Finalidad .
Sistema para la determinación cuantitativa del antígeno prostático específico libre o PSAL (Prostatic Specific AntigenFree - PSAf) en suero.[Sólo para uso diagnósticoin vitro.]
Introducción .
El antígeno prostático específico (PSA) es una glicoproteína de 237 aminoácidos, que pertenece a la familia de las calicreínas humanas. Producida principalmente por las células epiteliales de la próstata, esta serina proteasa actúa en la licuefacción del fluido seminal por un mecanismo de actividad enzimática similar a la quimotripsina. Hay otras fuentes de PSA, tales como la leche materna y las glándulas salivales, periuretrales y anales.El PSA está presente en el suero en dos formas distintas, PSA no complejado (PSA libre o PSAL) y PSA complejado. El PSA complejado está predominantemente unido a a-1-antiquimotripsina (PSA-ACT), mientras que un pequeño porcentaje se une aa-2-macroglobulina (PSA-A2M). Estos inhibidores de proteasas séricas (ACT y A2M) están presentes en el suero en concentración de 10 a 10 veces mayores que la6 concentración de PSA circulante, asegurando que la mayoría del PSA sérico esté en la forma inactiva, es decir, complejado a otras proteínas. El PSA-ACT es inmunorreactivo, pero inactivo enzimáticamente, mientras que el PSA-A2M mantiene actividad proteásica débil, aunque no sea inmunorreactiva. El PSAL es enzimáticamente inactivo y está presente en el suero que no está unido a cualesquiera proteínas.
Principio .
El PSA presente en la muestra se une específicamente a anticuerpos policlonales anti-PSA inmovilizados en la superficie de Inmunotubos . Después del lavado, se adicionan el anticuerpo'
monoclonal anti-PSA Libre marcado con biotina y el conjugado de estreptavidina-peroxidasa que forman un complejo cuaternario. Después de la eliminación de los reactivos en exceso, la reacción quimioluminiscente se desencadena mediante la adición de peróxido y luminol. La cantidad de luz emitida, medida en unidades relativas de luz (RLU), está relacionada con la concentración de PSA libre presente en la muestra, cuyo valor se obtiene a través de una curva de calibración.
Características del sistema .
El PSA Libre - Labtest es un sistema semiautomático desarrollado con un enfoque innovador que permite el uso de los sustratos quimioluminiscentes luminol y peróxido en cinética rápida, con obtención de la señal quimioluminiscente en unos pocos segundos.Los niveles de sensibilidad son equivalentes a los de otros sustratos quimioluminiscentes que emplean fosfatasa alcalina como enzima. Los estudios realizados demuestran que el ensayo no sufre interferencia significativa causada por altas concentraciones de hemoglobina, bilirrubina y de triglicéridos, además no presenta el efecto "hook" (reducción de la respuesta por exceso de antígeno).
La estabilidad de los reactivos reduce la frecuencia de las calibraciones, lo que permite la adaptación a las pequeñas rutinas, con realización de pruebas individuales sin aumentar los costos.
Metodología .
Quimioluminiscencia en tubos.Reactivo
1.
-!
Diluyente de Muestra . Almacenar entre 2 - 8 C.º Contiene tapón 100 mmol/L pH 7,4; conservante, tensoactivo y estabilizantes. Listo para su uso.2.
"
-
Biotinilado . Almacenar entre 2 - 8 C.ºContiene anticuerpo monoclonal anti-PSA biotinilado en tapón 100 mmol/L pH 7,4;conservante; tensoactivo y estabilizantes. Listo para su uso.
3.
-#
Conjugado Concentrado 50X . Almacenar entre2 - 8 ºC.
Contiene estreptavidina-peroxidasa, conservante, tensoactivo y estabilizantes. Consultar apartado “Procedimiento - Preparación de los reactivos”.
4.
-$
Diluyente del Conjugado . Almacenar entre 2 - 8 ºC. Contiene tapón 100 mmol/L pH 7,4; conservante, tensoactivo y estabilizantes. Listo para su uso.5.
-%
Calibrador Low (Bajo) . Almacenar entre 2 - 8 ºC. Preparación liofilizada de antígeno prostático específico libre (PSAL) que contiene tapón 1 0 mmol/L pH0 8,1 conservante, y estabilizantes. Consultar el apartado “Procedimiento - Preparación de los reactivos”. La concentración de PSA Libre está señalada en la etiqueta del frasco. Después de la reconstitución, el calibrador es estable durante 5 días cuando se almacenan entre 2 - 8 ºC, bien cerrado y protegido de la luz, y por 90 días cuando se almacenan a -15 ºC, bien cerrado y protegido de la luz.La concentración de ese calibrador, que figura en el rótulo del producto, deberá ser inserida en el protocolo del test.
