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Segmentación de imágenes para el análisis de eritrocitos en microscopía celular

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Academic year: 2020

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(1)Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ingeniería Eléctrica Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información. TRABAJO DE DIPLOMA Título: Segmentación de imágenes para el análisis de eritrocitos en microscopía celular. Autor: Lyanett Chinea Valdés. Tutor: Dr. Juan V. Lorenzo Ginori. Santa Clara 2010 "Año 52 de la Revolución".

(2) Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ingeniería Eléctrica Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información. TRABAJO DE DIPLOMA Título: Segmentación de imágenes para el análisis de eritrocitos en microscopía celular. Autor: Lyanett Chinea Valdés Tutor: Dr. Juan V. Lorenzo Ginori Profesor Titular Consultante. CEETI email:juanl@uclv.edu.cu. Santa Clara 2010 "Año 52 de la Revolución".

(3) Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la especialidad de Ingeniería Biomédica, autorizando a que el mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la Universidad.. Firma del Autor Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.. Firma del Tutor. Firma del Jefe de Departamento donde se defiende el trabajo. Firma del Responsable de Información Científico-Técnica.

(4) cxÇátÅ|xÇàÉ. El científico no tiene por objeto un resultado inmediato. Su deber es sentar las bases para aquellos que están por venir, y señalar el camino. Nikola Tesla (1856- 1943).

(5) ii. Wxw|vtàÉÜ|t A mis padres, por ser lo más importante que tengo en la vida. A mi hermana Lemia por ser mi apoyo, mi refugio y mi amiga. A mi sobrina Melissa, por ser la alegría y la luz de mi vida. A todas esas personas que confiaron en mí y me dieron fuerzas para seguir adelante cuando pensaba que no podía..

(6) iii. TzÜtwxv|Å|xÇàÉá A mis padres, por el apoyo que me han dado a lo largo de todos los años de estudio de mi vida. A mi hermana Lemia y mi cuñado Yoany, que siempre estuvieron al tanto de mis necesidades y de brindarme aliento para seguir adelante. A mi novio Osmany, por ayudarme a afrontar estos momentos tan difíciles, y por brindarme su amor y comprensión. A mi tía Ángela Chinea y a mi tío Ricardo Alemán por la ayuda, la preocupación y el apoyo brindado en todo momento. A la familia de mi novio, en especial a mi suegra Angelina, por ayudarme y apoyarme como si fuera una hija. A mi tutor Juan V. Lorenzo Ginori por confiar en mí, apoyarme, guiarme y darme confianza para llegar a donde no pensé que sería capaz. A mis profesores durante estos 5 años de estudios en la Facultad de Eléctrica y en especial a los profesores del CEETI, por todo lo que con paciencia y amor me han enseñado. A todas aquellas personas que de una forma u otra contribuyeron a la realización de este sueño hecho realidad..

(7) iv. TAREA TÉCNICA. 1. Realizar una amplia búsqueda y revisión bibliográfica sobre el tema de la segmentación de imágenes de microscopia celular, con énfasis en las imágenes de eritrocitos de sangre humana. 2. Implementar programas de computación en Matlab para la segmentación de imágenes a color de eritrocitos, empleando los algoritmos de Otsu y de Lloyd y realizar una evaluación comparativa de los resultados, en forma cualitativa. 3. Implementar en Matlab un algoritmo de segmentación que permita separar las células aglomeradas (que se superponen o se tocan) basado en la transformada watershed con uso de marcadores, y evaluar su desempeño en forma cualitativa, aplicándolo al caso de las imágenes de eritrocitos.. Firma del Autor. Firma del Tutor.

(8) v. RESUMEN. En los análisis de eritrocitos sobre frotis de sangre humana se hace necesario procesar grandes cantidades de imágenes para la realización de la clasificación y el conteo diferencial. Como este es un proceso que aún se desarrolla de forma manual, la automatización del mismo mediante la aplicación de técnicas de procesamiento digital de imágenes resulta una herramienta de gran aplicación. Para poder realizar un procesamiento de imágenes eficiente en este caso, se deben perfeccionar los métodos de segmentación de imágenes que se emplean. En este trabajo se implementan y aplican dos métodos de segmentación de imágenes de eritrocitos: el algoritmo de Otsu sobre la componente de saturación de la imagen en el espacio HSV, y al algoritmo de Lloyd utilizando la información de color en el espacio RGB. También se implementa un método para separar los eritrocitos que se superponen o se tocan, utilizando la transformada watershed con empleo de marcadores. Mediante una comparación cualitativa de los resultados de la segmentación, se concluye que el algoritmo de Lloyd aporta los mejores resultados. También se concluyó que la transformada watershed, utilizada para separar los eritrocitos aglomerados, es más eficaz si se aplica sobre la transformada de distancia externa..

(9) vi. ÍNDICE. Pensamiento .............................................................................................................................i Dedicatoria..............................................................................................................................ii Agradecimientos ................................................................................................................... iii TAREA TÉCNICA................................................................................................................iv RESUMEN .............................................................................................................................v INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................1 CAPÍTULO 1. Fundamentos teóricos sobre la segmentación de eritrocitos en imágenes microscópicas de muestras de sangre humana........................................................................6 1.1 Introducción .................................................................................................................6 1.2 Características morfológicas y estructura de los eritrocitos.........................................6 1.3 Análisis de laboratorio de los eritrocitos....................................................................10 1.4 Análisis de las fuentes y de la bibliografía ................................................................12 1.5 Breves fundamentos de las imágenes digitales a color ..............................................14 1.6 Fundamentos teóricos del procesamiento morfológico de imágenes.........................17 1.7 Fundamentos teóricos de la segmentación de imágenes............................................21 1.7.1. Algoritmo de segmentación de Otsu.............................................................22. 1.7.2. Algoritmo de segmentación de Lloyd...........................................................25. 1.7.3. Algoritmo de segmentación watershed.........................................................26. 1.7.3.1. Gradiente morfológico.............................................................................27. 1.7.3.2. Transformada de distancia (TD)..............................................................28. 1.7.3.3 Otras operaciones importantes del procesamiento morfológico de imágenes en escala de grises utilizadas en este trabajo ............................................30 1.8 Conclusiones del capítulo ..........................................................................................30 CAPÍTULO 2.. MATERIALES Y MÉTODOS ...............................................................31. 2.1 Introducción ...............................................................................................................31 2.2 Características de las imágenes utilizadas en el estudio ............................................32.

(10) vii 2.3 Esquema general del proceso de segmentación .........................................................33 2.4 Algoritmos de segmentación implementados en Matlab ...........................................34 2.4.1. Algoritmo de Otsu ........................................................................................35. 2.4.2. Algoritmo de Lloyd ......................................................................................35. 2.4.3. Comparación entre los algoritmos de Otsu y de Lloyd ................................37. 2.5 Pasos adicionales en el proceso de segmentación......................................................38 2.6 Segmentación de eritrocitos aglomerados..................................................................39 2.6.1. Detección de las aglomeraciones: uso de métodos de granulometría...........39. 2.6.2 Segmentación de los eritrocitos que se tocan o superponen (aglomeraciones) empleando la transformada watershed .......................................................................40 2.6.2.1 Refinamiento de la segmentación de aglomeraciones a partir de la transformada de distancia externa.............................................................................43 2.7 Estructura de almacenamiento adoptada para las imágenes segmentadas .................43 2.8 Conclusiones del capítulo ..........................................................................................45 CAPÍTULO 3.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.............................................................46. 3.1 Introducción ...............................................................................................................46 3.2 Resultados de la primera etapa de la segmentación (segmentación gruesa)..............46 3.2.1. Resultados de la segmentación mediante el algoritmo de Otsu....................46. 3.2.2. Resultados de la segmentación mediante el algoritmo de Lloyd..................48. 3.3 Pasos adicionales en el proceso de segmentación......................................................50 3.4 Segmentación de eritrocitos aglomerados..................................................................52 3.5 Estructura de almacenamiento de los eritrocitos de forma individual .......................55 3.6 Conclusiones del capítulo ..........................................................................................56 CONCLUSIONES ................................................................................................................57 RECOMENDACIONES.......................................................................................................58 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................60 ANEXOS ..............................................................................................................................64 Anexo I. Programas de computación.............................................................................64.

