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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS TOTALES DE Sinapis alba L POR EL MÉTODO DE PLACAS Y POZOS

MARIANA DURÁN BLANCO

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Departamento de Microbiología Carrera de Microbiología industrial

Bogotá D.C.

2017

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS TOTALES DE Sinapis alba L POR EL MÉTODO DE PLACAS Y POZOS

MARIANA DURÁN BLANCO

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Departamento de Microbiología Carrera de Microbiología industrial

Bogotá D.C.

2017

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS TOTALES DE Sinapis alba L POR EL MÉTODO DE PLACAS Y POZOS

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Departamento de Microbiología Carrera de Microbiología industrial

Bogotá D.C.

2017

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución n0 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de grado. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ella el anhelo

por buscar verdad y justicia”.

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AGRADECIMIENTOS

A Janeth Arias y a Oscar Rodríguez por su acompañamiento, disposición, comprensión y confianza durante el desarrollo de este trabajo de grado.

A María Ximena Rodríguez por brindarme su apoyo, sus consejos y brindarme un espacio para llevar a cabo el proyecto de grado.

A mis compañeros de UNIDIA por acogerme en su laboratorio y por su colaboración.

(6)

RESUMEN

Sinapis alba es una planta de la familia de las crucíferas, conocida como mostaza blanca y por su uso como condimento, además sus semillas tienen efecto terapéutico. En este proyecto se planteó determinar la capacidad antifúngica relativa de los extractos de S. alba utilizando tres solventes con diferentes polaridades, éter de petróleo apolar, diclorometano medianamente polar y etanol polar, frente a los hongos Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Candida albicans y Saccharomyces cerevisiae por el método de placas y pozos.

Los resultados permitieron determinar que los extractos totales de las flores tuvieron actividad antifúngica relativa sobre A. niger utilizando los solventes éter de petróleo y etanol, sin embargo, ningún otro extracto causó la inhibición de los hongos utilizados en el estudio.

(7)

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN, JUSTIFICACIÓN- PLANTEAMIENDO DEL PROBLEMA……….8

2. MARCO TEÓRICO……….8

2.1 Sinapis alba………..8

2.2 Antifúngicos……….8

2.3 Extractos de plantas………9

2.4 Microorganismos……….9

2.5 Métodos analíticos y microbiológicos para la determinación de la capacidad antifúngica……….11

2.5.1 Método de dilución en caldo……….11

2.5.2 Método de difusión en disco……….11

2.5.3 Etest………11

2.5.4 Otros métodos………..11

3. OBJETIVOS………..11

3.1 General………11

3.2 Específicos………..11

4. METODOLOGÍA………11

4.1 Obtención de las cepas………..11

4.2 Preparación de medios de cultivo………11

4.3 Preparación del inóculo……….12

4.4 Extractos……….12

4.5 Preparación de las placas de agar……….12

4.6 Controles………12

4.7 Incubación………..12

4.8 Análisis estadístico- Medición de la capacidad antimicrobiana relativa………….12

5. RESULTADOS………12

5.1 Extractos totales obtenidos a partir de las flores en los solventes: éter de petróleo, etanol y diclorometano………12

5.2 Extractos totales obtenidos a partir de las hojas y de los tallos en los solventes: éter de petróleo, etanol y diclorometano………15

5.3 Extractos totales obtenidos a partir de las raíces en los solventes: éter de petróleo, etanol y diclorometano……….17

6. DISCUSIÓN……….20

7. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES………21

8. REFERENCIAS……….21

(8)

1. INTRODUCCIÓN, JUSTIFICACIÓN- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El presente estudio planea indagar si los extractos de la planta Sinapis alba L tienen efecto fungicida sobre las levaduras Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans y los hongos filamentosos Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger.

Actualmente las patologías relacionadas con hongos son tratadas en su mayoría por fármacos de orígen sintético; sin embargo, el uso de extractos vegetales proporciona una alternativa terapéutica a la medicina occidental tradicionalmente usada.

Algunos de los microorganismos que se probaron en el experimento producen enfermedades tales como aspergilosis, candidiasis, entre otras. Actualmente existen en el mercado fármacos de origen sintético o que combinan síntesis química y natural para tratar estas infecciones, no obstante, hay reportes de cepas hiperresistentes de algunos géneros o especies de microorganismos como los que se usarán en el proyecto, por lo cual es importante probar el efecto que producen los extractos de la planta.

Además, los extractos totales de S. alba pueden ser potenciales desinfectantes de superficies con posibles usuarios como laboratorios que procesan muestras agrícolas o industrias que involucran hongos en sus procesos de producción, que necesitan destruir las esporas o células que le permiten su propagación por la fábrica y contaminar áreas que involucren otros procesos de la misma, también para iniciar un nuevo proceso de producción que involucre un microorganismo diferente.