6.
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Calibrador High (Alto) . Almacenar entre 2 - 8 C.º Preparación liofilizada del antígeno prostático específico libre (PSAL) que contiene tapón 1 0 mmol/L pH0 8,1 conservante, y estabilizantes. Consultar apartado “Procedimiento - Preparación de los reactivos”. La concentración de PSA Libre está señalada en la etiqueta del frasco. Después de la reconstitución, el calibrador es estable durante 5 días cuando se almacenan entre 2 - 8 ºC, bien cerrado y protegido de la luz, y por 90 días cuando se almacenan a -15 ºC, bien cerrado y protegido de la luz.La concentración de ese calibrador, que figura en el rótulo del producto, deberá ser inserida en el protocolo del test.
PSA LIBRE
7.
'
-
Inmunotubos . Almacenar entre 2 - 8 C.ºTubos de poliestireno sensibilizados con anticuerpos policlonales anti-PSA. Listo para su uso.
Los envases de plástico que contienen los inmunotubos deben abrirse sólo cuando están en equilibrio con la temperatura ambiente (temperatura inferior a 30 ºC), donde se hará la prueba, para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo
Después de abrir los envases, los tubos son estables durante 6 meses cuando se almacenan entre 2 e 8 ºC y con el desecante en el envase de plástico bien cerrado.
Los reactivos sin abrir, cuando se almacenan bajo las condiciones establecidas, son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Después de abiertos, los reactivos deben ser manejados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar reducción de la estabilidad.
Se deben aplicar los cuidados habituales de seguridad en el manejo de los reactivos (no se deben pipetearlos con la boca).
No mezclar reactivos de lotes distintos y no utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No permitir la contaminación cruzada entre los componentes.
Utilizar solamente puntas desechables para pipetear cada muestra y cada reactivo.
La limpieza y el secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. Residuos de jabón, detergentes o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación del Conjugado de uso pueden interferir en la reacción. Utilizar preferiblemente material de plástico desechable. Si utilizar envases de vidrio, se recomienda lavarlos con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico 0,5 mol/L, enjuagar exhaustivamente con agua destilada o desionizada y secar antes de usarlos.
Los envases de plástico que contienen los inmunotubos deben
'
abrirse sólo cuando están en equilibrio con la temperatura ambiente (temperatura inferior a 30 ºC), donde se hará la prueba, para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo Después de abrir los envases, los tubos son estables durante 6 meses cuando se almacenan con el desecante en el envase de plástico bien cerrado.Los inmunotubos deben ser desechados después de su uso.
'
No reutilizar para otros fines.
Para la eliminación de los reactivos y del material biológico, se aconseja aplicar las normas locales, provinciales o federales de protección ambiental.
Material necesario (no está incluído)
1.
Micropipetas y puntas desechables.2.
Baño María (37 1 C).± º3.
Recipiente para preparar las diluciones.4.
Cronómetro.5.
Solución de avadoL Concentrada(Ref. 908).6.
Soluciones Reveladoras (Ref. 909).7.
Estantería para tubos 12 x 75 mm con sistema de fijación.8.
Microordenador.9.
Luminómetro Lumiquest o instrumento similar equipado con dos inyectores y capacidad para acomodar tubos 12 x 75 mm.10.
SoluciónDesinfectante(Ref.604).Utilizar solamente suero.
El analito es estable durante 48 horas entre 2 y 8 ºC y hasta 3 meses en temperatura inferior a 15 ºC negativos cuando se almacena en un recipiente apropiado para la congelación.
Asegurarse de que las muestras estén descongeladas y homogeneizadas antes de su uso. Se deben eliminar las partículas en suspensión a través de la centrifugación. No usar las muestras con signos de contaminación o muestras congeladas y descongeladas más de una vez
Debe crearse un Procedimiento Operativo Estándar (POE) para la recolección, preparación y almacenamiento de la muestra. Enfatizamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho más grandes que los errores que se ocurrieron en el procedimiento analítico.
Como ninguna prueba conocida puede garantizar que muestras de sangre no transmiten infecciones, todos ellas deben considerarse como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, para su manejo, se deben seguir las normas de bioseguridad.
Concentraciones de hemoglobina hasta 1000 mg/dL, bilirrubina hasta 10 mg/dL y triglicérido hasta 1000 mg/dL no producen interferencias significativas.
Cuidados especiales .
