SECRETARIA DE COMERCIO
Y
FOMENTO INDUSTRIAL
NORMA MEXICANA
NMX-AA-42-1987
CALIDAD DEL AGUA DETERMINACION DEL NUMERO MAS
PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES
FECALES (TERMOTOLERANTES) Y Escherichia coli PRESUNTIVA.
WATER QUALITY-DETERMINATION OF THE MOST PROBABLE
NUMBER (NMP) OF TOTAL COLIFORMS, FECAL COLIFORMS
(THERMAL TOLERANTS), AND Escherichia coli PRESUMPTIVE.
PREFACIO
En la elaboración de la presente norma participaron las siguientes instituciones: SECRETARIA DE DESARROLLO URBANO Y ECOLOGIA Instituto SEDUE. SECRETARIA DE SALUD
SECRETARIA DE AGRICULTURA Y RECURSOS HIDRAULICOS SECRETARIA DE MARINA. Dirección General de Oceanografía Naval.
DEPARTAMENTO DEL DISTRITO FEDERAL Dirección General de Reordenación Urbana y Protección Ecológica. Laboratorio Central de Control.
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO. Facultad de Química. PETROLEOS MEXICANOS
CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DEL HIERRO Y EL ACERO.
ASOCIACION MEXICANA CONTRA LA CONTAMINACION DEL AGUA Y EL AMBIENTE
CELANESE MEXICANA, S.A. MERCK MEXICO, S.A.
CALIDAD DEL AGUA-DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES) Y Escherichia coli PRESUNTIVA.
WATER QUALITY-DETERMINATION OF THE MOST PROBABLE NUMBER (NMP) OF TOTAL COLIFORMS, FECAL COLIFORMS (THERMAL TOLERANTS), AND
Escherichia coli PRESUMPTIVE.
0 INTRODUCCION
La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud publica al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en le intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse para estimar el grado de contaminación fecal.
1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
Esta Norma Mexicana establece un método para la detección y enumeración en agua de organismos coliformes totales, organismos coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva (E. coli) mediante el cultivo en un medio liquido en tubos múltiples y él cálculo de sus números más probables (NMP) en la muestra.
Este método es aplicable para todo tipo de agua, incluyendo aquellos que contienen una cantidad apreciable de materia en suspención.
La selección de las pruebas usadas en la detección y confirmación del grupo de organismos coliformes, incluyendo E. coli, puede verse como parte de una secuencia continua. El grado de confirmación con una muestra en particular depende parcialmente de la naturaleza del agua y parcialmente de las razones para realizar el examen.
En la practica, la detección de E. coli presuntiva, como se define en el punto 3.3 de esta norma, da usualmente una indicación satisfactoria de contaminación fecal.
2 REFERENCIAS
Esta norma se competa con las siguientes Normas Mexicanas vigentes: NMX-Z-1 Sistema Internacional De Unidades (SI)
NMX-BB-14 Clasificación y tamaños nominales para utensilios de vidrio usados en laboratorios.
3 DEFINICIONES
Para propósitos de esta Norma Mexicana, se aplican las siguientes definiciones:
3.1 Organismos coliformes.- Organismos capaces de crecimiento aeróbico ya sea 308 ± 1k (35 ± 1°C) ó 310 ± 1k (37 ± 1°C) en un medio de cultivo líquido lactosado con producción de aciso y gas dentro de un periodo de 48 h.
3.2 Organismos coliformes fecales (termotolerantes). Organismos coliformes como se describe en 3.1 que tienen las mismas propiedades fermentativas a 317 ± 0.5k (44 ± 0.5°C).
3.3 Escherichia coli presuntiva (E. coli).- Organismos coliformes termotolerantes como se describe en 3.2 que también producen Indol a partir de tripofano a 317k (44°C).
4 PRINCIPIO
El método se basa en la inoculación de alicuotas de la muestra, diluida o sin diluir, en una serie de tubos de un medio de cultivo liquido conteniendo lactosa.
Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubación ya sea a 308 o 310k (35 o 37°C). Cada uno de los que muestran turbidez con producción de gas se resiembra en un medio confirmativo más selectivo y, cuando se busca E. coli presuntiva, en un medio en el que se pueda demostrar la producción de indel.
Se lleva acabo la incubación de estos medios confirmativos basta por 48 horas ya sea 308 ó 310k (35 o 37°C) para la detección de organismos coliformes y a 317k (44°C) para organismos termotolerantes y E. coli.
Mediante tablas estadísticas se lleva acabo él calculo del numero más probable (NMP) de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. coli que pueda estar presente en 100 cm3 de muestra, a partir de los números de los tubos que dan resultados confirmativos positivos.
5 APARATOS Y EQUIPO
Aparte de los equipos que se suministran estériles, el material de vidrio y el resto del equipo deben esterilizarse.
5.1 Incubadora capaz de mantener una temperatura de 308 ± 1k (35 + 1°C) ó 310 ± 1k (37 ± 1°C) y 317 ± 0.5k (44 ± 0.5°C).
5.2 Estufa capaz de mantener una temperatura de 453 a 473k (180 a 200°C). 5.3 Autoclave u olla de presión o con manómetro.
5.4 Potenciometro.
5.5 Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001 g. 5.6 Pipetas serológicas.
5.7 Pipeteros de aluminio o acero inoxidable; se pueden sustituir con papel aluminio o papel Kraft.
5.8 Tubos de ensaye de cristal refractario de 15mm x 150 mm con tapón de baquelita, aluminio o algodón.
5.9 Frascos muestreadores, de vidrio resistente o cristal refractario de 125 cm3, con tapón de cristal esmerilado.
5.10 Tubos de fermentación (Durham). 5.11 Asas de inoculación.
5.12 Material común de laboratorio.
6 REACTIVOS.
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico a menos que se indique otra cosa. Cuando se especifique el uso de agua se debe entender agua destilada in vitro o agua desionizada libre de sustancias que pueden inhibir el crecimiento bacteriano en las condiciones de prueba.
Para la preparación de los reactivos, las condiciones de esterilización deben ser 349k (121°C) y 0.098066 Mpa (1 kg/cm2) de presión manométrica durante 15 minutos. Los tubos de fermentación (Durham) no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.
En caso de utilizar medios deshidratados, seguir las recomendaciones del fabricante para su preparación.
6.1. Utilizar uno de los siguientes medios de cultivo: 6.1.1. Caldo lauril triptosa (CLT).
Medio de doble concentración:
Triptosa 40.0g Lactosa 10.0g Cloruro de sodio (NaCl) 10.0g Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 5.5g
Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 5.5g
Lauril sulfato de sodio 0.2g Agua para llevar a 1000cm3
Añadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y añadir el lauril sulfato de sodio. Disolver el resto de los componentes por separado y agregarlos a los anteriores mezclando suavemente para evitar la formación de espuma. Ajustar a pH 6.8. Preparar medio de simple concentración diluyendo el medio de doble concentración con un volumen igual de agua.
Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 53cm3 y el medio de doble concentración en volúmenes de 10 y 50 cm3
Cada tubo o matraz deben contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min.
6.1.2.Caldo Mc Conkey. Medio doble de concentración:
Sales biliares 10.0g Peptona 40.0g Lactosa 20.0g Cloruro de sodio (NaCl) 10.0g Púrpura de brmocresol (1% v/v en solución
Etanolica) 2cm3 Agua para llevar a 1000cm3
Disolver, calentando, la peptona, el cloruro de sodio y las sales biliares en agua y almacenarlo a 277k (4°C) durante todo la noche. Filtrar mientras esta aun frío añadir la lactosa y disolver. Ajustar a pH 7.4 y añadir la púrpura de bromocresol.
Preparar el medio de simple concentración disolviendo el de doble concentración con un volumen igual de agua o prepararlo usando la mitad de concentración de los ingredientes. Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 5 cm3 y la doble concentración en volúmenes de 10 y 50 cm3 en tubos o matraces conteniendo un tubo de fermentación invertido (Durham).
Colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min. 6.1.3.Caldo lactosa.
Medio de doble concentración:
Peptona 10.0g Lactosa 10.0g Extracto de carne 6.0g Agua para llevar a 1000cm3
Disolver los componentes en agua hirviendo. Si es necesario ajustar el pH de modo que al terminar la esterilización sea de 6.7. Preparar el medio de simple concentración diluyendo el medio de doble concentración con un volumen igual de agua.
Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 5cm3 y la doble concentración en volúmenes de 10 y 50 cm3, Cada tubo o matraz debe contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Esterilizar en autoclave a 394 ± 1k (121 ± 1°C) durante 15 min.
Estos tres medios son de uso común en numerosos países la selectividad del Mc Conkey y del CLT depende respectivamente de la presencia de salas biliares y del agente de superficie activo, el laurilsulfato. El caldo lactosa no es un medio selectivo.