2. MARCO TEÓRICO 2.1 Sinapis alba

Sinapis alba es una planta de la familia de las Crucíferas, su género en latín “sinapis” significa mostaza, la especie en latín “alba” significa blanca, hace referencia al color claro de las semillas.

También es conocida como Brassica alba, Brassica hirta o mostaza amarilla. Esta planta es usada no solo para la fabricación de la mostaza como condimento si no también tiene diferentes ventajas medicinales. La semilla o su aceite se consume para patologías cancerosas como tumores del abdomen, el bazo, el estómago, la garganta, el útero o la muñeca induraciones. Las semillas se consideran diurético, emético, expectorante, estimulante. Se cree que la planta tiene incluso propiedades narcóticas emolientes y sedantes (Duke, 1983).

2.2 Antifúngicos

Los antimicrobianos son sustancias presentadas como medicamentos que destruyen o inhiben microorganismos, dividiéndose en grupos de acuerdo al tipo de microorganismo que van a atacar de la siguiente forma: antimicóticos, antibacterianos, antivirales, antiparasitarios, antirretrovirales y antimicobacterianos. Los antimicrobianos actúan de forma específica sobre la estructura o función del microorganismo, inhibiendo o destruyendo los mismos y generando baja toxicidad a las células del organismo (Girón, 2008).

Actualmente existen menos antimicóticos que antibacterianos en el mercado, debido a que los hongos están formados por células eucariotas y por lo tanto lo que los afecte puede dañar las células del hospedador. Algunos ejemplos de antimicóticos son Anfotericina B, Nistatina, Griseofulvina, Compuestos imidazólicos, Tionaftato, Naftifina, Tiocarbamato, Alilamina y Benzilamina, con blancos como las estructuras de membrana y pared celular (Wolff, y otros, 2009) o algunos que afectan la síntesis de sus polímeros estructurales en el interior celular (Negroni, 2009).

En un ensayo realizado en el 2011 (Alcántara , Pujadas, & Saavedra , 2011) utilizaron Sinapis alba L en cultivos de oliva durante el invierno para evitar el crecimiento de hierbas de maleza, reduciendo del 50 al 60% la aparición de malas hierbas. Además (Alcántara C. , Pujadas , Saavedra , & Sánchez , 2009) también realizaron un experimento en el que S. alba redujo la densidad del inóculo de Verticillium dahliae, un hongo fitopatógeno que se encontraba en el suelo

(9)

infestando un campo olivar, esto sugiere que la planta podría tener efecto biocida sobre los microorganismos en estudio por algún producto de su metabolismo.

2.3 Extracción de plantas

Los extractos consisten en la fracción no volátil de los componentes del material vegetal, es decir, aquellos que por no ser volatilizables o ser inestables con la temperatura, no se pueden obtener únicamente por destilación, y requieren diversas técnicas de extracción (Universidad Politécnica de Madrid, 2001).

El método de extracción soxhlet (Patiño, 2000) se usa para obtener un producto natural a partir de su fuente, la planta; es una extracción sólido líquido que consiste en poner en contacto un sólido previamente triturado y macerado (flores, hojas, tallos, raíz) con un líquido (disolvente), se suele ayudar con agitación, temperatura o ultrasonido para una mayor eficacia. Normalmente se somete a centrifugación, tras la extracción, para eliminar los sólidos que permanecen en la muestra (Universidad Politécnica de Madrid, 2001). Algunas de las sustancias que componen a la planta quedan en el solvente obteniendo el extracto y un sólido seco sin componentes.

Para realizar los extractos de los órganos vegetales de la planta (raíz, tallo, hojas y flores), se coloca cada uno en un dedal y este se inserta dentro de la cámara de extracción. Se escoge un solvente de bajo punto de ebullición, que disuelva el compuesto deseado. Este se coloca en el balón de destilación y se calienta hasta reflujo.

Los vapores subirán por el lado izquierdo hasta el condensador. El disolvente condensado cae dentro del dedal que contiene el sólido extrayendo el compuesto deseado del material vegetal. Una vez el dedal está lleno de solvente, este regresa por un brazo hacia el balón de destilación; este proceso se repite varias veces y el extracto final se concentra en el balón de destilación (Ocampo , Ríos , Betancur , & Ocampo , 2008).

2.4 Microorganismos

Los hongos son organismos eucariotas y ubicuos, que pueden ser saprófitos o parásitos causando enfermedad en plantas y animales. Pueden ser unicelulares o multicelulares y crecer como levaduras u hongos filamentosos (Powers-Fletcher , Kendall , Griffin, & Hanson , 2016).

