Finalidad .
Sistema para la determinación cuantitativa del antígeno prostático específico total(Prostatic Specific Antigen - PSA)en suero. [Sólo para uso diagnóstico in vitro.]Introducción .
El antígeno prostático específico (PSA) es una glicoproteína de 237 aminoácidos, que pertenece a la familia de las calicreínas humanas. Producida principalmente por las células epiteliales de la próstata, esta serina proteasa actúa en la licuefacción del fluido seminal a través de un mecanismo de actividad enzimática similar a la quimotripsina. Hay otras fuentes de PSA, tales como la leche materna y las glándulas salivales, mamarias, periuretrales y anales.El PSA está presente en el suero en dos formas distintas, PSA no complejado (PSA libre o PSAL) y PSA complejado. El PSA complejado está predominantemente unido a a-1-antiquimiotripsina (PSA-ACT), mientras que un pequeño porcentaje se une aa-2-macroglobulina (PSA-A2M). Estos inhibidores de proteasas séricas están presentes en el suero en concentración de 10 a 10 veces mayores que la concentración6 de PSA circulante, asegurando que la mayoría del PSA sérico esté en la forma inactiva, complejado a otras proteínas. El PSA-ACT es inmunorreactivo, pero inactivo enzimáticamente, mientras que el PSA-A2M mantiene actividad proteásica débil, aunque no sea inmunorreactiva. El PSAL es enzimáticamente inactivo y está presente en el suero que no está unido a cualesquiera proteínas.
Principio .
El PSA presente en la muestra se une específicamente a anticuerpos policlonales anti-PSA inmovilizados en la superficie de inmunotubos (IT). Después del lavado, se adicionan los anticuerpos policlonales marcados con biotina y conjugado de estreptavidina-peroxidasa que forman un complejo cuaternario. Después de la eliminación de los reactivos en exceso, la reacción quimioluminiscente se desencadena mediante la adición de peróxido y luminol. La cantidad de luz emitida, medida en unidades relativas de luz (RLU), está relacionada con la concentración de PSA total presente en la muestra, cuyo valor se obtiene a través de una curva de calibración.Características del sistema .
El PSA - Labtest es un sistema semiautomático desarrollado con un enfoque innovador que permite el uso de los sustratos quimioluminiscentes luminol y peróxido en cinética rápida, con obtención de la señal quimioluminiscente en unos pocos segundos.Los niveles de sensibilidad son equivalentes a los de otros sustratos quimioluminiscentes que emplean fosfatasa alcalina como enzima. Los estudios realizados demuestran que el ensayo no sufre interferencia significativa causada por altas concentraciones de hemoglobina, bilirrubina y de triglicéridos, además no presenta el efecto "hook" (reducción de la respuesta por exceso de antígeno).
La estabilidad de los reactivos reduce la frecuencia de las calibraciones, lo que permite la adaptación a pequeñas rutinas, con realización de pruebas individuales sin aumentar los costos.
Metodología .
Quimioluminiscencia en tubos.Reactivo
1.
-!
Diluyente de Muestra . Almacenar entre 2 - 8 ºC. Contiene tapón 100 mmol/L pH 7,4; conservante, tensoactivo y estabilizantes. Listo para su uso.2.
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Biotinilado . Almacenar entre 2 - 8 ºC.Contiene anticuerpo policlonal anti-PSA biotinilado 0,5 g/mL en tapónm 100 mmol/L pH 7,4; conservante; tensoactivo y estabilizantes. Listo para su uso.
3.
-#
Conjugado Concentrado 50X . Almacenar entre 2 - 8 ºC.Contiene estreptavidina-peroxidasa 50 g/mL, conservante, tensoactivom y estabilizantes. Consultar apartado “Procedimiento - Preparación de los reactivos”.
4.
-$
Diluyente del Conjugado . Almacenar entre 2 - 8 ºC. Contiene tapón 100 mmol/L pH 7,4; conservante, tensoactivo y estabilizantes. Listo para su uso.5.
-%
Calibrador Low (Bajo) . Almacenar entre 2 - 8 ºC. Preparación liofilizada del antígeno prostático específico (PSA) que contiene tapón 150 mmol/L pH 7,4 conservante y estabilizantes. Consultar el apartado “Procedimiento - Preparación de los reactivos”. La concentración de PSA Total está señalada en la etiqueta del frasco. Después de la reconstitución, el calibrador es estable durante 30 días cuando se almacena entre 2 - 8 ºC, bien cerrado y protegido de la luz. La concentración de ese calibrador, que figura en el rótulo del producto, deberá ser inserida en el protocolo del test.6.
