SUMARIO CONTENTS
ARTÍCULOS ORIGINALES
Normalización de la técnica de reducción de placas para diferenciar una infección por dengue de una infección por fiebre amarilla
Standardization of the plaque reduction assay to differentiate an infection caused by dengue from an infection due to yellow fever
Mayling Álvarez Vera, Danay Valdés Palacios, Susana Vázquez Ramudo, Iselys Delgado Hernández, Serafina García Infante, Luis Morier Díaz y María Guadalupe Guzmán Tirado
Incidencia de los Adenovirus en las conjuntivitis virales
Incidence of Adenovirus on viral conjunctivitis
Gisset Torres Rojas, Ángel Goyenechea, Clara Savón, Odalys Valdés e Isabel Oropesa
Detección de herpesvirus en pacientes inmunocomprometidos con meningoencefalitis, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
Detection of herpesvirus in patients immunocompromised with meningoencephalitis by polymerase chain reaction
Vivian Kourí, Carlos Suárez, Sonia Resik y Serafina García
Aplicación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa para la detección de secuencias de Papillomavirus humano
Application of polymerase chain reaction to detect sequences of human Papillomavirus
Yudira Soto, Mayra Muné, Adibel Goicolea, Estrella Morales, Jean Michell Santoyo, Odalys Valdés, Rosa Ramírez y Tamara Pimentel
Susceptibilidad de las larvas de Anopheles pseudopunctipennis al parasitismo del nematodo
Romanomermis iyengari (Nematoda: Mermithidae), Estado de Oaxaca, México
Susceptibility of Anopheles pseudopunctipennis larvae to the parasitism of nematode Romanomermis
iyengari
(Nematoda: Mermithidae), Estado de Oaxaca, México
Rafael Pérez Pacheco, Alberto Santamarina Mijares, Sabino Honorio Martínez y Gonzalo Flores Ambrosio
Susceptibilidad antimicrobiana y aislamiento de plásmidos en Plesiomonas shigelloides
Antimicrobial susceptibility and isolation of plasmids in Plesiomonas shigelloides
Laura Bravo Fariñas, Olga Susana De Paula Almeida, Jorge Maestre Mesa, Margarita Ramírez Álvarez y Belkys García Rodríguez
177
182
186
191
199
203
Evaluación del polisacárido capsular tipo específico de Cryptococcus Neoformans como inmunógeno y antígeno control positivo
Evaluation of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide as an immunogen and positive control antigen
Gilda T. Toraño Peraza, Werner Rodríguez Acebo y Gerardo Martínez Machín
Detección de anticuerpos, antígenos y complejos inmunes circulantes en las fascioliasis aguda y crónica. Resultados preliminares
Detection of antibodies, antigens and circulating immune complexes in acute and chronic fascioliasis. Preliminary results
Liliana Pelayo, Ana Margarita Espino, Blanca E. Duménigo Ripoll y Carlos M. Finlay Villalvilla
PRESENTACIÓN DE CASOS
Dermatitis causada por Hylesia metabus (Lepidoptera: Hemileucidae) en la región costera del Estado del Delta del Amacuro, Venezuela
Dermatitis caused by Hylesia metabus (Lepidoptera: Hemileucidae) in the coastal region of Estado del Delta del Amacuro, Venezuela
Alexis Rodríguez-Acosta, Hernando Rubiano, Matías Reyes y Carmen Teresa Fernández
COMUNICACIÓN BREVE
Estudio comparativo entre diferentes esquemas de administración de 2 dosis con la vacuna cubana antihepatitis B
Comparative study of different 2 dosing schedules of Cuban vaccine against hepatitis B
Martha de J. González-Griego, Zurina Cinza, Abraham Ortega, María M. Gali, María E. Santoyo, Gerardo García y Aurora Delahanty
Diagnóstico serológico del VIH-1 en muestras de sangre seca en papel de filtro por el sistema DAVIH Dot VIH-1
HIV-1 serological diagnosis in dried blood specimen spotted on filter paper by the HIV-1 DAVIH Dot system
René Grana Sánchez, María Teresa Pérez Guevara, Ana Luisa Lubián Caballero, Héctor Díaz Torres y Lucy Montano Tamayo
CARTAS AL DIRECTOR
A propósito de un caso de filaria
Apropos of a case with filariasisMarta Bouza Suárez, Idalia Ayala Rodríguez y Blanca E. Duménigo Ripoll
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223
207
REV CUBANA MED TROP 1998;50(3):177-81
ARTÍCULOS ORIGINALES
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL "PEDRO KOURÍ"
Normalización de la técnica de reducción de placas
para diferenciar una infección por dengue de una infección
por fiebre amarilla
Lic. Mayling Álvarez Vera,1 Téc. Danay Valdés Palacios,2 Lic. Susana Vázquez Ramudo,3 Lic. Iselys Delgado Hernández,4
Téc. Serafina García Infante,5 Lic. Luis Morier Díaz6 y Dra. María Guadalupe Guzmán Tirado7
RESUMEN
Se normalizó la técnica de neutralización por reducción de placas para diferenciar una infección por dengue de una infección por fiebre amarilla. Para ello se utilizaron muestras de suero de donantes cubanos en los que el antecedente previo de vacunación o no con fiebre amarilla era conocido y de pacientes costarricenses con un cuadro clínico de dengue sin antecedentes de vacunación con fiebre amarilla. El día óptimo de coloración de las placas fue el 5 y la menor dilución de suero capaz de diferenciar entre una infección por dengue de una por fiebre amarilla fue de 1/5. Dada la elevada especificidad de la técnica normalizada, se podrán realizar estudios de factores de riesgo de dengue hemorrágico en individuos vacunados por fiebre amarilla, tema de gran actualidad e importancia.
Descriptores DeCS: TESTS DE NEUTRALIZACIÓN/normas; DENGUE/diagnóstico; FIEBRE AMARILLA/diagnóstico.
1
Master en Virología. Licenciada en Microbiología. Aspirante a Investigadora.
2
Técnica en Procesos Biológicos.
3
Doctora en Ciencias Médicas. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar.
4
Licenciada en Microbiología.
5
Técnica en Microbiología.
6
Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar.
7
Doctora en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Profesora e Investigadora Titular.
La fiebre amarilla (FA) se ha mantenido como un problema importante de salud en las áreas selváticas y rurales de las Américas y en África. Las epidemias han involucrado a cientos de miles de casos en las últimas décadas a pesar de existir una campaña masiva de inmunización en la que se emplea la vacuna de virus vivo-atenuado de la cepa 17D.1,2
Se conocen 2 formas epidemiológicas principales, la FA urbana que se transmite de persona a persona a través de la picadura del mosquito Aedes aegypti, y la FA selvática que se encuentra generalmente en los monos y
se transmite de mono a mono a través de la picadura de mosquitos del género Haemagogus en América y de la especie Aedes africanus en África.
El diagnóstico específico de esta entidad depende de estudios histopatológicos, del aislamiento del virus, de la demostración del antígeno viral y de la respuesta específica de anticuerpos.
No se conoce si la vacunación por fiebre amarilla (FA) sería capaz de proteger frente a una infección por dengue o de lo contrario actuar sensibilizando frente a una infección por este agente. Además, existen pocos
estudios al respecto, principalmente porque las áreas endémicas de ambas enfermedades no coincidían. Con el aumento de los casos de dengue y de fiebre hemorrágica del dengue (FHD) en nuestra región esta situación ha cambiado y existen áreas endémicas de dengue donde la vacunación por FA es frecuente debido a la existencia de FA selvática.
