ì
ALICIA HERNANDEZ
C O L A B O R A D O R E S
CONTENIDO
Prólogo... ix Pr e s e n t a c ió n... x i GENERALIDADES Objetivos ... 2 ANTCÇB3ENT1S HjglpRlCO S ... , ... 3La era antes de Pasteur ... i
Louis Pasteur y sus investigaciones ... 4
La era después de Pasteur ... 5
Las levaduras... 7
Los mohos ... g 1 -a* hartonas ... 8
Ejercicios de autoevaluación... 9
Fuentes y lecturas recomendadas ... 11
Catxiutoi: EL MANEIO DE LOS CULTIVOS M O O B IO IÓ G IC O S Objetivos ... 14
IN l-K Q P U C C lÓ N —... • . ■ . . * 1 3 El aislam ien to de m icroorganism os ... 16
Los cultivos puros y los mixtos ... 16
Las técnicas para obtener cultivos puros ... 17
La siembra en placas de Petri por rayado ... 17
La siembra en placa vertida ... 17
Las diluciones en serie ... 1S La desecación ... 19
La congelación... 20
La congelación ordinaria ... 20
La congelación ultrafria ... 20
La congelación con nitrógeno líquido ... 21
Ul r of i l i zadán. * . . . . a . .____ 21
XV
La fuente de energía ... 22
La fuente de carbono ... 22
La fuente de nitrógeno ... 23
Las fuentes de otros elementos ... 2á LOS REQUERIMIENTOS AMBIENTALES ... 24
La preparación pe medios de cultivo ... 25
Los tipos de medios de cu ltiv o s... 25
El medio sintético ... 25
El medie complejo ... 25
La formulación áe medios de cultivo - ... 26
U.£REFAKAa(>N.D£LiMX:ULQ-.^..,..^^x...^^., ^ ^ . . . . 2Z Las etapas para preparar el inoculo ... 27
La recuperación de la cepa ... 27
El crecimiento en un medie de cultivo sólido ...____ 28 El crecimiento en un medio de cultivo liquido ... 28
Los aspectos por considerar en la preparación del in ó cu lo ... 28
La cantidad de inóculo ... 2& La concentración de microorganismos... 28
Ejercicios de autoevaluación... 31
Fuentes y lecturas recomendadas ... 33
Guxtub3: LAS FERMENTACIONES UÜfCltVOS . . . ♦ • * ... 36
37 El concepto bioquímico de fermentación ... 37
El concepto microbiológico de fermentación ... 38
I a r i asificactO n df. i ¡ns procesos df ffrmfntA< TQm ... 38
Los productos finales de la fermentación ... 39
El oxígeno en el proceso de fermentación ... 39
Las rutas bioquímicas de las fermentaciones ... 40
Laglucólisis ... 40
F1 rielo de Krebs ... 41
Los fh rm fn tad o rrs ... 42
El matraz erlenmeyer ... 43
El reactor de tanque agitado ... 43
El sistema de agitación ... 44
Las placas deflectoras ... 45
Los dispositivos de adición, extracción v control ... 45
El sistema de aireación ... 45
Los sistemas de transferencia de calor ... 45
El reactor d e elev ación con aire 46 El reactor de d isco rotatorio ... 46
LOS SISTEMAS DF. FERMENTACIÓN ... 47
La curva de crecimiento de un microorganismo ... 47
La fase de latericia ... 47
La fase logarítmica o exponencial ... 47
XVI
La fast’ estacionaria 48
El efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de crecimiento . . . 48
Algunos términos relacionados con la ecuación de Monod ... 48
La ecuación de Monod ... 49
El cultivo en lote ... 50
El cultivo continuo ... 50
El quimiostato ... 51
El turbidostato ... 52
El sistema de flujo tapón ... 52
Las ventajas y las desventajas del cultivo continuo en relación con el cultivo en lote ... 53
I A RFC I TPFRAClO V Y 1 A Pl FRIFIC A n ^ V I OS PROni IfTTK ... ... 53
La separación liquido-sólido ... 54 La filtración ... 54 La centrifugación ... 55 La floculación y la flotación ... 56 La desintegración celular ... 56 La extracción líquido-líquido ... 56 La cristalización... 57 La cromatografía ... 57
Ejercicios de autoem luación... 59
fuentes y lecturas recomendadas... 61
cuítalo 4: LOS PRODUCTOS LÁCTEOS Objetivos ... 64
In tr o d u c c ió n... 65
ElYOGUR ... 66
Definición ... 66
Historia ... 67
Los tipos de yogur ... 67
El proceso de elaboración del vogur batido ... 68
La ntaieria prinui ... 68 La estandarización ... 68 La homogeneización ... 69 La pasteurización ... 69 El enfriamiento pospasteurización ... 70 La inoculación y la fermentación ... 70 El enfriamiento posfermentación ... 70
La agitación y la adición de frutas ... 71
El em paque... 71
El proceso de elaboración de yogur firme ... 71
La producción de "yogur" en forma casera ... 71
La microbiología y la bioquímica de la fermentación del yogur ... 72
Aspectos nutricionales del yogur ... 73
LOSOUtSOS ... 74
Las características del queso ... 74
_______ XVII
Los tipos de q u e so s... 74
El proceso general de elaboración de quesos ... 75
La materia prima y la estandarización ... 75
La pasteurización ... 76
La inoculación y ¡a fermentación ... 76
La coagulación ... 77 El desuerado o escurrimiento ... 77 El moldeo y el prensado ... 78 El salado ... 78 La maduración ... 78 L a n a t i l l a ... 80 Definición ... §0
El proceso de elaboración de la natilla ... 80
La materia prima y la estandarización ... 80
La homogeneización ... 80 La pasteurización ... 80 La inoculación y la fermentación ... 81 El enfriam iento... 81 El em paque... 81 El suero de queso ... 81 Los PROB1ÓT1COS ... 82
Las ventajas del uso de los productos probióticos ... 82
Los requisitos de los microorganismos probióticos ... 83
Ejercicios de autoew luaáón... 85
Fuentes y lecturas recomendadas ... 87
úpjhifa 5 LOS EMBUTIDOS FERMENTADOS Objetivos ... 90
INTRODUCCIÓN... 21
LOS EMBUTIDOS FERMENTADOS ... 92
El PROCESO GENERAL DE ELABORACIÓN DE UN EMBUTIDO FERMENTADO ... 22
La selección de la carne y la grasa ... 94
La co n g elació n ... 94
El picado de las materias primas ... 94
La adición de otros ingredientes ... 95
La adición del cultivo iniciador ... 95
El embutido. ^ ^ ^ ^ . ^ . 96 La fermentación y el ahumado ... 96
El secado ... . ... 22
LA MICROBIOLOGÍA Y LA BIOQUÍMICA PE LA FERMENTACIÓN DE EMBUTIDOS ... 97
El proceso de fermentación de los embutidos ... 97
Los microorganismos involucrados en el proceso de fermentación de los embutidos ... 98
El .desarrollo del color e n lo s em bu tid os., « ______ «....»...____ IDO Los ERQCESQS ESPECIFICOS D£BJiBÜlL\QÚN±)E DOS lili El salami duro ... ., ...« . . , ,... 101
El peppenm i... 102
XVIII
Ejercicios de autoevaluación . ..