(11) INTRODUCCIÓN. El análisis de sangre ha adquirido gran relevancia en el diagnóstico clínico puesto que constituye una ayuda fundamental orientada hacia el diagnóstico de diversas enfermedades que se han sospechado mediante el estudio de la historia clínica y la exploración física. Con el desarrollo del microscopio óptico digital se obtienen una gran cantidad de imágenes las cuales brindan informaciones sobre diversas patologías que puede presentar el paciente y posibilitan realizar a su vez la clasificación y conteo de los diversos tipos de células presentes en la sangre, mediante la aplicación de técnicas de Procesamiento Digital de Imágenes (PDI). El PDI en el análisis de imágenes de eritrocitos de muestras de sangre humana, es un tema novedoso y con un amplio campo de desarrollo. A pesar de que los métodos de conteo de eritrocitos se han automatizado, con la clasificación y conteo diferencial de células no se ha alcanzado todo el desarrollo deseado, realizándose aún este proceso de manera manual. Por tanto, el PDI enfocado a lograr una mayor automatización de los procesos resulta una opción beneficiosa, para obtener resultados de forma rápida, automatizada y con mayor grado de confiabilidad. El análisis al microscopio de extensiones (frotis) de sangre humana para la clasificación y conteo de los eritrocitos, tiene importantes y diversas aplicaciones médicas y biotecnológicas, como es el caso, en estudios realizados por el CBQ (Centro de Bioactivos Químicos) de la UCLV en el desarrollo de medicamentos y en investigaciones que realiza el CBM (Centro de Biofísica Médica) de la Universidad Oriente, en el estudio de la anemia falciforme o sicklemia. La necesidad de analizar grandes cantidades de imágenes representa en la actualidad una seria limitación en el desarrollo de las investigaciones en este campo, que solo puede ser superada mediante la introducción de las técnicas de computación. Se.

(12) INTRODUCCIÓN. 2. deriva de esto que la automatización de los procesos constituye un problema científico de gran interés actual, con un campo de investigación muy activo a nivel mundial. Como principal motivación de este trabajo está precisamente la necesidad de analizar grandes cantidades de imágenes de microscopía celular en diferentes aplicaciones. Este análisis es necesario en la clasificación y conteo de eritrocitos, el cual es un factor de gran importancia en aplicaciones tales como la detección de patologías que se asocian con las alteraciones morfológicas de estos, y con la presencia de parásitos en su interior. Por lo que se persigue facilitar, con la segmentación y extracción de los eritrocitos, la realización de la clasificación y el conteo diferencial de estos, así como brindar una plataforma de automatización de los procesos de análisis de las imágenes de microscopía celular, que pueda ser utilizada en las aplicaciones e instituciones mencionadas y en otras similares. Existe en la actualidad un gran número de algoritmos computacionales para la segmentación de imágenes, que han sido descritos en la literatura científica, así como una considerable actividad investigativa dirigida a crear nuevas soluciones a esta problemática. Esta situación está motivada porque no existen métodos de segmentación generales, que puedan dar solución al problema independientemente de la clase de imágenes de que se trate. Debido a lo anterior, resultan de particular importancia los métodos de evaluación de los algoritmos de segmentación de imágenes, a partir de la evaluación cuantitativa de determinados criterios de calidad. Esta evaluación permite comparar el desempeño de diferentes algoritmos para una clase dada de imágenes, así como determinar los valores adecuados de los parámetros utilizados en dichos algoritmos, con el objetivo de lograr el mejor desempeño posible. En general puede decirse que un buen algoritmo de segmentación de imágenes será aquel que resalte de forma adecuada las regiones compactas de interés en la imagen, de forma tal que estas regiones puedan ser utilizadas posteriormente en los procesos de análisis, reconocimiento de patrones y toma de decisiones. Existen dos clases de métodos de evaluación de algoritmos de segmentación de imágenes: los supervisados y los no supervisados [1]. En los métodos supervisados, se utiliza una imagen de referencia previamente segmentada (groundtruth), en la cual esta segmentación pueda considerarse “exacta”. Diferentes métodos permiten cuantificar la exactitud con que.

(13) INTRODUCCIÓN. 3. un algoritmo dado es capaz de producir como resultado una segmentación coincidente con la de referencia. La dificultad principal para aplicar estos métodos reside precisamente en la necesidad de disponer de imágenes de referencia. Muchas veces estas referencias se obtienen mediante segmentación manual por parte de expertos humanos, no obstante en el caso particular de la segmentación de células, este procedimiento resulta muy impreciso, por lo que se tiende en la actualidad a crear células simuladas [2] que puedan servir de referencia. Los métodos no supervisados, por otra parte, se basan en medir determinados criterios de calidad de las imágenes segmentadas, tales como ciertos parámetros estadísticos en las regiones resultantes de la segmentación. Como ejemplo pueden citarse parámetros relacionados con la uniformidad intra-regiones o con el contraste inter-regiones. El problema de la evaluación de la calidad en la segmentación es por tanto complejo, y ha de tener como punto de partida disponer de métodos de segmentación que sean buenos candidatos para satisfacer los requerimientos planteados. En el caso del presente trabajo, se trata de implementar algoritmos de segmentación en dos aplicaciones: la segmentación de objetos que pueden ser eritrocitos o agregados de estos, donde se empleará fundamentalmente la información relativa al color y la segmentación destinada a subdividir los agregados celulares. Los algoritmos se seleccionaron a partir de los resultados que se reportan en la literatura científica y se realizó una evaluación visual cualitativa de los mismos, dado que en el período de tiempo disponible para la realización de este trabajo no es posible completar un análisis cuantitativo de la calidad de la segmentación.. La. evaluación por inspección visual, independientemente de la subjetividad que puede estar presente en la evaluación cualitativa de los resultados de la segmentación por parte de un observador humano, y a pesar de ser poco rigurosa, también es reconocida como una forma de evaluar la calidad de la segmentación [1], y en este caso sirve como antecedente de un proceso más riguroso de evaluación cuantitativa, que se dejará como recomendación para la continuación del presente trabajo..

(14) INTRODUCCIÓN. 4. Por lo antes expuesto se propusieron los siguientes objetivos: Objetivo General: Desarrollar un algoritmo de segmentación de imágenes, orientado a la clasificación y el. conteo diferencial de eritrocitos en imágenes microscópicas de muestras de sangre humana, mediante el procesamiento digital de imágenes, y programar el mismo utilizando el software Matlab. Objetivos específicos: 1.. Implementar dos métodos de segmentación, un método basado en umbrales (método de Otsu sobre la imagen de saturación) y otro método utilizando la información del color (algoritmo de Lloyd generalizado) en imágenes de eritrocitos de muestras de sangre humana.. 2.. Separar las células aglomeradas aplicando la transformada watershed, aplicada a la transformada de distancia de las imágenes binarias de las máscaras obtenidas en el primer paso de segmentación.. 3.. Almacenar los eritrocitos separados de forma independiente para su posterior utilización en procesos de análisis.. 4.. Realizar un análisis comparativo cualitativo entre los métodos de segmentación de Otsu y de Lloyd implementados.. Para lograr la solución del problema expuesto se planteó la siguiente tarea técnica: 1. Realizar una amplia búsqueda y revisión bibliográfica sobre el tema de la segmentación de imágenes de microscopia celular, con énfasis en las imágenes de eritrocitos de sangre humana. 2. Implementar en Matlab los algoritmos de Otsu y de Lloyd para la segmentación de imágenes a color de eritrocitos en muestras a las que les han sido aplicadas tinciones, y realizar una evaluación comparativa de los resultados, en forma cualitativa. 3. Implementar en Matlab un algoritmo de segmentación que permita separar las células aglomeradas (que se superponen o se tocan) basado en la transformada.