6.2 Utilizar uno o más de los siguientes medios confirmativos: 6.2.1 Medios para la producción de gas:
6.2.1.1 caldo bilis lactosa verde brillante:
Peptona 10.0g Lactosa 10.0g Bilis de buey (deshidratada) 20.0g Verde brillante (1% m/m en solución acuosa) 13cm3 Agua para llevar a 1000cm3
Disolver la peptona en 500 cm3 de agua. Añadir los 20g de bilis de buey deshidratada disueltos en 200cm3 de agua; La solución debe tener un pH entre 7.0 y 7.5 Disolver con agua hasta un volumen aproximado de 975 cm3. Añadir la lactosa y ajustar el pH a 7.4. Añadir la solución verde brillante y aforar a 1000 cm3 con agua.
Distribuir volúmenes de 5cm3 en tubos de ensaye conteniendo tubos de fermentación
invertidos (Durham) y colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min.
Nota 1. - Este medio no da resultados reproducibles en todos los casos y se recomienda comprobar sus propiedades inhibitorias antes de usarlo.
6.2.1.2 Medio EC:
Triptosa o tripticasa 20.0g Lactosa 5.0g Mezcla de sales biliares 1.5g Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 4.0g
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 1.5g
Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g Agua para llevar a 1000cm3
Disolver los componentes por separado y agregarles agitando suavemente. El pH debe ser de 6.9 después de la esterilización. Antes de esterilizar, distribuir en tubos de fermentación con suficiente medio para que el tubo invertido quede cubierto cuando menos parcialmente Después de la esterilización.
Como medio confirmativo para coliformes totales, el más generalizado es el caldo de bilis lactosa verde brillante (BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes fecales se utilizan tanto el BLVB como el caldo EC.
6.2.2. Medio para la producción de indol: 6.2.2.1. Agua de triptona:
Triptona 20.0g Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g Agua para llevar a 1000cm3
Disolver los componentes en agua y ajustar a pH. 7.5 distribuir en volúmenes de 5cm3 y colocar en autoclave a 308K (115°C) durante 10 min.
NOTA 2. - La adición de 0.1% (m/m) de L ó DL- triptofano puede mejorar el funcionamiento del medio.
6.3.Reactivo de Kovacs para indol: 1,4 dimetilaminobenzaldehído
(C6H4[H(CH3)2]CHO) 5.0g
Alcohol amílico (CH3(CH2)4CH) libre
de bases orgánicas 75cm3 Acido clorhídrico concentrado(HCL) 85cm3
Disolver el aldehido en el alcohol. Añadir el ácido concentrado con cuidado. Proteger de la luz y almacenar a 277K (4°C)
NOTA 3. - El reactivo debe tener la coloración entre amarillo claro; algunas muestras de alcohol amilico son insatisfactorias y dan una coloración oscura con el aldehido.
6.4 Reactivo de oxidasa para la prueba de oxidasa: Clorihidrato de tetrametil-p-fenilendiamina 0.1g 10cm3
Este reactivo no es estable y debe prepararse para usarse en pequeñas cantidades cada vez que sea necesario.
6.5.1 Diluyentes:
6.5.1 Diluyente de peptona (0.1%)
Peptona
Agua para llevar a
Disolver la peptona en aproximadamente 950cm3 de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio 1mol/L ó ácido clorhídrico 1 mol/L de modo que después de la esterilización sea de 7.0±0.1. Llevar a 1000cm3 con agua, distribuir en volúmenes
convenientes y esterilizar en autoclave a 394± 1K (121±1°C) 6.5.2 Solución salina de peptona:
Peptona 1.0g Cloruro de sodio (NaCL) 8.5g Agua para llevar a 1000 cm3
Disolver los componentes hirviéndolos en aproximadamente 950cm3 de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio 1mol/L o ácido clorhídrico 1 mol/L de modo que después de la esterilización sea de 7.0±0.1. Llevar a 1000cm3 con agua, distribuir en
volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 394±1K (121±1°C) durante 15 min. 6.5.3 Solución de Ringer:
Cloruro de sodio (NaCL) 2.25g Cloruro de potasio (KCL) 0.105g
Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) 0.12g
Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 0.05g Agua para llevar a 1000 cm3
Disolver los componentes y dividirlos en volúmenes convenientes. Esterilizar en autoclave a 394K (181°C) durante 15min.
6.5.4 Solución amortiguadora de fosfato:
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 42.5mg
Cloruro de magnesio(MgCL2) 190.0mg
Agua para llevar a 1000 cm3 6.5.4.1 Solución de fosfato.
Disolver 34g de fosfato en 500cm3 de agua. Ajustar a PH 7.2±0.5 con solución de hidróxido de sodio 1mol/L y aforar a 1000 cm3 con agua.
6.5.4.2 Solución de cloruro de magnesio.
Disolver 38g de cloruro de magnesio en 1000cm3 de agua.
Para usarla, añadir 1.25cm3 de solución de fosfato (6.5.4.1) y 5.0cm3 de solución de cloruro de magnesio (6.5.4.2) a 1000cm3 de agua. Distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 394±1K (121±1°C) durante 15 min.
7 MUESTREO
El procedimiento para la recolección de las muestras de agua para el análisis bacteriológico, depende del tipo de agua que se desee muestrear.
Las muestras para el análisis bacteorológico, se deben tomar en frascos muostreadores que se hayan lavado con extremo cuidado y esterilizado. En su interior colocar previo a la esterilización, 0.1cm3 de solución de tiosulfato de sodio al 1% con el propósito de inhibirla acción del cloro que puede contener la muestra, cubriendo además el tapón del frasco hasta el cuello con papel aluminio.
7.1.1 Muestreo en cuerpos receptores
7.1.1 Siempre que sea posible, llenar el frasco a 2/3 partes de su capacidad; una cantidad menor sería insuficiente, si fuera mayor, disminuiría el espacio de aire disponible, necesario para homogeneizar la muestra. Las muestras deben ser representativas del agua en el estudio y asimismo no deben contaminarse en forma alguna.
7.1.2 El frasco donde se colecta la muestra no se debe destapar sino hasta el momento en el que se efectúe el muestreo.
Al muestrear, se debe evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material contaminante.
7.1.3 El examen de la muestra colectada debe realizarse lo más pronto posible, para evitar proliferación o muerte de las bacterias.
Cuando el examen se practica dos horas después de tomar la muestra, los resultados empiezan a ser inciertos.
7.1.4 El volumen de muestra suficiente para efectuar el análisis bacteriológico, de preferencia debe ser de aproximadamente 100cm3. Es importante que todas las muestra estén acompañadas de datos completos y exactos de identificación y descripción.
7.1.5 El mecanismo de muestreo superficial es el siguiente:
7.1.5.1 Quitar el papel aluminio del cuello del frasco; Introducir el frasco aproximadamente 30 cm3 bajo la superficie del agua.
7.1.5.2 Destapar el frasco dentro del agua. La boca del envase debe quedar en sentido contrario al flujo de la corriente. Si no existe corriente, como en los embalses, crearla empujando el frasco horizontalmente, en dirección opuesta al movimiento de la mano. 7.1.5.3 Una vez que la muestra ocupe el volumen correspondiente del frasco (2/3 partes); tapar sin sacarlo del agua teniendo cuidado de que el papel aluminio vuelva a cubrir el cuello de la botella.
7.1.5.4 Si no es posible la recolección de muestras en las condiciones antes anunciadas; fijar un lastre al frasco, al que se hace descender en el agua.
7.1.6 Para tomar muestras profundas en lagos o embalses; usar aparatos especiales que permitan destapar y tapar mecánicamente el frasco debajo de la superficie.
7.2 Muestreo en pozos y grifos.
7.2.1 Si el pozo está provisto de bomba de mano, bombear durante 5 min. , Para que el agua fluya libremente, antes de tomar la muestra.
7.2.2 Si el pozo esta dotado de bomba mecánica, tomar la muestra en una llave previamente flameada de la descarga, dejando que fluya el agua libremente 5min. antes de tomar la muestra.
7.2.3 A efectuar este muestreo, se deben flamear los bordes del frasco y tapón durante el tiempo que dura el muestreo. Esto se hace con objeto de mantener el máximo las condiciones de asepsia.
7.2.4 Si no se cuenta con equipo de bombeo, tomar la muestra directamente del pozo por medio de un frasco estéril con lastre. En este caso se debe evitar la contaminación de la muestra por las notas superficiales.
7.2.5 Si se trata de tomar una muestra de un grifo del sistema de servicio, flamear el grifo y abrirlo completamente, dejando que el agua fluya por 2 ó 3 min. , O el tiempo suficiente para permitir la purga de la línea.