Fuentes y lecturas recomendadas
103 105
CwMot: LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS
In tro d u c c ió n... 109
F1 alcohol Phlirn nn es solo una bebida 109 Los tipos de bebidas alcohólicas ... 110
Los microorganismos termentadores ... 112
La CERVEZA ... 113
Las materias primas ... 114
La malta ... 115
Los adjuntos ... 116
El lúpulo ... 116
La levadura ... 117
El a g u a... 117
El proceso de elaboración de la cerveza ... 118
La molienda de la malta ... 118
La macerarían ... 119
La filtración ... 120
_ J 2 1 La separación de precipitados (Whirlpool) ... 122
El enfriamiento del mosto ... 122
La aireación del mosto y la inoculación de la levadura ... 122
La fermentación ... 123
La separación de la levadura ... La maduración ... 125 125 La filtración y la carbomtación de la cerveza ... 126
El llenado y la pasteurización ... 128
El deterioro de la cerveza ... 128
El deterioro microbiológico ... 128
El deterioro químico ... 129
129 Los últimos desarrollos tecnológicos... 129
En nuestro país ... 130
El vino ... 130
Las materias prim as... 132
La uva ... 132
La levadura ... 134
El proceso de elaboración del vino ... 135
La vendimia ... 135
La eliminación de ¡os tallos y las ramas. Trituración ... 136
El prensado déla uva ... 137
El tratamiento del mosto de uva ... 13Z La fermentación ... 139
El trasiego del v in o... 143 La maduración de los mim . . . ___1M
________ XIX
La clarificación y la filtración ... 144
El embotellado ... 145
Otros vinos ... 146
Los vinos de postre ... 146
Los vinos espum osos... 146
Los defectos y las enfermedades del v in o ... 148
En nuestro país ... 150
Ejercicios de autoei<aluación... 151
Fuentes y lecturas recomendadas ... 153
cwirt.7 LA PRODUCCIÓN DE VINAGRES Y VEGETALES FERMENTADOS Objetivos ... 156
In tr o d u c c ió n ... 157
La p rod u cción de v in ag re ... 158
Aspectos generales ... 158
El proceso de elaboración de vinagre a partir de frutas ... 159
La preparación de la fr u t a... 160 El tratamiento térmico ... 160 La inoculación ... 160 La fermentación alcohólica ... 160 La eliminación de la levadura ... 161 la fermentación acética ... 161 La pasteurizaáón ... 162
Los métodos para obtener vinagre ... 162
El método de Orleans ... 162
El método de la acetificación sumergida ... 163
El repollo ácido o sauerkraut ... 164
El acondicionamiento ... 165 El picado ... 165 La adición de sal ... 165 El prensado ... 166 La fermentación láctica ... 166 El tratamiento térmico ... 166 El empacado ... 166 Los encurtidos—... 167 El acondicionamiento ... 1ÉZ La prcfmración de la salmuera ... 168
La fermentación de los vegetales ... 168
Las operaciones postenores a la fermentación ... 168
La preparación del medio ... 169
La mezcla de iv¡(e tales con el medio preparado ... 169
El empaque y el enfriamiento ... 169
Ejercicios de autoevaluación... 171
Fuentes y lecturas recomendadas ... 173
XX
Optobe: LA PANIFICACIÓN
Objetivos ... iNrrRonirrrií'W ...
176 177 LOS INGREDIENTES UTILIZADOS
EN LA ELABORACIÓN DEL PAN ... 178
La levadura ... 178 La harina de trigo ... 179 _ m El azúcar ... 181 El agua ... A-iI ... 182 La grasa ... 182 Otros ingredientes ... El proceso de elaboración del p a n ... La reconstitución de la levadura ... F1 mpyrladn o el amasado ... 182 182 182 183 í j i ferm entación... 183
El cortado y el formado de la masa ... 184
El horneado ... 184
Ejercicios de autoevaluación... Fuentes y lecturas recomendadas ... ■ ■ ■ — 187 189 c*/Wo9 LA PROTEÍNA UNICELULAR Y OTROS PRODUCTOS UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Objetivos ... 192
Introducción 193 La p rod u cción de p roteín a u n ic e lu la r ... 193
La selección de microorganismos para producir la P U C ... 194
El valor nutricional y la calidad de la PUC ... 195
La digestibilidad ... La condición de patógeno y la toxiadad ... La velocidad de creamiento específico ... El sustrato utilizado ... Las condiciones del m ed io... 196 196 196 1% 196 197 La forma de crecimiento del microorganismo ... 197
La recuperación de la PUC ... 197
El proceso general de elaboración de la PUC ... 197
La materia prima ... 198
La inoculación y la fermentación ... 198
La recuperación del producto ... 198
Los usos de la PUC ... 199
Las ventajas y las desventajas de la PUC ... 199
Las ventajas ... 199
Las desventajas... 200
La producción de hongos comrstjbi.e s ... 201
La producción de setas u hongos de sombrero ... 201
La producción de hongos por fermentación en sustrato sólido ... 202
________ XXI
La producción de ácidos o r g á n ic o s... 204
El ácido cítrico ... 204
El ácido glucónico ... 204
El ácido lá ctico ... 205
L a p rod u cción de am inoácidos ... 205
UrRODUCClÓN DE ENZIMAS ... >... M La obtención de la fructosa y la glucosa, a partir del almidón ... 208
1.a lirupfarrión ... 208
L a^ acariñ cad ón -.... ^ =___ 208 La isomerizarión ... 2Q§ Ejercidos de autoevaluación... 211
Fuentes y lecturas recomendadas ... 213
C**futo io: EL TRATAMIENTO BIOTECNOLÓGICO DE L05 DESECHOS SÓLIDOS Y LAS AGUAS RESIDUALES Objetivos ... 176
In tr o d u c c ió n... 217
Fundam entos te ó ric o s ... 2J8 El proceso aerobio de biodegradadón ... 219
La biodegradadón de los carbohidratos ... 220
La biodegradadón de los triglicéridos ... 220
La biodegradadón de las proteínas ... 220
La biodegradadón de ¡a lignina ... 221
El proceso anaerobio de biodegradadón ... 221
La hidrólisis ... 222
La acidogénesis ... 222
La acetogénesis ... 222
La metanogénais ... 223
El impacto de la materia blodegradable en el ambiente ... 223
LOS TRATAMIENTOS DE DESECHOS SÓLIDOS BlODECRADABl.ES ... 224
Los tratamientos aerobios de desechos sólidos biodegradables: compostajes . ■ 225 Las tecnologías industriales de compostaje ... 228
Las técnicas artesanales de biodegradadón ... 229
Los tratamientos anaerobios de desechos sólidos biodegradables ... 230
Las condiciones ¡meas y químicas del proceso... 231
Las etapas del proceso biffeico ... 231
LOS TRATAMIENTOS DE AGUAS RESIDUALES ... 232
Los tratamientos aerobios de aguas residuales ... 235
Riego ... 235
Biomasa inmovilizada... 236
Lodos adivados ... 238
Los tratamientos anaerobios de aguas residuales ... 239
Reactores de lecho f i j o ... 240
Reactores de lecho expandido . . . . ... 240
Biorreactor de flujo ascendente con lecho de lodo ... 240
O tra s co n sid eracio n es ... 241
Ejerddos de autoevaluación... 243
Fuentes y lecturas recomendadas ... 245
A nexos... 247
RESPUESTAS A LOS EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN ... 251
XXII
Elementos didácticos de apoyo
Cuadro 1.1; Algunos tipos de levaduras utilizadas industrialmente... 7
Cuadro 1-2: Algunos ejemplos de mohos utilizados industrialmente... 8
Cuadro 1.3: Algunos ejemplos de bacterias utilizadas industrialmente 8 Cuadro 2.1: Algunas colecciones microbianas en el mundo... 18
Cuadro 22: La composición promedio de Pharmamedia... 23
Cuadro 23: Algunos factores de crecimiento requeridos por los microorganismos... 24
Cuadro 2.4: La composición de un medio sintético... 25
Cuadro 15: La composición de un medio com plejo... 26
Cuadro 2.6: La composición promedio típica de los microorganismos... 26
Cuadro 3.1: Algunos compuestos de interés comercial producidos por fermentacián... 39
Cuadro 4.1: La composición promedio de la leche de vaca ... 65
Cuadro 4.2: Ejemplos de quesos madurados y frescos... 75
Cuadro 4.3: Diferentes tipos de queso y sus cultivos iniciadores ... 76
Cuadro 4.4: La composición promedio del suero de q u e s o ... 82
Cuadro 5.1: Algunos embutidos fermentados (secos y semisecos) ... 93
Cuadro 5.2: Algunos microorganismos utilizados en la obtención de fermentación embutidos fermentados... 99
Cuadro 6.1: Ejemplos de clasificación de las bebidas alcohólicas ... 111