(15) INTRODUCCIÓN. 5. watershed con uso de marcadores, y evaluar su desempeño en forma cualitativa, aplicándolo al caso de las imágenes de eritrocitos. Los resultados de este trabajo son valiosos en el área de la imaginología médica relacionadas con el análisis de imágenes de microscopía celular, y constituyen parte de los primeros pasos para la realización de diferentes aplicaciones en las investigaciones sobre Procesamiento Digital de Imágenes en microscopía celular que realiza el CEETI en colaboración con el CBQ. Este trabajo está estructurado de la siguiente forma: introducción, capitulario, conclusiones, recomendaciones, referencias bibliográficas y anexos. En el capítulo 1 se tratan las características morfológicas de los eritrocitos, los análisis de laboratorio que se realizan para estudiar los mismos, así como. los fundamentos teóricos de los métodos de. segmentación propuestos. El segundo capítulo trata sobre la implementación en Matlab de los algoritmos de segmentación definidos en el capítulo 1, aplicados a las imágenes de eritrocitos en muestras de sangre humana y la estructura de almacenamiento adoptada. El tercer capítulo se basa en la visualización y análisis de los resultados obtenidos con los métodos de segmentación propuestos. Por último, en los anexos se pueden encontrar las líneas de comando de la programación realizada..

(16) CAPÍTULO 1. Fundamentos. teóricos. sobre. la. segmentación. de. eritrocitos en imágenes microscópicas de muestras de sangre humana. 1.1. Introducción. En este capítulo se presentan los fundamentos de la segmentación de imágenes de microscopía celular particularizándose al caso de los eritrocitos y se realiza un análisis de una selección de la literatura científica publicada sobre el tema. El capítulo tiene cinco epígrafes y está estructurado de la forma que se explica a continuación. El epígrafe 1.1 es introductorio, en el epígrafe 1.2 se analizan las características morfológicas y la estructura de los eritrocitos. En el epígrafe 1.3 se tratan los análisis de laboratorio realizados para el estudio de los eritrocitos. En el epígrafe 1.4 se realiza un análisis de algunas de las fuentes y de la bibliografía científica existente referente al tema. El epígrafe 1.5 comprende brevemente los fundamentos de las imágenes digitales a color, abordando mayormente los espacios de color utilizados en el trabajo. El epígrafe 1.6 aborda los fundamentos teóricos del procesamiento morfológico de imágenes, haciendo referencia a las operaciones básicas del filtrado morfológico utilizadas. En el epígrafe 1.7 se tratan los fundamentos teóricos de la segmentación de imágenes profundizando en los algoritmos de segmentación empleados. Y por último, en el epígrafe 1.8 se hacen las conclusiones del capítulo. 1.2. Características morfológicas y estructura de los eritrocitos. La sangre es una sustancia líquida que circula por las arterias y las venas de los organismos, la cual está compuesta por tres tipos básicos de células o elementos celulares: los eritrocitos también conocidos como glóbulos rojos o hematíes, los leucocitos también nombrados glóbulos blancos y las plaquetas..

(17) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 7. De las células de la sangre los eritrocitos son las más abundantes y el principal medio que tiene el cuerpo humano de suministrar oxígeno a los tejidos. Son los responsables de la tonalidad propia de la sangre, ya que normalmente contienen hemoglobina (Hb) la cual consta de varias moléculas de hierro, cuyo mineral al cargarse de oxígeno u oxidarse, adquiere una coloración rojiza característica. Los eritrocitos humanos, son células que no presentan núcleo cuando maduran, son de forma oval, bicóncava, aplanada, con una depresión en el centro, ver figura 1.1. Tienen un diámetro medio de aproximadamente 7,8 micrómetros, un espesor máximo de 2,5 micrómetros y de 1 micrómetro o menos por el centro. El volumen medio de los eritrocitos es de 90 a 95 micrómetros cúbicos. En los varones sanos el número medio de eritrocitos por milímetro cúbico es de 5 200 000 (+ 300 000) y en las mujeres sanas, es de 4700 000 (+ 300 000) [3].. Figura 1.1 Eritrocitos de una muestra de sangre humana.. La producción de los eritrocitos depende en gran medida de que el organismo adquiera cantidades suficientes de proteínas, carbohidratos, grasa, minerales (especialmente hierro) y vitaminas (especialmente B 12 , ácido fólico, vitamina B 6 [piridoxina] y vitamina C [ácido ascórbico]) [4]. Existe un gran número de enfermedades relacionadas con los eritrocitos, que pueden ser determinadas por la morfología que presenten estos [5], las variaciones que se pueden presentar están relacionadas con el tamaño, la forma y el color que tengan. En la Tabla 1.1 se muestra. una relación a partir de las alteraciones de tamaño, forma, color y las. inclusiones intraeritrocitarias, donde se describen las características de las células ante estas.

(18) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 8.

(19) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 9.

(20) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 10. alteraciones y qué indican al personal médico al realizar un diagnóstico. 1.3. Análisis de laboratorio de los eritrocitos. Un examen de sangre brinda información acerca del número y la forma de las células sanguíneas. Los eritrocitos se analizan mediante diferentes pruebas de laboratorio, los tres análisis principales son: el conteo de eritrocitos (RBC), la hemoglobina (HGB) y el hematocrito (HCT). Existen también otras pruebas que ayudan a determinar un posible diagnóstico, entre las que se encuentran: el volumen corpuscular medio (MCV), el análisis de distribución de los glóbulos rojos (RDW), la hemoglobina corpuscular media (MCH), la concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), así como otros análisis destinados, por ejemplo, a determinar la presencia de parásitos como el Plasmodium (Malaria) [4, 6-7]. La determinación de la cantidad de eritrocitos presentes en una muestra de sangre puede realizarse manualmente por un personal experimentado. o de forma automatizada. El. recuento manual se realiza con un hemocitómetro o cámara de recuento Neubauer y un microscopio. La cámara de Neubauer es un aparato de vidrio óptico especial de precisión, con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una retícula micrométrica. Existen dos tipos de métodos de recuento automatizado: los contadores electrónicos y los contadores ópticos, este último comprende a su vez los contadores por bloqueo de la luz blanca y los contadores por absorción y dispersión de la luz. Algunos contadores aplican las dos tecnologías o incluso incorporan otras más recientes como radiofrecuencia, luz polarizada, etc. [7-8] La tecnología moderna ha automatizado los procesos de conteo de células de la sangre y la evaluación de varios parámetros característicos de estas, basada en la confiabilidad de las técnicas y el costo. Debido a esto cualquier simple operador manual puede realizar el conteo automatizado de células y un conteo automatizado avanzado con una plataforma aplicada al servicio de las más específicas necesidades médicas..