Los empaques de plástico que contienen los inmunotubos deben abrirse sólo en equilibrio con'
la temperatura ambiente (temperatura inferior a 30 ºC) donde se hará la prueba, para evitar la condensación de vapor de agua en los tubos. El incumplimiento de esta orientación resultará en la disminución de la estabilidad del reactivo.
Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de su uso.
Precauciones y cuidados especiales
Muestra
1Procedimiento
Interferencias
Preparación de los reactivos
Conjugado de uso .
Para preparar el Conjugado de Uso, pipetear todo el contenido del frasco de Conjugado Concentrado ,#
transferir para el frasco que contiene el Diluyente del Conjugado$
y homogeneizar. Si es necesario, centrifugar el material para asegurar que todo el contenido del frasco de Conjugado Concentrado es en la parte inferior del tubo. Después de transferir la totalidad del volumen, enjuagar el frasco de Conjugado Concentrado con parte de la mezcla Conjugado Concentrado y Diluyente del Conjugado. Homogeneizar suavemente por inversión. Una vez preparado, el Conjugado de Uso es estable durante 4 meses cuando se almacena entre 2 y 8 ºC. Identificar el frasco y anotar la fecha de caducidad.Si es necesario, se puede preparar volúmenes más pequeños del Conjugado de Uso y transferir 1 (un) volumen del Conjugado
Concentrado y 50 volúmenes del Diluyente del
#
Conjugado ara un frasco limpio y seco. Una vez
$
ppreparado, el Conjugado de Uso es estable durante 4 meses cuando se almacena entre 2 y 8 ºC. Identificar el frasco y anotar la fecha de caducidad.
Para mantener su desempeño, el Conjugado de Uso debe permanecer fuera de la nevera sólo el tiempo necesario para su uso.
Reconstitución de los calibradores .
Consultar el apartado 1 -ObservacionesQuitar el precinto de aluminio y retirar con cuidado la tapa de goma. Sumar al frasco del calibrador el volumen de agua calidad reactivo con una pipeta volumétrica, tal como se indica en la etiqueta. Vuelva a colocar la tapa de goma, dejar reposar durante 15 minutos y homogeneizar suavemente por inversión. Antes de usar, homogeneizar suavemente y retirar la cantidad necesaria para su uso. Tapar inmediatamente y almacenar entre 2 y 8 ºC.
Después de la reconstitución, los calibradores permanecen estables durante 5 días, si se almacena entre 2 a 8 ºC.
Para su uso posterior, separar el calibrador en alícuotas inmediatamente después de la reconstitución y almacenar en temperatura inferior a 15 ºC negativos por hasta 90 días en recipiente herméticamente cerrado, protegido de la luz Para evitar la evaporación del material durante el. período de almacenamiento es esencial utilizar frascos adecuados para congelación (criotubos). Las alícuotas del calibrador deben descongelarse sólo una vez.
Los calibradores deben ser manejados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar las contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar reducción de la estabilidad.
Calibración .
La calibración del sistema se realiza mediante el uso de unaMaster Curvede 6 puntos (concentración de los calibradores y sus respectivas RLUs) y ajustada, cuando sea necesário, utilizando los dos calibradores de ajuste(Calibrador Low Bajo( ) -Ref. 9 .5 e Calibrador02 High Alto Ref. 90 .6).( ) - 2LaMaster Curvees suministrada en un documento adjunto juntamente con el producto PSA libre y es específica para cada lote de reactivos.
Al inserir los datos de laMaster Curvedurante la cr ación dele protocolo del test, inserir también las concentraciones de los calibradores de ayuste que figuran en el rótulo de los productos (Calibrador Low Bajo( ) - Ref. 90 .5 e Calibrador High Alto2 ( ) -Ref. 90 .6).2
Cuando se utiliza un lote de producto por primera vez, deben insertarse los datos de la Master Curve en el programa del luminómetro y luego debe hacer un ajuste en la curva de calibración, ensayando en duplicado los dos calibradores proporcionados en el kit (Calibrador Low Ba o - Ref. 90 .5 e Calibrador High Alto( j ) 2 ( ) -Ref. 90 .6).2 Para configurar la programación del aparato e introducir correctamente los datos de laMaster Curve, consultar el manual del equipo.
Cuando los reactivos se mantienen en las condiciones indicadas, la calibración permanece estable durante 7 días.
La calibración del sistema se ajusta en las condiciones a continuación:
1.
Cuando se utiliza un lote de producto por primera vez;2.
A cada nueva preparación del Conjugado de Uso;3.
A cada cambio de lote de las Soluciones Reveladoras (Ref. 909).4.
Cuando el control de calidad indicar.Procedimiento de prueba
Importante
1.