Teniendo en cuenta lo anterior se hace necesario desarrollar estudios que permitan determinar las consecuencias positivas (protección) o negativas (inmunoamplificación) de la vacunación con FA en relación con el dengue.3-5 Para esto es indispensable contar con ensayos suficientemente específicos que permitan determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes al virus de la FA.
En este trabajo se presenta la normalización de la técnica de neutralización por reducción de placas para la FA y se determina, frente a un grupo de sueros humanos de reactividad diferente para dengue y FA, la menor dilución del suero capaz de diferenciar entre una infección por dengue y una infección por FA.
MÉTODOS
CULTIVOS CELULARES
Células de línea de riñón de mono verde africano, Vero, utilizadas para el crecimiento del virus. Las células
Vero (ATCC) fueron crecidas en medio 199 con 10 % de suero fetal bovino inactivado (SFBI) a 56 °C durante 30 min a una razón de pase semanal de 1/8 e incubadas a 37 °C. El medio de mantenimiento de dichas células consistió en el medio de crecimiento pero suplementado con SFBI al 2 %.
Células de línea BHK-21 clono 15 (riñón de hámster)utilizadas en la titulación viral. Las células
BHK-21 clono 15, gentilmente donadas por el profesor
S.B.Halstead, de la Fundación Rockefeller, fueron
mantenidas a 37 °C en frascos plásticos de 75 cm2 con medio MEM con aminoácidos no esenciales y 10 % de SFBI a una razón de pase semanal de 1/8. El medio de mantenimiento de dichas células consistió en el medio de crecimiento pero suplementado con SFBI al 2 %.
VIRUS
La cepa vacunal 17D de FA, gentilmente donada por la doctora Evelia Quiroz del Centro Conmemorativo Gorgas de Panamá, y con 2 pases en células Vero fue pasada en el mismo sustrato celular. En células Vero crecidas en frascos plásticos de 25 cm2 con monocapa
confluente fueron inoculados 500 µL del virus. Después de 1 h de incubación a 37 °C se añadió el medio de mantenimiento (199 con 2 % de SFBI) y se incubó durante 4 a 6 d a 37 °C. La cosecha viral se realizó cuando el efecto citopático (ECP) fue máximo. Una vez realizada la cosecha viral, el virus se alicuotó y conservó a -85 °C para su titulación posterior y utilización en las pruebas de neutralización por reducción de placas.
MUESTRAS DE SUERO
Se estudió un total de 20 sueros, 8 procedentes de donantes cubanos sanos, en los que el antecedente previo de vacunación o no con la vacuna 17D era conocido, y 12 procedentes de pacientes costarricenses clínicamente sospechosos de dengue sin antecedentes de vacunación por FA.
TITULACIÓN VIRAL
Para la titulación viral se siguió el método descrito por Morens y otros.6 De forma breve, a partir de cultivos de células BHK-21 clono 15 con 7 d de siembra se preparó una suspensión de 2x105 células/mL en el medio de crecimiento de éstas. Para la titulación viral se sembraron 500 µL de la suspensión celular por pocillo, en placas plásticas de poliestireno de 24 pocillos. Después de 1h de incubación a temperatura ambiente, se inocularon 50 µL (por triplicado) de las diluciones en base 10 del virus. El medio de mantenimiento de las células, consistente en 3 % de carboximetilcelulosa viscosidad media en medio MEM con 10 % SFBI, se añadió a razón de 500 µL/pocillo después de 4h de incubación a 37 °C en incubadora de CO2 al 5 %. Las placas plásticas fueron incubadas en las mismas condiciones durante 5 d. La coloración de las células con una solución de naftol blue-black y ácido acético y el conteo de las placas virales se realizó al quinto día posinoculación.
ESTUDIOS SEROLÓGICOS
Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH).
A cada muestra de suero se le determinó la presencia de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación (IH) al virus dengue 2 utilizando un antígeno preparado en cerebro de ratón lactante y extraído mediante el método de sacarosa acetona según describen Clarke y Casals,7 adaptado para microtécnica. Todo suero que presentaba títulos de anticuerpos mayores o iguales que 1/20 se consideró como positivo de anticuerpos a dengue. Las muestras de
pacientes que presentaron títulos de anticuerpos IH ≥ 1/1 280 se clasificaron como portadores de una infección secundaria según el criterio establecido en las guías para la prevención y control del dengue en las Américas.8
Prueba de neutralización por reducción de placas (PNRP). Se utilizó el método descrito por Morens
y otros.6 Se realizaron diluciones al doble de cada muestra de suero desde 1/2,5 a 1/80 en medio MEM con SFBI al 2 %. Un volumen de 100 µL de cada suero fue incubado a 37 °C durante 1 h con 100 µL de la dilución de trabajo del virus calculado para dar 10-20 ufp/50 µL en el volumen final de la mezcla virus-suero. Después de la incubación, fueron inoculados por triplicado 50 µL de la mezcla virus-suero sobre células BHK21 previamente sembradas en placas de poliestireno de 24 pocillos en forma similar a como se describió para la titulación viral. Los pasos siguiente fueron similares a los antes descritos. Para cada suero, se calculó la media del número de placas y su porcentaje de reducción en relación con el virus control. Toda muestra con un porcentaje de reducción del número de placas mayor o igual que 50 % se consideró positiva de anticuerpos.
Elisa de captura de IgM. En los sueros de pacientes
clínicamente sospechosos de dengue se determinó la presencia de anticuerpos IgM a los 4 serotipos de dengue mediante un ELISA de captura9 con el objetivo de confirmar la infección reciente por estos agentes.
RESULTADOS
Para cumplimentar los objetivos propuestos, ini-cialmente, crecimos la cepa vacunal 17D de la FA en cultivos de células Vero, y observamos la aparición del efecto citopático característico (redondeamiento celular y desprendimiento) al sexto día posinoculación. Para la titulación viral por placas se aplicó el método descrito por Morens y otros6 para los virus del dengue, y se obtuvieron títulos infectivos de 2,8x105 ufp/mL. El momento de coloración de las placas se determinó mediante la tinción de las células a intervalos diferentes y se determinó que el quinto día era el óptimo.
Para el montaje de la técnica de neutralización por reducción de placas primero se utilizaron sueros humanos diluidos desde 1/10 hasta 1/80, lo que permitió reconocer títulos variables de anticuerpos principalmente dependientes del tiempo de vacunación. Después, considerando que un gran número de individuos vacunados pueden tener niveles bajos de anticuerpos a FA decidimos utilizar diluciones 1/2,5 y 1/5 siguiendo las recomendaciones de Poland y otros, quienes utilizan diluciones de 1/2 y 1/4.10
En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos en un grupo de sueros de individuos cubanos con antecedentes o no de vacunación por FA y de inmunidad conocida a dengue, y en la tabla 2 se presentan los títulos de anticuerpos neutralizantes a la cepa 17D de la FA en sueros de pacientes clínicamente sospechosos de dengue sin antecedentes de vacunación por FA. Los sueros fueron estudiados a las diluciones 1/2,5; 1/5 y 1/10. Como puede observarse, 7 casos presentaban niveles bajos de anticuerpos a dengue que oscilaron entre 1/20 a 1/40 y 5 eran portadores de una infección de tipo secundaria dado por los niveles de anticuerpos a dengue mayores o iguales que 1/10 240. Algunos sueros mostraron entrecruzamiento antigénico con la FA a diluciones de 1/2,5; pero a diluciones de 1/5 en ninguno se detectó la presencia de anticuerpos neutralizantes (Nt) a FA.