Las levaduras, son un grupo de hongos conocidos por realizar la fermentación de cerveza y el pan, se pueden definir como hongos que se reproducen asexualmente por fisión o gemación, e incluso pueden tener estadios sexuales y pertenecer a los filos Ascomycota y Basidiomycota (Kurtzman, Fell, & Boekhout, 2011).

Los hongos filamentosos o mohos se dividen por crecimiento apical de sus filamentos conocidos como hifas, produciendo una red llamada micelio, de igual forma pueden reproducirse de forma sexual, asexual o parasexual por diferenciación de sus células (Powers-Fletcher , Kendall , Griffin,

& Hanson , 2016).

-S. cerevisiae es una levadura de alto interés industrial utilizada para la producción de bioetanol con alto rendimiento y productividad, ya que puede tolerar azúcar y etanol en altas concentraciones (Lee, Jin , Cha, & Seo , 2017).

-C. albicans es una levadura que constituye normalmente la microbiota del intestino, la cavidad oral y vaginal; es la mayor causa de fungemias nosocomiales, afectando de gravedad a pacientes inmunosuprimidos (Tong & Tang , 2017).

-Los hongos filamentosos cumplen un papel importante en la biotecnología industrial por su amplio uso para la producción de compuestos tales como antibióticos, metabolitos y enzimas como P.

chrysogenum productor de B-lactámicos (Polli , Meijrink, Bovenberg, & Driessen , 2016) y A. niger, también causante de enfermedades nosocomiales por su baja virulencia (Atchade , y otros, 2017), también productor de lipasas (Utami, Hariyani, Alamsyah , & Hermansyah , 2017), enzimas celulolíticas (Carvalho, Souza, Ferreira, Batista, & Franco, 2011) y ácido cítrico (Haq, Ali, & Iqbal, 2003).

(10)

Figura 1. Aislamientos de los hongos filamentosos y levaduriformes. a. P. chrysogenum b. A. niger c. C. albicans d. S. cerevisiae

Tabla 1. Características microscópicas de los microorganismos

Microorganismo Características tintoriales

Penicillium chrysogenum

Micelio delgado, hialino, septado. Fiálides con proliferación basipétala de ameroconidos catenulados en tinción con azul de lactofenol (Nielsen, 1997). Filum Ascomycota

Saccharomyces cerevisiae

Levaduras teñidas con cristal violeta de Gram. (Lee, Jin , Cha, & Seo , 2017) Filum Ascomycota.

Candida albicans Levaduras teñidas con cristal violeta de Gram, puede alterar su morfología de levadura para producir hifas (Prasad, 2017). Filum Ascomycota Aspergillus niger Conidióforo globoso, fiálides producen conidios catenulados en tinción con

azul de lactofenol. Filum Ascomycota (Abarca, 2000)

Estos microorganismos son conocidos por causar patologías como aspergilosis, candidiasis, entre otras, que actualmente son tratadas con antimicrobianos sintetizados en laboratorio o que combinan síntesis química y natural, que atacan pared, membrana, síntesis de ácidos nucléicos o de proteínas (Murray, 2016).

(11)

Estos hongos crecen en agar TSA, un medio de cultivo enriquecido que mantiene la viabilidad de los microorganismos para realizar pruebas microbiológicas (Midcalf, Phillips, Neiger , & Coles , 2004).

2.5 Métodos analíticos y microbiológicos para la determinación de la capacidad antifúngica 2.5.1 Método de dilución en caldo

Este método permite realizar la medición in vitro de la susceptibilidad de levaduras y hongos filamentosos contra distintos fármacos antifúngicos a concentraciones diferentes en medio de cultivo líquido (Tapia, 2009), si el microorganismo no es sensible hay turbidez en el tubo indicando que hay crecimiento celular. Conocida la concentración inicial celular pueden tomarse alícuotas para realizar recuento de las células viables en un agar sin antimicrobiano (Guerra, Torres , &

Martínez , 2001).

2.5.2 Método de difusión en disco

Este método consiste en la medición de un halo de inhibición del crecimiento de un microorganismo sembrado en una placa de petri al que se le implantó un disco, que puede tener diferentes concentraciones, de un antimicótico soluble en agua que se difunde por el agar (Tapia, 2009).

2.5.3 Etest®

Este método consiste en la inoculación de un microorganismo a una placa de petri, posteriormente se aplica una tira de antimicótico comercial con diferentes concentraciones para determinar la concentración mínima inhibitoria (Tapia, 2009).