-&
Calibrador High (Alto) . Almacenar entre 2 - 8 ºC. Preparación liofilizada del antígeno prostático específico (PSA) que contiene tapón 150 mmol/L pH 7,4 conservante y estabilizantes. Consultar apartado “Procedimiento - Preparación de los reactivos”. La concentración de PSA Total está señalada en la etiqueta del frasco. Después de la reconstitución, el calibrador es estable por 30 días cuando se almacena entre 2 - 8 ºC, bien cerrado y protegido de la luz.La concentración de ese calibrador, que figura en el rótulo del producto, deberá ser inserida en el protocolo del test.
7.
-'
Inmunotubos . Almacenar entre 2 - 8 ºC.Tubos de poliestireno sensibilizados con anticuerpos policlonales anti-PSA. Listo para su uso.
PSA TOTAL
Los envases de plástico que contienen los tubos deben abrirse sólo cuando están en temperatura ambiente (15 - 30 ºC), para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo. Después de abrir los envases, los tubos son estables durante 6 meses cuando se almacenan con el desecante en el envase de plástico bien cerrado.
Los reactivos sin abrir, cuando se almacenan bajo las condiciones establecidas, son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Después de abiertos, los reactivos deben ser manejados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar reducción de la estabilidad.
Se deben aplicar los cuidados habituales de seguridad en el manejo de los reactivos (no se deben pipetearlos con la boca).
No mezclar reactivos de lotes distintos y no utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No permitir la contaminación cruzada entre los componentes.
Utilizar solamente puntas desechables para pipetear cada muestra y cada reactivo.
La limpieza y el secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. Residuos de jabón, detergentes o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación del Conjugado de uso pueden interferir en la reacción. Utilizar preferiblemente material de plástico desechable. Si utilizar envases de vidrio, se recomienda lavarlos con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico 0,5 mol/L, enjuagar exhaustivamente con agua destilada o desionizada y secar antes de usarlos.
Los envases de plástico que contienen los inmunotubos (IT) deben abrirse sólo cuando están en temperatura ambiente (15 - 30 ºC), para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo
Después de abrir los envases, los tubos son estables durante 6 meses cuando se almacenan con el desecante en el envase de plástico bien cerrado.
Los inmunotubos (IT) deben ser desechados después de su uso. No reutilizar para otros fines.
Para la eliminación de los reactivos y del material biológico, se aconseja aplicar las normas locales, provinciales o federales de protección ambiental.
Material necesario (no está incluído)
1.
Micropipetas y puntas desechables.2.
Baño María (37 1 ºC).±3.
Recipiente para preparar las diluciones.4.
Cronómetro.5.
Solución de Lavado Concentrada (Ref. 908).6.
Soluciones Reveladoras (Ref. 909).7.
Estantería para tubos 12 x 75 mm con sistema de fijación.8.
Microordenador.9.
Luminómetro Lumiquest o instrumento similar equipado con dos inyectores y capacidad para acomodar tubos 12 x 75 mm.10.
Solución desinfectante (Ref. 911).Utilizar solamente suero.
El analito es estable durante 4 días entre 2 y 8 ºC y hasta 8 meses en temperatura inferior a 20 ºC negativos cuando se almacena en un recipiente apropiado para la congelación.
Asegurarse de que las muestras estén descongeladas y homogeneizadas antes de su uso. Se deben eliminar las partículas en suspensión por centrifugación. No usar las muestras con signos de contaminación o muestras congeladas y descongeladas más de una vez
Debe crearse un Procedimiento Operativo Estándar (POE) para la recolección, preparación y almacenamiento de la muestra. Enfatizamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho más grandes que los errores que se ocurrieron en el procedimiento analítico.
Como ninguna prueba conocida puede garantizar que muestras de sangre no transmiten infecciones, todos ellas deben considerarse como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, para su manejo, se deben seguir las normas de bioseguridad.
Concentraciones de hemoglobina hasta 1000 mg/dL, bilirrubina hasta 30 mg/dL y triglicérido hasta 1000 mg/dL no producen interferencias significativas.
Cuidados especiales .
Los empaques que contienen los inmunotubos deben abrirse sólo en temperatura ambiente (15 - 30 ºC), para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo.Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de su uso.
Precauciones y cuidados especiales
Muestra
Procedimiento
Interferencias
Preparación de los reactivos
Conjugado de uso .
Transferir el volumen total del Conjugado Concentrado para el frasco que contiene el Diluyente del#
Conjugado . Homogeneizar suavemente por inversión.