TABLA 1. Determinación de la presencia de anticuerpos neutralizantes a la cepa 17D de la FA en sueros humanos de individuos sanos, inmunes y no inmunes a dengue y FA
Vacunación FA Anticuerpos IH Anticuerpos Anticuerpos No. (año) Dengue 2 IgG/ELISA Nt a FA Dengue 2 1 <1/20 NR <1/10 2 <1/20 <1/20 <1/10 3 1/20 2 0 <1/10 4 1990 NR 2 0 1/40 5 1983 <1/20 <1/20 1/10 6 1983 1/160 1/160 <1/10 7 1983 1/160 1/160 <1/10 8 1986 1/40 1/40 1/20 NR: No realizado.
TABLA 2. Determinación de la presencia de anticuerpos neutralizantes a la cepa 17D de la FA en sueros de pacientes clínicamente sospechosos de dengue sin antecedentes de vacunación por FA
Título de Tipo de Título de Anticuerpos anticuerpos infección anticuerpos No. IgM a dengue IH (dengue 2) por dengue Nt a FA
1 + ≥1/10 240 Sec. <1/5 2 + 1/40 Prim. <1/5 3 + 1/40 Prim. <1/5 4 + 1/40 Prim. <1/5 5 + ≥1/10 240 Sec. <1/5 6 + ≥1/10 240 Sec. <1/5 7 + ≥1/10 240 Sec. <1/5 8 + 1/20 Prim. <1/5 9 + 1/80 Prim. <1/5 1 0 + 1/40 Prim. <1/5 1 1 + ≥1/10 240 Sec. <1/5 1 2 + 1/80 Prim. <1/5
DISCUSIÓN
La FA y el dengue son Flavivirus estrechamente relacionados, que comparten en su envoltura antígenos comunes de grupo capaces de inducir la producción de anticuerpos de reactividad cruzada detectables mediante diferentes técnicas serológicas como la IH y los ensayos inmunoenzimáticos.11-13 Esta estrecha relación ha hecho sugerir a los investigadores que la inmunidad natural o adquirida mediante vacunas para la FA podría tener algún efecto sobre la enfermedad del dengue. Aún más, se ha planteado si una vacuna para el dengue pudiera tener algún efecto sobre la infección por FA o algún otro Flavivirus relacionado como la encefalitis japonesa (EJ).5,14 Tres posibles efectos podrían observarse en el primer caso: 1) incremento del riesgo de desarrollo de la FHD debido a la producción del fenómeno de inmu-noamplificación dependiente de anticuerpos, 2) efecto protector y 3) no producirían alguna incidencia sobre la enfermedad.
Estudios en voluntarios realizados por Sabin parecen sugerir que la presencia de anticuerpos antiFA no resulta en protección cruzada para el dengue.15 En su lugar, la inmunidad a FA parece aumentar la respuesta inmune a cepas atenuadas de dengue. En este sentido, Scott y
otros, en 1983, demostraron un aumento en la magnitud y
duración de los anticuerpos específicos a dengue en un grupo de voluntarios inmunes a FA frente a otro grupo no inmune.15 Estos resultados indican aparentemente, que los anticuerpos antiFA "amplificaron" la infectividad de la cepa vacunal PR159/S1 del virus dengue 2 utilizada en el estudio, pudiendo esperarse que la presencia de anticuerpos de reactividad cruzada no neutralizantes para dengue pudieran resultar en infecciones más agresivas.16 No obstante lo anterior, hasta el momento no se ha atribuido ningún caso de FHD a una secuencia de infección de un Flavivirus no dengue-dengue,5 además, las infecciones por dengue en el personal militar norteamericano radicado en Viet Nam fueron muy ligeras17 y sueros de individuos inmunes a otro Flavivirus, el que produce la EJ, han fallado para amplificar la infección por dengue 2 en líneas celulares de macrófagos.18
Las regiones endémicas de FA están restringidas a áreas tropicales de Suramérica y África, mientras las de FHD se localizan en el Sudeste Asiático, el Caribe y Centroamérica.1,8 Hasta finales de los años 80 las zonas endémicas de FA y FHD habían sido diferentes, lo que explica el por qué este problema ha sido tan poco estudiado. Con el desarrollo de epidemias de FHD en Venezuela, Brasil y Colombia, y de FD en Perú y Bolivia, estas regiones se superponen por primera vez, por lo que surge la disyuntiva de evaluar las ventajas y potenciales
desventajas de la vacunación con FA a la población general de estos países como un problema real. Existen algunas evidencias de una relación directa en el número de casos de FHD asociados con una historia previa de vacunación por FA en la región de Bucaramanga, Colombia (Villar LA. Comunicación personal).
Para realizar cualquier estudio al respecto se hace necesario contar con una técnica serológica con suficiente especificidad que permita determinar la presencia de anticuerpos a FA aun en individuos que han sufrido una o varias infecciones por dengue. Por tal motivo nos propusimos normalizar la técnica de neutralización por reducción de placas para determinar la presencia de anticuerpos a este agente. Varios estudios han demostrado que después de 30 años posvacunación con la cepa 17D de la FA, los anticuerpos neutralizantes están presentes aunque en títulos bajos, por lo que decidimos estudiar también un grupo de sueros de individuos con antecedentes conocidos de vacunación o no por FA y de la presencia de anticuerpos a dengue y determinar la menor dilución de suero capaz de discriminar la presencia de los anticuerpos antiFA.
En los sueros de individuos cubanos se pudo observar 2 casos sin anticuerpos a dengue ni antecedentes de vacunación en los que no se detectó la presencia de anticuerpos Nt a FA en títulos de 1/10. Un caso sin antecedentes de vacunación y con anticuerpos a dengue no presentó anticuerpos Nt a FA como era de esperar. Un caso sin anticuerpos a dengue pero con antecedentes de vacunación demostró la presencia de anticuerpos Nt a FA en títulos de 1/10. De los restantes casos que mostraban anticuerpos a dengue y antecedentes de vacunación por FA, 2 mostraron títulos de anticuerpos antiFA de 1/20 y 1/40. En 2 sueros no se detectaron anticuerpos antiFA, lo que podría deberse a que el título fuera menor que la dilución de suero estudiada. Uno de ellos probado posteriormente mostró títulos de anticuerpos de 1/5.
Para estudiar el posible entrecruzamiento antigénico de los anticuerpos a dengue frente al virus de la FA estudiamos 12 sueros de pacientes de dengue con títulos variables de anticuerpos a éste sin historia previa de vacunación con FA y procedentes de un área geográfica donde este agente no circula (Costa Rica). A la dilución 1/5 del suero no se observó entrecruzamiento antigénico entre ambos agentes. Estos resultados sugieren que la dilución 1/5 es óptima, ya que se mantiene la especificidad de los anticuerpos y permite discriminar la respuesta de anticuerpos específica frente a cada agente.
Los resultados obtenidos nos permiten contar con una técnica útil y de gran especificidad para la realización de estudios serológicos que permitan dilucidar la problemática planteada anteriormente.