2.5.4 Otros métodos

Para cuantificar la concentración fungicida inhibitoria se pueden realizar curvas de muerte del microorganismo, citometría de flujo y cuantificación de ergosterol. (Tapia, 2009)

3. OBJETIVOS 3.1 General:

Verificar si los extractos totales de los órganos de Sinapis alba L (raíz, tallo, hojas, flores) poseen actividad antifúngica sobre Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Penicillium chrysogenum y Aspergillus niger, analizada por el método de placas y pozos.

3.2 Específicos:

- Determinar cuáles de los extractos totales de la planta posee mayor actividad antifúngica relativa.

- Determinar cuál de los órganos de la planta presenta mayor actividad antifúngica relativa.

4. METODOLOGÍA

4.1 Obtención de las cepas

Los microorganismos utilizados en el estudio corresponden a cepas del cepario de hongos de la Pontificia Universidad Javeriana que realizó la reactivación de las cepas.

Las cepas son:

a.Saccharomyces cerevisiae b.Candida albicans

c.Aspergillus niger

d.Penicillium chrysogenum

4.2 Preparación de medios de cultivo

Para el montaje de cada parte de la planta enfrentado a una cepa, se preparó agar TSA en agua destilada en una concentración de 40 g/L.

(12)

4.3 Preparación del inóculo

Se realizó una suspensión de cada hongo reactivado en Caldo TSA (10% del volúmen de agar TSA), estas suspensiones se incubaron a 28°C durante siete días. Terminado el tiempo de incubación se realizaron diluciones del inóculo, se sembraron en profundidad y se incubaron en las mismas condiciones para verificar que la concentración inicial que se mezcló con el agar TSA fuera de 10⁶UFC/mL.

4.4 Extractos

El proceso de extracción se realizó del tallo, la raíz, las hojas y las flores de la planta, empleando como solventes éter de petróleo, etanol y diclorometano, obteniendo los extractos con una consistencia pastosa. Se realizó una suspensión de 100mg de cada extracto en 1mL de DMSO para realizar las pruebas de actividad antifúngica, posteriormente los extractos fueron filtrados con membranas de 0,22μL.

4.5 Preparación de las placas de agar

Se sirvieron aproximadamente 50mL de medio inoculado en cada placa de petri de 100x15mm, después de la solidificación del agar se refrigeró durante 24h. Posterior a la refrigeración del medio se realizó una perforación central con pipeta invertida de 5mL y se selló con 30uL de medio de cultivo estéril, por último se agregaron 50 o 100uL de cada extracto por triplicado (Prada &

Vega, 2008), correspondientes a 5mg y 10mg de extracto respectivamente.

4.6 Controles

Se utilizaron como control de crecimiento de cada hongo el medio inoculado sin perforar, para realizar el control blanco se utilizarán 50 y 100uL de DMSO por duplicado, y un antifúngico comercial como control positivo (Hipoclorito de sodio al 5,25%) (Ramírez & Diaz, 2007).

4.7 Incubación

Las levaduras y los hongos filamentosos se incubaron a 28°C durante 7 días.

4.8 Análisis estadístico- Medición de la actividad antimicrobiana relativa

Luego de la incubación se realizó la medición de los halos de cada montaje y se calculó la actividad antimicrobiana relativa respecto al antifúngico comercial y al DMSO empleando la siguiente fórmula (Ramírez & Diaz, 2007).

Diámetro del halo blanco (mm): DMSO

Diámetro del control (mm): Hipoclorito de sodio al 5,25%

5. RESULTADOS

5.1 Extractos totales obtenidos a partir de las flores en los solventes: éter de petróleo, etanol y diclorometano.

Las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans no presentaron halos de inhibición respecto a los extractos totales de las flores de Sinapis alba, como tampoco lo presentaron frente al dimetilsulfóxido; sin embargo, presentaron inhibición frente al control positivo realizado con hipoclorito (Figuras 2 y 3).

Los hongos filamentosos Penicillium chrysogenum y Aspergillus niger presentaron halos frente al dimetilsulfóxido, sin embargo, Aspergillus niger fue el único en evidenciar inhibición frente a los extractos éter de petróleo y etanol, presentando un halo mayor al del control positivo realizado (Figuras 4 y 5).

(13)

Particularmente en el caso de A. niger contra el extracto de las flores utilizando el solvente éter de petróleo en el volumen de 100 μL podría reportarse un falso positivo, ya que la actividad antifúngica relativa estaría dada por el DMSO y no por la composición del material vegetal; por el contrario en los extractos de las flores utilizando los solventes etanol y éter de petróleo con volumen de 50μL la inhibición es mayor que en el blanco, lo que indica que esos extractos tienen posiblemente acción frente a este hongo (Tabla 1.).