$
Identificar el frasco y anotar la fecha de caducidad.
Hay también la opción de preparar volúmenes más pequeños del Conjugado de Uso y transferir 1 (un) volumen del Conjugado Concentrado y 50 volúmenes del Diluyente del Conjugado
#
$
para un frasco limpio y seco. Identificar el frasco y anotar la fecha de caducidad.Una vez preparado, el Conjugado de Uso es estable durante 4 meses cuando se almacena entre 2 y 8 ºC. Identificar el frasco y anotar la fecha de caducidad.
Para mantener su desempeño, el reactivo debe permanecer fuera de la nevera sólo el tiempo necesario para su uso.
Reconstitución de los calibradores .
Consultar el apartado 1 -ObservacionesQuitar el precinto de aluminio y retirar con cuidado la tapa de goma. Sumar al frasco del calibrador el volumen de agua calidad reactivo con una pipeta volumétrica, tal como se indica en la etiqueta. Vuelva a colocar la tapa de goma, dejar reposar durante 15 minutos y homogeneizar suavemente por inversión. Antes de usar, homogeneizar suavemente y retirar la cantidad necesaria para su uso. Tapar inmediatamente y almacenar entre 2 y 8 ºC.
Después de la reconstitución, los calibradores permanecen estables durante 30 días, si se almacena entre 2 a 8 ºC, bien cerrado y protegido de la luz. Para mantener su desempeño, dejar el calibrador fuera de la temperatura de almacenamiento sólo por el tiempo mínimo necesario para obtener el volumen a utilizarse.
Para almacenar por más de 30 días se sugiere, después de la reconstitución, separar el calibrador en alícuotas y almacenar en temperatura inferior a 20 ºC negativos por hasta 6 meses en recipiente herméticamente cerrado, protegido de la luz Para evitar la evaporación del material durante el período de almacenamiento es esencial utilizar frascos adecuados para congelación (criotubos). Las alícuotas del calibrador deben descongelarse sólo una vez.
Los calibradores deben ser manejados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar reducción de la estabilidad.
Calibración .
Los calibradores son trazables al Material de Referencia NIBSC código 96/670 (WHO International Standard - Prostate Specific Antigen 90:10).La calibración del sistema se realiza mediante el uso de una Master Curve de 6 puntos (concentración de los calibradores y sus respectivas RLUs) y ayusta , cuando sea necesario, utilizando los dos calibradores deda ayuste (Calibrador Low- (Bajo Ref. 901.5 e Calibrador High) -(Alto Ref. 901.6).)
LaMaster Curvees suministrada en un documento adjunto juntamente con el producto PSA total y es específica para cada lote de reactivos.
Al inserir los datos de laMaster Curvedurante la creación del protocolo del test, inserir también las concentraciones de los calibradores de ayuste que figuran en el rótulo de los productos (Calibrador Low - (Bajo Ref. 901.5 e Calibrador High) - (Alto) Ref. 901.6).
Cuando se utiliza un lote de producto por primera vez, deben insertarse los datos de la Master Curve en el programa del luminómetro y luego debe hacer un ajuste en la curva de calibración, ensayando en duplicado los dos calibradores proporcionados en el kit (Calibrador Low - Ba o Ref. 901.5 e Calibrador High( j ) - (Alto) Ref. 901.6). Para configurar la programación del aparato e introducir correctamente los datos de la Master Curve, consultar el manual del equipo.
Cuando los reactivos se mantienen en las condiciones indicadas, la calibración permanece estable durante 90 días.
La calibración del sistema se ajusta en las condiciones a continuación:
1.
Cuando se utiliza un lote de producto por primera vez;2.
A cada nueva preparación del Conjugado de Uso;3.
A cada cambio de lote de las Soluciones Reveladoras (Ref. 909).4.
Cuando el control de calidad indicar.Procedimiento de prueba
IMPORTANTE
1.
Los parámetros de lectura de las pruebas, así como los datos de la Master curve deben insertarse en el luminómetro antes de hacer las pruebas. Consultar apartado "Calibración" y el manual del equipo para obtener más informaciones.2.
No utilice en el ensayo una cantidad mayor que 20 inmunotubos a la vez.1.
Separar el número de inmunotubos (IT) necesarios a las pruebas, identificarlos y posicionarlos en la estantería para inmunotubos.2.
Sumar 0,20 mL de Diluyente de Muestra en la parte!
inferior de cada tubo.
3.