SUMMARY
The plaque reduction neutralization assay was standardized to differentiate an infection caused by dengue from another infection produced by yellow fever. Serum samples from Cuban donors were used to this end. Information on previous vaccination against yellow fever was available. Samples from Costa Rican patients with a clinical picture of dengue and with no antecedents of vaccination against yellow fever were also utilized. The optimal plaque staining day was the fifth day and the smallest serum dilution capable of differentiating an infection resulting from dengue from another infection caused by yellow fever was of 1/5. According to the high specificity of the standardized technique, risk factor studies of dengue hemorrhagic fever could be made among individuals vaccinated against yellow fever, which is a present and important topic.
Subject headings: NEUTRALIZATION TESTS/standards; DENGUE/diagnosis; YELLOW FEVER/diagnosis.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 18 de enero de 1998. Aprobado: 20 de mayo de 1998. Lic. Mayling Álvarez Vera. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
REV CUBANA MED TROP 1998;50(3):182-5
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL “PEDRO KOURÍ”
Incidencia de los Adenovirus en las conjuntivitis virales
Dra. Gisset Torres Rojas,1 Dr. Ángel Goyenechea,2 Lic. Clara Savón,3 Lic. Odalys Valdés4 y Dra. Isabel Oropesa5
RESUMEN
Se llevó a cabo un estudio de incidencia de los Adenovirus en las conjuntivitis virales, para lo cual se realizó un diseño muestral y se tomaron muestras de exudado conjuntival a 150 pacientes con diagnóstico de conjuntivitis de presuntiva causa viral, en el Hospital Oftalmológico "Ramón Pando Ferrer" en el período comprendido entre julio y diciembre de 1994. Las muestras fueron inoculadas en cultivo celular y a las que presentaron un efecto citopatogénico sugestivo de infección por Adenovirus, se les realizó la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Se usaron anticuerpos monoclonales contra Adenovirus, lo que permitió identificarlas como pertencientes a la familia Adenoviridae. Se utilizó la técnica de hemaglutinación, con hematíes de monos y ratas como sistema indicador, para agrupar los aislamientos previamente identificados mediante la técnica de IFI, después se les realizó el análisis por enzimas de restricción del genoma viral, lo cual posibilitó la clasificación en tipos. Los resultados de este estudio mostraron una incidencia de los Adenovirus en las conjuntivitis virales de 20 %, con un intervalo de confianza del 14-26 %, y un índice de confiabilidad de 95 %. Se demostró que el serotipo 37 fue el que produjo conjuntivitis con mayor frecuencia.
Descriptores DeCS: CONJUNTIVITIS VIRAL/etiología; INFECCIONES HUMANAS POR ADENOVIRUS/epidemiología; TECNICA DEL ANTICUERPO FLUORESCENTE INDIRECTA/métodos; TESIS DE HEMAGLUTINACION/métodos; GENOMA VIRAL; ADENOVIRUS HUMANO/genética; ADENOVIRUS HUMANO/aislamiento & purificación.
1
Master en Ciencias. Especialista de I Grado en Microbiología.
2
Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular.
3
Doctora en Ciencias Biológicas. Licenciada en Microbiología. Investigadora Titular.
4
Licenciada en Bioquímica. Investigadora Aspirante.
5
Especialista de II Grado en Microbiología. Investigadora Auxiliar.
Los Adenovirus fueron reportados por primera vez como agentes virales en 1953, durante intentos por establecer una línea celular continua procedente de tejido tonsilar y adenoideo.1 En la actualidad se reconocen 42 serotipos, que producen afecciones en humanos al nivel de los sistemas respiratorio, cardiovascular, digestivo y urinario, entre otros.2 Al nivel ocular pueden producir clínicamente 3 grandes síndromes: querato-conjuntivitis epidémica (QCE), fiebre faringo-conjuntival y conjuntivitis folicular aguda no específica, todas estas entidades tienen en común la presencia de conjuntivitis caracterizada por enrojecimiento de la conjuntiva, edema, lagrimeo, fotofobia, sensación de cuerpo extraño y frecuentes adenopatías preauriculares.3 Las conjuntivitis infecciosas y dentro de ellas las virales, constituyen una
importante causa de morbilidad y sustanciales pérdidas económicas, dentro de ellas los Adenovirus desempeñan una función importante desde el punto de vista causal.4 Desde que en 1980, Wadell y otros5 establecieron los patrones de restricción para los diferentes serotipos de Adenovirus, se ha logrado un avance notable en el campo de la epidemiología molecular de estos agentes, lo que ha permitido aumentar el conocimiento acerca del origen de diferentes entidades clínicas y ha posibilitado un diagnóstico eficaz y rápido de epidemias y brotes.
Hasta el momento, no existen reportes en nuestro país que permitan conocer la incidencia de los Adenovirus en las conjuntivitis virales, ni el serotipo más frecuentemente implicado en esta afección, por lo cual conocer estos datos fue nuestro objetivo fundamental,
se utilizaron técnicas como inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemaglutinación y el análisis del genoma viral con endonucleasas de restricción.
MÉTODOS
Pacientes y muestras. Para realizar este estudio se
escogió el Hospital Oftalmológico "Ramón Pando Ferrer", que reporta el mayor número diario de atenciones de enfermedades oculares, al nivel provincial. Se realizó un diseño muestral que tenía en cuenta la frecuencia de los casos de conjuntivitis virales en años anteriores y los reportes de la literatura, que señalan una incidencia de los Adenovirus en las conjuntivitis virales entre 20 y 80 %.6,7 El diseño consistió en un muestreo simple aleatorio, con 95 % de confiabilidad y precisión de ± 0,05 y se calculó el tamaño de la muestra, la cual quedó constituida por 150 pacientes,que cumplieron los requisitos siguientes:
1. Diagnóstico de conjuntivitis de presuntiva causal viral, basado en la presencia de inflamación de la conjuntiva, lagrimeo, prurito, fotofobia, folículos y adenopatías preauriculares.
2. Tiempo de evolución de aproximadamente 5 d. 3. No uso previo de antivirales.
4. Ausencia de otra enfermedad ocular acompañante. Conociendo el promedio reportado anteriormente, que fue de 33 casos mensuales, se decidió tomar muestra a 25 casos por mes, y se completó a 150 en el semestre estudiado, de julio a diciembre de 1994. Para conocer la incidencia de Adenovirus en las conjuntivitis agudas con diagnóstico presuntivo de causa viral, se utilizó la fórmula de proporción y se estimó su error.
A estos pacientes se les realizó exudado conjuntival con hisopo estéril; para el traslado de la muestra se utilizó solución Hanks con lactoalbúmina y antibióticos: 150 U de penicilina, 150 mg de estreptomicina y 5 mg de anfotericín B/mL a 4 °C. Las muestras se conservaron a - 70 °C hasta su inoculación.
Aislamiento viral. Para la inoculación de las muestras
se utilizaron cultivos de células procedentes de carcinoma humano cervical (HELA-ATCC) en medio esencial mínimo con glutamina, suero de ternera fetal al 2 % y antibióticos (se utilizaron como controles positivos, los serotipos 3, 7, 9 y 15; y como controles negativos, cultivo celular sin inocular). Se realizó la incubación de las muestras a 37 °C, y se observó diariamente en busca de la aparición de efecto citopático (ECP); en caso de no observarse se realizaron 3 pases ciegos, antes de reportar una muestra como negativa.
