El empleo de células enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las enzimas aisladas:
•Se evita los procesos de aislamiento y purificación enzimática.
•Las enzimas de interés se hallan en su ambiente celular natural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentemente la vida útil del sistema permitiendo la reutilización del material catalítico.
•El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y demás compuestos necesarios para asegurar una óptima actividad, además de brindar buenas condiciones de temperatura y pH.
•Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimáticas.
Inmovilización celular
•Condiciones básicas que debe reunir un método
• Sencillez de preparación
• Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de
preparación
• Bajo costo
• Alta resistencia mecánica
• Baja o nula interferencia en los procesos de
purificación de productos
• Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos
de producción y/o biotransformación
Inmovilización celular
Por adsorción Por entrampamiento
•Adsorción a
soportes inertes
•Entrampamiento en matrices
poliméricas
•Inclusión en estructuras
preformadas
Inmovilización celular
•Adsorción a soportes inertes
•Inclusión en estructuras preformadas
•Bolillas de vidrio
• Virutas de madera, etc
•Biorreactores de fibra hueca
• Espumas de poliuretano
Inmovilización celular: en esferas alginato O O O O OH O OH n
Alginato (Acido manurónico β 1,4) O O CaCl2 + O O O O-O O-O O O O O O O-O O-O O O O O O-O O-O O O O O O O-O O-O O Ca Ca Ca Ca Ca Ca
Inmovilización celular: Metodología de trabajo
Mezcla de solución de alginato Y cultivo celular en medio libre De agentes complejantes de Ca++
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial producidos en sistemas de células vegetales inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Catharanthus roseus Agarosa Catelamina Suministro de
ajmalicina
Catharanthus roseus Alginato Alcaloides
indólicos
Prolonga capacidad biosintética
Catharanthus roseus Alginato Ajmalicina Prolonga estabilidad y
capacidad biosintética (220 dias con cambio de medio)
Catharanthus roseus Xantanos/po
liacrilamida
Serpentina Prolonga estabilidad y capacidad biosintética (180 dias con cambio de medio)
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial producidos en sistemas de células vegetales inmovilizadas
Daucus carota Alginato 5-β
-hidroxidigi-toxigenina
Técnica: Suministro de precursor
(digitoxigenina)
Daucus carota Alginato fenoles No hay variaciones con
respecto a cultivos no inmovilizados Especie Matriz Producto Comentarios
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial producidos en sistemas de células vegetales inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Digitalis lanata Alginato β-metildigoxina Suministro de precursor:
β-metildi-gitoxina
Digitalis lanata Alginato digoxina Suministro de precursor:
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial producidos en sistemas de células vegetales inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Beta vulgaris Nylon Betacianina Incrementa
acumulación
Capsicum frutescen Espuma de
poliuretano
Capsaicina Incrementa rendimiento
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial producidos en sistemas de células vegetales inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Morinda citrifolia Alginato Antraquinonas Incrementa acumulación
intracelular
Talictrum minus Alginato Berberina Incrementa liberación
Solanum surretense Alginato Solasodina Incrementa liberación
Lithospermun erithrorhysum
Fibra hueca
fenoles Incrementa rendimiento.
El empleo de células inmovilizadas ofrece una serie de ventajas
vinculadas al estado fisiológico y al diseño y modo de operación del proceso fermentativo.
•El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generación de gradientes físicos y químicos que conducen a un mayor grado de diferenciación.
•Al estar minimizada la tasa de reproducción celular la inestabilidad génica se disminuye notablemente.
•Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante cuando la producción esta asociada a la idiofase o al final de la etapa exponencial
•Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y
producción facilitando el empleo de estrategias como la elicitación biótica y abiótica o la permeabilización para incrementar la
producción
• Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimiento para mantener la viabilidad y capacidad biosintética.
•las células inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de disolución sin riesgo de lavado de los cultivos
•Es posible controlar el tamaño de los agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulación y/o producción de metabolitos.
•Con la biomasa entrampada es más sencillo trabajar con procesos en dos fases, lo más común es realizar una de crecimiento previo a la
inmovilización y la segunda de producción inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.