Cuadro 6.2: Los principales congenérieos presentes en las bebidas alcohólicas .. 111
Cuadro 6.3: Distintos tipos de cerveza en el mundo: sus nombres y características... 114
Cuadro 6.5: Los parámetros recomendados para las uvas destinadas a la elaboración de vinos . . . ... 134
Cuadro 6.6: Algunos agentes utilizados en los procesos de clarificación y filtración de v i n o ... 145
Cuarlm fi.7:____I m dpfprtrw del v in o ... 148
Cuadro 6.8:____Las enfermedades del v in o ... 149
Cuadro 7.1: La clasificación de los vinagres, con base en la materia p rim a 159 Cuadro 7.2: Los tiempos de fermentación para diferentes vegetales... 168
Cuadro 73: La formulación de un medio para encurtidos... 169
Cuadro 8.1: La formulación del pan cuadrado ... 178
Cuadro 8.2: La composición química de algunas m elazas... 178
Cuadro 8.3: La composición química aproximada del grano de trig o... 180
Cuadro 8.4: La composición de la harina de trigo con diferentes grados de extracción... 180
Cuadro 8.5: La clasificación y aplicación de las harinas de trigo, de acuerdo con el contenido de proteínas... 180
Cuadro 9.1: Algunos microorganismos utilizados para la producción de PUC y los sustratos en los que crecen ... 195
Cuadro 9.2: Las características que se deben considerar al seleccionar el microorganismo para producir P U C ... 195
_______ XXIII
Cuadro 9.3: Cuadro 9.4: Cuadro 9.5: Cuadro 10.1: Cuadro 10.2: Cuadro 103: Cuadro 10.4: Cuadro 10.5: Cuadro 10.6: Cuadro 10.7: Cuadro 10.8: Cuadro 10.9: Cuadro A.10.1: Cuadro A.10.2: Cuadro A. 10.3: Diagrama 3.1:
El contenido proteico de varias fuentes ... 199
Algunos hongos comestibles ... 201
Enzimas de interés industrial obtenidas por fermentación... 207
La clasificación de los desechos biodegradables... 217
Las condiciones recomendables de) sustrato para el proceso de compostaje ... 225
Las características deseables de la composta... 227
El contenido de las compostas que producen buen rendimiento de sorgo... 227
Las concentraciones máximas permitidas de metales pesados en la composta (en países de la Unión Europea)... 228
La productividad de biogás, según la materia prim a... 232
La frecuencia mínima de muestreo y los análisis para aguas residuales de tipo ordinario y especia)... 233
Los límites máximos permisibles para el vertido de aguas residuales en el alcantarillado o en cuerpos de a g u a 234 Comparación entre los procesos aerobios y anaerobios de depuración de aguas residuales ... 235
Los límites máximos permisibles para el vertido de aguas residuales al alcantarillado sanitario... 247
Los límites máximos permisibles para el vertido de aguas residuales en cuerpos de agua... 248
Las concentraciones máximas permisibles de contaminantes por tipo de actividad... 249
Las principales partes de un reactor de tanque agitado... 44
Las placas deflectoras en un reactor de tanque agitado... 45
Los sistemas de transferencia de calor en un reactor de tanque agitado... 46
Un reactor de elevación con aire ... 46
Un reactor de disco rotatorio ... 46
El sistema de fermentación de tipo quimiostato... 51
Un reactor de flujo tapón ... 53
El filtro p re n sa ... 54
El filtro rotatorio ... 55
La centrífuga de d isc o s... 56
Una máquina para picar la ca rn e ... 95
Un molino de m alta... 118
Los maceradorcs involucrados en la infusión con doble macerador 119 Un lauter... 121
Una olla de ebullición... 121
Un uni tan qu e... 123
Dos tipos de filtros utilizados para clarificar la cerveza... 127
Una prensa horizontal de tomillo ... 137
Una cuba de madera para la fermentación y la maduracián del vino ... 140
Un tanque de fermentación de acero inoxidable para la fermentación y la maduración del vino ... 140
Sección longitudinal de un tanque rotatorio (Roto-tank) ... 143 Diagrama 32: Diagrama 3.3: Diagrama 3.4 Diagrama 3.5 Diagrama 3.6 Diagrama 3.7 Diagrama 3.8 Diagrama 3.9 Diagrama 3.10: Diagrama 5-1 Diagrama 6.1 Diagrama 6.2 Diagrama 6.3 Diagrama 6.4 Diagrama 6.5 Diagrama 6.6 Diagrama 6.7 Diagrama 6.8 Diagrama 6.9: Diagrama 6.10: xxrv
Copyrighted material
Diagrama 7.1: El acetificador Frings... 164
Diagrama 7.2: Un cavitador... 164
Diagrama 10.1: Lechos sumergidos ... 237
Diagrama 10.2: El sistema de filtro por g o te o ... 237
Diagrama 10.3: Los sistemas de incorporación de aire en procesos con lodos activados... 238
Diagrama 10.4: Un biorreactor de fosa (Cía. ICI) ... 238
Diagrama 10.5: Un biorreactor de torre (Cía. Bayer)... 239
Diagrama 10.6: Un biorreactor de lecho fijo ... 240
Diagrama 10.7: Un biorreactor de lecho expandido ... 240
Diagrama 10.8: Digestor anaerobio de flujo ascendente, con capa de sedimento . . . 241
Esquema 2.1: La clasificación de los microorganismos, con base en la fuente de energia que u tilizan... 22
Esquema 3.1: La secuencia de reacciones de la glucólisis... 41
Esquema 3J2: El ciclo de Krebs... 42
Esquema 3.3: Los sistemas de operación de cultivo continuo... 51
Esquema 4.1: Las etapas del proceso de elaboración del yogur b a tid o ... 68
Esquema 4.2 Las etapas del proceso de elaboración del q u e s o ... 75
Esquema 4.3: Las etapas del proceso de elaboración de la natilla ... 80
Esquema 5.1: Clasificación general de los embutidos con base en rl tratamiento térmico... —____ _____ 92 Esquema 5.2: Las etapas del proceso general de elaboración de un embutido fermentado... 94
Esquema 5.3: La formación de los compuestos responsables del color en los embutidos ... lili Esquema 5.4: Las etapas del proceso de elaboración del salami d u ro ... 101
Esquema 5.5: Las etapas del proceso de elaboración del pepperoni ... 102
Esquema 6.1: Las etapas del proceso general de elaboración de la cerveza ... 118
Esquema 6.2: Una linea de llenado de botellas ... 127
Esquema 6.3: Las etapas de los procesos de elaboración de los vinos blanco y tinto ... 135
Esquema 6.4: La producción de champán en grandes recipientes... 147
Esquema 7.1: Las etapas del proceso de elaboración de vinagre a partir de una fruta ... 159
Esquema 7.2: Las etapas del proceso de elaboración del sauerkraut... 165
Esquema 73: Las etapas del proceso de la elaboración de un encurtido fermentado... lóZ Esquema 8.1: Las etapas del proceso de elaboración de pan ... 182
Esquema 9.1: Las etapas del proceso de elaboración de proteina unicelular para alimentación a n im a l... 198
Esquema 9.2: Las etapas del pnyeso de elaboración de tempe ... 203
Esquema 93: Las etapas para la obtención de jarabe de fructosa a partir de almidón, por medio de enzimas ... 209
Esquema 10.1: El reciclaje de materiales en la naturaleza... 218
Esquema 10.2: El flujo de materiales en la sociedad de economía lin ea l... 219 Esquema 10.3: El flujo de materiales en una economía de recirculadón
de materiales, en la que el entorno social y natural son congruentes 219
________XXV
Esquema 10.4: La secuencia de biodegradadón de productos
por diferentes microorganismos... 222
Esquema 105: La formarión de gas metano mediante biodegradadón anaerobia . . 223
Esquema 10.6: Las etapas del tratamiento anaerobio bifásico de desechos sólidos . 232 Esquema 10.7: Las etapas del tratamiento biológico de aguas residuales... 234
Figura 2.1: La siembra en placa de Petri por rayado... 17
Figura 2.2: La siembra en placa vertida ... 17
Figura 2.3: El equipo utilizado para resiembra ... 19
Figura 3.1: Algunos productos que se pueden formar a partir del piruvato 40 Figura 3.2: Erlenmeyers utilizados en procesos de fermentación... 43
Figura 3.3: Los tipos de paletas utilizados en los impulsores... 45
Figura 4.1: Un cultivo de microoiganismos para la preparadón de yogu r 70 Figura 4.2: El corte de la cuajada del coágulo en la fabricadón de q u eso s 77 Figura 43: La perforación de quesos para el desarrollo de hongos... 79