Los parámetros de lectura de las pruebas, así como los datos de laMaster curvedeben insertarse en el luminómetro antes de hacer las pruebas. Consultar apartado "Calibración" y el manual del equipo para obtener más informaciones.2.
No utilice más de 20 inmunotubos en cada carrera.1.
Separar el número de inmunotubos necesarios a las pruebas,'
identificarlos y posicionarlos en la estantería para inmunotubos.
2.
Sumar 0,20 mL de Diluyente de Muestra en la parte!
inferior de cada tubo.3.
Sumar 0,05 mL de la muestra (suero, controles o calibradores) directamente al contenido de cada tubo. Homogeneizar.4.
Incubar 30 minutos en baño María a 37 ºC.5.
Retirar los tubos del baño María.6.
Sumar 1,0 ml de Solución de LavadoConcentrada(Ref. 908) lista para uso.7.
Descartar el contenido de los tubos por inversión y con la estantería invertida, retirar el exceso de líquido, apoyando el borde superior de los tubos sobre una superficie absorbente (2-3 capas de toallas de papel).8.
Sumar 0,15 mL de Biotinilado en la parte inferior de cada"
tubo.
9.
Sumar 0,10 mL de Conjugado de Uso directamente al contenido de cada tubo. Homogeneizar.10.
Incubar 30 minutos en baño María a 37 ºC.11.
Retirar los tubos del baño María.12.
Repetir por seis veces consecutivas los pasos 6 y 7.13.
Para obtener los resultados, proceder de la siguiente manera:1.
Realizar elprimedel luminómetro (consultar las instrucciones de uso del producto Soluciones de Reveladoras- Ref. 909 y el manual de operación del luminómetro);2.
Seleccionar el protocolo de la prueba que tiene los datos de la Master Curve;3.
Realizar la medición de los calibradores de ajuste (si es necesario), muestras y controles.Intervalo operativo .
El intervalo operativo de la prueba es de 0,05 ng/mL hasta 20 ng/mL. Las muestras con resultados más bajos que el límite de sensibilidad analítica deben reportarse como <0,05 ng/mL. Las muestras con concentraciones superiores a 20 ng/mL se pueden diluir con solución salina 0,85%. Después de la dilución, multiplicar el valor obtenido por el factor de dilución utilizado.Control interno de calidad .
El laboratorio debe mantener un programa de control interno de la calidad que define claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, normas, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. El uso de los controles en todos los conjuntos de pruebas es esencial para controlar la imprecisión de la medición y desviaciones de la calibración.Se sugiere utilizar las preparaciones de la Línea Qualitrol Q de Labtest (Ref. 907) para control interno de la calidad en ensayos de quimioluminiscencia.
Intervalo de referencia
2, 3, 4.
Estudios indican que un 65% a un 75% de los hombres con elevación moderada del PSA total (valores entre 2,5 ng/mL y 4 ng/mL) no van a desarrollar cáncer de próstata y que aproximadamente un 15% de los pacientes con la enfermedad mantendrán niveles normales. A partir de estas constataciones, con el fin de ayudar en el diagnóstico de pacientes y reducir el número de biopsias innecesarias, se han desarrollado varios parámetros. Parámetros como la velocidad del PSA (velocidad del aumento del valor de PSA en el transcurso de los años), los cálculos de la densidad del PSA (relación entre PSA en el suero y el volumen de la próstata) y la adopción de valores de referencia específicos para distintos grupos de edad.
Otro método comúnmente utilizado es la relación entre el PSA libre y el PSA total. La fracción libre (no conjugada) del PSA Total disminuye en los pacientes con cáncer de próstata en comparación a los casos de hiperplasia benigna prostática. Varios estudios tienen distintos valores para la relación PSA libre/PSA total, con un promedio alrededor de un 20% de acuerdo con los métodos utilizados.
Valores abajo de este porcentaje sugieren neoplasias, mientras que los valores por encima de eso sugieren hipertrofia benigna. Cabe resaltar que esta relación sólo tiene significado clínico en pacientes con valores alterados de PSA total (encima de 2,5 ng/mL).
Características del desempeño
5Efectos de la dilución de la matriz .
Se utilizó una muestra con valor igual a 43,5 ng/mL para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/L (0,85%). Utilizando factores de dilución que variaron de 2 a 64 se encontró recuperación media de 100,1%.Comparación de métodos .
El método que se propone fue comparado con producto disponible en el mercado, que utiliza metodología similar y se obtuvo los resultados a continuación:Usando la ecuación de regresión, el error sistemático (sesgo) estimado fue igual a 9,75% para una muestra igual 0,41 ng/mL, 3,53% para una muestra igual a 2,26 ng/mL y 2,42% para una muestra igual a 9,06 ng/mL, error considerado aceptablel y no representa desviaciones de resultados6 entre la metodología comparativa.