•En cultivos inmovilizados se facilita la remoción de inhibidores metabólicos
Con inmovilización es posible lograr: sistemas de producción de metabolitos de una vida útil prolongada puesto que se puede
reutilizar la biomasa y realizar una recuperación continua de los productos.
Es posible inducir la liberación al medio extracelular los metabolitos de interés que naturalmente no son excretados mediante el empleo de
agentes permeantes, especialmente DMSO
El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la producción de compuestos secundarios y la realización de procesos de
bioconversión dónde los productos de interés se liberen al medio de cultivo.
Metabolito Género vegetal Aplicación
Atropina Hyoscyamus Anticolinérgico Berberina Hydratis canadensis Antihemorrágico uterino Esteres de bornilo Valeriana Sedante Ginsenósidos Panax ginseng Tónico,
estimulante Rotenona Derris elliptica Insecticida Vincristina, vinblastina Catharantus roseus Antileucémico Quinina, quinidina Cinchona Antimalárico, antirreumático Reserpina Rauwolfia Antihipertensivo
Agrobacterium rhizogenes …….
Bacteria del suelo gram negativa
La infección de muchas especies in-vitro con el
microorganismo patógeno Agrobacterium rhizogenes
permite obtener clones de raíces estables y en condiciones axénicas
Mayoritariamente, los clones preservan la capacidad biosintética de las raíces de las plantas que les dieron origen
Las raíces neoplásicas producidas por A. rhizogenes
se caracterizan por :
su alto índice de crecimiento
y su estabilidad genética
Estos cultivos producen niveles de metabolitos
secundarios comparables a las plantas intactas
Biología de la interación
Agrobacterium-planta
El único ejemplo conocido de
transferencia natural de AND
Genes Rol A, B, C y D
catabolismo de opinas
Auxinas
Opinas
Región Vir
Origen de
Replicación
TL TREl T-ADN es el sector del plásmido que se transfiere a las células huésped
Esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb esenciales para la transferencia
En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL)
Ambas codifican para funciones rizogénicas una vez integradas a la célula huésped
La región TR especifica la síntesis de agropinas y auxinas
Región TL porta cuatro loci que contienen los genes rol (A,B,C y D) implicados en el desarrollo morfológico de las raíces mediante la sensibilización de las células al efecto auxínico
El gen rol D induce la formación de tejido de callos mientras que los genes rol A, B y C regulan el tamaño, grado de ramificación, alteraciones de tropismo y demás características de las raíces en cabellera
Hairy roots are fast growing and plagiotropic
•They require no external supply of growth hormones
•The plagiotropic characteristic is advantageous as it
increases the aeration in liquid mediumand roots grown in air have an elevated accumulation of biomass.
Una vez establecidos los cultivos de raíces transformadas se pueden desarrollar a partir de pequeños inóculos y obtener buenos índices de crecimiento.
El principal problema es el cambio de escala a niveles industriales ya que la agitación mecánica causa injurias que conducen a la formación de callos.
Debido a las ramificaciones las raíces forman una matriz que ofrece resistencia al flujo, siendo el principal problema nuevamente el suministro de oxígeno.
En los medios líquidos se forman esferas de raíces con las raicillas jóvenes en crecimiento sobre la periferia y un corazón de tejido viejo en el interior
La restricción nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en lo referido al oxígeno da origen a un “bolsillo” de tejido senescente
Las principales ventajas de utilizar cultivos de raíces transformadas, en
cabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar de
cultivos dediferenciados son:
•Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados con
fitorreguladores para desarrollar biomasa
•Las raíces transformadas crecen rápidamente, son robustas y vigorosas
•Sintetizan metabolitos secundarios característicos de las raíces de las plantas
de las cuales provienen
•La síntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles puesto que, a diferencia de los cultivos de células indiferenciadas, son genéticamente estables por períodos prolongados de cultivo
•El cultivo masivo de raíces transformadas es sencillo y tiene potencialidad para desarrollarse en biorreactores, ampliando la posibilidad de aplicación industrial de estos procedimientos