Identificación viral por inmunofluorescencia indirecta y hemaglutinación. Se realizó la técnica de IFI,
a partir del cultivo celular inoculado con las muestras que presentaron ECP, según el protocolo descrito por Knight y otros.8 Se usaron anticuerpos monoclonales antihexón (Chemicon Light Diagnostic, EE.UU.) de Adenovirus de acuerdo con las indicaciones del productor, se consideró positiva la presencia de 5 o más células fluorescentes por campo.
A las muestras positivas por IFI se les realizó la técnica de hemaglutinación, con hematíes de mono y rata según el protocolo descrito por Hierholzer9 (con el fin de clasificarlas en grupos hemaglutinantes). Para la interpretación de la prueba se consideró la presencia o ausencia de hemaglutinación, de acuerdo con los patrones propuestos por el anterior autor, para los serotipos productores de conjuntivitis.
Extracción del ADN y análisis de restricción. El
ADN de los aislamientos fue extraído a partir de cultivos de células HELA infectadas, según el método descrito por Hirt y otros.10 Para comprobar la calidad y con-centración del ADN extraído se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, se utilizó como buffer de corrida el Tris-Borato EDTA. Se estimó la concentración de ADN correspondiente a cada muestra, para su posterior digestión se consideró como adecuada la concentración de 2 µg. Se digirió cada una de las muestras en una mezcla que incluyó ADN extraído y 25 unidades de la enzima (Hind III Promega), teniendo en cuenta las indicaciones del productor), en un volumen final de 50 µL de agua bidestilada, y se mantuvo 3 h a 37 °C.11
Para la detección del producto digerido se realizó una electroforesis (se aplicaron 20 µL de la mezcla), en un gel de agarosa al 0,8 % teñido con bromuro de etidium. Se dejó migrar a 80 V por 3 h. Se utilizaron marcadores de pesos moleculares (Lambda ADN digerido con ECORI--Hind III y Lambda ADN digerido con Hind III) y 2 controles positivos que correspondieron a ADN extraídos de cepas de Adenovirus 3 y 7, con los cuales se siguió igual procedimiento.
Las bandas fueron visualizadas en transiluminador de luz ultravioleta (Transiluminator 2001 Macrowe) y fotografiadas.
RESULTADOS
En este trabajo se encontró que de las 150 muestras inoculadas, en 30 se observó un efecto citopático sugestivo de infección por Adenovirus,"racimos de uvas". Al realizarse la IFI para identificar los aislamientos como pertenecientes a la familia Adenoviridae,
encontramos 100 % de coincidencia entre la observación de los cambios morfológicos celulares y la positividad de las muestras por la IFI. Estos resultados permitieron conocer (según los métodos antes descritos), que la incidencia de Adenovirus en las conjuntivitis virales en el presente estudio, fue de 20 %, con un intervalo de confianza de 14 a 26 % y un índice de confiabilidad de 95 %.
Al realizar la técnica de hemaglutinación a las muestras previamente identificadas por IFI, todas quedaron incluidas dentro de los grupos hemaglutinantes I y II; por lo tanto se decidió utilizar la enzima Hind III, que permite diferenciar entre los serotipos productores de conjuntivitis de estos 2 grupos y distinguir las diferentes variantes que existen dentro de un mismo serotipo.12 En la figura, en el canal 1, se encuentra el marcador de peso molecular Lambda ADN digerido con ECOR I - Hind III, y en los canales 18 y 19 se encuentra el marcador de peso molecular Lambda ADN digerido con Hind III. Los patrones de restricción que se observan en los canales 2 y 11, se corresponden con los Adenovirus 7 y 3, respectivamente, que se usaron como controles positivos (la utilización de esta enzima permitió identificar al control positivo de Adenovirus 7, como la variante 7a de acuerdo con Kajon y otros).12 Según los patrones
Fig. Gel de agarosa al 0,8 % teñido con bromuro de etidium, donde se muestran los diferentes patrones obtenidos de la digestión de los genomas virales procedentes de casos clínicos.
Canal:
1. Marcador de peso molecular Lambda ADN digerido con Hind III-ECOR I.
18, 19. Marcador de peso molecular Lambda ADN digerido con Hind III.
2. Cepa prototipo de Adenovirus 7a (previamente descrita). 11. Cepa prototipo de Adenovirus 3 (previamente descrita). 3, 6. Casos clínicos correspondientes al serotipo 7. 10, 14. Casos clínicos correspondientes al serotipo 3.
4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16 y 17. Se encuentran casos clínicos cuyos patrones se corresponden con 2 variantes del serotipo 37.
propuestos por el anterior autor en 1992,12 por Johansson en 1993,13 y por Wigand y otros en 1989,14 4 de las muestras aplicadas presentaron patrones idénticos a los observados en las posiciones 10 y 14, las cuales corresponden al serotipo 3, 4 muestras correspondieron al serotipo 7a (canales 3 y 6), y en el resto de los canales, se observan patrones que pertenecen a variantes del serotipo 37, que se obtuvieron en 21 muestras. Al realizarse la digestión una muestra se degradó (tenía un patrón I de hemaglutinación).
DISCUSIÓN
En estudios de incidencia de Adenovirus en con-juntivitis virales, autores como Bueno y otros4 en 1993, obtuvieron un resultado de 63 %, con una buena correlación clínico-microbiológica, estudios previos realizados por Irving en 1981,6 Aoki en 19827 y Mc Minn en 1991,15 señalan porcentajes de aislamientos de 20, 80 y 60 %, respectivamente. Las variaciones de incidencia observadas en los diferentes reportes, pueden justificarse por las condiciones epidemiológicas específicas de cada país, y por los cambios anuales, que pueden ocurrir dentro de una misma zona. Los serotipos de Adenovirus causantes de conjuntivitis producen tantos casos esporádicos como epidémicos, y dependiendo de esta situación habrá también fluctuaciones en el número de aislamientos.
El análisis de restricción del genoma viral permite clasificar con alta especificidad a los Adenovirus, y ha contribuido a esclarecer las reacciones cruzadas que se observan por otras técnicas; posibilita además, el incremento del conocimiento sobre la epidemiología molecular de estos agentes. La utilización de esta técnica permitió tipificar nuestros aislamientos, nuestros resultados son similares a los de otros autores,16,17 que plantean que los serotipos 3, 7 y 37 están entre los principales productores de enfermedad ocular. De acuerdo con lo reportado en la literatura, los aislamientos de los serotipos 3 y 7 son más frecuentes en el verano, y los del serotipo 37 se mantienen constantes durante todo el año.18 En el presente estudio, la distribución de los aislamientos del serotipo 37 coincide con lo reportado; sin embargo, en el caso de los serotipos 3 y 7 no se pudo establecer la estacionalidad. Estos resultados no son concluyentes, ya que para precisar la relación entre la circulación de los diferentes serotipos de Adenovirus y la época del año, es necesario realizar un estudio longitudinal en un período mayor. Hay que tener en cuenta además, que los trabajos que reportan esa relación fueron realizados en zonas geográficas con estaciones bien delimitadas, lo cual no sucede en nuestro país.
Al corresponder el 70 % de nuestros aislamientos a 2 variantes del serotipo 37, se confirma lo planteado por
Kemp en 1983,19 e Higuchi en 1990, 20 en cuanto a los cambios en la causa de las queratoconjuntivitis, y la posibilidad del serotipo 37 y de sus variantes de provocar casos esporádicos y epidémicos, en niños y adultos. El grupo D, al que pertenece el serotipo 37, exhibe una gran variabilidad, con 29 variantes reconocidas.21 Es carac-terístico en este grupo la presencia de cepas seroló-gicamente intermedias; es comprensible por tanto, la necesidad de utilizar endonucleasas de restricción para distinguir entre los aislamientos.