Sumar 0,05 mL de la muestra (suero, controles o calibradores) directamente al contenido de cada tubo. Homogeneizar.4.
Incubar 30 minutos en baño María a 37 ºC.5.
Retirar los tubos del baño María.6.
Sumar 1,0 mL de Solución de Lavado Concentrada (Ref. 908).7.
Descartar el contenido de los tubos por inversión y con la estantería invertida, retirar el exceso de líquido, apoyando el borde superior de los tubos sobre una superficie absorbente (2-3 capas de toallas de papel).8.
Sumar 0,15 mL de Biotinilado en la parte inferior de cada9.
Sumar 0,10 mL de Conjugado de Uso directamente al contenido de cada tubo. Homogeneizar.10.
Incubar 30 minutos en baño María a 37 ºC.11.
Retirar los tubos del baño María.12.
Repetir por seis veces consecutivas los pasos 6 y 7.13.
Para obtener los resultados, proceder de la siguiente manera:1.
Realizar el prime del equipo utilizando Soluciones Reveladoras (consultar las instrucciones de uso del producto Soluciones Reveladoras - Ref. 909 y el manual de operación del equipo);2.
Seleccionar el protocolo de la prueba que tiene los datos de la Master Curve;3.
Realizar la medición de los calibradores de ajuste (si es necesario), muestras y controles.Intervalo operativo .
El intervalo operativo de la prueba es de 0,05 ng/mL hasta 40 ng/mL.Las muestras con resultados más bajos que el límite de sensibilidad analítica deben reportarse como <0,05 ng/mL. Las muestras con concentraciones superiores a 40 ng/mL se pueden diluir con solución salina 0,85%. Después de la dilución, multiplicar el valor obtenido por el factor de dilución utilizado.
Control interno de calidad .
El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que define claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, normas, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. El uso de los controles en todos los conjuntos de pruebas es esencial para controlar la imprecisión de la medición y desviaciones de la calibración.Se sugiere utilizar las preparaciones de la Línea Qualitrol Q de Labtest para control interno de la calidad en ensayos de quimioluminiscencia.
Intervalo de referencia .
3La determinación del PSA en el suero humano, en combinación con el examen de tacto rectal (DRE), forma la base para los programas modernos de selección de cáncer de próstata (CaP).
Este enfoque fue inicialmente adoptado en el final de los años 80, donde un estudio a gran escala realizado por Catalona et al evaluó el resultado de biopsias de la próstata realizadas en pacientes que tuvieron alguna anormalidad en los exámenes de DRE, ecografía transrectal (TRUS) y concentración sérica de PSA superior a 4,0 ng/mL. El resultado de este estudio mostró que 43% de los cánceres no serían diagnosticados si los pacientes tuvieran se sometido sólo al examen de TRUS. Por esta razón, a principio de los años 90 se publicó la recomendación para hacer la biopsia de la próstata en los casos de DRE anormal o en exámenes de serología que presenten PSA en concentraciones superiores a 4,0 ng/mL. Sin embargo, varios estudios recientes relatan la ocurrencia de cáncer de próstata en hombres con concentraciones sericas de PSA inferiores a 4,0 ng/mL. En 1993, un estudio mostró la ocurrencia de cáncer de próstata en 15,2% de los casos en que la concentración sérica de PSA fue inferior a 4,0 ng/mL.
Por esta razón, desde 1995 surgió el consenso urológico moderno que recomienda la realización de biopsia de la próstata en pacientes que presenten concentración sérica de PSA superior a 2,5 ng/mL.
Características del desempeño
4Efectos de la dilución de la matriz .
Se utilizó una muestra con valor igual a 89,7 ng/mL para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/L (0,85%). Utilizando factores de dilución que variaron de 2 a 16 se encontraron recuperaciones medias de 105,8%.Comparación de métodos .
El método que se propone fue comparado con método similar y se obtuvo los resultados a continuación:Usando la ecuación de regresión, el error sistemático (sesgo) estimado fue igual a 15,3% para un nivel de decisión igual 2,5 ng/mL e 12% para un nivel de decisión igual a 10 ng/mL, error considerado aceptable y no5 representa desviaciones de resultados entre la metodología comparativa.
Estudios de precision .
Los estudios de precisión se realizaron utilizándose muestras nativas en tres niveles distintos:Sensibilidad metodológica o analítica .