Figura 6.1: La espiga y el grano de cebada... 115
Figura 6.2: La inflorescenda femenina del lúpulo... 116
Figura 6.3: El radmo de unas y la u v a ... 132
Figura 7.1: Un densímetro o hidrómetro ... 168
Figura 8.1: Las partes de un grano de tr ig o ... 179
Figura 10.1: Las dimensiones recomendables de cúm ulos... 225
Figura 10.2: Máquinas para voltear cúmulos de composta ... 229
Figura 10.3: La segmentadón de una vermicompostera... 230
Fotografía 3.1: Un reactor de tanque agitad o... 44
Fotografía 6.1: Diferencia entre el vino clarificado y sin clarificar... 144
Gráfico 1.1: La reladón entre el comportamiento de la concentradón celular (crecimiento) y la concentración de metabolitos, a través del tiempo 7 Gráfico 3.1: La curva de crecimiento de un microorganismo... 47
Gráfico 3.2:_____El efecto de la concentración de sustrato limitante sobre la veloddad de crecimiento de un microorganismo... 49
Gráfico 4.1: La influenda de la temperatura sobre la proporción de las espedes al final de la fermentación, en un cultivo de yogur . 73 Gráfico 4.2: La influencia de la cantidad de inóculo y el tiempo sobre la propordón de las especies al final de la fermentación, en un cultivo de yogur ... 73
Gráfico 6.1: Ejemplo de una curva de maceradón ... 121
Gráfico 6.2: Ejemplo de una curva de fermentación para la cerveza la g e r... 125
Gráfico 10.1: La evolución promedio de la temperatura de desechos biodegradables, tratados por compostaje (en un cúmulo de cincuenta centímetros de a ltu ra )... 226
llustradónó.l: Vista parcial del cuarto de cocimiento... 122
Ilustración 6.2: Unitanques de fermentadón y maduración ... 124
llustradón 6.3: Dos tipos de filtros utilizados para clarificar la cerveza... 126
Ilustración 6.4: Sección de la línea de llenado de latas . . . ___ 128 ilustración 6,5 ; Una linea de embotellado de vino , , , _____________ __ ,____140 llustradón 9.1: Agaricus btsporus... 202
XXVI
CAPÍTULO 1
GENERALIDADES
S u m a r i o
Antecedentes históricos
Los microorganismos utilizados industrialmente
OBJETIVOS
a) Explicar qué es la microbiología industrial.
b) Describir el campo de aplicación de la microbiología industrial. c) Explicar el origen y el desarrollo de la microbiología industrial. d) Explicar la importancia de las investigaciones de Louis Rasteur en
el campo de la microbiología industrial.
e) Reconocer la importancia de los microorganismos en los proce sos industriales.
2
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / M ic ia He r n á n d e zA
ntecedentes
h istó r ic o s
La historia de la microbiología industrial es muy amplia; se desarro lla en muchos escenarios y en las manos de grandes maestros de la investigación. Es sorprendente conocer la forma en que los seres hu manos incursionaron en el mundo microscópico y cómo, a partir de ese momento, el desarrollo de esta área de la microbiología crece a un ritmo cada vez mayor.
Esta sección es un complemento del Capítulo 1 del libro Introducción
a la microbiología, de García (1995). Se recomienda estudiar el capítulo indicado y, con base en ese material, realizar la siguiente actividad.
Confeccione una lista de los acontecimientos de la historia de la microbiología, que se encuentran directamente involucrados
con el área de la microbiología industrial.
Muchos investigadores han contribuido al desarrollo de la microbiolo gía industrial; sin embargo, el francés Louis Pasteur (1822-1895) es con siderado el más exitoso, por sus relevantes aportes, principalmente, en el campo de los alimentos y en el de la medicina (con el descubrimien to de los microorganismos causantes de ciertas enfermedades y la for ma de controlarlos). Con base en las investigaciones de Pasteur, se es tudiará la historia de la microbiología industrial en tres etapas:
a) La era antes de Pasteur
b) Louis Pasteur y sus investigaciones c) La era después de Pasteur.
En este apartado, se proporcionará una visión general, ya que el de sarrollo de los procesos de fabricación de determinados productos, como el vino, la cerveza o el queso, será analizado en los próximos capítulos.
m m o i : G e n e r a lid a d e s 3
La era antes de Rasteur
En la antigüedad, el ser humano no tenía idea de la existencia de microorganismos, sin em bargo, los utilizaba para su beneficio: se repor ta el consumo de cerveza, vino y queso, cuya fabricación se inició de forma más bien acci dental. La cerveza es el primer producto -del que se tiene información- obtenido a partir de la transformación, por microorganismos, de un sustrato. Su elaboración se originó alrede dor del año 6000 a.C. en la civilización sume- ria. Dos mil años después, en el año 4000 a.C., los egipcios también preparaban esta bebida; además, utilizaban la levadura de la cerveza como agente para esponjar el pan, por su capa cidad de producir dióxido de carbono (C 0 2). La fabricación de queso data del año 2000 a.C. y se menciona en el Antiguo Testamento.
Ya para el siglo XIV a.C., el hombre sabía ela borar y destilar bebidas alcohólicas, a partir
de fermentaciones de granos de cereales. De ahí en adelante y hasta el año 1700, los avan ces en este campo fueron lentos pero significa tivos; entre ellos, se pueden citar la produc ción de yogur, vinagre y otros alimentos fer mentados, provenientes de la cultura oriental principalmente.
En 1663, el biólogo holandés Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) inventó el micros copio y, por medio de este instrumento, descu brió la existencia de los microorganismos. A partir de esa fecha, todo cuanto caía en sus ma nos era objeto de observación; sin embargo, no logró descifrar los efectos y las utilidades de los microorganismos, incógnitas que permane cieron sin resolver por dos siglos más.
Louis Pasteur y sus investigaciones
En 1837, tres investigadores (Cagniard de la Tour, Schwann y Kützing) detectaron median
te el microscopio -en forma simultánea, pero independíente- la presencia de microorganis mos en la espuma de la cerveza. Los microor ganismos observados eran levaduras en el pro ceso de germinación, lo cual les indicó que es taban vivos y los relacionaron con la produc ción de la cerveza. Denominaron la levadura
Saccharomyces (hongo del azúcar), por su capa cidad de convertir el azúcar en alcohol. A pe sar de ese descubrimiento, fue Louis Pasteur quien demostró al mundo la utilidad de los mi croorganismos para el ser humano, por lo que se le considera el pionero de estos estudios.
La oportunidad de Louis Pasteur de revolu cionar el campo de la aplicación de la micro biología, se le presentó en Lille (ciudad de cul tivadores de remolacha y destiladores de alco hol). En las destilerías de este lugar, existía un problema: en unos de los recipientes que con
tenían el azúcar de remolacha no se estaba produciendo alcohol, mientras que en otros sí. Hasta el momento, se sabía que el azúcar de remolacha era convertido en alcohol, pero no se conocía por cuál mecanismo. Pasteur tomó muestras de los recipientes en los que no se producía alcohol, y encontró que los microor ganismos eran diferentes de los responsables de la producción del alcohol. Analizó el con tenido de estos recipientes y descubrió que era ácido láctico. Entonces, concluyó que ha bía unos microorganismos específicos para la producción de alcohol y otros para la de ácido láctico. Con el fin de solucionar el problema de "contaminación" en las destilerías, Pasteur aconsejó a los industriales evitar la presencia de los microorganismos productores de ácido láctico en los recipientes de producción de al cohol; sin embargo, en ese momento, él no sa bía exactamente cómo lograrlo.