Estudios de precisión .
Los estudios de precisión se realizaron utilizándose muestras nativas, en tres niveles distintos:Sensibilidad metodológica o analítica .
Límite de detección: 0,05 ng/mL. Representa la concentración más baja de PSA que se puede distinguir de cero. Equivale a la concentración de PSA libre situada dos desviaciones estándares del calibrador 1 (0 ng/mL).Número de muestras Intervalo de concentraciones (ng/mL)
Media de las estimativas (ng/mL) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Método Comparativo 45 0,05 - 5,12 1,26 Método Labtest = 1,0207 x Método Comparativo + 0,0363 0,962 45 0,05 - 5,251 1,33 Método Labtest
Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo
Media (ng/mL) 0,41 2,26 9,06 DP 0,02 0,06 0,38 CV (%) 4,89 5,48 5,08 N 40 40 40 Muestra 2 Muestra 3 Muestra1
Reproducibilidad - Imprecisión total
Media (ng/mL) 0,41 2,26 9,06 DP 0,03 0,15 0,54 CV (%) 6,65 7,01 7,34 N 40 40 40 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 1
Significado clínico .
7,8En los últimos 20 años, el PSA sérico ha sido el marcador tumoral más comúnmente utilizado para selección, estadificación y pronóstico del cáncer de próstata (CaP). Sin embargo, la selección de pacientes para biopsia da próstata utilizando como parámetro sólo el análisis del PSA sérico no es concluyente, principalmente en los hombres mayores de 50 años, ya que las altas concentraciones de PSA también se observan en casos de hipertrofia benigna prostática (HBP), neoplasia intraepitelial prostática, isquemia prostática, prostatitis aguda o crónica o después de la manipulación de la próstata.
En este contexto, la determinación sérica de PSAL ha sido sugerida como prueba adjunta a la prueba de determinación del PSA total (PSA complejado + PSAL), con el objetivo de reducir el número de biopsias prostáticas innecesarias y aumentar el porcentaje de “acierto” de diagnóstico diferencial entre CaP y HBP, dado que hombres que desarrollan el CaP presentan porcentaje de PSAL más baja que los hombres que tienen HBP. Cabe resaltar, sin embargo, que la determinación aislada de PSAL, en ausencia de la determinación de PSA total no son relevantes. Se obtendrá el aumento de la fiabilidad del diagnóstico sólo cuando se obtiene el porcentaje (PSAL%) que determina la concentración de PSAL en relación con la concentración de PSA total. La probabilidad de que haya CaP aumenta a medida que el PSAL % disminuye. Cuando los valores de PSA total exceden 10 ng/mL, el cálculo del PSAL% no contribuye para distinguir casos de CaP y enfermedades benignas, pero en el intervalo de 2,5 a 10 ng/mL de PSA total, el cálculo del PSAL es utilizado para aumentar la especificidad del diagnóstico.% En este contexto, el uso juicioso de los valores sanguíneos asociados al examen clínico directo (tacto rectal), tiene gran utilidad clínica.
Observaciones
1.
El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o³ conductividad£1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/L. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua.Referências
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2. Ferraz, M.L.C.G e Andriolo, A. - Artigo de revisão: Marcadores Tumorais Bioquímicos. Disponível em:
<http://www.moreirajr.com.br/revistas.asp?fase=r003&id_materia =105>, acesso em 05/10/2011.
3. Antígeno Prostático Específico. Disponível em:
http://www.lsf.com.br/arquivos/medicos/texto/ANTIGENO%20PROS T%20ESPECIFICO.pdf>, acesso em 05/07/2011
4. Roscigno, M., Scattoni, V., Bertini, R., Pasta,A., Montorsi, F., Rigatti, P., Diagnosis of prostate cancer.Minerva Urol Nefrol 2004; 56:123-45. 5. Arquivos Labtest
6. Ricós V. (1999) Current databases on biological variation: pros, cons and progress.Scand J Clin Lab Invest; 59: 491-500.
7. Stephan C. (2000) Molecular forms of prostate-specific antigen and human Kallikrein 2 as promising tools for early diagnosis of prostate cancer.Cancer Epidemiol biomarkers Prev, 9:1133-1147. 8. Okegawa T. (2000) Comparisons of the various combinations of free,
complexed and total prostate-specific antigen for the detection of prostate cancer.Eur Urol, 38:380-387.
Informaciones al consumidor
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