(21) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 11. Los equipos automatizados para recuentos celulares han sido diseñados teniendo en cuenta. algunas propiedades de las células entre las que se encuentran: la mala conductividad de electricidad, la variedad de tamaños, las diferentes densidades que presentan, que cada célula refracta la luz con una intensidad diferente, que tienen una composición histoquímica diferente que se puede caracterizar para cada célula y una relación núcleo-citoplasma diferente para cada una. En los laboratorios hematológicos, producto del gran desarrollo alcanzado en el conteo celular automatizado, ya el conteo manual no se realiza. Pero aún se continúan haciendo análisis manuales para la clasificación y conteo diferencial de células, en los cuales los diagnósticos realizados por el personal capacitado pueden estar sujetos a errores al. ser. desarrollados por expertos humanos, además de alcanzarse menor eficiencia en términos de tiempo. La clasificación y conteo diferencial de eritrocitos es un examen que se realiza como parte de una evaluación médica general para ayudar a diagnosticar muchas enfermedades o cuando el médico sospecha de una anomalía en las células sanguíneas. Es por tanto, una prueba que sirve para orientar sobre diversas enfermedades que se han sospechado por la historia clínica y la exploración física. Por su relevante importancia en el primer diagnóstico del paciente, se debe realizar de la mejor manera en términos de tiempo y con el menor error posible por parte del médico. A pesar de la gran relevancia médica que tiene la clasificación y conteo diferencial de eritrocitos en imágenes microscópicas, en este proceso se producen errores intra e interanalistas debidos a la variabilidad de la apreciación de estos, además, es un proceso que resulta ser muchas veces lento y tedioso. Teniendo en cuenta estos factores, en este trabajo se propone un método de segmentación de eritrocitos que posibilite la clasificación y conteo de los mismos mediante técnicas de Procesamiento Digital de Imágenes (PDI), utilizando las herramientas del software Matlab. El método propuesto brinda un soporte y una plataforma de automatización de los procesos que puede contribuir a una buena toma de decisiones por parte de los profesionales de la medicina. De esta forma se persigue desarrollar un método de clasificación y conteo diferencial automatizado,. utilizando. tecnologías de procesamiento computacional, con menor costo, mayor eficiencia en.

(22) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 12. términos de tiempo y pequeños márgenes de error. Por todo lo anterior, se considera que los resultados de este trabajo pueden ser potencialmente de gran importancia para el Sistema Nacional de Salud. 1.4. Análisis de las fuentes y de la bibliografía. Para obtener una clasificación y conteo diferencial de eritrocitos lo más fiel posible, mediante el PDI, se necesita realizar como una de las tareas fundamentales un buen proceso de segmentación de las imágenes. El proceso de segmentación tiene una gran relevancia, ya que es uno de los elementos más importantes de cualquier sistema automatizado de visión, puesto que es el primer nivel de la tarea de entendimiento de la imagen y afecta de manera importante el proceso posterior de interpretación de la misma. Por esta razón, en este trabajo se realizó una amplia búsqueda sobre los algoritmos de segmentación celular existentes. Existe gran variedad de métodos semi-automáticos o automáticos que han sido propuestos para la realización de la segmentación celular [9] . A continuación se citarán algunos: Wu et. al. [10] manifiestan que en el caso de la segmentación de las células de la sangre, la detección de bordes es deficiente porque no todos los bordes son nítidos, es difícil obtener toda la información relativa a los mismos, así como localizar las células con precisión; por lo que desarrollan un método de Otsu iterativo, basado en histogramas circulares. Anoraganingrum [11] expone una forma de realizar la segmentación celular empleando una combinación del filtro de mediana con operadores matemáticos morfológicos, como la dilatación y la erosión. En este método se usa una forma simple de determinación de los umbrales, flexible y controlada por el usuario, por lo que no se alcanza una segmentación lo más automatizada posible. Al realizar el experimento se demuestra que el procedimiento es adecuado para la segmentación basada en la detección de bordes y que su funcionamiento es comparable a varios algoritmos de detección de bordes como Sobel, Prewitt, Roberts y el Laplaciano de la Gaussiana. Bergen et. al. [12] proponen una forma de segmentar leucocitos y eritrocitos donde se combina. la clasificación píxel a píxel con el ajuste de plantillas, para localizar los.

(23) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 13. eritrocitos y usar un enfoque de conjuntos de nivel para obtener los contornos exactos de los núcleos de los leucocitos y las regiones de plasma, así como las regiones ocupadas por los eritrocitos. La utilización para la segmentación celular del algoritmo watershed está muy difundida en la práctica científica actual, seguidamente se mostrarán algunos ejemplos. Kachouie et. al. [13] consideran la segmentación como un problema inverso, localizando el centro de la célula por adelantado y reconstruyendo las regiones asociadas con el mismo, usando un método optimizado de watershed. La metodología expuesta da la posibilidad de segmentar diferentes tipos de células sin considerar la forma que estas tengan. Mientras que Wang et. al. [14] presentan el algoritmo watershed, combinando técnicas basadas en regiones y bordes para la segmentación de imágenes en escala de grises, el cual comparado con el método tradicional del algoritmo de segmentación por watershed mejora los resultados en cuanto a la sobresegmentación. Gao et. al. [15] por su parte proponen un método donde utilizan la tranformada wavelet compleja dentro de la segmentación de watershed, y usan la información obtenida por la segmentación de umbral adaptativo para refinar el resultado de la segmentación de watershed. En los diferentes métodos referidos donde se emplea el algoritmo watershed, no se utiliza la información de color presente en las imágenes celulares, por lo que se desperdicia información que puede ser de mucha utilidad. En el artículo de Di Ruberto et. al. [16] se introduce un método morfológico para la segmentación de imágenes celulares, que es más exacto que el algoritmo clásico de la transformada watershed. Se plantea aplicar la granulometría en escala de grises basada en una apertura con elementos estructurantes en forma de discos, plano y hemisférico. Se utiliza en este caso un elemento estructurante con forma de disco hemisférico para realzar la redondez y la compactación de los eritrocitos, mejorando la exactitud de la clasificación del algoritmo clásico de watershed, así como un elemento estructurante con forma de disco plano para separar las células aglomeradas. Kumar et. al. [17] abordan una metodología para la segmentación de imágenes a color usando el alto orden de entropía como una característica para la determinación de umbrales. Esta técnica puede ser utilizada para la segmentación de células sanguíneas, producto de.

(24) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 14. que las imágenes a color son una fuente muy rica de información, porque proporcionan una mejor descripción de la escena en comparación con las imágenes en escala de grises. De forma general se evidencia que no es una tarea simple encontrar un método, que pueda ser considerado exacto, para la segmentación de células sanguíneas, por lo que hay que esforzarse para encontrar una solución inconcusa y robusta, para resolver de forma satisfactoria la segmentación de las mismas. 1.5. Breves fundamentos de las imágenes digitales a color. El uso del color en el procesamiento de imágenes está motivado por dos factores principales: el primero es que el color es un poderoso descriptor que a menudo simplifica la identificación y extracción de objetos, y el segundo factor es que el ojo humano puede discernir muchos más colores (del orden de miles de combinaciones de intensidad y color) que niveles de grises (algo más de veinte). Las bases técnicas y experimentales de la percepción del color por el ojo humano, han sido descritas por un gran número de autores, entre ellos Gonzalez y Woods [18]. Existen muchos modelos de color importantes descritos por Gonzalez y Woods [18], Russ [19] y Pratt [20].De los mismos, los modelos de más importancia a los efectos de este trabajo son el RGB y el HSV, por lo que se describirán a continuación. El modelo RGB (sigla construida a partir de red, green y blue, del idioma inglés, correspondientes a los colores rojo, verde y azul) captura y almacena por separado las componentes de los colores primarios, asociadas a las longitudes de onda corta, media y larga del espectro visible. Este modelo es basado en un sistema de coordenadas cartesianas, representado en forma de cubo. Los valores RGB en el cubo y los valores cian, magenta y amarillo, están constituidos por tres coordenadas, el negro es el origen y el blanco es la coordenada más alejada desde el origen, esto se ilustra en la figura 1.2..