7.2.6 En el momento del muestreo, restringir el flujo de la llave para que se pueda llenar el frasco sin salpicaduras.
7.2.7 Las condiciones de asepsia deben ser las mismas que las enunciadas en el punto 7.2.3.
8. PRESERVACION Y ALMACENAMIENTO
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su recolección. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el análisis, se inicie dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y en ningún caso, este lapso debe exceder de 24 horas para agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua para que sea válido el resultado del análisis. Durante el período que transcurra del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a 277K(4°C), con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados falsos o dudosos.
9. PROCEDIMIENTO
9.1 Pruebas presuntivas.
9.1.1 Preparación de la muestra e inoculación del medio
Antes del examen, mezclar perfectamente la muestra agitándola vigorosamente para lograr una distribución uniforme de los microorganismos y, dependiendo de la naturaleza del agua y el contenido bacteriano esperado, hacer las diluciones necesarias en esta etapa.
Utilizar series que constan de por lo menos tres diluciones: 10.0cm3, 1.0cm3 y 0.1cm3 ó bien1.0cm3, y 0.01cm3.
Por cada dilución debe haber 3 ó 5 tubos.
Para diluciones a 10 veces, poner 90 ó9 cm3 del diluyente en matraces o tubos de dilución esterilizados. Alternativamente, usar volúmenes de diluyente preesterilizado en botellas de tapón de rosca. Hacer una o más diluciones a 10 veces transfiriendo un volumen de la muestra de agua a 9 volúmenes de diluyente. Repetir estos pasos cuantas veces sea necesario. Preparar suficiente cantidad de cada dilución para todas las pruebas que se vayan a llevar a cabo con la muestra. Para diluciones diferentes a 10 veces ajustar el
volumen de diluyente a la porción de prueba. Inocular los tubos conteniendo medios de aislamiento de doble concentración con porciones de prueba de un volumen mínimo de 5cm3.
9.1.2 Incubación de los tubos.
Incubar los tubos inoculados ya sea a 308± 1K (35± 1°C) o 340± 1K(37±1°C) durante 48 horas.
9.1.3 Examen de los tubos
Examinar los cultivos de los tubos después de un período de incubación de 18 a 24 horas y considerar como resultados positivos a aquellos que muestren turbidez debida al crecimiento bacteriano y formación de gas en los tubos internos invertidos (Durham) junto con producción de ácido si el medio de aislamiento contiene un indicador de pH. Reincubar aquellos tubos que no muestran alguno o todos estos cambios y examinarlos nuevamente para detectar reaccionan positivas a las 48 horas.
9.2 Pruebas confirmativas. 9.2.1 Inoculación del medio.
Resembrar a partir de cada tubo de medio de aislamiento que muestro un resultado positivo en uno o más tubos de medio confirmativo (6.2) para detectar la producción de gas e indol. NOTA 4: - Si se usa el medio más inhibitorio de caldo lactosa para aislar, resembrar en alguno de los dos medios confirmativos más selectivos, Caldo de Bilis Lactosa Verde Brillante o Caldo EC para efectuar la confirmación.
9.2.2 Incubación y examen.
Para confirmar la presencia de organismos coliformes, incubar un tubo de 9.2.1 de Caldo Lactosa Verde Brillante o Caldo EC a 310K(37°C) y examinarlo para ver si hay producción de gas dentro de un período de 48 horas.
Para confirmar la presencia de organismos coliformes termotolerantes, incubar otro tubo de 9.2.1 de Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante o Caldo EC a 317K (44°C) durante 24 horas para ver si hay producción de gas.
Para confirmar la presencia de E. coli. Presuntiva, incubar un tubo de 9.2.1 de agua de triptona para detectar la formación de indol a 317L(44°C) durante 24 horas. Después añadir de 0.2 a0.3 cm3 de reactivo de Kovacs (6.3) el tubo de agua de triptona; El desarrollo de un anillo de color rojo después de agitar suavemente de note la presencia de indol.
NOTA 5.- La detección de E. coli presuntiva se considera una evidencia satisfactoria de contaminación fecal. Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para la confirmación de E. coli si se considera necesario.
9.3 Prueba de oxidasa
Algunas bacterias existentes en el agua pueden conformarse a la definición de organismos coliformes en muchos aspectos, pero son capaces de producir gas a partir de lactosa solamente a temperaturas inferiores a 310K (37°C). Por consiguientes dan resultados negativos a las pruebas confirmativas estándar para organismos coliformes y su presencia en agua usualmente no se considera significativa. Las especies de Aeromonas, que se encuentran naturalmente en el agua, tienen una temperatura óptima de crecimiento en el rango 303 a 308K (30 a 35°C), pero a pesar de ello son capaces de producir ácido y gas a partir de lactosa a 310K(37°C). Tienen poco significado para efectos sanitarios y se distinguen del grupo de los coliformes por una reacción de oxidasa positiva.
9.3.1 Llevar a cabo la prueba con subcultivos puros de los organismos fermentadores de lactosa, crecidos en medio nutriente de agar, como sigue:
-Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa recientemente preparado (6.4) en un papel filtro en una caja de Petri.
-Con una barra de vidrio o un asa de alambre de platino (no de nicromel), colocar parte del cultivo en el papel filtro preparado.
-Considerar la aparición de u color azul marino purpúreo en un lapso de 10 segundos como una reacción positiva.
NOTA 6. - En cada ocasión que se use el reactivo de oxidasa, llevar a cabo pruebas de control con cultivos de organismos que se sepa dan una reacción positiva (pseudomonas aeruginosa) y uno que de una reacción negativa (E, coli) en 100 cm3 de la muestra.
10 CALCULOS
A partir del número de tubos que dan reacciones positivas en los medios de aislamiento y confirmativo, calcular por referencia a las tablas estadísticas (ver tabla) el número más probable de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. coli presuntiva en 100 cm3 de la muestra. Cuando se emplean de dilución para hacerlo equivalente.
En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para los cálculos la siguiente ecuación:
No. de tubos positivos x 100 Nmp/100cm3=_____________________________
Cm3 de muestra cm3 de muestra En tubos negativos x en todos los tubos.
TABLA 1
Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con
porciones de 1cm3 y con 5 porciones de 0.1 cm3.
No. de tubos con reacciones positivas
Límite confiable de 95%
No. de tubos con reacciones positivas Límite confiable de 95% 5tubo s con 10cm 5tubo s con 1cm3 5tubo scon 0.1c m3 Indic e del NMP por 100c
m3 Inte-rior Supe-rior
5tubo s con 10cm 3 5tubo s con 1cm3 5tubo s con 0.1c m3 Indic e del NMP POR 100c m3 Interi or Supe rior 0 0 0 <2 0 0 1 2 <0.5 7 4 2 1 26 9 78 0 1 0 2 <0.5 7 4 3 0 27 9 80 0 2 0 4 <0.5 11 4 3 1 33 11 93 4 4 0 34 12 93 1 0 0 2 <0.5 7 1 0 1 4 <0.5 11 5 0 0 23 7 70 1 1 0 4 <0.5 11 5 0 1 31 11 89 1 1 1 6 <0.5 15 5 0 2 43 15 110 12 2 0 6 <0.5 15 5 1 0 33 11 93 5 1 1 46 16 120 2 0 0 5 <0.5 13 5 1 2 63 21 150 2 0 1 7 1 17 2 1 0 7 1 17 5 2 0 49 17 130 2 1 1 9 2 21 5 2 1 70 23 170 2 2 0 9 2 21 5 2 2 94 28 220 2 3 0 12 3 28 5 3 0 79 25 190 5 3 1 110 31 250 3 0 0 8 1 19 5 3 2 140 37 340 3 0 1 11 2 25 3 1 0 11 2 25 5 3 3 180 44 500 3 1 1 14 4 34 5 4 0 130 35 300 3 2 0 14 4 34 5 4 1 170 43 490 3 2 1 17 5 46 5 4 2 220 57 700 3 3 0 17 5 46 5 4 3 280 90 850
5 4 4 350 120 1,000 4 0 0 13 3 31 5 5 0 240 68 750 4 0 1 17 5 46 5 5 1 350 120 1,000 4 1 0 17 5 46 5 5 2 540 180 1,400 4 1 1 21 7 63 5 5 3 920 300 3,200 4 1 2 26 9 78 5 5 4 1600 640 5,800 4 0 0 22 7 67 5 5 5 =<24 00 TABLA 2
Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 1 tubo con porciones de 50 cm3 5 tubos con porciones de 10 cm3 y 5 tubos con porciones de 10cm3
No. de tubos con reacciones positivas
Límite confiable de 95%
No. de tubos con reacciones positivas Límite confiable de 95% 1tubo con5 0cm3 5tubo scon 10cm 3 5tubo s con 1cm3 Indic e del NMP por 100c m3 interior Supe rior 1tubo con 50cm 3 5tubo s con 10cm 3 5tubo s con 1cm3 Indic e del NMP por 100c m3 Interior Supe rior 0 0 0 <1 0 0 1 1 <0.5 4 1 2 1 7 1 17 0 0 2 2 <0.5 6 1 2 2 10 3 23 0 1 0 1 <0.5 4 1 2 3 12 3 28 0 1 1 2 <0.5 6 1 3 0 8 2 19 0 1 2 3 <0.5 8 1 3 1 11 3 26 0 2 0 2 <0.5 6 1 3 2 14 4 34 0 2 1 3 <0.5 8 1 3 3 18 5 53 0 2 2 4 <0.5 11 1 3 4 21 6 66 0 3 0 3 <0.5 8 1 4 0 13 4 31 0 3 1 5 <0.5 13 1 4 1 17 5 47 0 4 0 5 <0.5 13 1 4 2 22 7 69 1 0 0 1 <0.5 4 1 4 3 28 9 85 1 0 1 3 <0.5 8 1 4 4 35 12 100 1 0 2 4 <0.5 11 1 4 5 43 15 120 1 0 3 6 <0.5 15 1 5 0 24 8 75 1 1 0 3 <0.5 8 1 5 1 35 12 100 1 1 5 5 <0.5 13 1 5 2 54 18 140
1 1 7 7 1 17 1 5 3 92 27 220
1 1 9 9 2 21 1 5 4 160 39 450
1 2 5 5 <0.5 13 1 5 5 =>24
0
TABLA 3 Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 50 cm3, 5 tubos
con porciones de 10 cm3 y 5 tubos con porciones de 1 cm3.
No. de tubos con
reacciones positivas Límite confiable de 95%
No. de tubos con
reacciones positivas Límite confiable de 95% 5tubos con50 cm 5tubos con 10cm 5tubos con1c m3 Indice del NMP Por 100cm 3 Inferior Superior 5tubos con 50cm3 5tubos con10 cm3 5tubos con 1cm3 Indice del NMP por 100cm 3 Inferior Superior 0 0 0 <1 0 0 1 1 <0.5 2 4 1 1 4 1 9 0 1 0 1 <0.5 2 4 1 2 4 1 9 0 1 1 1 <0.5 2 4 2 0 4 1 9 0 2 0 1 <0.5 2 4 2 1 4 1 9 0 3 0 1 <0.5 2 4 2 2 5 2 12 4 3 0 5 2 12 1 0 0 1 <0.5 2 1 0 1 1 <0.5 2 4 3 1 5 2 12 1 1 0 1 <0.5 2 4 3 2 6 2 14 1 1 1 1 <0.5 2 4 4 0 6 2 14 1 2 0 1 <0.5 2 4 4 1 7 3 17 1 2 1 2 <0.5 4 4 5 0 7 3 17 1 3 0 2 <0.5 4 4 5 1 8 3 19 2 0 0 1 <0.5 2 5 0 0 4 1 9 2 0 1 1 <0.5 2 5 0 1 4 1 9 2 1 0 1 <0.5 2 5 0 2 6 2 14 2 1 1 2 <0.5 4 5 1 0 5 2 12 2 2 0 2 <0.5 4 5 1 1 6 2 14 2 2 1 2 <0.5 4 5 1 2 7 3 17 2 3 0 2 <0.5 4 5 2 0 6 2 14 2 3 1 3 1 7 5 2 1 8 3 19 2 4 0 3 1 7 5 2 2 10 4 23 5 2 3 12 4 28 3 0 0 2 <0.5 4 3 0 1 2 <0.5 4 5 3 0 9 3 21 3 1 0 2 <0.5 4 5 3 1 11 4 26 3 1 1 2 <0.5 4 5 3 2 14 5 34 3 1 2 3 1 7 5 3 3 18 6 53
3 2 0 3 1 7 5 4 0 13 6 31 3 2 1 3 1 7 5 4 1 17 6 47 3 2 2 4 1 9 5 4 2 22 7 70 3 3 0 3 1 7 5 4 3 28 9 85 3 3 1 4 1 9 5 4 4 35 11 100 3 4 0 4 1 9 5 5 0 24 8 75 3 4 1 4 1 9 5 5 1 35 11 100 4 0 0 2 <0.5 4 5 5 2 54 18 140 4 0 1 3 1 7 5 5 3 92 27 220 4 0 2 3 1 7 5 5 4 160 39 420 4 1 0 3 1 7 5 5 5 =>240 TABLA 4
Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 1 cm3 y 3 con porciones de
0.1 cm3.
No. de tubos con reacciones positivas Límite Confiable de 95% 3 tubos con
cm3 3 tubos con 1cm3 3 tubos con 0.1 cm3
Indice Del NMP.
0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1,100 => 2,400 <0.5 <0.5 <0.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150 9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 280 380 440 470 1,300 2,400 4,800 11. REPORTE DE LA PRUEBA
El reporte de la prueba debe hacer referencia a esta norma y dar toda la información relevante, incluyendo
a.. Todos los detalles necesarios para la identificación completa de la muestra. b. La técnica y medio de cultivo empleados.
c. El tiempo, temperatura y condiciones de la incubación.
e. Cualquier suceso particular observado en el curso del análisis y cualquier operación no especificada en el método o considerada opcional que pueda haber influído en los resultados.
11 CONFIABILIDAD
El procedimiento de fermentación en tubos múltiples es el método más usado por su facilidad y economía. El resultado de esta prueba se expresa por el “número más probable” (NMP), pero debe entenderse que este método no es exacto ya que sólo nos da la probable densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada.
La confiabilidad está dada por los niveles superiores o inferiores del límite de confianza al 95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 cm3, no obstante, es una indicación importante para evaluar la calidad sanitaria del agua.
12 BIBLIOGRAFIA
STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER.
15th edition. Paginas 794-805. 1980.
14 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
Esta norma concuerda parcialmente con el anteproyecto de norma ISO/DP 9308/2. Water quality- Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant coliform organisms and presumtive
Escherichia coli by the multiple tube (most probable number) method.
México, D.F. a 3 Junio de 1987
LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS
SECRETARIA DE COMERCIO
Y
FOMENTO INDUSTRIAL
NORMA MEXICANA
NMX-AA-112-1995-SCFI
ANALISIS DE AGUA Y SEDIMENTOS – EVALUACION DE
TOXICIDAD AGUDA CON PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM –
METODO DE PRUEBA.
WATER AND SEDIMENT ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION
WITH PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – TEST METHOD.
PREFACIO
En la elaboración de la presente Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas e instituciones:
- ASESORIA Y CONSULTORIA ECOLOGICA-REMMSA - ASOCIACION NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUIMICA - BECTOR DICKINSON DE MEXICO
- CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE CELULOSA Y PAPEL - CONTROL DE CONTAMINACION DEL AGUA, S.A. DE C.V.
- COMITÉ TECNICO DE NORMALIZACION NACIONAL DE PROTECCIÓN AL AMBIENTE
- DISEÑO HIDRAULICO Y TECNOLOGIA AMBIENTAL, S.A. DE C.V.
- EMPRESA PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION DEL AGUA EN LA ZONA E CIVAC
- F.J. SALCEDO Y COMPAÑÍA
- INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO - INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
Centro de investigación y de Estudios Avanzados. - INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC
- JUNTA MUNICPAL DE AGUA Y SANAMIENTO DE CIUDAD JUAREZ CHICHUAHUA
- SECRETARIA DE MARINA
Dirección general de Oceanografía Naval.
- SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA. Comisión Nacional de Agua.
Dirección general de Acuacultura.
Instituto mexicano de Tecnología del agua. Instituto Nacional de Ecología.
INDICE DEL CONTENIDO Núm. del Capítulo 1. Objetivo 2. Campo de aplicación 3. Referencias 4. Definiciones 5. Muestreo 6. Principio 7. Reactivos y materiales 8. Aparatos
9. Preparación y acondicionamiento de la muestra 10. Procedimiento
11. Expresión de los resultados. 12. Informe de los resultados 13. Informe de la prueba 14. Bibliografía
15. Concordancia con normas internacionales. Apéndice A (informativo)
ANALISIS DE AGUA Y SEDIMENTOS – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – METODO DE PRUEBA.
WATER AND SEDIMENT ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – TEST METHOD.
1 OBJETIVO.
Esta Norma Mexicana establece el método para determinar la calidad del agua. Lixiviados y sedimentos mediante pruebas de toxicidad aguda utilizando a la bacteria bioluminiscente marina Photobacterium phosphoreum.
2 CAMPO DE APLICACIÓN
Esta Norma Mexicana es aplicable para la evaluación de toxicidad aguda en cuerpos de agua dulce, salubre y/o marina, así como aguas residuales industriales, agrícolas o municipales, sustancias puras o combinadas, lixiviados y sedimentos.
3 REFERENCIAS
Esta norma se complementa con las siguientes Normas Mexicanas y Norma Oficial Mexicana vigentes:
NMX-AA-033 Aguas residuales – Muestreo.
NMX-AA-007 Aguas – Determinación de temperatura. NMX-AA-008 Aguas – Determinación de pH.
NMX-AA-014 Cuerpos receptores – Muestreo.
NMZ-AA-087-SCFI Análisis de agua – Evaluación de toxicidad aguda con Daphnia mangna Straus (Crustacea – Cladocera) – Método de prueba.
NOM-053-ECOL Que establece el procedimiento para llevar a cabo la prueba de extracción para determinar los constituyentes que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.
4 DEFINICIONES.
Para fines de esta Norma Mexicana, se entiende por: 4.1. Agua desionizada.
Es el agua que ha sido tratada para remover los iones en solución que presenta una conductividad menor o igual a 2µmhos/cm.
4.2. Agua destilada.
Es el agua que ha sido evaporada y condensada en un aparato de destilación de vidrio borosilicato u otro material, para remover impurezas.
4.3. Agua intersticial.
Es el agua que se encuentra ocupando un espacio entre las partículas del sediento. La cantidad de agua interstical se expresa como un porcentaje del sedimento húmedo en relación a su masa seca.
4.4. Agua marina.
Es el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares al agua marina natural.
4.5. Agua de mar artificial.
Es el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares al agua marina natural.
4.6. Aguas residuales.
Son las aguas de composición variada provenientes de las descargas municipales, industriales, comerciales, agrícolas, pecuarias, domésticas y en general de cualquiera otra. 4.7. Bioluminiscencia.
Es el fenómeno por el cual, ciertos organismos vivos emiten luz como resultado de su actividad bioquímica.
4.8. Contaminante.
Es toda materia o energía en cualesquiera de sus estados físicos y formas que al incorporarse o actuar en la atmósfera, agua suelo, flora, fauna o cualquier otro elemento natural, altere o modifique su composición o condición natural.
4.9. Concentración efectiva media (CE50)
Es la concentración de sustancias puras, combinadas, cuerpos receptores, afluentes, lixiviados y sedimentos que reducen la intensidad de luz emitida por la bacteria photobecterium phosphoreum a un 50%
4.10. Cuerpos de agua.
Son los mares, lagos, lagunas, estuarios, acuíferos, redes colectoras con excepción de los sistemas de drenaje y alcantarillado urbano o municipal, ríos y sus efluentes directos o indirectos, permanentes o intermitentes, presas. Cuencas. Cauces, canales, embalses, cenotes, manantiales, y demás depósitos o corrientes de agua.
4.11. Descarga.
Son las aguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua o sistema de drenaje y alcantarillado urbana o municipal, incluyéndose los procesos de infiltración e inyección.
4.12. Efecto agudo.
Es aquél que se manifiesta como una respuesta inmediata de un organismo al tóxico o tóxicos a los que se ha sido expuesto. Usualmente produce inhibición de alguna función metabólica, inmovilidad o muerte.
4.13. Efluente.
Es el agua u otro líquido que procede de un embalse, cuenca, procesos o planta de tratamiento.
4.14. Falso positivo.
Es la reducción de luz detectada, causada por un factor o factores diferentes de la presencia de algún tóxico.
4.15. Liofilizado.
Es el producto sometido a deshidración en condiciones de baja temperatura y alto vacío con el fin de conservarlo.
4.16. Lixiviado.
Es el líquido proveniente de los residuos, el cual se forma por reacción, arrastre o percolación y que contienen, disueltos o en suspensión, componentes que se encuentran en los mismos residuos.
4.17. Muestra simple o instantánea.
Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar un volumen que resulte representativo de la descarga de aguas residuales, en el sitio y en el momento del muestreo.
4.18. Muestra compuesta.
Es aquélla que se forma con la mezcla de muestras simples o instantáneas tomadas en un efluente industrial, agrícola o municipal. El número de muestras simples depende de las horas por día que opere el proceso generado de la descarga.
4.19. Photobacterium phosphoreum.
Es la bacteria marina bioluminiscente, con forma bacilar, Gramm-negativa, anaerobia facultativa, halofílica, la cual posee un flagelo en uno de los polos.
4.20 Prueba de toxicidad (bioensayo de toxicidad).
Es la exposición controlada de organismos a sustancias puras o combinadas y aguas provenientes de cuerpos de agua, para evaluar su efecto.
4.21. Reconstitución.
Es la reactivación de la bacteria liofilizada por la adición de agua destilada. (rehidratación). 4.22. Salinidad
Es el contenido de sales disueltas por litro. 4.23. Sedimento.
Es el material particulado o granular que se deposita en el fondo de un cuerpo de agua, sistema de drenaje o alcantarillado urbano o municipal.
4.24. Sustancia pura.
Es el elemento o conjunto de dos o más elementos combinados químicamente, que dan lugar a un compuesto con pureza no menor al 98%, por ejemplo: dicromato de potasio (K2Cr2O7), fenol (C6H5-OH), sulfato de zinc (ZnSO4).
4.25. Sustancia combinada.
Es aquélla que se forma por la integración de dos o más compuestos en una proporción no mayor al 98% de cualquiera de ellos. Para fines de esta norma: aguas residuales, industriales, efluentes agrícolas, municipales, lixiviados y sedientos.
4.26. Tiempo de exposición.
Es el período en el que se someten los organismos a las soluciones de prueba, en un bioensayo de toxicidad.
4.27. Tiempo de reconstitución bacteriano.
Es el período en el que se lleva a cabo la rehidratación bacteriana y que comprende desde el momento en que la solución de reconstitución es vertida al liofilizado, hasta el instante en que es colocada en incubación a 5,5ºC y que no debe exceder de 10 s.
4.28. Toxicidad.
Es el efecto que produce un tóxico. 4.29. Toxicidad aguda.
Es el efecto medido por la reducción de luz de Photobacterium phosphoreum. Después de ser expuesta a un tóxico una sola vez durante un período corto no mayor a 30min.
4.30. Tóxico.
Es cualquier sustancia pura o combinada que al entrar en contacto con un organismo, produce daños estructurales o alteraciones bioquímicas o fisiológicas e incluso la muerte; dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición.
4.31. Tóxico de referencia.
Es una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad cuyo efecto en los organismos a determinadas concentraciones es conocido y por lo tanto, permite establecer el estado de respuesta de los mismos; así como, comparara los resultados intra e inter laboratorios. El uso de estos tóxicos, proporciona también una evaluación general de la precisión (estabilidad y reprocibilidad) del método a través del tiempo.
5. MUESTREO.
El muestro tanto de cuerpos de agua como de efluentes industriales, agrícolas, municipales o urbanos, lixiviados y sedimentos, constituyen una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de la calidad del ambiente acuático.
Se efectúan muestreos instantáneos de acuerdo a la tabla 1.
TABLA 1.- Muestras instantáneas requeridas para formar una muestra compuesta. Intervalo para la obtención de
muestras simples. Horas pro día que opera
el proceso generador de la descarga. Número de muestras. Mínimo H Máximo h Hasta 8h Más de 9h y hasta 12h Más de 12h y hasta 18h Más de 18h y hasta 24h 4 4 6 6 1,0 2,0 2,0 3,0 2 3 3 4
La integración de la muestra compuesta se efectúa de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-003 (ver 2 Referencias), tomándose las precauciones necesarias en cuanto a la preservación de las muestras simples, para la cual, cada una de éstas se debe mantener a 4ºC ± 2ºC hasta que sea integrada la muestra compuesta. Una vez concluido esto, dependiendo de cuando se realice el análisis, la muestra compuesta se debe almacenar y preservar de acuerdo al capítulo 9 de esta norma.
5.2. Muestreo en cuerpos de agua.
El muestro se debe realizar de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-014 (VER 2 Referencias). Además de los parámetros fisicoquímicos básicos, considerados sólo para fines del reporte (pH, oxígeno disuelto, conductividad, temperatura de agua y aire), se deben registrar las siguientes características aparentes:
- Olor - Color - Turbiedad
- Presencia o ausencia de burbujas y espuma
Las muestras simples o instantáneas se integran de acuerdo al inciso 4.17 de esta norma, siguiendo los ejemplos indicados en el inciso 13.1 de la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 2 Referencias).
5.3. Muestreo en sedimentos.
El muestreo de sedimentos se lleva a cabo utilizando una draga tipo Ekman o similar, o bien un nucleador, siempre que se realice en cuerpos de agua cuya profundidad sea igual o mayor a 50 cm. Si el muestreo se efectúa a profundidades menores a la anterior, se utiliza una pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte, o bien, puede realizarse muestreo directo, utilizando el recipiente de almacenamiento.
En cualquiera de los dos casos mencionados, la muestra que se considera para el análisis corresponde a la lámina superior de sedimento con un espesor de 3cm y mas húmeda aproximada de 200g.
Al efectuar el muestreo, se recomienda considerar lo siguiente:
- Cuando se realiza el muestreo en sedimentos limosos, se sugiere introducir lentamente la draga o el nucleador para evitar remolinos y corrientes que suspendan el sedimento.
- Si el muestreo se realiza en un sedimento rocoso arenoso, pueden quedar atrapadas rocas pequeñas entre las mandíbulas de la draga, impidiendo el cierre total de ésta, ocasionado pérdida de sedimento cuando se recupera; por lo cual. Se debe lanzar la draga tantas veces como sea necesario hasta obtener la cantidad de sedimento suficiente. De igual forma, si se utiliza un nucleador, quizá se requiera efectuar varios muestreos hasta obtener el sedimento necesario.
- Cuando el muestreo de sedimentos se realice en zonas de aguas someras (menor a 50 cm de profundidad), al utilizar la pala pequeña, se debe procurar sumergirla en dirección del flujo, y al llegar al fondo introducirla lentamente inclinando la pala en un ángulo aproximado de 45º, posteriormente arrastrar ésta, paralelamente al fondo hasta obtener una cantidad suficiente. En seguida, se debe elevar la pala en forma casi horizontal (paralela al fondo) muy lentamente, para evitar pérdida de sedimento.
Para todos los casos anteriores, la muestra colectada para el análisis se coloca en recipientes limpios de boca ancha de volumen mínimo de 250ml, de polietileno de alta densidad, con tapa o contratapa del mismo material.
5.3. Muestreo de lixiviados
El muestreo de lixiviados se debe efectuar en los pozos de monitoreo de los sistemas de captación de los mismos, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-053-ECOL, (ver 2 Referencias).
Para la colecta de la muestra, se deben tomar las preocupaciones necesarias utilizando el equipo de seguridad adecuado. Las muestras se deben colocar en recipientes limpios de 50 ml de polietileno e alta densidad con contratapa.
6. PRINCIPIO
Este método se basa en la evolución del efecto que sustancias puras, combinadas, cuerpos receptores, efluentes, lixiviados y sedimentos pueden tener sobre la intensidad e la luz emitida por la bacteria Photobacterium phosphoreum en condiciones controladas de exposición.
7.- REACTIVOS Y MATERIALES. 7.1. Reactivos y soluciones.
7.1.1. Reactivos.
7.1.1.1. Fenol (C6H5-OH)
Compuesto con una pureza superior o igual a 99%.
7.1.1.2. Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) Compuesto con una pureza superior o igual a 99%
7.1.1.3. Metanol (CH3OH)
Grado plaguicida, para efectuar la extracción Soxhlet en la muestra testigo.
7.1.1.4. Acetona (C3H6O)
7.1.1.5. Acido nítico concentrado (HNO3)
7.1.1.6. Agua destilada, o en su defecto, agua con pureza equivalente. 7.1.1.7. Agua desionizada.
7.1.1.8. Cloruro de sodio (NaCL)
7.1.1.9. Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCL2.6H2O)
7.1.1.10. Cloruro de estrocio hexahidratado (SrCL2.6H2O)
7.1.1.11. Cloruro de potasio (KCL) 7.1.1.12. Bromuro de potasio (KBr)
7.1.1.13. Cloruro de calcio (CaCL2) anhidro
7.1.1.14. Sulfato de sodio decahidratado (NaSO4.10H2O)
7.1.1.15. Bicarbonato de sodio (NaHCO3)
7.1.1.16. Floruro de sodio (NaF) 7.1.1.17. Acido borico (H3BO3)
7.1.2. Soluciones
7.1.2.1. Medio de reconstitución.
Reactivo de agua destilada o similar no tóxica a la bacteria Photobacterium phosphoreum. 7.1.2.2. Medio de dilución para muestras de agua dulce.
El mismo medio señalado en el inciso anterior agregado en una relación mas volumen (M/V) 2% de cloruro de sodio (NaCL).
7.1.2.3. Medio de dilución para muestras de agua salina o salobre.
El medio de dilución debe ser agua de mar artificial preparada según el inciso 7.1.2.6. 7.1.2.4. Medio de dilución para fase sólida.
Medio señalado en el inciso 7.1.2.1. con la adición de NaCL en una relación masa volumen (M/V) de 3,5%. En caso de muestras salinas o salobres, el medio de dilución es agua de mar artificial preparada como se indica en el inciso 7.1.2.6.
7.1.2.5. Solución de ajuste osmótico.
Medio utilizado para el inciso 7.1.2.1. con la adición de NaCL en una relación masa volumen (M/V) de 22%.
7.1.2.6. Agua de mar artificial
Se prepara con agua destilada o desionizada de acuerdo con la tabla 2, con una salinidad aproximada de 35, (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.16).
TABLA 2.- Reactivos utilizados en la preparación de agua de mar artificial Solución A Solución B Sales Cantidad (g) Sales Cantidad (g) NaCL 23,90 NaSO4.10H2O 9,06 MgCL2.6H2O 10,83 NaHCO3 0.02
CaCL2 anhidro 1,15 NaF 0,003
SrCL2.6H2O 0,004 H2BO3 0,0003
KCL 0,682 Agua destilada 100 ml KBr 0,099
La solución B se adiciona lentamente a la solución A, agitando constantemente para lograr una mezcla homogénea. Después de 24h, filtrar la mezcla utilizando un filtro de membrana de 0,45 µm.
7.1.2.7. Agua marina.
Libre de tóxicos, puede emplearse en sustitución de 7.1.2.6. 7.2. Materiales.
7.2.1. Material biológico.
7.2.1.1. Photobacterium phosphoreum
la suspensión bacteriana debe ser utilizada a una concentración aproximada de 1 X 108 células/ml. Dado que los cultivos frescos son inherentemente variables, se debe utilizar un cultivo liofilizado con 2,0% de NaCL, 94% de sólidos de leche descremado y 4% de bacterias. Estas se deben preservar en forma liofilizada en un congelador a una temperatura entre –18ºC y –20ºC (bajo estas condiciones, el tiempo de caducidad de la bacteria es de un año). Cuando se hidratan, las bacterias comienzan inmediatamente a emitir luz, y pueden ser usadas en pruebas sin ningún tratamiento posterior. La cepa liofilizada aporta valores constantes de CE50 para tóxicos de referencia (ver inciso 10.3.3.). si la cepa se preserva por
otros métodos o se utilizan cultivos frescos, su respuesta a tóxicos de referencia puede ser no reproducible (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.2).
7.2.2. Otros materiales. 7.2.2.1. Celdillas.
Las celdillas de lectura deben ser compatibles con el luminómetro utilizado; tener capacidad para un volumen total de 3000µL-5000µL; de vidrio borosilicato y descabales. 7.2.2.2. Columnas filtradoras.
Provista con un filtro de fibra de vidrio de 45µm. Utilizadas para extraer el sobrenadante de las muestras de sedimentos.
7.2.2.3. Micropipetas.
Deben tener doble fase de aire, y capacidad para extraer volúmenes de 1000µL, 500µL, 250µL y 10µL.
7.2.2.4. Puntas para micropipetas.
7.2.2.5 Soporte de celdillas.
Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, treinta celdillas en baño de recirculación o sistema de control de temperatura. El soporte debe prevenir que las celdillas se sumerjan en agua (el exceso de agua en la parte externa de las celdillas puede interferir con la lectura de luz de cada celdilla), así como tener buena transferencia de calor y resistencia a la corrosión; éste es necesario cuando se utilice un luminómetro sin pozos de celdilla con temperatura controlada.
7.2.2.6.Soporte de celdilla R
Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, una celdilla en baño de recirculación o sistema de control de temperatura a 5,5ºC. Este soporte puede sumergir a la celdilla en agua y debe ser resistente a la corrosión. Si la celdilla no está inmersa en agua, éste debe cumplir con las especificaciones del material del soporte de celdillas, descrito en el inciso anterior. El soporte de celdillas es necesario cuando se utiliza un luminómetro sin bloque de incubación con temperatura controlada.
7.2.2.7.Soporte de tubos de ensaye.
Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, al menos 30 tubos de ensaye descritos en el inciso 7.2.2.8., dentro del baño de recirculación o sistema de control de temperatura mencionado en el inciso 8.2. El material de construcción debe tener buena transferencia de calor y resistencia a la corrosión dentro del sistema de recirculación os sistema de control de temperatura. Este soporte es necesario para realización de la prueba en fase sólida.
7.2.2.8. Tubos de ensaye
desechables, de vidrio borosilicato o policarbonato, con capacidad de 15 ml y 20mm de diámetro. Limpios. Se utilizan para la prueba en fase sólida
7.2.2.9. Equipo de seguridad
Guantes, mascarillas, lentes de seguridad, botas de hule, etc. 7.2.2.10. Recipientes de muestreo
de polietileno de alta densidad, de 50 ml y de 250mL (boca ancha), tapa o contratapa del mismo material.
7.2.2.11 Sistema de extracción (de acuerdo a lo indicado en el apéndice B) De capacidad mínima de 250 mL.
7.2.2.12. Paraflim 7.2.3. Lavado de material
Todo el material que se utilice en el muestro y análisis (excepto celdillas y puntas de micropipeta) debe llevarse según el método descrito a continuación:
- Lavar con detergente y enjuagar dos veces con agua de la llave. - Enjuagar con acetona (C3H6O). Dejar secar completamente.
- Enjuagar con ácido nítico (HNO3) concentrado, eliminar el excedente. Enjuagar
abundantemente con agua desionizada, escurrir y dejar secar. Una vez lavado, proteger el material de polvo y otros factores. 8.- APARATOS.
8.1. Luminómetro.
Debe ser capaz de detectar la luz emitida por photobacterium phosphoreum, a una longitud de onda de 490nm.
8.2. Baños de recirculación o sistemas de control de temperatura.
Debe ser capaces de mantener una temperatura de 15º ± o,5ºC y 5,5ºC ± 0,5ºC.
Los 3 equipos descritos pueden ser individuales o estar integrados en un sistema automatizado.
8.3. Congelador
Debe ser capaz de mantener una temperatura de –20ºC ± 2ºC. 8.4. Refrigerador
Debe ser capaz de mantener una temperatura de 4ºC ± 2ºC. 8.5 Parrilla magnética.
8.6. Parrilla de calentamiento para el sistema de extracción (ver Apéndice B) Debe ser capaz de mantener una temperatura entre 70ºC y 80ºC.
8.7. Centrífuga clínica o equivalente.
Debe ser capaz de separar la fase sólida de la líquida. 8.8. Medidor de pH.
El pH de las muestras se determina de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-008, (ver 2 Referencias).
8.9. Ternómetro
La temperatura se determina de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-007, (ver 2 Referencias).
8.10. Salinómetro.
Utilizado para determinar la salinidad de las muestras marinas y salobres. 8.11. Oxímetro.
Para determinar el oxígeno disuelto de las muestras en campo. 8.12. Horno de secado o equivalente
Debe ser capaz de mantener una temperatura de 100ºC. 8.13. Balanza analítica.
Con sensibilidad mínima de 1mg.
9 PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS. 9.1. Preparación.
En general, el contenido de salas de la muestra y del medio de dilución durante el análisis, debe ser de 2,0% (M/V) como cloruro de sodio (NaCL) para muestras de agua dulce y de 3,5% (M/V) para muestras de agua salobre y marina.
9.1.1. Preparación de muestras de agua dulce
el contenido de sales de las muestras debe ajustarse a 2,0% de cloruro de sodio (NaCL) previo al análisis, lo cual es necesario par evitar la pérdida de bioluminiscencia de la bacteria debida al choque osmótico. Este ajuste se logra adicionando la cantidad adecuada de solución de ajuste osmótico descrita en el inciso 7.1.2.5. (1 parte de solución por 10 partes de muestra). Por ejemplo, supóngase que se tienen una muestra e agua dulce (0% de NaCL), se debe agregar 2,5ml de muestra y 0,25ml de solución de ajuste osmótico; o bien, adicionar NaCL sólido a la muestra (0,2g en 9,8ml de muestra).
9.1.2. Preparación de muestras de agua salubre.
La salinidad de las muestras debe determinarse antes de ser analizadas, Si el contenido de sales está por debajo del 2,0%, debe ajustarse a este valor adicionado NaCL. Si el contenido de sales es mayor a 2,0%, se debe adicionar NaCL al medio de dilución hasta igualar la salinidad de la muestra.
9.1.3. Preparación de muestras de agua marina.
El contenido de sales de las muestras es aproximadamente de 3,5%, por lo tanto, no se requiere ajuste osmótico. El diluyente de prueba debe ser agua de mar artificial o agua de mar carente de contaminación (ver incisos 7.1.2.6. y 7.1.2.7).
9.1.4. Preparación de muestras de agua interstical de sedimentos.
Centrifugar el sedimento de cada muestra par separar la fase sólida de la fase líquida. Decantar cuidadosamente la fase líquida y emplearla par su preparación de acuerdo a los incisos 9.1.1., 9.1.2. y 9.1.3, según su procedencia.
- En muestras de sedimento de sistemas de agua dulce, se debe hacer la preparación descrita en el inciso 9.1.1.
- En muestras de sedimento de sistemas de agua dulce salubre, se debe hacer la preparación descrita en el inciso 9.1.2.
- En muestras de sedimento de sistemas de agua marina, se debe realizar la preparación descrita en el inciso 9.1.3.
9.1.5. Preparación de extractos acuosos de sedimentos.
Homogeneizar la muestra de sedimento colectada, mezclar con el tipo de agua que corresponda al origen de la muestra en una relación 1:4 (M/V) utilizando un matraz Erlenmeyer. Agitar vigorosamente durante 60min en una parrilla magnética. Centrifugar la mezcla de 10 00r/min hasta obtener una separación completa de las dos fases. Utilizar el sobrenadante para el análisis.
9.1.6. Preparación muestra de sedimento para la prueba de fase sólida. 9.1.6.1. Muestra problema.
Proceder a mezclar la muestra hasta homogeneizarla. Si es necesario, centrifugar a una velocidad adecuada para separar la fase sólida de la líquida. Psoteriormente eliminar el sobrenadante.
9.1.6.2. Muestra testigo.
Efectuar una extracción (ver Apéndice B) exhaustiva (de 4h a 5h) empleando metanol, grado, grado plaguicidad. Recuperar el sedimento y evaporar el metanol remanente a temperatura ambiente, o utilizando un horno de secado a 40ºC.
Para la muestra problema y testigo (ver incisos 9.1.6.1. y 9.1.6.2.), determinar la masa de 0,3g de sedimento o fase sólida en tubo de ensaye, agregar 3,000µl de medio de dilución para fase sólida, preparado según el inciso 7.1.2.4. para efectos de cálculo, considerar únicamente la masa seca de la muestra.
9.1.7. Preparación de la bacteria y desarrollo de la prueba.(ver figura 1, número 3)
Sacar un frasco de bacteria liofilizada del congelador; de inmediato, vaciar en él, el medio de reconstitución contenida en la celdilla R (mantenida a 5,5ºC) y suspender. Estas acciones deben efectuarse rápidamente para evitar un efecto de choque osmótico a las bacterias. Transferir la mezcla nuevamente a la celdilla R (ahora RB), y continuar su incubación a 5,5ºC. Mezclar el contenido de dicha celdilla con una micropipeta. Esto implica la aspiración y eyección de la mezcla en la celdilla; repetir el mismo proceso 20 veces.
9.2. Acondicionamiento.
Las muestras de agua, lixiviados y sedimentos se almacenan dependiendo del tiempo entre la toma y el inicio del análisis, es decir:
Si el análisis de la muestras se realiza dentro de las primeras 48h, se deben almacenar a 4ºC ± 2ºC, en los recipientes indicados en 7.2.2.10; deben ser llenados completamente, evitando dejar espacio entre la muestra y el tapón. Si el análisis se realiza después de 48h y hasta 12 días posteriores a la fecha de colecta, la temperatura de conservación debe ser de –10ºC Las muestras deben ser preservadas sin la adición de producto químico alguno.
Antes de iniciar el análisis, las muestras deben ser descongeladas a temperatura ambiente; posteriormente, agitar para lograr la homogeneización, sin abrir el recipiente y dejar reposar 30min para alcanzar el equilibrio.
Si el análisis se realiza después de 48h, se debe reportar el tiempo transcurrido entre la colecta y el análisis.
Las muestras preservadas pro más de 12 días no son válidas para realizar pruebas de toxicidad.
El tiempo cero, en una muestra compuesta, es el momento de la toma de la última colecta simple o instantánea.
El tiempo final, es el momento en el que las bacterias reconstituidas entran en contacto con la muestra.
10.- PROCEDIMIENTO.
La prueba de toxicidad aguda con photobacterium phosphoreum se realiza por duplicado utilizando cuatro diluciones (90%, 45%, 22,5 %, 11,25%), y un control por réplica.
10.1. Procedimiento para efectuar el análisis en muestras de agua dulce, salobre, marina, lixiviados, agua interstical y extractos acuosas de sedimento, (ver figura 1)
10.1.1. Estabilizar el baño de recirculación o sistema automatizado a 15ºC ± 0,5ºC durante el análisis.
10.2.2. Colocar 5 celdillas (de la A1 a la A5) en los pozos de incubación del luminómetro o en el soporte de celdillas en el baño de recirculación o sistema de control de temperatura a 15ºC ± 0,5ºC.
10.1.3. Colocar 5 celdillas ® en el pozo de incubación del luminómetro o en el soporte de celdillas en un baño de recirculación o sistemas de control de temperatura a 5,5ºC.
