem Sem Sem Sem Sem
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