(25) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 15. Figura 1.2. Modelo de color RGB.. Las imágenes representadas en el modelo de color RGB consisten en tres planos de imágenes independientes, una para cada color primario. Cuando son introducidas en un monitor RGB, las imágenes se combinan en la pantalla del mismo para producir una imagen de combinaciones de color. El modelo HSV (sigla construida a partir de hue, saturation y value, del idioma inglés, correspondientes a hue, saturación y valor) es un modelo que pertenece a un grupo de sistemas de coordenadas de color orientadas al tinte, el cual corresponde estrechamente a la percepción del color por el ojo humano. Este sistema presenta forma cilíndrica, es representado por un cono hexagonal y es una simplificación del. modelo HSI, la. representación del mismo se puede observar en la figura 1.3. Una mayor información sobre el modelo de color HSI se puede encontrar en [18, 21]..

(26) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 16. Figura 1.3. Modelo de color HSV.. El hecho de que el modelo HSV pertenezca a familia del HSI, proporciona varias ventajas sobre los otros espacios de color en determinadas aplicaciones. Este espacio tiene una buena compatibilidad con la intuición humana,. presentando los valores cromáticos y. acromáticos separados. Además brinda la posibilidad de emplear un rasgo de color, en lugar de los tres, lo que permite obtener algoritmos más rápidos en la segmentación de imágenes. Con una imagen en el formato RGB, la componente H de cada píxel RGB es obtenida usando la ecuación: 1 [( R − G ) + ( R − B)] 2 H 1 = cos −1{ } ( R − G ) 2 + ( R − B)(G − B). H = H1. , si B ≤ G. H = 360 0 − H 1. , si B >G. (1). La componente de saturación es determinada por: S=. max( R, G, B) − min( R, G, B) max( R, G, B). (2).

(27) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 17. Y la componente de valor es determinada por: V =. max( R, G , B ) 255. (3). Para estas ecuaciones se asume que los valores de RGB están entre 0 y 255, correspondiendo la R, G y la B a las componentes rojo, verde y azul respectivamente y la H a la componente de hue [21]. Las imágenes celulares pueden ser analizadas utilizando la información del color producto de las tinciones que se utilizan en los laboratorios de hematología. Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas. Esto tiene como objetivo aumentar el contraste entre las estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visualizadas en el microscopio con mayor facilidad [22]. En el presente trabajo se hará una amplia utilización de las imágenes en el espacio RGB, quedando el uso del espacio HSV reducido al caso del algoritmo de Otsu. No obstante el uso del espacio HSV puede ser considerado como una alternativa potencialmente útil en futuros trabajos. 1.6. Fundamentos teóricos del procesamiento morfológico de imágenes. Toda operación morfológica es el resultado de una o más operaciones de conjuntos (unión, intersección, complementación,… etc.) [18], [23], [24], [25]. Las imágenes tanto en niveles de gris como binarias son conjuntos sobre los que se llevarán a cabo las operaciones. Las transformaciones morfológicas pueden efectuarse en N dimensiones euclidianas, aunque es común operar sobre imágenes binarias, que corresponden a un espacio bidimensional [25]. Las operaciones básicas del procesamiento morfológico de imágenes binarias utilizadas en este trabajo son: dilatación, erosión, apertura, cierre, reconstrucción morfológica y etiquetado de regiones conectadas y apertura por áreas. Dilatación Con A y B como conjuntos en Z2, la dilatación de A por B, es denotada. A ⊕ B y es. definida como:. { (). }. A ⊕ B = z | Bˆ z ∩ A ≠ Ο /. (4).

(28) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 18. Esta ecuación está basada en la obtención de la reflexión de B respecto al origen y en el corrimiento por z. La dilatación de A por B es el conjunto de todos los desplazamientos, z, tal que B̂ y A se superponen al menos por un elemento. Basado en esta interpretación, la ecuación se puede escribir como:. { [( ). ] }. A ⊕ B = z | Bˆ z ∩ A ⊆ A. (5). El conjunto B es comúnmente referido como el elemento estructurante (EE) de la dilatación, al igual que en las demás operaciones morfológicas. Erosión Para los conjuntos A y B en Z2 la erosión de A por B, está definida como: (6) Por tanto la erosión de A por B es el conjunto de todos los puntos z tales que B, trasladado por z, está contenida en A. Apertura La apertura de A por el elemento estructurante B, se denota A o B y se define como: (7) Expresándose como una operación de erosión de A por B, seguida de una dilatación del resultado por B. A partir de la interpretación geométrica, la apertura se puede definir como la unión de todas las traslaciones de B que están comprendidas en A:. U {( B). z. | ( B) z ⊆ A}. (8). La apertura generalmente suaviza los contornos de un objeto, rompe regiones de unión, y elimina ”islas” y “picos”..

(29) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 19. Cierre El cierre de un conjunto A por un elemento estructurante B, es denotado A • B , y se define como: (9) Y se puede expresar, como la operación de dilatación de A por B seguida de una erosión del resultado por B. El cierre también tiende a suavizar los contornos, pero opuesto a la apertura, tiende a fusionar “canales” angostos, eliminar “agujeros” pequeños y rellenar las “ensenadas” en los contornos. Reconstrucción morfológica La reconstrucción es una transformación morfológica que involucra dos imágenes y un elemento estructurante. Una imagen, el. “marcador”, es el punto de partida para la. transformación, y la otra imagen, la “máscara”, restringe la transformación. El elemento estructurante por su parte define la conectividad. Con la reconstrucción morfológica se “rellena” o reconstruye la máscara de la cual se conoce el contorno, a partir de otra imagen que actúa como elemento inicial o de partida, con empleo de un elemento estructurante apropiado. La reconstrucción se realiza mediante un proceso iterativo de dilataciones e intersecciones con la máscara, para reconstruir la imagen original. Este proceso tiene utilidad, por ejemplo, para restaurar exactamente la forma de los objetos que permanecen después de una erosión o una apertura. Si g es la máscara y f es el marcador, la reconstrucción de g a partir de f, es denotada Rg(f), y es definida por el siguiente procedimiento iterativo: 1. Inicializar h1 para que sea el marcador f de la imagen. 2. Crear un elemento estructurante B..

(30) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 20. 3.Repetir:. hk +1 = (hk ⊕ B) ∩ g. (10). hasta que hk+1=hk. El marcador f debe ser un subconjunto de g, f ⊆ g .[26] Etiquetado de regiones conectadas El concepto de conectividad entre los píxeles se basa en el concepto de adyacencia entre píxeles. Es posible definir trayectorias de adyacencia 4, 8 o m en dependencia del tipo de adyacencia que se especifique para las mismas, los conceptos de estas trayectorias de adyacencia se pueden encontrar en [27]. Dos píxeles son adyacentes si son vecinos y satisfacen determinado criterio de similitud, por ejemplo que sus niveles de gris sean iguales o se encuentren dentro de un intervalo especificado. En una imagen binaria se plantea que dos píxeles son adyacentes si son vecinos y tienen el mismo valor lógico (1 o 0). Si V es el conjunto de valores en los niveles de gris para definir la adyacencia de píxeles, al hacer por ejemplo V (1) se está definiendo la adyacencia de píxeles con valor 1 en una imagen binaria. En una imagen en escala de grises, el conjunto V contiene en general más elementos, por ejemplo un subconjunto del intervalo [0, 255]. Sea S un subconjunto de los píxeles en una imagen. Se dice que dos píxeles p y q están conectados en S si existe alguna trayectoria entre ellos que consista solamente de píxeles en S. Para cualquier píxel p en S, el conjunto de píxeles conectados a él en S se considera una componente conectada en S. Si S tiene solamente una componente conectada se dice que S es un conjunto conectado. La extracción de componentes conectadas en una imagen binaria es central para automatizar muchas aplicaciones en el análisis de imágenes, puesto que en muchos casos es necesario distinguir en una imagen binaria entre el primer plano y el fondo. En el primer plano quedan representados los objetos de interés, que pueden según la convención acordada, estar en el nivel 1 (blanco) o 0 (negro)..