En la epidemiología de las QCE, ocupan un lugar importante los casos esporádicos de conjuntivitis y queratoconjuntivitis (como los que reportamos en el presente estudio), ya que son ellos los que mantienen a los virus productores de epidemias circulando en la comunidad, y al unirse este factor a la violación de las normas de higiene individual y colectiva, se favorece el desencadenamiento de las epidemias.22
En nuestro país no existían estudios previos de incidencia de los Adenovirus en las conjuntivitis virales, por lo cual este trabajo constituye el primer reporte, con el serotipo 37 como el agente que con mayor frecuencia fue aislado, seguido de los serotipos 3 y 7.
SUMMARY
A study about the incidence of Adenovirus on viral conjunctivitis was conducted. A sample design was made and samples of conjunctival exudate were taken from 150 patients with diagnosis of apparently viral conjunctivitis at the "Ramón Pando Ferrer" Ophthalmological Hospital from July to December, 1994. S a m p l e s were innoculated in cell culture and the indirect immunofluorescence technique was applied to those with a cytopathogenic effect that suggested infection due to Adenovirus. Monoclonal antibodies were used against Adenovirus allowing t o identify them as part of the Adenoviridae family. The hemoagglutination technique was used with erythrocytes of monkeys and rats as an indicator system in order to group the isolates previously identified by the indirect immunofluorescence technique. Later on, it was made an analysis by restriction enzymes of the viral genome to enable typing. The results of this study showed an incidence of Adenovirus on viral conjunctivitis of 20 %, with a confidence interval between 14 and 26 % and a reliability index of 95 %. It was proved that serotype 37 caused conjunctitivis more frequently.
Subject headings: CONJUNCTIVITIS, VIRAL/etiology; ADENOVIRUS INFECTIONS, HUMAN/epidemiology; FLUORESCENT ANTIBODY TECHNIQUE, INDIRECT/ methods; HEMAGGLUTINATION TESTS/methods; GENOME, VIRAL; ADENOVIRUSES, HUMAN/genetics; ADENOVIRUSES, HUMAN/isolation & purification.
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Recibido: 28 de agosto de 1997. Aprobado: 30 de abril de 1998. Dra. Gisset Torres Rojas. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
REV CUBANA MED TROP 1998;50(3):186-90
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL “PEDRO KOURÍ”
Detección de herpesvirus en pacientes
inmunocomprometidos con meningoencefalitis, mediante
la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
Dra. Vivian Kourí,1 Lic. Carlos Suárez,2 Dra. Sonia Resik3 y Téc. Serafina García4
RESUMEN
Se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) múltiple para detectar, en un solo tubo de reacción, la presencia del virus de herpes simple (VHS), Citomegalovirus (CMV), virus de Epstein Barr (VEB), virus de la varicela zóster (VVZ) y/o el virus del herpes humano 6 (VHH6). Cincuenta líquidos cefalorraquídeos de pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida y con sospecha clínica de meningoencefalitis por el VHS, recibidos en el Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual del Departamento de Virología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" entre los años 1993 y 1996 fueron analizados; de éstos, 4 resultaron positivos al VHS, 3 a CMV, 2 al VVZ y 1 al VHH6, para 20 % de positividad. Se correlacionaron los resultados de la RCP con los hallazgos clínicos que presentaban los pacientes en el momento que se les realizó la punción lumbar. La introducción de esta técnica en el laboratorio permite contar con una herramienta útil, por su sencillez y rapidez, para el diagnóstico de las meningoencefalitis por herpesvirus.
Descriptores DeCS: REACCION EN CADENA POR POLIMERASA/métodos; MENINGOENCEFALITIS/diagnóstico; SINDROME DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA/líquido cefalorraquídeo; INFECCIONES OPORTUNISTA S RELACIONADAS CON SIDA; INFECCIONES POR HERPESVIRIDAE; HERPESVIRIDAE/aislamiento & purificación.
1
Master en Ciencias. Especialista de I Grado en Microbiología.
2
Licenciado en Microbiología.
3
Especialista de II Grado en Microbiología. Investigadora Agregada.
4
Técnica en Microbiología.
Se conoce que existen hasta el momento actual 8 herpesvirus que afectan al hombre. Éstos son el virus tipo 1 del herpes simple (VHS1) y el tipo 2 (VHS2), el virus de la varicela zóster (VVZ), el Citomegalovirus (CMV), el virus del herpes humano 6 (VHH6), el virus del herpes humano 7 (VHH7), el virus de Epstein-Barr (VEB) y el herpesvirus humano 8 (VHH8) recientemente descrito y que se encuentra asociado con el Sarcoma de Kaposi.1-3 A pesar de que algunas de las enfermedades causadas por herpesvirus presentan cuadros clínicos bien definidos, en muchas ocasiones diferentes herpesvirus pueden producir un mismo cuadro clínico lo que hace más difícil su diagnóstico.4
Esto reviste gran importancia en los pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), donde se conoce que las infecciones oportunistas, dentro de las cuales los herpesvirus desempeñan una
función importante, complican el curso de la enfermedad. Se plantea por algunos autores que cerca de la mitad de las enfermedades oportunistas que afectan el sistema nervioso central (SNC) en los pacientes VIH positivos son ocasionadas por virus, éstas incluyen aquéllas causadas por herpesvirus; fundamentalmente el CMV y en menor número los VHS tipos 1 y 2, y el VVZ. El VHH6 puede ser un patógeno importante en pacientes inmunodeprimidos, así como el VEB, que se ha encontrado con una elevada frecuencia en los linfomas primarios de pacientes con sida.5-7
Obtener un diagnóstico de estas enfermedades en pacientes seropositivos o no al VIH es un gran problema por la baja sensibilidad que tienen los métodos convencionales de cultivo para el LCR.8 El examen histológico del tejido cerebral requiere un proceder muy invasivo y sólo está indicado en la minoría de los casos.
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) ha sido propuesta recientemente para el diagnóstico de algunas enfermedades neurológicas.9-11
En nuestro trabajo nos proponemos estudiar muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con sida y sospecha clínica de meningoencefalitis por el VHS, para ello se usó la técnica de RCP anidada múltiple, que permite detectar en un solo tubo de reacción diferentes herpesvirus según la talla del producto amplificado.
MÉTODOS
Muestras. Se utilizaron 50 LCRs de pacientes con
sida y sospecha clínica de meningoencefalitis por el VHS, que fueron recibidos en el Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS) del Departamento de Virología del Instituto de Medicina Tropical"Pedro Kourí" (IPK) en el período comprendido entre los años 1993 y 1996, y que después de ser procesados para aislamiento viral en el momento en que se recibieron, fueron mantenidos a -70 °C hasta su utilización en este estudio.