Tabla 1. Resultados de las mediciones de los halos (mm) y el porcentaje de inhibición de los extractos totales de las flores contra los cuatro microorganismos y sus respectivos

controles

Microorganismo Extracto

(Flores) Volúmen (μL)

Halos

% Inhibición % CV halo de

inhibición (mm)

halo de inhibición control con

DMSO (mm)

halo de inhibición control de hipoclorito

(mm)

Saccharomyces cerevisiae

Dicloro 50 -

- 16

0 0

100 - 0 0

Etanol

50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo 50 - 0 0

100 - 0 0

Candida albicans

Dicloro

50 -

- 15

0 0

100 - 0 0

Etanol 50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo

50 - 0 0

100 - 0 0

Aspergillus niger

Dicloro 50 -

18 12

0 0

100 - 0 0

Etanol

50 31 217 10

100 - 0 0

petróleo 50 21 50 7

100 13 0 0

Penicillium chrysogenum

Dicloro

50 -

16 15

0 0

100 - 0 0

Etanol 50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo

50 - 0 0

100 - 0 0

(14)

Figura 2. Controles de P. chrysogenum durante ensayo flores. a. Control de crecimiento b.

control con hipoclorito de sodio (15mm) c. control con DMSO (16mm)

Figura 3. Resultados y controles A. niger durante ensayo flores. a. control de crecimiento b.

control con hipoclorito (12mm) c. controles con DMSO (18mm) d. etanol 50μL (31mm) e.

petrol 100μL (13mm) f. petrol 50μL (21mm)

Figura 4. Controles C. albicans durante ensayo flores. a. Control con hipoclorito (15mm) b.

control de crecimiento

(15)

Figura 5. Controles S. cerevisiae durante ensayo flores. a. control con hipoclorito (16mm) b.

control de crecimiento dilución 10-4

5.2 Extractos totales obtenidos a partir de las hojas y de los tallos en los solventes: éter de petróleo, etanol y diclorometano

Las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans no presentaron halos de inhibición respecto a los extractos totales de las hojas ni de los tallos de Sinapis alba, como tampoco lo presentaron frente al dimetilsulfóxido; sin embargo, presentaron inhibición frente al control positivo realizado con hipoclorito (Figuras 6 y 7).

Los hongos filamentosos Penicillium chrysogenum y Aspergillus niger presentaron halos frente al dimetilsulfóxido y el control con hipoclorito, pero no frente a los extractos totales de las hojas ni de los tallos (Figuras 8 y 9).

Tabla 2. Resultados de las mediciones de los halos (mm) y el porcentaje de inhibición de los extractos totales de las hojas y de los tallos contra los cuatro microorganismos y sus respectivos controles

Microorganismo

Extracto (Hojas y tallos)

Volúmen (μL)

Halos

% Inhibición % CV halo de

inhibición (mm)

halo de inhibición control con

DMSO (mm)

halo de inhibición control de hipoclorito (mm)

Saccharomyces cerevisiae

Dicloro

50 -

- 16

0 0

100 - 0 0

Etanol

50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo

50 - 0 0

100 - 0 0

Candida albicans

Dicloro 50 -

- 17

0 0

100 - 0 0

Etanol

50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo 50 - 0 0

100 - 0 0

Aspergillus

niger Dicloro

50 -

13 10

0 0

100 - 0 0

(16)

Etanol

50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo

50 - 0 0

100 - 0 0

Penicillium chrysogenum

Dicloro

50 -

14 12

0 0

100 - 0 0

Etanol 50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo

50 - 0 0

100 - 0 0

Figura 6. Controles C. albicans hojas y tallos a. control positivo (17mm) b. control crecimiento

Figura 7. Controles S. cerevisiae hojas y tallos a. control crecimiento b. control positivo (16mm)

(17)

Figura 8. Controles A. niger hojas y tallos a. control de crecimiento b. control positivo (10mm) c. control con DMSO (13mm)

Figura 9. Controles P. chrysogenum hojas y tallos a. control de crecimiento b. control positivo (12mm) c. control con DMSO (14mm)

5.3 Extractos totales obtenidos a partir de las raíces en los solventes: éter de petróleo, etanol y diclorometano.

Las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans no presentaron halos de inhibición respecto a los extractos totales de las raíces de Sinapis alba, como tampoco lo presentaron frente al dimetilsulfóxido; sin embargo, presentaron inhibición frente al control positivo realizado con hipoclorito (Figuras 10 y 11).