(31) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 21. Si Y representa una componente conectada contenida en un conjunto A y se asume que un punto p de Y es conocido, entonces la siguiente expresión iterativa produce todos los elementos de Y:. X k = ( X k −1 ⊕ B ) ∩ A. k=1, 2, 3,…. (11). donde X0= p, y B es un elemento estructurante adecuado. Si Xk=Xk-1, el algoritmo converge y entonces se hace Y=Xk.[18, 26] Apertura por áreas En la apertura por área, se mide en una imagen binaria, el área de cada componente conectada y la elimina si es más pequeña que un umbral definido. 1.7. Fundamentos teóricos de la segmentación de imágenes. La segmentación de imágenes es un paso previo cuando se requiere identificar y extraer las diferentes características de un objeto en una imagen dada, que permitan realizar una descripción de dicho objeto. La segmentación subdivide una imagen en regiones u objetos. El nivel con el cual la subdivisión es llevada a cabo depende del problema a resolver, lo cual implica que la segmentación debe parar cuando el objeto de interés es aislado.. Los algoritmos de. segmentación de imágenes generalmente están basados en una de las dos propiedades básicas de los valores de intensidad: discontinuidad y similitud. La primera categoría esta enfocada a la partición de la imagen a partir de los cambios abruptos de intensidad, como son los bordes en una imagen. La segunda categoría está basada en dividir una imagen en regiones similares de acuerdo con un conjunto de criterios predefinidos. La segmentación de imágenes tiene su origen en numerosos estudios psicológicos que indican la preferencia de los humanos por agrupar regiones visuales en términos de proximidad, similitud y continuidad, para construir un conjunto de unidades significativas. En cuanto a la unidad significativa que rige la segmentación, ésta suele corresponder a píxeles, regiones o contornos que muestran o disciernen una similitud en cuanto a intensidad, color, textura, gradiente local, movimiento, etc..

(32) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 22. Existe una gran variedad de técnicas de segmentación que se pueden ver en [18, 24-25].En general, los métodos clásicos de segmentación, se pueden clasificar como se indica a continuación: ƒ. Métodos basados en la comparación con umbrales en el histograma, en los cuales se obtiene un umbral de comparación para el agrupamiento de los píxeles.. ƒ. Métodos basados en la detección de discontinuidades, éstos dividen la imagen a partir de cambios bruscos de los niveles de grises.. ƒ. Métodos basados en la propiedad de similitud de los valores de los niveles de grises, que permiten la agrupación de puntos a partir de ciertos criterios de homogeneidad.. ƒ. Métodos heurísticos de segmentación, los cuales se basan en el conocimiento previo de la imagen a segmentar y en la experiencia del observador, ellos incluyen en muchas ocasiones los métodos supervisados de segmentación.. A continuación se presenta una descripción abreviada de los algoritmos de segmentación empleados en este trabajo: el algoritmo de Otsu, orientado a la segmentación de imágenes en escala de grises, el algoritmo de Lloyd, que utiliza la información del color en el espacio RGB, ambos empleados en una primera etapa de segmentación, y el algoritmo de la transformada watershed, utilizado en una segunda etapa para la segmentación de las aglomeraciones (eritrocitos que se tocan o se superponen). 1.7.1. Algoritmo de segmentación de Otsu. El algoritmo de segmentación de Otsu fue publicado en el año 1979 por Nobuyuki Otsu [28]. Este método de detección de umbrales utiliza técnicas estadísticas, para analizar la dispersión de los niveles de grises. La importancia del método de Otsu radica en que es automático, ya que no necesita supervisión humana ni información previa de la imagen antes de su procesamiento. El problema de la segmentación mediante umbrales se puede formular a partir de la teoría de la decisión estadística, donde el objetivo es minimizar el error promedio en que se incurre al asignar píxeles a uno o más grupos o clases. En el método de Otsu la solución de este problema se basa en el uso de dos parámetros: la función de densidad probabilística (FDP) de los niveles de intensidad de cada clase y la probabilidad de ocurrencia de cada clase en una aplicación dada. El método de Otsu se basa en maximizar una medida.

(33) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 23. estadística que se denomina “varianza entre clases“. Un umbral que produzca la mejor separación entre clases, en términos de los valores de intensidad de estas, será el umbral óptimo [18], [28-29], [30]. El método de Otsu está basado completamente en cálculos que se realizan a partir del histograma de la imagen y su algoritmo tiene los siguientes pasos: 1. Calcular el histograma normalizado de la imagen a segmentar. Se denotan las componentes del histograma como pi , i = 0, 1,…, L-1, donde L son los diferentes niveles de intensidad presentes en la imagen.. MN=n0+n1+n2,+...+nL-1 Donde MN es el número de píxeles contenidos en la imagen y ni el número de píxeles que posee el nivel de intensidad correspondiente a su subíndice. Luego pi = L −1. ∑p i =0. i. ni MN. = 1,. (12). pi ≥ 0. (13). Se selecciona un umbral T(k)=k, 0<k<L-1 y se emplea para dividir los píxeles de la imagen en dos clases C1 y C2. 2. Se calculan las probabilidades acumulativas Pi(k), donde i es un subíndice asociado a la clase correspondiente: Si C1 son todos los píxeles de la imagen en el rango [0,k] y C2 son todos los píxeles de la imagen en el rango [k+1,L-1], se tienen las siguientes probabilidades: •. P1 (k): probabilidad de que un píxel sea asignado a la clase C1.. •. P2 (k): probabilidad de que un píxel sea asignado a la clase C2. k. P1 (k ) = ∑ pi. (14). i =0. P2 (k ) =. L −1. ∑p. i = k +1. i. = 1 − P1 (k ). (15).

(34) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 24. 3. Se calculan los valores medios acumulativos mi(k), donde i es un subíndice asociado a la clase correspondiente: Se determinan los valores medios de las intensidades correspondientes a las clases C1 y C2 como:. 1 k m1 (k ) = ∑ ipi P1 (k ) i =0. (16). 1 L −1 m 2 (k ) = ∑ ipi P2 (k ) i = k +1. (17). 4. Se calcula la media global mG. La intensidad promedio (hasta el nivel k) para toda la imagen es: k. m(k ) = ∑ ip i i =0. (18). y la intensidad media global para toda la imagen es: L −1. mG = ∑ ipi. (19). i =0. 5. Se calcula la varianza inter-clases. Con las definiciones dadas, se cumplen las relaciones siguientes: P1m1+P2m2=mG. (20). P1+P2=1. (21). Se definen la varianza global, o varianza de la intensidad de todos los píxeles de la imagen como: L −1. σ G2 = ∑ (i − mG ) 2 Pi. (22). i =0. y la varianza inter-clases:. σ B2 (k ) = P1 (m1 − mG ) 2 + P2 (m2 − mG ) 2 = P1 P2 (m1 − m2 ) 2. (23).