Límite de detección: 0,05 ng/mL. Equivale a la concentración de PSA que está lejos dos desviaciones estándares del calibrador 1 (0 ng/mL) y representa la concentración más baja de PSA que se puede distinguir de cero.Número de muestras Intervalo de concentraciones (ng/mL)
Media de las estimativas (ng/mL) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Método Comparativo 41 0,05 - 33,3 6,30 Método Labtest = 1,110 x Método Comparativo + 0,109 0,993 41 0,05 - 39,12 7,10 Método Labtest
Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo
Media (ng/mL) 2,50 10,0 DE 0,20 0,69 CV (%) 4,43 9,37 N 40 40 Muestra 2 Muestra1Reproducibilidad - Imprecisión total
Media (ng/mL) 2,50 10,0 DE 0,18 0,79 CV (%) 3,10 8,24 N 40 40 Muestra 2 Muestra 1Significado clínico .
6,7En los últimos 20 años, el PSA sérico ha sido el marcador tumoral más comúnmente utilizado para selección, estadificación y pronóstico de CaP. Sin embargo, la selección de pacientes para biopsia de la próstata utilizando como parámetro sólo el análisis del PSA sérico no es concluyente, principalmente en los hombres mayores de 50 años, ya que las altas concentraciones de PSA también se observan en casos de hipertrofia benigna prostática (HBP), neoplasia intraepitelial prostática, isquemia prostática, prostatitis aguda o crónica o después de la manipulación de la próstata. En este contexto, la determinación sérica de PSAL ha sido sugerida como prueba adjunta a la prueba de determinación del PSA total (PSA complejado + PSAL), con el objetivo de reducir el número de biopsias prostáticas innecesarias y aumentar el porcentaje de “acierto” de diagnóstico diferencial entre CaP y HBP, dado que hombres que desarrollan el CaP presentan porcentaje de PSAL más baja que los hombres que tienen HBP. Cabe resaltar, sin embargo, que la determinación aislada de PSAL, en ausencia de la determinación de PSA total no son relevantes. Se obtendrá el aumento de la fiabilidad del diagnóstico sólo cuando se obtiene el porcentaje (PSAL%) que determina la concentración de PSAL en relación con la concentración de PSA total. La probabilidad de que haya CaP aumenta a medida que el PSAL % disminuye. Cuando los valores de PSA total exceden 10 ng/mL, el cálculo del PSAL% no contribuye para distinguir casos de CaP y enfermedades benignas, pero en el intervalo de 2,5 a 10 ng/mL de PSA total, el cálculo del PSAL% es utilizado para aumentar la especificidad del diagnóstico.
Observaciones
1.
El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o³ conductividad £1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/L. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua.,Referencias
1. Pettersson, K., Piironen, T., Seppala, M., Liukkonen, L., Christensson, A., Matikainen, M.T., Suonpaa, M., Lovgren, T. and Lilja, H. (1995) Free and complexed prostate-specific antigen (PSA):in vitro stability, epitope map and development of immunofluorometric assays for specific and sensitive detection of free PSA and PSA-1-antichymotrypsin complex.Clin. Chem. 41, 1480-1488.
2. Ajani Kumari G, Malati T. (2004) Stability of total and free prostate specific antigen in serum samples at different storage conditions. Ind.
J. Clin. Bioch. 19, (2) 10-13.
3. Catalona WJ, Loeb S (2010) Prostate cancer screening and determining the appropriate prostate-specific antigen cutoff values. J
Natl Compr Canc Netw. 8(2): 265-270).
4. Arquivos Labtest.
5. Ricós V. (1999) Current databases on biological variation: pros, cons and progress.Scand J Clin Lab Invest; 59: 491-500.
6. Stephan C. (2000) Molecular forms of prostate-specific antigen and human Kallikrein 2 as promising tools for early diagnosis of prostate cancer.Cancer Epidemiol biomarkers Prev, 9:1133-1147. 7. Okegawa T. (2000) Comparisons of the various combinations of free,
complexed and total prostate-specific antigen for the detection of prostate cancer.Eur Urol, 38:380-387.
Presentación
Referencia 901-50 PSA Total Producto Contenido 1 X 10 mL 1 X 7,5 mL 1 X 0,1 mL 1 X 5 mL 1 X 1 mL 1 X 1 mL 2 X 25 un LOW CAL H I G H CAL I T S A M P DIL C O N J DIL C O N J 5 0 x B I O T 901-100 1 X 20 mL 1 X 15 mL 1 X 0,2 mL 1 X 10 mL 1 X 1 mL 1 X 1 mL 4 X 25 un LOW CAL H I G H CAL I T S A M P DIL C O N J DIL C O N J 5 0 x B I O T Edición: Julio, 2012 Ref.: 071015Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización
