CCP-Ab ELISA
Inmunoensayo enzimático para de la determinación cuantitativa de
anticuerpos IgG contra péptidos cíclicos citrulinados (CCP) en suero o
plasma humano.
RE75791
96
2-8°C
I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 [email protected] D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com
1. USO PROPUESTO
El CCP-Ab ELISA es usado en la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG contra péptidos cíclicos citrulinados (CCP) en suero o plasma humano.
2. IMPLICACIONES CLÍNICAS
La artritis reumatoide (AR) se diagnostica en la mayoría de los casos mediante la determinación de factores reumatoideos (FR). El factor reumatoideo es un anticuerpo dirigido contra la región Fc de IgG. Aparece principalmente como un anticuerpo IgM, siendo menos frecuente como anticuerpo del subgrupo IgA o IgG.
Los factores reumatoideos están presentes en el suero del 70 – 80% de los pacientes que sufren artritis reumatoide, pero no es específico para AR ya que se encuentran también en personas sanas. La incidencia depende de la edad: para personas jóvenes es 1 – 4%, para personas mayores puede llegar hasta un 25%.
La ventaja de los anticuerpos CCP es una sensibilidad y especificidad más altas para el diagnóstico de artritis reumatoide en comparación con los factores reumatoideos. Los anticuerpos Anti-CCP se encuentran a menudo en un estadío muy temprano de la enfermedad y tienen un alto valor predictivo en el desarrollo de la enfermedad.
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO
En el primer paso, CCP AAb de la muestra diluida (así como de los estándares y del control) se adhieren a los péptidos cíclicos citrulinados fijados a la placa de microtitulación. Después de un periodo de incubación de 60 minutos a temperatura ambiente (TA) los componentes no adheridos son removidos mediante un proceso de lavado.
En un siguiente paso, los anticuerpos adheridos reaccionan con un conjugado conformado por anti-IgG humano acoplado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Luego de un periodo de incubación de 30 minutos (TA), el conjugado en exceso es removido por otro paso de lavado.
La HRP convierte el sustrato incoloro TMB agregado, en un producto de coloración azul. Luego de 15 minutos de incubación a TA, la reacción enzimática es detenida mediante la adición de una solución ácida, y el color vira de azul a amarillo. La absorbancia del producto resultante es medida dentro de los 30 minutos siguientes a 450 / 620 nm. La densidad óptica (DO) obtenida es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos fijados en la microplaca.
4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional.
2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo.
3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación.
4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos.
5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario.
6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL.
7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad 8. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 9. Mientras no sean usados, todos los reactivos deben ser mantenidos a 2 -8 °C en el envase original. 10. Algunos de los reactivos contienen pequeñas cantidades de Timerosal (< 0.1 % p/v) y Kathon
11. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-HIV I/II, HBsAg and anti-HCV. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación.
5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Permitir a la microplaca sellada alcanzar la temperatura ambiente por al menos 30 minutos antes de abrirla. Los pocillos sin usar deben mantenerse refrigerados y protegidos de la humedad en el envase original; así pueden usarse hasta por 8 semanas.
La solución de IgG anti humana-HRP es estable hasta por 8 semanas a 2-8°C después de abierta. Evitar la exposición del sustrato (E) a la luz. La fecha de expiración de cada componente se indica en su respectiva etiqueta, la del kit completo en la etiqueta de la caja. Una vez recibido el kit CCP-Ab ELISA, todos sus componentes deben mantenerse a 2 - 8 °C, preferentemente en la caja original. La micro-placa viene sellada al vacío en una bolsa de aluminio con desecante.
6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Suero, Plasma
Las precauciones habituales para venipunctura han de ser tenidas en cuenta. Es importante conservar la integridad química de un especímen sanguíneo desde el momento de la obtención hasta que es analizado. No utilizar especímenes hemolíticos severos, ictéricos o lipémicos severos. No utilizar especímenes que contengan NaN3 o Timerosal ya que puedan llevar a resultados falsos. Las muestras que presenten
turbidez deben ser centrifugadas antes del ensayo para eliminar cualquier partícula de materia Almacenamiento: 2-8 °C -20 °C (Aliquots)
Estabilidad: < 3 d > 3 d
Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Evite congelar y descongelar repetidamente.
7. MATERIALES SUMINISTRADOS
CCP-Ab ELISA ha sido diseñado para 96 determinaciones, lo cual es suficiente para el análisis por duplicado de 42 muestras desconocidas, los correspondientes estándares y suero de control.
Cantidad Símbolo Componente
1 x 12 x 8 MTP Placa de Microtitulación
Tiras separables. Cubiertos con péptidos citrulinados sintéticos.
1 x 15 mL ENZCONJ
Conjugado Enzimático IgM
Listo para usar. Contenido: : IgM anti humano (oveja) peroxidasa de rábano
picante (HRP) complejo
5 x 1 mL CAL
Estándar 1-5
Listo para usar. Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado CQ.
1 x 1 mL CONTROL+ Control Positivo Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado CQ.
1 x 1 mL CONTROL-
Control Negativo
Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado CQ.
1 x 100 mL SAMPLEDIL Diluyente de Muestras
Listo para usar.
1 x 100 mL WASHBUF CONC Solución Buffer de LavadoSuficiente para 1000 mL. , Concentrado (10x )
1 x 15 mL TMB SUBS Solución de Substrato TMB
Listo para usar. Contenido: 3,3´,5,5´-TMB, peróxido de hidrógeno.
1 x 15 mL TMB STOP Solución de Parada TMB
Listo para usar. Contenido: 0.25 M ácido sulfúrico.
El CCP-Ab ELISA es calibrado artificialmente y las concentraciones de anti-CCP son por lo tanto expresadas en U/mL. Estas unidades muestran un factor constante (1:12) respecto a la Referencia estándar W1066 de la Organización Mundial de la Salud (WHO) para factor reumatoide.
8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Pipetas 5 - 1000 µL
2. pipeta multicanal puntas de pipeta descartables 3. cuba de lavado o lavador de microplaca
4. Lector de microplaca con filtros ópticos para 450 nm y 620 nm o 690 nm 5. Cilindros graduados
6. Agua destilada o desionizada 7. Papel absorbente o toallas de papel
8. Tubos (2 mL) para dilución de muestra 9. Papel de aluminio
9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO
1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados.
2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 °C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma.
3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos.
4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo.
5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa.
6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales.
7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos.
8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante.
10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO
10.1. Preparación de componentes liofilizados o concentrados
Diluya /
disuelva Componente Diluyent Relacíon Notas Almacenamiento Estabilidad
50 mL WASHBUF CONC con
450 mL Agua destilada 1+ 9 Para disolver los cristales, temple hasta 37 °C. 2-8 °C up to 30 days
10.2. Dilución de Muestras
Muestra para ser diluído con Relacíon Notas
Suero y
plasma generalmente SAMPLEDIL 1+100 e.g. 5 µL diluida + 500 µL SAMPLEDIL
11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
1. Pipetee 100 µL de cada estándar, control y muestras diluída en los pocillos respectivos de la Placa
de Microtitulación.
2. Cubre la placa con folio adhesivo. Incube 60 min a TA (18-25 °C).
3. Remueva totalmente el exceso de la solución, golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un
toalla de papel. Lave la placa 3 x con 300 µL de Solución Buffer de Lavado diluída con 5 seg de
humectación cada vez.
4. Pipetee 100 µL de Conjugado Enzimático en cada pocillo. 5. Cubre la placa con folio adhesivo. Incube 30 min a TA (18-25 °C).
6. Remueva totalmente el exceso de la solución, golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un
toalla de papel. Lave la placa 3 x con 300 µL de Solución Buffer de Lavado diluída con 5 seg de humectación cada vez.
7. Para la adición del Substrato y Solución de Parada utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La
adición de substrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen.
8. Pipetee 100 µL de Solución de Substrato TMB en cada pocillo y agitar un poco. 9. Incube 15 min a TA (18-25 °C) en la oscuridad.
10. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µL de Solución de Parada TMB en cada pocillo.
Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo.
11. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm)
dentro de los 30 min de haber agregado la Solución de Parada.
12. CONTROL DE CALIDAD
The test results are only valid if the test has been performed following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All kit controls must be found within the acceptable ranges as stated on the vial labels. If the criteria are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls.
In case of any deviation the following technical issues should be proven: Expiration dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods.
13. CÁLCULO DE RESULTADOS
Evaluación cuantitativamente
La curva estándar se establece graficando el promedio de los valores de la DO de los estándares 1-5 en el eje de las ordenadas (eje y, escala lineal), frente a las concentraciones respectivas de anticuerpos CCP-Ab en el eje de las abscisas (eje x, escala logarítmica).
La concentración de anticuerpos CCP-Ab en los controles y en las muestras se obtiene directamente por extrapolación en U/mL a partir de los valores obtenidos de DO. No es necesaria una posterior corrección por dilución.
La determinación de las concentraciones de los anticuerpos CCP-Ab puede ser llevada a cabo con la asistencia de un software de análisis adecuado integrado al equipo de fotometría.
Curva de Calibración Típica
(Ejemplo. ¡No usar para el cálculo!)
Estándar DO (a) DO (b) DO (media) U/mL 1 0.037 0.043 0.040 1 2 0.304 0.285 0.295 20 3 0.514 0.551 0.533 40 4 1.771 1.589 1.680 400 5 2.631 2.284 2.458 2000 Muestra diluída 1.024 1.019 1.022 103
Las muestras con una DO mayor que el estándar 5 deben diluirse con el diluyente de muestra y la concentración de anticuerpos CCP debe calcularse con el factor de dilución aplicado.
14. INTERPRETACION DE RESULTADOS
CCP-Ab ELISA
Intervalo Interpretación
< 30 U/mL negative ≥ 30 U/mL positive
Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico.
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos de referencia normales y patológicos para niveles de anticuerpos anti-CCP en suero, como se hace generalmente para otros parámetros de diagnóstico. Por lo tanto, los datos mencionados arriba sólo dan una guía de los valores que podrían esperarse.
15. VALORES ESPERADOS
Los resultados obtenidos con individuos sanos deberán dar negativos usando CCP-Ab ELISA. Sin embargo, los autoanticuerpos CCP pueden también estar presentes en personas aparentemente sanas.
16. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Linealidad
Con base en la naturaleza heterogénea de la población de autoanticuerpos y en teniendo en cuenta la especificidad y afinidad por epitope de los autoanticuerpos, los valores teóricos esperados por dilución con suero humano libre de anti-CCP corresponden muy a menudo con las concentraciones medidas.
Especificidad y sensibilidad
Los resultados disponibles muestran una sensibilidad clínica de 79% a una especificidad de 97% para el diagnóstico de artritis reumatoide.
Límites de detección
La sensibilidad analítica (límite de detección más bajo, 0 + 3 SD) se estableció en 1.2 U/mL. La sensibilidad funcional fue medida como 20 % del CV inter ensayo a alrededor de 2 U/mL.
Variación intra e inter ensayo
Intra-ensayo Inter-ensayo Muestro no. Concentración promedio (U/mL) CV (%) Muestro no. Concentración promedio (U/mL) CV (%) 1 29 7 6 2.5 8 2 39 3 7 91 6 3 147 7 8 209 8 4 572 5 9 1140 11 5 870 6 10 1737 9
17. ESQUEMA DE ENSAYO
Llevar todos los componentes a temperatura ambiente. Mezclar suavemente todos los reactivos para asegurar la homogeneidad. Diluir todas las muestras 1 + 100 (v/) con diluyente de muestras.
Paso Actividad Material Estándares Control Muestras diluidas
de patientes 1, 2 etc.
1 Pipetee Muestras 100 µL 100 µL 100 µL
2 Incubar Placa 1 hora a TA (18-25 °C)
Aspirar o decantar put sharply onto absorbent tissue
3 Pipetee Solución de lavado 3 x 300 µL 5 segundos c/u 3 x 300 µL 5 segundos c/u 3 x 300 µL 5 segundos c/u
4 Pipetee IgG
Anti-Humana - HRP
100 µL 100 µL 100 µL
5 Incubar Placa 30 minutos a TA (18-25 °C)
Aspirar o decantar put sharply onto absorbent tissue
6 Pipetee Solución de lavado 3 x 300 µL 5 segundos c/u 3 x 300 µL 5 segundos c/u 3 x 300 µL 5 segundos c/u 7 Pipetee Sustrato 100 µL 100 µL 100 µL
8 Incubar Placa 15 min at RT (18-25 °C) in the dark
9 Pipetee y mezclar Solución Stop 100 µL 100 µL 100 µL
10 Medir DO a 450 nm versus 620 nm (o 690nm) dentro de los 30 minutos siguientes
18. PRODUCT LITERATURE REFERENCES
1. Zendman A. J. W. et al. Use and significance of anti-CCP autoantibodies in rheumatoid arthritis. Rheumatology 2006;45:20–25 (2005)
2. Smith JB et al. Rheumatoid arthritis - a molecular understanding. Ann Intern Med 136: 908-922 (2002).
3. Schellekens GA et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum 43: 155-163 (2000).
4. Schellekens GA et al. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 101: 273-281 (1998).
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbHFlughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany
Tel.: + 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11 E-MAIL: [email protected] WEB: http://www.IBL-International.com IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.: +1 (416) 645 -1703 Fax: -1704 E-MAIL: [email protected] WEB: http://www.IBL-International.com
LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