Otro éxito de las investigaciones de Pasteur consistió en la elaboración de un medio de cul
tivo artificial para reproducir los microorga
4 M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l ! Al ic ía H e r n á n d e z
nismos. El acontecimiento lo originó el si guiente problema: los microorganismos pro ductores de áddo láctico se desarrollaban en un líquido de color grisáceo difícil de estudiar; por lo tanto, ideó un medio de cultivo transpa
rente con base en azúcar, cal y levadura seca, en el que, después de un tiempo de incuba ción, los microorganismos se multiplicaron.
Continuando con sus experimentos, Pasteur detectó que, en algunos casos, no se producía ácido láctico, sino un líquido con un olor a mantequilla rancia, en el que descubrió la pre sencia de otro microorganismo: el productor del ácido butírico. De esta forma, confirmó su hipótesis de que se pueden obtener diferentes productos a partir de un determinado sustra to, dependiendo del microorganismo que se encuentre en el cultivo. Con este experimen
to, accidentalmente, también se percató de otro hecho: el aire era perjudicial para esos microorganismos, pues aquellos "bichitos" que estaban en el borde de una gota no se mo vían, mientras que los que se encontraban en el centro sí tenían movimiento.
Además, demostró que los microorganismos también eran los responsables de la descompo sición de los alimentos y rebatió, en definitiva, la idea de la generación espontánea, por medio de su experimento con un balón con cuello de ganso. Para ampliar la información al respec to, se puede consultar el Capítulo I del libro In
troducción a la microbiología (Garda, 1995).
Un problema similar al de las destilerías se presentó en la producción de vino y de vina gre: a veces, el producto obtenido no reunía las características deseadas; Pasteur, con un poco más de experiencia en estos asuntos, rá pidamente atribuyó el problema a la presen cia de microorganismos ajenos al proceso de interés. Solucionó el problema de los indus triales al descubrir que si calentaba el mosto
empleado en la fabricación del vino por deba jo de su punto de ebullición, los microorganis mos morían y el vino se mantenía sin altera ciones. Este proceso dio origen al tratamiento
térmico denominado pasteurización. La pas teurización revolucionó el campo de la con servación de los alimentos y del control de la contaminación en los procesos de fabricación de diferentes productos.
Los descubrimientos de Pasteur no se detu vieron aquí: continuó investigando y hacien do aportes fundamentales en el área de la m e dicina; sin embargo, no se mencionarán en es ta unidad didáctica, pues no se encuentran dentro de sus objetivos.
El doctor Louis Pasteur es considerado el "pa dre de la microbiología industrial", ya que sus investigaciones contribuyeron no solo a mejo rar los procesos existentes (que hasta el mo mento eran empíricos), sino a crear los ci mientos para el desarrollo de un sinfín de in dustrias nuevas basadas en el uso de los mi croorganismos.
La era después de Pasteur
Hacia fines del siglo XIX, después de las im portantes contribuciones de Pasteur, los her manos Buchner llevaron a cabo un experi mento mediante el cual, accidentalmente, en contraron las bases de la bioquímica. Ellos querían conservar inalterado un extracto de le
vaduras (líquido sin células vivas), entonces, para conseguirlo, le adicionaron una gran cantidad de azúcar, con base en el hecho de que el azúcar sirve como medio para preser var algunos alimentos; sin embargo, después de un tiempo notaron -con sorpresa- que el azúcar se transformaba en alcohol. A partir de ese experimento, se iniciaron los estudios sobre los mecanismos de transformación de los compuestos.
cvfn .w i. G en eralid ad es
________ 5
En el siglo XX, continuó la ola de descubri mientos en el área de la microbiología. Desde
1900 hasta 1940, se desarrolló una serie de procesos industriales: la producción de aceto na, butanol, glicerol, ácido cítrico, ácido lácti co y biomasa. En este último proceso, se recu rrió a la rapidez de reproducción de los mi croorganismos en comparación con el tiempo que tardan las plantas o los animales para cre cer y ser fuentes de proteínas, como opción para suplir de alimento a grandes poblaciones que sufren de hambruna. También, en esos años, se empezó la producción de enzimas, ta les como proteasas, amilasas e invertasas; en
1914, se iniciaron las investigaciones para el tratamiento de las aguas negras. Estos avan ces reflejan cómo se fue ampliando el ámbito de aplicación de los microorganismos y su ín tima relación con la vida del hombre.
La producción industrial de la penicilina (an tibiótico) es un hecho ligado a las necesidades del ser humano en ese momento -el trata miento de los heridos en la Ií Guerra Mun dial-, que marca la historia de la humanidad. En esa época, ya se empleaban los cultivos su mergidos y aeróbicos, y se utilizaban termen tadores agitados con controles automáticos
(detalles sobre ese tipo de fermentadores se encuen tran en el Capítulo 3 de este texto).
De 1960 a 1975 se lograron grandes avances en la producción masiva de enzimas a partir de microorganismos y de jarabes con alto con tenido de fructosa por vía enzimàtica. Tam bién se produjeron, por esta vía, aminoácidos, estimuladores del sabor, vitaminas (B2 y B]2) y polímeros microbianos utilizados como aditi vos en alimentos. La crisis petrolera, en 1974, incentivó al ser humano a buscar alternativas para sustituir el uso de combustibles deriva dos del petróleo, por lo que se mejoró el pro ceso de producción de alcohol, compuesto
utilizado en la fabricación de gasohol.
En la actualidad, la microbiología industrial ha traspasado muchas fronteras que delimita ban su campo, y es difícil continuar hablando solo de "microbiología", cuando los procesos tienen componentes de disciplinas como la in geniería química, la ingeniería genética y la biotecnología, entre otras. Por ejemplo, los avances se han dirigido, principalmente, a la manipulación genética de los microorganis mos para aumentar los rendimientos de pro ducción de metabolitos, disminuir su toxici dad, erradicar enfermedades y un sinfín de
aplicaciones más. Además, se desarrollan
procesos para el aprovechamiento de desper dicios (agrícolas e industriales) así como para el tratamiento de residuos (líquidos y sóli dos), con la finalidad de controlar y disminuir la contaminación ambiental, y conservar los recursos del planeta.
LOS MICROORGANISMOS
UTILIZADOS INDUSTRIALMENTE
En los microorganismos, como en cualquier célula, ocurre una serie d e re a c c io n e s quími
cas cuyo conjunto se denomina metabolismo; las sustancias que se producen se conocen co mo metabolitos. Los metabolitos primarios son los compuestos esenciales para el crecimiento del microorganismo, mientras que los produc
tos sintetizados que no están relacionados con su crecimiento se conocen como metabolitos se
cundarios. El Gráfico 1.1 ilustra el comporta miento del crecimiento microbiano en rela ción con la producción de cada tipo de meta-
bolito. Los metabolitos primarios (Gráfico
1.1.a) se producen al mismo tiempo que se da el crecimiento del microorganismo, mientras que los metabolitos secundarios (Gráfico 1.1.b) se producen generalmente cuando la veloci dad de crecimiento de los microorganismos es igual a su velocidad de muerte.
6 M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l ! Al ic ia He r n á n d e z
Metabolitos Crecimiento celular
Gráfico 1.1:
a)
b)
La relación entre el comportamiento de la concentración celular (crecimiento) y la concentración de metabolitos, a través del tiempo, a) Metabolitos primarios, b) Metabolitos secundarios.
Fuente: Adaptado de Marison (19%).
Durante un proceso industrial, es importante que el microorganismo participante se desa rrolle de tal forma que se maximice la produc ción del compuesto de interés. Los compues tos de interés pueden ser:
• Los mismos microorganismos (término
más comúnmente conocido como biomasa).
• Los metabolitos: primarios y secundarios.