10.1.4. Agregar a la celdilla R, la cantidad apropiada de medio de reconstitución para alcanzar una densidad bacteriana de 1 X 108 células/ml.
1.-Preparación de la muestra.
FIGURA1. Procedimiento para efectuar el análisis en muestras de agua dulce, salobre, marina, agua interstical, lixiviados y extracto acuoso de sedimentos
10.1.5. Para muestras líquidas, intersticiales y extractos acuoso de sedimentos provenientes de sistemas de agua dulce y lixiviados. Agregar 1 000µl del medio de dilución (ver inciso 9.1.1) a las celdillas A1, A2, A3 Y A4 indicadas en 10.1.2.
10.1.6. Para muestras líquidas, intersticiales y extractos acuosos de sedimentos, provenientes de sistemas de agua salobre o marinos y lixiviados. En caso de muestras salobres, adicionar 1 00µl a la celdillas A1, A2, A3 y A4 del medio de dilución que corresponda de acuerdo al inciso 9.1.2. en caso de muestras de agua marina, utilizar como diluyente agua de mar artificial o marina.
10.1.7. Agregar 2 750 µl de la muestra preparada según los incisos 9.1.1, 9.1.2. y 9.1.3. para muestras de agua dulce, salobre y marina respectivamente, a la celdilla A5. 10.1.7.1. Efectuar una serie de 3 diluciones partiendo de la celdilla A5 y finalizando en A2, en un patrón de dilución 1:2, obteniéndose las concentraciones al 90%, 45%, 22,5% y 11,25%, que se preparan transfiriendo volúmenes de 1 000µL a cada celdilla. Posteriormente desechar de A2 1 000µL y 750 µL de A5 para uniformizar volúmenes. La celdilla A1 contienen sólo medio de dilución y es considerada control (ver figura 1 número 2).
10.1.8. En el caso de que los límites de confianza se localicen fuera de ± 15% del valor de CE50 obtenido (considerando un 95% de confiabilidad estadística), se debe repetir la prueba
para obtener mayor precisión. Con la misma finalidad, también se puede elaborar una serie con un mayor número de diluciones utilizando factores como: 1:1,2 ó 1:1,25 ó 1:1,33. Para su elaboración se debe emplear un factor de dilución menor a 2, como puede ser: 1:1,2 ó 1:1,25 ó 1:1,33.
10.1.9. Adicionar con una micropipeta 10 µL de suspensión bacteriana (celdilla RB) a cada una de las celdillas de prueba (de la A1 a la A5) y agitar ligeramente para asegurar su correcta distribución en la solución.
Inmediatamente poner en funcionamiento el cronómetro ajustado para indicar el tiempo a los 5min y 15min.
10.1.10. Calibración del luminómetro.
Al sonar la primera alarma (5min), colocar la celdilla A1 (control) en el luminómetro y calibrar la lectura al 90% de la escala; posteriormente, registrar las lecturas de las celdillas A1 a la A5.
10.1.11. Realizar el procedimiento por duplicado de los incisos: 10.1.2. 10.1.5, 10.1.6., 10.1.7, 10.1.7.1, 10.1.9 y 10.1.1.10.
10.2. Prueba de fase sólida o sedimentos. La técnica para fase sólida o sedimentos.
La técnica para fase sólida permita la medición del efecto de tóxicos fuertemente adheridos a partículas sólidas en suelos y sedimentos. Este procedimiento permite el contacto de la bacteria con el complejo tóxico-partícula sólida.
Este procedimiento debe utilizarse en esta norma como una forma preliminar de evaluación de sedimentos, ya que el contacto de la partícula sólida con la bacteria siempre ocasiona reducción en la luminiscencia detectada aún cuando el sedimento no contenga tóxicos (respuesta falso positiva).
Algunos de los factores que pueden producir este efecto son: - Adsorción de las bacterias a las partículas sólidas.
- Efectos de sombra de las partículas en suspensión sobre la detección de bioluminiscencia.
- Floculación bacteriana.
Por lo anterior, es necesario preparar una muestra testigo para cada muestra problema, de acuerdo al inciso 9.1.6.
10.2.1. Procedimiento
10.2.1.1. Preparación de la celdilla R proceder conforme a los incisos 10.1.3. y 10.1.4. 10.2.1.2. Desarrollo de la prueba (ver figura 2)
este procedimiento debe realizarse tanto para la muestra problema como para la muestra testigo.
Introducir 15 tubos de ensaye (denominados a1, b1 a b5 y c1 a c5) para fase sólida en el soporte de tubos de ensaye y colocarlos en la incubadora con baño de recirculación a 15ºC; agregar 1 500µL de medio de dilución para fase sólida (ver inciso 7.1.2.4.) en cada uno de los tubos, excepto en el tubo c5.
Colocar en el tubo c5 la muestra preparada de acuerdo al inciso 9.1.6. cubrir con parafilm y agitar hasta obtener una suspensión homogénea (ver figura 2, paso 1).
Utilizar una pipeta de 1000µL a 5 000µL para mezclar y resuspender el contenido del tubo c5 llenando y vaciando la pipeta de 5 a 6 veces; mientras los sólidos están en suspensión transferir 1 500µL de éste al tubo c44; mezclar éste último. Transferir 1 500 µL del tubo c4 al c3, mezclar éste y repetir la operación hasta llegar al tubo a4.
Posteriormente, descartar 1 500µL del tubo a4 para igualar volúmenes. Los tubos a1, a2 y a3 son controles. Esperar 10 min para alcanzar la uniformidad térmica (ver figura 2, Paso 2) Proceder conforme a lo indicado en el inciso 10.1.9.
Poner en marcha un cronómetro de cuenta regresiva ajustado a 20 min, inmediatamente agregar 20µL de la suspensión bacteriana a cada uno de los 15 tubos en dirección a1 a a5, b1 ab5 y c1 a c5. Mezclar la muestra de cada tubo con una pipeta de 1 000 µL a 5 ... µL, succionando y vaciando ésta de 5 a 6 veces. Tres minutos antes de que termine la cuenta regresiva, insertar las columnas filtradoras en cada uno de los tubos, cuidando de que éstas no toquen el sobrenadante.
Una vez transcurridos los 20min, empujar suavemente las columnas en la muestra, debiéndose detener antes de llegar al nivel superior de los sólidos sedimentados; posteriormente, transferir 500µL del filtrado de la columna a la celdilla correspondiente en el sopor te de celdillas, en la misma dirección indicada en el inciso anterior, ajustar el cronómetro al tiempo de prueba (5min). Tiempo total de exposición: 25min (ver figura 2, paso 3)
Al sonar la alarma, colocar la celdilla A1, referida como control, en el luminometro y calibrar la lectura al 90%, posteriormente registrar las lecturas de las celdillas a1 a la c5. 10.2.2. Para el caso de muestras extremadamente tóxicas, tanto de agua como de sedimento, en las cuales no sea factible detectar bioluminiscencia, es indispensable preparar todas las diluciones necesarias, de acuerdo al inciso 10.2.3, para obtener el valor de CE50 consultar el
capítulo 11 de esta norma.
10.2.3. Preparación de diluciones.
Cualquier tren de diluciones puede funcionar; sin embargo, diluciones 1:10 son fáciles de efectuar. Par un volumen no mayor de las celdillas requeridas, se deben utilizar 250 µL de muestra y 2 250µL de medio de dilución para un volumen total de 2,5 µL. En caso de requerir diluciones mayores, preparar diluciones 1:1’’ y/ó 1:1 000.
Para la obtención del resultado, se debe considerar el factor de dilución utilizado. 10.3. Evaluación de sensibilidad.
El laboratorio que realice pruebas de toxicidad como photobacterium phosphoreum debe validar la sensibilidad del organismo utilizando cualquiera de los 2 tóxicos de referencia señalados en los incisos 10.3.3.1. y 10.3.3.2. de esta norma. Esto se debe llevar a cabo en cuando se presente alguno de los siguientes casos:
- Se observen anomalías en la respuesta. - Se inicie el uso de un lote de bacterias. - Se inicie el análisis de un lote de muestras.
10.3.1. Los tóxicos de referencia deben tener como principales características la siguientes: - Amplio espectro tóxico.
- Facilidad de obtención en forma pura - Alta solubilidad en agua
- Persistencia y estabilidad en solución - Estabilidad en almacenamiento - Facilidad de cuantificación.
10.3.2. La sensibilidad de Photobacterium phosphoreum se evalúa mediante la determinación de la CE50, empleando concentraciones establecidas de alguno de los tóxicos
de referencia sugeridos: fenol (C6H5-0H) y sulfato de zinc (ZnSO4). El método y las
condiciones de prueba, deben ser los descritos en la presente norma, de acuerdo al inciso 10.1.