Aislamiento viral. Cada uno de los casos fue
inoculado por duplicado en cultivo de células Vero (línea celular derivada de riñón de mono verde africano, subcultivos 129 a 135) y posteriormente se le dieron 3 pases a ciegas, durante todo este período se observaron los tubos inoculados a diario.12
Reacción en cadena de la polimerasa. Se utilizó otra
alícuota de cada caso para realizar una RCP anidada múltiple que permite detectar en un solo tubo de reacción la presencia de VHS, CMV, VVZ, VEB y VHH6, según la talla de la banda de ADN que se observa; se incluye además, como control interno de la reacción 10 000 copias de un plásmido del virus de la pseudorrabia porcina (VPR). Tanto para la extracción del ADN como para la RCP se siguió el protocolo del doctor A. Tenorio y otros, del Instituto de Salud "Carlos III" de Majadahonda, Madrid.13 Los juegos de oligonucleótidos empleados también fueron donados de forma gentil por esta misma institución, los cuales amplifican un fragmento del gen de la ADN polimerasa viral.13
El producto de la RCP fue observado posteriormente, en un gel de agarosa al 4 % utilizando un patrón de peso molecular preparado por Tenorio y otros con casos positivos para los diferentes herpesvirus, lo que permite detectar los distintos tipos de herpes según la talla de la banda de ADN observada. Se utilizaron 2 controles negativos en cada ensayo, los cuales estaban constituidos por agua, uno se trabajó antes que las muestras y el otro al final, para así descartar cualquier contaminación y sólo se dieron como positivos aquellos casos que, al repetirse el ensayo usando otra alícuota de la muestra, resultaron positivos.
Se correlacionaron los resultados de la RCP con el cuadro clínico que presentaban los pacientes en el
momento en que se les realizó la punción lumbar. Para ello se revisaron las historias clínicas de los pacientes que resultaron positivos mediante la RCP, se prestó particular atención a los síntomas y signos neurológicos, resultado de los análisis convencionales así como en los estudios neurorradiológicos.
RESULTADOS
Los 50 LCRs utilizados para el estudio fueron ino-culados en células Vero; éstos se pasaron 3 veces en este mismo sistema celular y no se obtuvo efecto citopa-togénico durante el período que fueron observados.
Utilizando otra alícuota de las mismas muestras, se realizó una RCP anidada múltiple, se demostró la presencia de ADN de herpesvirus en el LCR de 10 de los 50 pacientes estudiados, para 20 % de positividad.
El VHS fue el que se encontró con mayor frecuencia en estos pacientes reportándose en 4 casos, seguido por el CMV que se encontró en 3 casos; el VVZ se detectó en 2 pacientes y el VHH6 en 1. En nuestro estudio no se reportó ningún caso positivo al VEB (fig.).
Fig. Resultados de la RCP. Gel de agarosa al 4 % teñido con bromuro de etidio, donde se observan las bandas de ADN correspondientes a los casos que resultaron positivos para los diferentes herpesvirus. VPR 140 pb, VHS 120pb, VVZ 98 pb, CMV 78 pb, VHH6 66 pb y VEB 54 pb. Parte superior: líneas 1 y 6, patrón de peso molecular; líneas 2-5, casos positivos al VHS, líneas 7 y 8, casos positivos al VVZ; línea 9, caso negativo. Parte inferior: línea 1, patrón de peso molecular; líneas 2-4, casos positivos a CMV; línea 5, caso positivo al VHH6.
Las formas clínicas que más frecuentemente se encontraron asociadas con el VHS fueron la encefalitis (2 casos) con manifestaciones de hipertensión endocraneana y en 1 de ellos con trastornos del lenguaje y el pensamiento, así como la meningitis y mielitis que fueron constatadas en los otros 2 casos. De los 4 pa-cientes estudiados, 3 tenían lesiones genitales activas por el VHS.
De los 3 casos reportados como positivos para el CMV sólo pudimos recuperar los datos clínicos en 2, donde las manifestaciones clínicas que se presentaron eran de retinitis por CMV y en 1 de ellos había además un diagnóstico clínico presuntivo de citomegalovirosis generalizada. Estos pacientes presentaban en el momento de la punción lumbar manifestaciones de hipertensión endocraneana.
Los 2 casos que resultaron positivos al VVZ presentaban manifestaciones de meningoencefalitis, y en 1 de ellos aparecieron varios días antes de presentarse el cuadro encefálico, lesiones en la cara y el cuello sugestivas de ser producidas por el VVZ o el VHS. En 1 caso se pudo demostrar la presencia del VHH6 en el LCR, éste se trataba de un paciente con síntomas de hipertensión endocraneana y hemiparesia (tabla).
TABLA. Hallazgos clínicos más frecuentes encontrados en los pacientes que resultaron positivos a los diferentes virus mediante la RCP
Virus Manifestaciones clínicas más frecuentes
VHS Encefalitis, hipertensión endocraneana meningitis y mielitis
Lesiones genitales activas por el VHS CMV Retinitis, citomegalovirosis generalizada
Manifestaciones de hipertensión endocraneana VVZ Meningoencefalitis, lesiones de herpes zóster en la piel VHH6 Hipertensión endocraneana y hemiparesia
Criptococosis cerebral previa
VHS= Virus del herpes simple. CMV= Citomegalovirus. VVZ= Virus de la varicela zóster. VHH6= Virus del herpes humano 6.
En todos los casos estudiados se encontró un gran deterioro físico de los pacientes en el momento en que se les realizó la punción lumbar y el conteo de CD4 también estaba muy bajo.
DISCUSIÓN
Utilizando el aislamiento viral en el cultivo de los LCRs no se pudo detectar la presencia de ningún caso positivo al VHS, lo cual ha sido reportado previamente,14-16 ya que es conocido que en los casos de encefalitis sin
toma meníngea puede no detectarse virus en el LCR;14 además, cuando éste está presente se encuentra en muy bajas concentraciones, lo que dificulta el diagnóstico por esta vía. Por otra parte, el CMV y el VVZ no crece bien en células Vero sino en fibroblastos, y el VHH6 en células de origen linfoide. Se utilizaron las células Vero porque los casos habían sido enviados a nuestro laboratorio con sospecha de meningoencefalitis por el VHS y este sistema celular es el empleado para el aislamiento de este virus; sin embargo, al realizar la RCP pudimos demostrar que las manifestaciones clínicas que presentaban los pacientes no habían sido producidas, en todos los casos, por el VHS. Otro factor que puede influir en que los casos positivos al VHS hayan resultado negativos por cultivo, es el hecho de que una parte de estas muestras se encontraban congeladas a -70 °C desde hacía varios años; no obstante, se debe señalar que en el momento en que se recibieron y se inocularon también habían resultado negativas.
El porcentaje de positividad encontrada al realizar la RCP (20 %) coincide con lo reportado por otros autores en estudios previos.16,17
El virus que más frecuente se encontró fue el VHS seguido por el CMV y el VVZ, lo cual no coincide en su totalidad con lo reportado por la mayoría de los autores. Se plantea que en inmunodeprimidos el herpesvirus aislado con mayor frecuencia es el CMV, seguido por el EBV y el VVZ, y en último lugar está el VHS.16 El herpes 6 también se ha reportado en pacientes inmunodeprimidos afectando el SNC,6,16 aunque existen otros estudios donde aparece el VHS como el virus aislado el mayor número de veces en el LCR de pacientes con encefalitis, seguido por el CMV y el VVZ.17
En nuestro estudio no diferenciamos entre los VHS tipos 1 y el 2, pero por los hallazgos clínicos encontrados, en 2 de los casos habían manifestaciones con predominio encefálico, las cuales son producidas de forma general por el herpes tipo 1,18 por lo que pensamos que en estos 2 pacientes, el virus causante de la encefalitis pudiera ser el VHS tipo 1. En los otros 2 casos, las manifestaciones eran principalmente de tipo meníngeo y con toma medular; que se encuentran más asociadas al tipo 2,18 además, se detectó la presencia de lesiones activas por VHS en estos pacientes, esto nos hace pensar que en estos 2 pacientes el cuadro se deba al VHS tipo 2.