En forma natural, los microorganismos elabo ran únicamente la cantidad de metabolitos ne cesaria para su subsistencia; sin embargo, si se conoce su metabolismo, es posible alterarlo para lograr la sobreproducción de algún com puesto en particular.
Los microorganismos más utilizados son las levaduras, los mohos y las bacterias.
En el libro Introducción a la microbiología (Garda,
1995), encontrará aspectos generales sobre es
tos tres tipos de microorganismos. Con base
en ese m aterial, realice la sig u ien te activ id ad .
Algunos de los procesos de obtención de bio masa y metabolitos, a partir de levaduras, mo
hos y bacterias, se estudiarán en los próximos capítulos.
Las levaduras
Las levaduras son los microorganismos más importantes desde el punto de vista indus trial, porque muchas de las especies pueden convertir los azúcares en alcohol etílico y dió xido de carbono. Participan en la producción de cerveza, vino, alcohol industrial, glicerol y vinagre. Las células de levadura se utilizan también en la industria de la panificación y como alimento animal y humano, por su alto contenido de proteínas. En el Cuadro 1.1 se muestran algunos ejemplos de levaduras y los compuestos que producen.
Cuadro 1.1
ALGUNOS TIPOS DE LEVADURAS UTILIZADAS INDUSTRIALMENTE
Lrx.ulurn I’ roduc lo
Saccharomyces ellipsoideus Vino
Saccharomyces cerevtsiae Cerveza y levadura
de panificación
Torulopsis utilis Fuente de proteínas
Candida lipolytica
Schizosaccharomyces sp. Alcohol industrial
Fuente: Pelczarefa/. (1986,655).
Elabore una lista de las principales características de las levaduras, los mohos y las bacterias.
Cirtruto i: Generalidades
1 _______________________________________i
Los mohos
Los mohos se han utilizado especialmente en la producción de antibióticos, enzimas, vita minas y ácidos orgánicos, tales como el cítrico, el láctico y el glutámico; también, en la madu ración de varias clases de queso, como el Ro quefort. El Cuadro 1.2 contiene información acerca de algunos ejemplos de mohos y los productos de interés comercial que se pueden obtener a partir de ellos.
Las bacterias
Las bacterias han sido utilizadas para la pro ducción de vinagre, ácido glucónico y cetoglu- cónico. Las Acetobacter conforman un grupo de especies oxidantes, entre las cuales se encuen tran aquellas productoras de vinagre, dióxido de carbono y sorbitol. Otro grupo de bacterias, de gran importancia desde el punto de vista in dustrial, son las Lactibacillus delbrueckii, cuya denominación se debe a que el ácido láctico es el producto principal de su metabolismo.
Las bacterias del género Clostridium destacan en la producción de acetona y de butanol y las del género Streptomyces en la del antibiótico estreptomicina. El Cuadro 1.3 muestra algu nos ejemplos de bacterias utilizadas indus trialmente.
Cuadro t .2
ALGUNOS EJEMPLOS DE MOHOS UTILIZADOS INDUSTRIALMENTE Moho Producto Aspergillus rtiger Penicillium spp. PeniciHium roquefortí Aspergillus terreas Rhi/opus oryiae Penicillium griseoiuhvm Ácido cítrico Ácido glucónico Queso Roquefort Ácido itacónico Ácido láctico Griseofülvina Fuente: Pelczar et al. <1986, 658).
Cuadro 1.3
ALGUNOS EJEMPLOS DE BACTERIAS UTILIZADAS INDUSTRIALMENTE Bacteria Producto Acetobacter Acetobacter suboxydans Lactobacillus bulgmcus Lactobacillus delbrueckii Clostridium acetobutylicum Streptomyces griseus Vinagre Sorbitol Yogur Ácido láctico Acetona, butanol Estreptomicina Fuentp: Adaptado de Pelczar el al. (1986).
8
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / Al ic ia He r n á s d e zYou have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.
FUENTES Y LECTURAS RECOMENDADAS
B u tlin , K, 1967, "Aspects of microbiology". Cap. 1. En: Biochemica! and biológica} engineering Science. V61.1. New York: Academic Press.
CRUEGER, W. Y A. C ru eg er. 1989. Biotecnología: Manual de microbiología industrial.
España: Editorial Acribía.
DE KriííF, P. 1992. Cazadores de microbios. México: Editores Mexicanos Unidos. G a r c ía , V. 1995. Introducción a la microbiología. San José: EUNED.
MarISON, I. 1996. "Cinética del crecimiento". Cap 10. En: Biotecnología para inge nieros: sistemas biológicos en procesos tecnológicos. Ed. por Scragg, A. Mé xico: Editorial Limusa.
P e lc z a r , M.; C h a n , E. Y N. KríEG. 1986. Microbiology. 5 'e d . U.S.A.: M cG raw H ill. P e lc z a r , M.; Reíd, R. y E. Chan. 1982. Microbiología. 4* ed. México: Me Graw Hill. QUINTERO, R. 1993. Ingeniería bioquímica: teoría y aplicaciones. México: Alhambra
Mexicana.
RHODES, A. Y D. FlETCHER. 1969. Principios de microbiología industrial. España: Edi
torial Acribia.
S c r a g g , A. 1996. "Biotecnología", Cap. 1. En: Biotecnología para ingenieros: Siste mas biológicos en procesos tecnológicos. México: Editorial Limusa.
STANBURY, P. Y A. W h ita k e r. 1987. Principies of fermentation technology. Great
Bri-tain: Pergamon Press.
11
You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.
OBJETIVOS
a) Citar las etapas involucradas en el manejo de cultivos.
b) Explicar las condiciones que intervienen en la selección de un cultivo puro o uno mixto, en un proceso industrial.
c) Describir los métodos involucrados en el aislamiento de microor ganismos.
d) Establecer las diferencias entre los métodos de conservación de los microorganismos.
e) Mencionar los principales requerimientos nutricionales de los mi croorganismos.
0 Indicar los principales factores que se deben considerar en la for mulación de medios de cultivo.
g) Describir las etapas y los aspectos involucrados en la preparación de ¡nóculos.
14 M lCROeiOíOCU INDUSTRIAL / AttOÁ HERNÁNDEZ
I
n t r o d u c c ió nEl manejo de un cultivo microbiológico involucra las siguientes etapas: a) El aislamiento del microorganismo
b) La conservación del microorganismo
c) La preparación del medio de cultivo en el que se desarrolla d) La preparación del inoculo
e) El escalamiento
f) La producción industrial.
Cada una de estas etapas es importante, y un descuido en alguna de ellas puede conducir todo el proceso al fracaso.
El aislamiento de un microorganismo con características específicas es una labor ardua y costosa. Muchos microorganismos son irrem- plazables, pues han sido obtenidos por procedimientos empíricos: no existe un método bien definido para obtener la cepa nuevamente, en caso de perderla. Además, la modificación de un microorganismo para variar sus características hace que sea muy inestable y suscepti ble de perderlas con facilidad.
Actualmente, el aislamiento se realiza en condiciones cada vez más estandarizadas y repetibles, y se recurre al mejoramiento genético de las cepas para obtener cualidades especiales, tales como una mayor productividad de biomasa o sustancias de interés.
Cuando el microorganismo se ha aislado, debe ser conservado: se le aplica un método que garantice la estabilidad -a través del tiempo- de las propiedades que lo hacen valioso. El estudio de los requeri mientos nutricionales permite realizar una adecuada formulación del
o im o2: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
________15
medio de cultivo por utilizar, para que el mi croorganismo se desarrolle y produzca los metabolitos de interés.
Una vez definido el medio de cultivo, es nece sario preparar el inoculo, a partir del microor ganismo que se encuentra en conservación; fi nalmente, se lleva a cabo el proceso a escala industrial.
En este capítulo se estudiarán todas las etapas antes mencionadas, con excepción de la pro ducción industrial, que se desarrollará en el Capítulo 3.
El a i s l a m i e n t o d e m i c r o o r g a n i s m o s
Cuando se examina en el microscopio una go ta de agua de lluvia, se observa gran variedad de microorganismos; algunos de ellos podrían ser útiles al hombre, mientras que otros po drían ser patógenos. La separación de cada
una de estas variedades es lo que se conoce como el aislamiento de microorganismos.