(35) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 25. la cual da una medida de la separabilidad entre las clases. 6. Se determina el umbral de Otsu, k*, que maximiza la varianza inter-clases. Si no es único, se promedian los valores obtenidos y se redondean. Para encontrar el umbral en el método de Otsu, se calcula el valor de k (que será el umbral buscado) para el cual es máxima la varianza inter-clases:. σ B2 (k ) .. Según el método de Otsu, el umbral óptimo será por tanto el valor k=k* tal que:. σ B2 (k ∗ ) = maxσ B2 (k ) 0≤k ≤ L −1. (24). Para hallar el valor de k* se realiza una corrida, evaluando la expresión anterior para todos los posibles valores enteros de k, (de forma tal que se cumpla que 0<P1(k)< 1). Si se encuentra más de un valor de k que satisfaga la condición de máximo de la varianza inter-clases, se promedian estos valores. 7. Se calcula la medida de separabilidad η, de la forma siguiente:. σ B2 (k ) η (k ) = σ G2. (25). 8. Se realiza la segmentación de la imagen utilizando el umbral calculado. El algoritmo de Otsu, aunque está concebido para su uso en imágenes en escala de grises, puede ser utilizado en las imágenes a color aplicándolo a sus diferentes componentes en un espacio de color dado. 1.7.2. Algoritmo de segmentación de Lloyd. El algoritmo de Lloyd, es un algoritmo para agrupamiento de puntos de datos dentro de determinado número de categorías, usado para el agrupamiento según el método conocido como k-medias. El diseño básico del algoritmo fue descrito por primera vez por Stuart P. Lloyd en un reporte no publicado en 1957 y que fue publicado en 1982 [31]. El algoritmo es llamado algunas veces algoritmo de Lloyd I, para distinguirlo del segundo algoritmo introducido por Lloyd en el mismo reporte. El algoritmo de Lloyd I es usado ampliamente para el.

(36) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 26. diseño de cuantificadores escalares y vectoriales. El algoritmo realiza una discretización o particionamiento del espacio, generando las llamadas regiones de Voronoi, que se definen mediante el uso de una medida de distancia, obteniéndose un conjunto de ejemplos representativos (prototipos o centroides). El objetivo del mismo es generar el conjunto de prototipos que minimice una determinada medida de distorsión o de distancia promedio. El algoritmo de Lloyd consta de los siguientes pasos: 1. Comenzar con un alfabeto inicial C1, sea m=1. 2. Dado un alfabeto, Cm, ejecutar la iteración de Lloyd para generar un nuevo alfabeto. Cm+1. 3. Dado un alfabeto. r C m = {y i ; i = 1,..., N }, subdividir el conjunto de entrada T en. particiones Ri usando la siguiente condición:. r r r r r Ri = {x ∈ T : d ( x , y i ) ≤ d ( x , y j )} ;. para todo j≠i. (26). 4. Calcular los centroides de cada partición para recalcular el alfabeto. Hacer C m +1 = {cent( Ri )} . Si se generó una celda vacía en el paso 1, se asignará un vector alternativo (en vez del cálculo del centroide) para esa celda.. cent ( R) =. 1 R. r. ∑x. r xi ∈R. i. (27). 5. Calcular la distorsión media para Cm+1. Si ha cambiado en una pequeña cantidad solamente, desde la iteración anterior parar, si no, hacer m = m + 1 e ir al paso 2 [32]. 1.7.3. Algoritmo de segmentación watershed. La transformada watershed [18, 23] es un método de segmentación que se basa en el análisis de una representación tridimensional de la superficie de intensidad en una imagen. La palabra “watershed” designa las crestas que dividen las áreas de drenaje en un sistema hidrográfico, asociando el concepto de cuenca, o área geográfica que drena hacia un río o embalse..

(37) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 27. La base de la transformada watershed consiste en modelar las imágenes en escala de grises como superficies topológicas, donde los valores de f(x, y) sean considerados como alturas. Existen varios enfoques teóricos y algoritmos de computación para el cálculo de la transformada watershed en imágenes, los cuales tienen en común como objetivo final, encontrar los píxeles que componen las crestas. La transformada watershed se aplica por lo general a tres tipos de imágenes: la imagen original en escala de grises, la imagen del gradiente y la imagen correspondiente al negativo de la transformada de distancia. Este último caso es el que se desarrolla en el presente trabajo. La aplicación directa del algoritmo de segmentación watershed generalmente provoca una sobresegmentación, debida al ruido y a otras irregularidades locales del gradiente. La sobresegmentación puede afectar tanto, que el resultado obtenido por el algoritmo sea inservible. En estos casos una solución a este problema es limitar el número de regiones permisibles mediante la incorporación de una etapa de preprocesamiento diseñada para brindar información adicional al proceso de segmentación. Un método usado para controlar la sobresegmentación está basado en el concepto de los llamados marcadores, que son componentes conectadas pertenecientes a la imagen. Para controlar la sobresegmentación existen dos tipos de marcadores, los marcadores internos, asociados con los objetos de interés, y los marcadores externos, asociados con el fondo. Tanto los marcadores internos como los externos son utilizados para modificar la imagen a segmentar usando un procedimiento morfológico llamado imposición de mínimos, del cual se hablará más adelante. Para poder describir el proceso de la segmentación mediante la transformada watershed, es necesario introducir las siguientes definiciones de operaciones de procesamiento morfológico de imágenes en escala de grises, las cuales son empleadas en este trabajo, dichas operaciones tienen una implementación en diferentes funciones de Matlab. 1.7.3.1. Gradiente morfológico. Existen varias formas de definir los gradientes en una imagen en escala de grises, destacándose los gradientes basados en operadores derivativos como por ejemplo Sobel.

(38) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 28. [18]. Otra formulación importante es el gradiente morfológico, el cual tiene como ventaja, que tiende a depender menos de la direccionalidad de los bordes. El gradiente morfológico de una imagen es definido por: (28) donde ge y gi son EE centrados cerca del origen. El gradiente morfológico es la suma de dos gradientes parciales, un gradiente externo,. grad gexte ( f ) = ( f ⊕ g e ) − f. (29). y un gradiente interno, .. (30). El gradiente morfológico acentúa los puntos de las transiciones de los niveles de grises en una imagen de intensidad. Como en el caso de los gradientes diferenciales, el gradiente morfológico puede ser utilizado en conjunción con la comparación con umbrales para realizar la detección de bordes en escala de grises. El histograma de la imagen del gradiente es usado para determinar un valor de umbral y el resultado de comparar el gradiente con los umbrales permite obtener la imagen del borde. Al igual que en los gradientes diferenciales, el procedimiento puede presentar problemas debidos a la no uniformidad de la intensidad del gradiente [18, 23]. 1.7.3.2. Transformada de distancia (TD). Una herramienta comúnmente usada junto con la transformada watershed para la segmentación de imágenes es la TD [18, 23]. Una distancia o métrica d es una función que asocia un valor no negativo para dos puntos cualesquiera y que satisface tres condiciones, que son las siguientes, dados los puntos x, y y w: 1. El valor es positivo, o cero si los dos puntos coinciden. d(x,y) ≥ 0 y d(x,y)=0 si y solo si x=y. (31). 2. Cumple con la propiedad de ser reflexiva. d(x,y) = d(y,x),. (32).

(39) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 29. 3. Cumple con la desigualdad del triángulo. d(x,y) ≤ d(x,w) + d(w,y). (33). Las tres métricas más usadas son la euclidiana (dE), el tablero de ajedrez (d8) y la “cityblock” (d4) definidas de la forma siguiente:. d E [( x1 , y1 ), ( x 2 , y 2 )] =. (x1 − x 2 )2 + ( y1 − y 2 )2 ,. d 8 [( x1 , y1 ), ( x 2 , y 2 )] = max{ x1 − x 2 , y1 − y 2 }, d 4 [( x1 , y1 ), ( x 2 , y 2 )] = x1 − x 2 + y1 − y 2 .. (34). Definición de la transformada de distancia Para un conjunto A, se define la transformada de distancia de la siguiente manera: para cualquier punto x en A, TD(A)(x) es la distancia (mínima) de x al complemento de A:. {. TD( A)( x) = min d ( x, y ), y ∈ Ac. }. (35). La TD de una imagen binaria por tanto es la distancia de cada píxel al píxel con valor diferente de cero más cercano, en la figura 1.4 se ilustra la TD (con distancia euclidiana) de la matriz de una pequeña imagen binaria.. Figura 1.4. Transformada de distancia. a) Imagen binaria b) Transformada de distancia de la imagen binaria.. Definición de transformada de distancia externa (TDE): La transformada de distancia externa de una imagen binaria es un mapa de distancias, en el cual cada elemento de la matriz correspondiente a la posición de los píxeles del fondo, toma el valor de la menor distancia entre aquel y los objetos del primer plano [35]. En lo adelante se indicará explícitamente cuándo la transformada de distancia es externa..