En 2 de los 3 casos asociados con el CMV se constató la presencia de lesiones retinianas por CMV. Cinque y otros, Wolf y otros, y Roedel y otros, han reportado la alta frecuencia de infecciones del SNC por CMV en pacientes positivos al VIH, y en Cuba se ha encontrado de forma reiterada como hallazgo de necropsia en pacientes con sida.14,16,19,20
Los 2 casos positivos al VVZ tenían manifestaciones de meningoencefalitis, lo cual ha sido reportado por otros autores.16,17,21 Las lesiones en la piel causadas por el VVZ pudieron ser constatadas en 1 de los pacientes que resultaron positivos a este virus en LCR. En el otro caso no aparecieron lesiones en la piel, lo que ha sido reportado con anterioridad.21-23
En los reportes de otros autores se ha encontrado la presencia del VHH6 en el LCR, tanto de individuos sanos como de pacientes con afecciones del SNC,24 en especial en individuos inmunodeprimidos, produciendo cuadro de encefalitis,6,25 en nuestro caso el paciente presentaba manifestaciones neurológicas que pudieran ser compatibles con las causadas por este virus aunque este paciente también presentaba una criptococosis cerebral diagnosticada previamente, que pudiera haberse reactivado en este momento.
Es de señalar que para tener un diagnóstico certero de la enfermedad, se debe detectar la producción intratecal de anticuerpos, pero para ello es necesario hacer de forma previa un índice de albúmina que nos permita conocer si la barrera hematoencefálica se encuentra o no dañada, con lo cual tendría o no valor el título de anticuerpos en el LCR. En nuestro caso no fue posible realizar esta prueba ya que, como el estudio fue retrospectivo, no contábamos con sueros de estos pacientes tomados en el mismo momento en que se les realizó la punción lumbar, por lo que resultaba imposible determinar el índice de albúmina. Este trabajo nos permite demostrar la gran importancia de la técnica de RCP para el diagnóstico de las meningoencefalitis causadas por herpesvirus, ya que sin dudas, esta técnica posibilita contar con una herramienta muy útil para el diagnóstico de estas entidades, que con las técnicas habituales de cultivo son prácticamente imposibles de diagnosticar. Además, el hecho de poder hacer el diagnóstico de diferentes herpesvirus en una misma reacción de amplificación, nos permite tener un resultado en 24 h de cualquier afección ocasionada por estos virus, para imponer la terapéutica específica, y evitar así la muerte del paciente.
SUMMARY
The multiple polymerase chain reaction technique was used to detect in a single assay tube the presence of herpes simplex virus (HSV), Citomegalovirus (CMV). Epstein Barr virus (EBV), varicella zoster virus (VZV), and/or human herpes virus-6 (HHV6). 50 cerebrospinal fluids from patients with AIDS and clinically suspected to have meningoencephalitis due to HSV were received and analyzed at the laboratories of Sexually Transmitted Diseases of the Virology Department of the "Pedro Kourí" Tropical Medicine Institute from 1993 to 1996. 4 of them were positive to HSV, 3 to CMV, 2 to VZV, and 1 to HHV6 for a positivity of 20 %. The results of the PCR were correlated to the clinical findings presented by the patients at the time of the lumbar
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puncture. The introduction of this technique in the laboratory allows to have an easy, fast and useful tool for the diagnosis of meningoencephalitis due to herpesvirus.
Subject headings: POLYMERASE CHAIN REACTION/ methods; MENINGOENCEPHALITIS/diagnosis; ACQUIRED IMMUNO-DEFICIENCY SYNDROME/cerebrospinal fluid; AIDS-RELATED OPPORTUNISTIC INFECTIONS; HERPESVIRIDAE INFECTIONS; HERPESVIRIDAE/isolation & purification.
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Recibido: 28 de agosto de 1997. Aprobado: 2 de febrero de 1998. Dra. Vivian Kourí. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
REV CUBANA MED TROP 1998;50(3):191-8
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL “PEDRO KOURÍ”
Aplicación de la técnica de reacción en cadena
de la polimerasa para la detección de secuencias
de Papillomavirus humano
Lic. Yudira Soto,1 Lic. Mayra Muné,2 Dra. Adibel Goicolea,3 Dra. Estrella Morales,3 Lic. Jean Michell Santoyo,4
Lic. Odalys Valdés,5 Lic. Rosa Ramírez5 y Téc. Tamara Pimentel6
RESUMEN
Se aplicó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa para la detección de secuencias de Papillomavirus humano (PVH) mediante controles de líneas celulares de cáncer cervical y tejidos obtenidos por biopsia con diagnóstico clínico positivo a PVH. Se utilizó un juego de oligonucleótidos consenso, que son complementarios a una región altamente conservada dentro del marco de lectura abierta E1 del genoma viral de los PVH que afectan la mucosa cervical. Con este juego de cebadores fue posible amplificar secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) correspondientes a los PVH 6 y 11, considerados dentro del grupo de bajo riesgo y de los PVH 16, 18, 31 y 33 comprendidos en el grupo de alto riego. El estudio de la sensibilidad de la técnica de amplificación arrojó como resultado un nivel de detección de 3,5 partículas virales por cada genoma diploide celular.
Descriptores DeCS: PAPILLOMAVIRUS HUMANO/genética; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA/métodos; ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN/métodos; GENOMA VIRAL; ADN VIRAL/genética.
1
Master en Ciencias. Licenciada en Microbiología. Aspirante a Investigadora. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).
2
Master en Ciencias. Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada. IPK.
3
Especialista de I Grado en Ginecología y Obstetricia. Hospital Ginecoobstétrico "Eusebio Hernández".
4
Licenciado en Microbiología. IPK.
5
Licenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigadora. IPK.
6
Técnica en Procesos biológicos. IPK.
La familia Papovaviridae está constituida por un grupo heterogéneo de virus. Hasta el presente han sido identificados 77 genotipos diferentes de Papillomavirus en humanos. En la actualidad se ha podido determinar de forma parcial la secuencia de aproximadamente 30 tipos adicionales de Papillomavirus humanos (PVH), lo cual sugiere la existencia de un número total de 100 genotipos de PVH. De los 77 tipos cuyas secuencias han sido estudiadas por completo, más de 40 infectan la mucosa cervical y representan un grupo importante de patógenos que producen enfermedades de origen epitelial.1 La infección por PVH tiene una alta incidencia y demostrada asociación con el cáncer cervical.2 Una de las más fuertes
evidencias de la función que desempeña este virus en la carcinogénesis lo constituye la presencia del ADN viral en más del 90 % de los carcinomas celulares escamosos del tracto genital.3,4 Se reconoce la vía sexual como la más común de diseminación del virus.5
La infección del cuello uterino por PVH puede ser asintomática o provocar una serie de manifestaciones que varían desde la presencia de condilomas benignos hasta la ocurrencia de alteraciones displásicas de diferentes grados y cáncer. La distinción de los diferentes estadios patológicos tiene un alto valor pronóstico ya que mientras los condilomas casi siempre permanecen como lesiones benignas, las neoplasias intraepiteliales cervicales (NIC)