Los cultivos puros y los mixtos
En algunos procesos industriales es imprescin dible que se encuentre solo un tipo de microor ganismo, mientras que en otros es necesaria la presencia de un conglomerado de ellos para alcanzar los objetivos esperados. Por lo tanto, las características específicas de cada proceso industrial van a definir la conveniencia de uti lizar un cultivo puro o uno mixto.
Un cultivo puro es aquella población de mi croorganismos de un mismo tipo que, gene ralmente, se producen a partir de una sola cé lula. Una cepa (cultivo) de Sacdiaromyces cere-
visiae para producir cerveza es un ejemplo tí pico de un cultivo puro. En contraste, un cul
tivo mixto está compuesto por varios microor
ganismos, cuya presencia en conjunto cumple una determinada función. Las poblaciones de microorganismos utilizados para el trata miento de desechos líquidos (aguas residua les) representan un caso común de la utiliza ción de cultivos mixtos.
En varios procesos de fermentación, es estric tamente necesario mantener condiciones de asepsia para que el microorganismo pueda desarrollarse; por ejemplo, en la producción de antibióticos o ciertas vitaminas (cianocoba- lamina y riboflavina), si otros microorganis mos se hallan presentes, van a competir por los nutrimentos del medio, y la cepa de inte rés puede desaparecer o disminuir significati vamente la producción de metabolitos. Por el contrario, en algunas fermentaciones no es re quisito utilizar medidas estrictas de higiene, ya sea porque durante el proceso las sustan cias producidas favorecen solo la presencia del microorganismo de interés, o porque un cultivo mixto es el que participa en la reac ción. La producción de vinagre, por ejemplo, no necesita condiciones estériles, pues el me dio ácido y la temperatura a la que se lleva a cabo la fermentación son factores que se en cargan de impedir el desarrollo de otros mi croorganismos.
Cuando se hace referencia a un proceso indus trial, un aspecto prioritario es el económico: el proceso debe ser rentable. Por esta razón, se efectúa un estudio de los costos involucra dos en el aislamiento del microorganismo, y se comparan con el rendimiento que se obten drá del metabolito de interés; además, es im portante tomar en cuenta la productividad de ese metabolito así como la estabilidad de la ce pa seleccionada, pues no es recomendable se leccionar una de alto rendimiento si puede perder sus características fácilmente.
16 M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / Alic ia He r n á n d e z
Las técnicas para obtener cultivos puros
Se ha desarrollado una serie de técnicas mi- crobiológicas para aislar microorganismos y obtener cultivos puros. A continuación, se mencionan tres de ellas:
• Siembra en placas de Petri por rayado
• Siembra en placa vertida
• Diluciones en serie.
La siembra en placas de Petri por rayado
Esta técnica se basa en la separación de los mi croorganismos al dispersar -por rayado sobre agar- una muestra que los contiene, según se muestra en la Figura 2.1.a. Para llevar a cabo la disgregación, se recoge una porción de la muestra con un asa bacteriológica y se raya sobre una sección de una placa de Petri; lue go, se repite el rayado en tres secciones más de la placa. En cada rayado, se toma la mues
tra de la sección anterior, por lo que se logra una disminución gradual en la cantidad de microorganismos.
Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo reco mendados; al crecer, formarán colonias sepa radas unas de otras en alguna de las secciones del rayado, como se puede observar en la sec ción 4 de la Figura 2.1.b. En esa figura, cada punto representa una colonia.
a) b)
Figura 2.1 : La siembra en placa de Petri por rayado.
a) El rayado de placas con asa
microbiològica, b) El crecimiento y la separación de las colonias.
Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite el proce dimiento, con la finalidad de confirmar la pre sencia de un solo tipo de microorganismos.
La siembra en placa vertida
En esta técnica se hacen crecer los microorga nismos en tubos, cada uno con una concentra ción diferente, y se evalúa el tubo en el que las colonias crecieron en forma separada.
Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas diluciones y se colo ca cada una en un tubo con agar fundido, co mo se indica en la Figura 2.2.a. Luego, se mezcla homogéneamente el contenido (el agar y el inóculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri, según se muestra en la Figura 2.2.b.
Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona la dilu ción en la que se haya obtenido una mayor se paración de las colonias.
Por último, de esta dilución, se toma una muestra de una de las colonias y se siembra en una placa de Petri, por rayado, para confir mar si el cultivo está puro. La confirmación de pureza se puede realizar por observación a simple vista (colonias de igual morfología), por observación microscópica o mediante pruebas bioquímicas. m
-Vi
!
* 9 9 * ♦ • ♦ 4 9 9 \ # ♦ i • • • 0 0 0 t 0 0 0 • é 4 ♦ 4 « i * * • # f ♦ 0 0 0 a) b)Fígura 2.2: La siembra en placa vertida, a) Las
diluciones de la muestra, b) El vertido del cullivo en una placa de Petri.
cvttutoí: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS ___________ 17
Las diluciones en serie
Esta técnica se aplica cuando se conoce de an temano que el microorganismo de interés se encuentra en mayor cantidad que los demás. Para llevarla a cabo, se preparan varias dilu ciones de la muestra y se incuban en e! medio de cultivo adecuado para que crezca este mi croorganismo; así, se logra que en alguna de las diluciones solo él aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia, utilizando el méto do de siembra en placa de Petri por rayado.
El m a n t e n i m i e n t o
DE LOS MICROORGANISMOS
El mantenimiento de los microorganismos consiste en la conservación de ellos y de sus características por largos periodos. A través de los años, se han desarrollado varios méto dos de conservación de microorganismos, que se basan en la reducción de su actividad me tabòlica. La selección del método de conser vación depende de varios factores, entre los que se pueden mencionar:
• La susceptibilidad del microorganismo (al
proceso de conservación)
• La facilidad con la que puedan ocurrir
cambios genéticos en la cepa
• El número de muestras por conservar
• El costo del proceso de conservación
• El periodo durante el cual se desea conser
var el microorganismo
• El tipo de equipo disponible
• La probabilidad de contaminación que
exista en el medio.
En muchos países, hay entidades que tienen colecciones de cultivos y se dedican al mante nimiento de los microorganismos (brindan una garantía de sus características). Muchas de estas colecciones son reconocidas intema- cionalmente; por medio de ellas, se puede ad quirir la mayoría de los microorganismos exis tentes. En el Cuadro 2.1, se indican algunas de estas instituciones. Cuando se adquiere un microorganismo de una colección, viene iden tificado con las abreviaturas de la colección de la que proviene; por ejemplo, el microorganis mo Phanerochaetc chn/sosporium CDBB H-298 pertenece a la colección de cultivos del Depar tamento de Biotecnología y Bioingeniería del
Centro de Investigación y de Estudios A vanza
dos (CINVESTAV) del Instituto Politécnico Na cional, además, está identificado dentro de la colección como la cepa H-298.
Cuadro 2.1
ALGUNAS CO LECCIO NES M ICROBIANAS EN EL M UNDO
Nombre País Microorganismo
American Type Culture Collection (ATCQ USA Bacterias, acfinornicetos, hongos, algas, protozoarios
Colección (ie Cultivos del Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del
CINVESTAV (CDBB)
México Mongos, bacterias
National Collection of Industrial Bacteria (NCIB)
Escocia Bacterias
Instituto Pasteur Francia Bacterias
18 M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / Al ig a He r n á n d e z
Existen varios métodos para la conservación de los microorganismos; todos buscan que las células sufran el daño mínimo y se preserven por el máximo período posible. Los cuatro procedimientos generales son:
• La resiembra o el subcultivo • La desecación
• La congelación • La liofilización.