(40) CAPÍTULO 1. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. 1.7.3.3. 30. Otras operaciones importantes del procesamiento morfológico de. imágenes en escala de grises utilizadas en este trabajo Transformada H-mínima La “transformada H-mínima” de una función f es una operación morfológica en escala de grises que tiene el efecto siguiente: 1. Suprime todos los mínimos en la imagen de intensidad cuyas profundidades sean menores que h, siendo h un valor escalar. 2. Reduce en h la profundidad de todos los mínimos cuya profundidad sea mayor que h. Los mínimos regionales son componentes conectadas de píxeles con valores de intensidad constante y donde los píxeles exteriores conectados con la frontera de la región dada tienen todos valores más altos. Un mínimo regional es una zona plana no adyacente a una zona plana con un nivel de gris más bajo [23]. Imposición de mínimos La intensidad de una imagen se puede modificar usando la reconstrucción morfológica, a partir de una imagen binaria que tenga la localización específica de los mínimos de interés y que sea del mismo tamaño que la imagen de intensidad. La imposición de mínimos usa la reconstrucción morfológica de la imagen “máscara” con la imagen “marcadora” para imponer mínimos en los puntos deseados, de forma tal que en la imagen en escala de grises solamente tenga mínimos regionales en las regiones especificadas. 1.8. Conclusiones del capítulo 1. Los algoritmos de segmentación de imágenes a color pueden ser particularmente efectivos en los casos de imágenes de microscopía celular, debido al uso de tinciones en la preparación de las muestras. 2. Del análisis de la literatura científica publicada sobre la segmentación de células aglomeradas, se observa que los métodos basados en el uso de la transformada watershed con empleo de marcadores pueden proporcionar resultados satisfactorios y fue de este tipo el método elegido para este trabajo..

(41) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1. Introducción. Este capítulo está formado por ocho epígrafes donde se abordan los materiales y métodos utilizados en el trabajo. El epígrafe 2.1 es introductorio y el epígrafe 2.2 trata sobre las características de las imágenes utilizadas en el trabajo. En el epígrafe 2.3 se explica el esquema general de los procesos de segmentación utilizados. En el epígrafe 2.4 se abordan los métodos de segmentación mediante los algoritmos de Otsu y de Lloyd, explicando la implementación en Matlab y los criterios de comparación de forma subjetiva que se adoptaron para evaluar la calidad de los mismos. El epígrafe 2.5 trata sobre los pasos adicionales que se utilizan en el proceso de segmentación realizado, tales como rellenar “huecos”, eliminar células que tocan los bordes y eliminar elementos de pequeño tamaño presentes en la imagen luego de segmentarla, que no forman parte de los eritrocitos y que son artefactos presentes en la imagen. El epígrafe 2.6 trata sobre la segmentación de los eritrocitos que se superponen o se tocan, la detección de los mismos y la separación mediante la transformada watershed. En el epígrafe 2.7 se explica como se realizó la separación de las células segmentadas y la estructura de almacenamiento adoptada. Por último, en el epígrafe 2.8 se exponen las conclusiones del capítulo. Todas las imágenes con las cuales se trabajó se cargaron al Matlab versión 7.0.0.19920 (R14) con la función imread, normalizadas y convertidas a la clase double mediante la función im2double..

(42) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.2. 32. Características de las imágenes utilizadas en el estudio. Las imágenes utilizadas para los estudios realizados en este trabajo fueron tomadas de dos atlas de hematología que aparecen en Internet: 30 imágenes de [33] y 24 imágenes de [34]. Las imágenes son obtenidas sobre un extendido de sangre humana y se encuentran todas en el espacio de color RGB. En la Tabla 2.1 se muestran los datos de 13 de las imágenes del atlas [34], con las cuales se trabajó, con el objetivo de ilustrar la diversidad presente en las mismas. Tabla 2.1 Datos de 13 de las imágenes utilizadas.. Nombre de la imagen. Tamaño en píxeles. Formato de. Tinción utilizada. Aumento. Blood smear III. 498x724. JPG. May-Giemsa. x1000. Blood smear IV. 498x744. JPG. May-Giemsa. x1000. Blood smear V. 494x740. JPG. May-Giemsa. x1000. Spherocyte. 508x747. JPG. May-Giemsa. x1000. Elliptocyte. 508x748. JPG. May-Giemsa. x1000. Tear Drop Cell. 508x748. JPG. May-Giemsa. x1000. Basophilic Stippling. 508x737. JPG. May-Giemsa. x1000. Malaria. 508x745. JPG. May-Giemsa. x1000. Pappenheimer's body. 506x747. JPG. May-Giemsa. x1000. Leptocyte. 506x745. JPG. May-Giemsa. x1000. Poikilocyte. 508x723. JPG. May-Giemsa. x1000. Howell-Jolly's body. 508x745. JPG. May-Giemsa. x1000. Thalassemia. 508x745. JPG. May-Giemsa. x1000. la imagen.

(43) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.3. 33. Esquema general del proceso de segmentación. Para el desarrollo de la segmentación se siguió un esquema general, el cual se muestra en la figura 2.1. Primeramente se debe cargar al Matlab la imagen a segmentar, normalizarla y convertirla a la clase double con las funciones de Matlab mencionadas anteriormente. Luego se realiza lo que se llamó una segmentación gruesa, consistente en segmentar los objetos compuestos por eritrocitos ya sean estos simples o aglomeraciones, empleando dos métodos con el objetivo de comparar sus resultados y seleccionar el de mejor desempeño: el método de Otsu sobre la componente de saturación y el algoritmo de Lloyd utilizando la información del color. Posteriormente se desarrollan los pasos adicionales de la segmentación, correspondientes en este caso al rellenado de los “huecos”, la eliminación de las células que están en los bordes y la eliminación de los artefactos, sobre los cuales se hará referencia más adelante en este trabajo. Una vez determinadas las regiones de interés (ROI), pueden encontrarse casos en los que aparecen células aglomeradas (eritrocitos que se superponen o se tocan), las cuales necesitan otro procesamiento para su separación. Por tanto, se diferencian las ROI en dos grupos: uno compuesto por las células separadas y otro por las células aglomeradas. A este último se le realiza una segunda etapa de segmentación para separar los eritrocitos aglomerados, la cual se ha denominado en este trabajo segmentación fina. La misma consiste en segmentar las aglomeraciones en los eritrocitos constituyentes, aplicando la segmentación mediante el algoritmo de la transformada watershed. De forma subsiguiente se recompone la imagen con los dos grupos de células anteriormente definidos, pero en el caso del grupo de las células aglomeradas, se toman las células ya separadas. Con la recomposición de la imagen, se obtiene el resultado final de la segmentación, de modo que puedan ser separadas y almacenadas individualmente las células, para su utilización en procesos posteriores. La clasificación y conteo de eritrocitos propiamente dicha, para aplicaciones específicas, es una tarea de reconocimiento de patrones que queda fuera de los objetivos de este trabajo, donde tan solo se crean las condiciones para un posterior análisis diferencial..

Figure

Figura 1.1 Eritrocitos de una muestra de sangre humana.
Figura 1.2. Modelo de color RGB.
Figura 1.3. Modelo de color HSV.
Figura 1.4. Transformada de distancia. a) Imagen binaria b) Transformada de distancia de la imagen  binaria
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