Los hongos filamentosos Penicillium chrysogenum y Aspergillus niger presentaron halos frente al dimetilsulfóxido y el control con hipoclorito, pero no frente a los extractos totales de este órgano vegetal (Figuras 12 y 13).

(18)

Tabla 4. Resultados de las mediciones de los halos (mm) y el porcentaje de inhibición de los extractos totales de las raíces contra los cuatro microorganismos y sus respectivos

controles

Microorganismo Extracto

(Raíces) Volúmen (μL)

Halos

% Inhibición %CV halo de

inhibición (mm)

halo de inhibición control con

DMSO (mm)

halo de inhibición control de hipoclorito

(mm)

Saccharomyces cerevisiae

Dicloro

50 -

- 13

0 0

100 - 0 0

Etanol

50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo 50 - 0 0

100 - 0 0

Candida albicans

Dicloro

50 -

- 15

0 0

100 - 0 0

Etanol

50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo

50 - 0 0

100 - 0 0

Aspergillus niger

Dicloro 50 -

11 8

0 0

100 - 0 0

Etanol

50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo 50 - 0 0

100 - 0 0

Penicillium chrysogenum

Dicloro

50 -

12 9

0 0

100 - 0 0

Etanol 50 - 0 0

100 - 0 0

petróleo

50 - 0 0

100 - 0 0

(19)

Figura 10. Controles de raíces S. cerevisiae a. control positivo (13mm) b. control de crecimiento

Figura 11. Controles de raíces C. albicans a. control de crecimiento dilución 10-3 b. control positivo (15mm)

Figura 12. Controles de raíces P. chrysogenum a. control de crecimiento b. control positivo (9mm) c. control con DMSO (13mm)

(20)

Figura 13. Controles de raíces A. niger. a. control de crecimiento b. control con DMSO (11mm) c. control positivo (8mm)

6. DISCUSIÓN

Sinapis alba está reportada en la literatura como una planta productora de péptidos de bajo peso molecular (7-9kDa) con acción antifúngica defensinas y taninos, estas últimas fueron clasificadas en 1995 por causar cambios morfológicos en las hifas o no hacerlo mientras tenían efecto antifúngico (Broekaert, Terras, Cammue , & Osborn, 1995). La producción de estos péptidos según la literatura se realiza en los órganos vegetales hojas, raíz, tallo y flores (Meira Ribeiro, y otros, 2013), sin embargo el único órgano que al utilizar solventes polares (etanol) y apolares (éter de petróleo) presentó actividad antifúngica fueron las flores, posiblemente porque allí se encuentren en mayor concentración, o en la concentración suficiente para inhibir el crecimiento de A. niger como lo reportado en literatura (Meira Ribeiro, y otros, 2013).

La levadura S. cerevisie se encuentra reportada en literatura como sensible a las defensinas y taninos producidos por S. alba (Meira Ribeiro, y otros, 2013), pero no fue inhibida por los extractos totales de ninguno de los órganos vegetales, posiblemente porque se encontraban en baja concentración. Los órganos hojas, tallo y raíz no mostraron actividad antifúngica sobre ninguno de los hongos, esto puede deberse a una menor concentración de los péptidos que en las flores, haciéndolos incapaces de ejercer un efecto inhibitorio sobre los hongos.

Brassica oleracea también perteneciente a la familia de las crucíferas, se encuentra reportada en literatura por inhibir el crecimiento de C. albicans y de A. niger aproximadamente en un 50% a partir de un jugo hecho al centrifugar y homogenizar sus hojas; esta planta es productora de glucosinolatos (Sisti, Amagliani , & Brandi, 2003), aceites producidos durante el metabolismo secundario de las plantas pertenecientes a esta familia (Sanchez, Vargas, & Jimenez, 2015).

Existen reportes de la producción de glucosinolatos en Sinapis alba (Ekanayake, Zoutendam, Strife, Fu, & Jayatilake, 2012) y como se señala en literatura estos compuestos deben estar en una alta concentración para inhibir los microorganismos (Sisti, Amagliani , & Brandi, 2003), sin embargo, en estudios previos se ha demostrado que los hongos responden de distinta forma ante un estímulo, como lo es enfrentarse a un extracto vegetal, causando la inhibición micelial o la inhibición de su esporulación (Espinosa & Langenheim , 1991).

P. chrysogenum no esporuló durante ninguno de los ensayos (Figuras 2,9 y 12), probablemente por algunos compuestos volátiles (Linton & Wright , 1973) que causaron la inhibición su esporulación, posiblemente provenientes de los extractos vegetales; sin embargo, A. niger esporuló frente a los extractos que no presentó inhibición micelial (Figuras 8 y 13), es decir, frente a los extractos de los órganos vegetales hojas, tallos y raíz, ya que al enfrentarse con los extractos etanol y éter de petróleo de las flores fue inhibido su crecimiento miceliar y la esporulación al mismo tiempo (Figura 3), esto concuerda con un estudio previo al exponer A. flavus y A. parasiticus

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a extractos de Larrea tridentata, provocando una reacción del hongo al inhibir su crecimiento miceliar y no esporular (Sanchez C. , 2000).