La resiembra o el subcultivo
Este método consiste en sembrar el microor ganismo en determinado medio de cultivo y, luego, conservarlo en refrigeración. El proce dimiento se debe repetir cada cierto tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar in dinado (slants), o en botellas especiales que contienen un medio de cultivo sólido y estéril (botellas de Roux). Este equipo se muestra en la Figura 2.3. El tubo de ensayo se mantiene en posición inclinada hasta que el medio de cultivo solidifique, con lo cual se logra una mayor superficie para el crecimiento del mi croorganismo; en el caso de las botellas, estas se mantienen en forma horizontal. El mi croorganismo se inocula en el medio sólido y se deja crecer durante varios días; luego, el cultivo se refrigera. Una de las desventajas del método es que los tubos guardados en re
frigeración se deshidratan y, entonces, el mi croorganismo muere; por esta razón, es nece sario repetir el procedimiento periódicamen te: al menos cada seis meses, según señalan
Parton y Willis (1990).
La resiembra es uno de los métodos de mante nimiento de cultivos más simples y no requie re equipo especializado y costoso; sin embar go, es un método caro, ya que necesita mucha mano de obra, por la periodicidad de las re
siembras. Sus principales desventajas radican en la alta probabilidad de que el cultivo se contamine durante las resiembras y en que el microorganismo sufra cambios genéticos y bioquímicos durante el proceso.
a) b)
Fig u r a 2 .3 : El equipo utilizado para resiembra.
a) Los tubos con agar indinado (slants). b) Las botellas para resiembra (de
Roux).
Una variación del método consiste en adicio nar aceite mineral estéril al tubo o la botella con el microorganismo en crecimiento, de tal forma que cubra el agar hasta una altura de un centímetro y medio, para reducir el meta bolismo del microorganismo y la deshidrata- ción del medio de cultivo. La ventaja de esta modificación es que se puede obtener un sub cultivo sin perder el cultivo inicial; sin embar go, también se presentan problemas por cam bios en las características de los microorganis mos, tales como la pérdida de su capacidad de esporulación (reproducción) o de su actividad bioquímica.
La desecación
El método consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratación de las células de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se ino cula una muestra de cultivo en tierra húmeda estéril (material de soporte), se espera hasta que haya crecimiento (varios días) y, luego, se seca con aire o al vacío. Después, el cultivo se guarda en una atmósfera seca o en refrigera ción. Otros materiales de soporte pueden ser sílica gel, discos de gelatina y tiras de papel.
C««Mo* EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS 19
Entre las ventajas del método se pueden men cionar que no necesita equipo especial ni mu cho personal para ejecutarlo y, si no sufre da ños durante la desecación, el cultivo puede continuar viable por muchos años; Parton y Willis (1990) reportan una viabilidad del 50% a los veinte años de conservación. Este método es recomendable para las especies que al ser desecadas esporulan (se encierran para prote gerse), ya que se conservan por más tiempo que las que no esporulan.
La congelación
La congelación es, al igual que la liofilización, uno de los métodos de mantenimiento más uti lizados, porque se logran los periodos de con servación más largos (superiores a los veinte años, cuando se utiliza nitrógeno líquido).
En el proceso de congelación, lo más impor tante es controlar la velocidad de disminución de la temperatura, porque, si es muy lenta, los cristales que se forman a partir del líquido contenido en las células serán muy grandes y pueden romper la membrana celular.
Existen algunas sustancias, como el dimetil sulfóxido (DMSO) y el glicerol, que ayudan a proteger los microorganismos durante el pro ceso de congelación; se conocen como criopro-
tectores. Estas sustancias tienen un bajo punto de congelación (menor a 0 *’C), por lo que re ducen la velocidad de congelación de los com ponentes de la célula microbiana.
El método de congelación no necesita mucha mano de obra, pero el costo del equipo y del mantenimiento de los cultivos es alto. Si se presenta una falla mecánica o un corte en el suministro eléctrico, y no se han tomado las previsiones necesarias, el material se puede perder. Durante el transporte, el cultivo debe permanecer congelado (implica tener equipo
de congelación que pueda ser transportado) o se debe hacer crecer en un tubo inclinado, lo cual también representa una desventaja, por los problemas que conlleva la resiembra.
El proceso de congelación se puede clasificar, con base en la temperatura en la que se lleva a cabo, en:
• Congelación ordinaria • Congelación ultrafría
• Congelación con nitrógeno líquido.
La congelación ordinaria
Durante la congelación ordinaria se mantie nen temperaturas de -5 a -20 °C; en este inter valo, los microorganismos permanecen via bles (es decir, una vez descongelados, los mi croorganismos conservan todas sus funciones
y características) por uno o dos años (Drew,
im ). El método no se recomienda para perio dos de almacenamiento mayores.
La congelación ultrafría
El cultivo por congelar se recoge directamente por centrifugación de una suspensión de mi croorganismos, o se prepara raspando una muestra de la suspensión en un tubo con las condiciones adecuadas para su crecimiento. Luego, el cultivo se suspende en un medio con glicerol o DMSO. La suspensión se coloca en tubos especiales. La congelación ultrafría se efectúa en congeladores mecánicos, a tem peraturas entre -50 y -80 °C.
Como se mencionó, debe controlarse la veloci dad de congelación de los microorganismos para mantener su viabilidad y que la cepa no
sufra daños irreparables. Dalby (1983) reco
mienda congelarlos a una velocidad de 1 a 2 'XZ/min hasta llegar a -3 0 "C; después de al
20
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / Alicia. Hír n á n d e zcanzar esta temperatura, se acelera el proceso de congelación hasta lograr la temperatura de
seada. Drew (1986) ha observado que las cepas
se conservan bien, durante cinco años, a -60 °C.
La congelación con nitrógeno líquido
El método de conservación por congelación más recomendado es el que utiliza nitrógeno líquido, porque se logran temperaturas de
—150 a —196 C (Stanbury y Whitaker, 1987). La velo-
ddad de congelación debe ser 1 a 2 “C/min hasta alcanzar una temperatura de -30 °C, lue go, 1 °C/min hasta -56 °C. Después, se colo can las muestras directamente en nitrógeno lí quido para acelerar el proceso de congelación. El metabolismo celular se detiene completa mente a partir de los -130 "C; por esta razón, si el microorganismo soporta el proceso de congelación, su viabilidad permanece durante muchos años. Una de las principales ventajas de este método es que son innecesarias las re siembras, por lo que se reducen al mínimo los
riesgos de contaminación y los cambios gené ticos y bioquímicos en el microorganismo. Sin embargo, el costo del equipo requerido es alto y es necesario mantener un suministro cons tante de nitrógeno, lo que encarece el proceso. Además, es imprescindible tomar previsiones en cuanto a fallas mecánicas y eléctricas para evitar perder toda una colección.
La liofilización
La liofilización es la remoción de agua de las células congeladas (sólidas) a presión reduci da (sublimación). Para llevar a cabo este pro cedimiento, se toma una muestra del cultivo por conservar y se suspende en algún medio con crioprotectores, como leche, suero o gluta- mato de sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se congela y se some
te a alto vado hasta que el agua celular se su blima (pasa del estado sólido al gaseoso). Una vez liofilizada la cepa, la ampolla que la con tiene se sella para impedir que el microorga nismo se altere por el contacto con el medio ambiente.
Es uno de los métodos más efectivos para la conservación, pues los microorganismos pue den mantener su viabilidad por veinte años o más. Una de las principales ventajas de este método es que, una vez liofilizado, el cultivo no necesita tratamientos especiales -solo se debe mantener en refrigeradón-, lo que dis minuye los costos de operación y facilita enor memente el transporte. Otra ventaja es que no requiere resiembras, lo que contribuye a evi tar la contaminación y los cambios genéticos y bioquímicos en las células.
La inversión inidal en la adquisición del equi po es alta; sin embargo, los costos totales son menores que los de la congeladón en nitróge no líquido. Este es el método que selecdonan
muchas instituciones para conservar las colec ciones de cultivos.
LOS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Los microorganismos, como cualquier ser vi vo, requieren una serie de sustandas que les permitan realizar sus actividades metabólicas; básicamente, necesitan fuentes de:
• Agua • Energía • Carbono • Nitrógeno • Minerales • Vitaminas
• Oxígeno (en el caso de los aerobios).
Giím oI: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