Existen reportes de la acción inhibitoria de S. alba contra hongos fitopatógenos como Alternaria brassicae (Pedras & Smith , 1997 ), Alternaria brassicicola (Mazumder , y otros, 2013) y Verticillium dahliae (Alcántara C. , Pujadas, Saavedra, & Sánchez, 2009) por lo que podría investigarse el uso de los extractos en industrias agrícolas, invernaderos, etc. para controlar la diseminación de estos hongos por los cultivos blanco, ya que los experimentos realizados por los investigadores involucran la planta completa y no extractos de los órganos vegetales de la misma.

El DMSO es un líquido higroscópico e incoloro, usado como disolvente, de naturaleza aprótica que se asocia con cationes, dejando los aniones libres y reactivos (Beyer & Walter, 1987), tuvo un efecto inhibitorio sobre los hongos filamentosos y no contra las levaduras probablemente por las diferencias en su pared celular, ya que la pared celular de los hongos filamentosos P.

chrysogenum y A. niger está compuesta en su mayoría por quitina y glucano, diferente a la de las levaduras que contiene principalmente manano y glucano, también quitina pero en una menor cantidad (García, 1968), pudiendo ser la quitina el punto débil de la pared celular que ocasionó la sensibilidad de estos hongos.

7. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES

El órgano vegetal de Sinapis alba con actividad antifúngica relativa fueron las flores, en los solventes éter de petróleo y etanol a volumen de 50 μL sobre el microorganismo Aspergillus niger, utilizando el método de placas y pozos.

Se recomienda que en un estudio posterior se realice una cromatografía para confirmar que la actividad antifúngica está dada por los péptidos antimicrobianos defensinas y taninos; además realizar las pruebas de actividad antifúngica relativa utilizando masas de los extractos totales mayores a las probadas en el presente estudio.

8. BIBLIOGRAFÍA

Abarca, L. (2000). Taxonomía e identificación de especies implicadas en la aspergilosis nosocomial. Revista Iberoamericana de Micología , 79-84.

Alcántara, A., Pujadas, A., & Saavedra, M. (2011). Management of Sinapis alba subsp. mairei winter cover crop residues for summer. Crop Protection, 1239-1244.

Alcántara, C., Pujadas, A., Saavedra, M., & Sánchez, S. (2009). Brassica species as winter cover crops in sustainable agricultural systems in southern Spain. Journal of Sustainable Agriculture, 619-635.

Atchade, E., Jean-Baptiste, S., Houzé , S., Chabut, C., Massias, L., Castier, Y., Montravers, P.

(2017). Fatal invasive aspergillosis caused by Aspergillus niger after bilateral lung transplantation. Medical Mycology Case Reports , 4-7.

Beyer, H., & Walter, W. (1987). Química Orgánica. Barcelona: Reverté.

Broekaert, W., Terras, F., Cammue , B., & Osborn, R. (1995). Plant Defensins: Nobel Antimicrobial Peptides as component of the Host Defense system. Plant Physiology , 1353-1358.

Carvalho, T., Souza, I., Ferreira, R., Batista, N., & Franco, M. (2011). Optimization of productions of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger using residue of mango a substrate. Ciência Rural, vol. 21, no. 12.

Duke, J. (1983). Handbook of Energy Crops.

(22)

Ekanayake, A., Zoutendam, P., Strife, R., Fu, X., & Jayatilake, G. (2012). Development of white mustard (Sinapis alba L.) essential oil, a food preservative. Food Chemistry , 767-774.

Espinosa, F., & Langenheim , J. (1991). Effect of some leaf essential oil phenotypes in coastal redwood on the growth of several fungi with endophytic stages. Biochemical Systematics and Ecology, 629-642.

García, B. (1968). Cell wall chemistry, morphogenesis, and taxonomy of fungi . California.

Girón, I. (2008). Antimicrobianos. Honduras.

Haq, I.-U., Ali, S., & Iqbal, J. (2003). Direct production of citric acid from raw starch by Aspergillus niger. Process Biochemistry, 921-924.

Kurtzman, C., Fell, J., & Boekhout, T. (2011). The Yeasts a Taxonomic Study. Elsevier.

Lee, Y., Jin , Y., Cha, Y., & Seo, J. (2017). Bioethanol production from cellulosic hydrolysates by engineered industrial Saccharomyces cerevisiae. Bioresource technology, 355-361.

Linton , C., & Wright , S. (1973). Volatile organic compounds: microbiological aspects and some technological implications. Journal of Applied Bacteriology , 75, 1-12.

Mazumder , M., Das, S., Saha, U., Chatterjee, M., Bannerjee , K., & Basu, D. (2013). Salicylic acid- mediated establishment of the compatibility between Alternaria brassicicola and Brassica juncea is mitigated by abscisic acid in Sinapis alba. Plant physiology and biochemistry, 43- 51.

Meira Ribeiro, S., Farias Porto , W., Nascimiento Silva , O., de Oliveira Santos, M., Campos Dias, S., & Franco, O. L. (2013). Handbook of Biologically Active Peptides. capitulo 26: Elsevier.

Midcalf, B., Phillips, M., Neiger, J., & Coles, T. (2004). Phamaceutical Isolators. Pharmaceutical Press.

Murray, P. (2016). Microbiología Médica. Philadelphia: Elsevier.

Nielsen, J. (1997). Physiological Engineering Aspects of Penicillium chrysogenum. World Scientific.

Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica. Panamericana.

Ocampo, R., Ríos, A., Betancur, A., & Ocampo, D. (2008). Curso práctico de Química Orgánica.

Manizales.

Patiño, A. (2000). Introducción a la Ingeniería Química (Balances de Masa y Energía). México.

Pedras, S., & Smith , K. (1997 ). SINALEXIN, A PHYTOALEXIN FROM WHITE MUSTARD ELICITED BY DESTRUXIN B AND ALTERNARIA BRASSICAE. Phytochemistry, 833-837 vol. 46.

Polli , F., Meijrink, B., Bovenberg, R., & Driessen, A. (2016). New promoters for strain engineering of Penicillium chrysogenum. Fungal Genetics and Biology, 62-71.

Powers-Fletcher, M., Kendall, B., Griffin, A., & Hanson, K. (2016). Fiamentous Fungi. Microbiology Spectrum.

Prada, L., & Vega, P. (Abril de 2008). Pontificia Universidad Javeriana. Obtenido de

Caracterización y evaluación de actividad antimicrobiana de extractos etanólicos de hongos de la familia Tricholomataceae frente a agentes causales de dermatomicosis en animales: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis135.pdf

(23)

Prasad, R. (2017). Biology, Candida albicans: Cellular and Molecular. Springer Nature.

Ramírez, L., & Diaz, H. (2007). Actividad antibacteriana de extractos y fracciones del ruibarbo (Rumex conglomeratus). Scientia et Technica, 397-400.

Sanchez, C. (2000). Universidad Autónoma de Nuevo León. Obtenido de Alteración del

crecimiento, la esporulación y la producción de toxinas de Aspergillus flavus Link ex Fries y Aspergillus parasiticus Speare por extractos de plantas del género Yucca y Larrea

tridentata DC Cov. : http://eprints.uanl.mx/830/1/1020145323.PDF

Sanchez, G., Vargas, A., & Jimenez, P. (2015). Evaluación de la actividad antifúngica de extractos etanólicos de dos morfotipos de Raphanus raphanistrum L. sobre tres hongos

fitopatógenos. Bioagro.

Sisti, M., Amagliani , G., & Brandi, G. (2003). ntifungal activity of Brassica oleracea var. botrytis fresh aqueous juice. Fitoterapia, 453-458.

Tong , Y., & Tang , J. (2017). Candida albicans infection and intestinal immunity. Microbiological Research , 27-35.

Universidad Politécnica de Madrid. (2001). Open Course Ware. Obtenido de Uso industrial de plantas aromáticas y medicinales: http://ocw.upm.es/ingenieria-agroforestal/uso-industrial- de-plantas-aromaticas-y-medicinales/contenidos/material-de-clase/tema12.pdf

Wolff, K., Goldsmith, L., Katz, S., Gilchrest, B., Paller, A., & Leffel, D. (2009). Dermatología en Medicina General.

Guerra, M., Torres , D., & Martínez , L. (2001). Validación del uso tradicional de plantas medicinales cultivadas en Cuba. Revista Cubana de Plantas Medicinales.

Tapia, C. (2009). Actualización en técnicas de susceptibilidad antifúngica. Revista Chilena de Infectología, 144-150.

Utami, T., Hariyani, I., Alamsyah , G., & Hermansyah , H. (2017). Production of dry extract extracellular lipase from Aspergillus niger by solid state fermentation method to catalyze biodiesel synthesis. Energy Procedia, 41-46.

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