Genética de la tembladera o scrapie ovino

Genética de la tembladera o scrapie ovino

Laboratorio de Genética. Facultad de Veterinaria. UCM. http://www.ucm.es/info/genetvet

El scrapie, prurito lumbar o tembladera es una enfermedad degenerativa, transmisible, que afecta al sistema nervioso central de óvidos y cápridos, que pertenece al grupo de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, y cuyo curso es fatal para el animal que la padece.

Esta enfermedad fue ya descrita en 1732 y afecta a la especie ovina de la mayoría de los paises, con la excepción de Australia y Nueva Zelanda. Se caracteriza, al igual que las demás Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, por la acumulación de una proteína (PrP o prión) que adquiere una conformación anormal (PrPsc_{) en diferentes órganos del animal afectado (Prusiner et al., 1990).} Los síntomas clínicos típicos del scrapie en la oveja incluyen incoordinación motora, prurito, excitabilidad, temblores, finalizando con parálisis y la muerte del animal (Dickinson, 1976; Clark y Moar, 1992). En algunas ocasiones no cursa con estos síntomas y sólo las lesiones histopatológicas evidencian la enfermedad (Onodera y Hayashi, 1994). Aunque no ha sido caracterizado ningún agente infeccioso, hay evidencias experimentales de la existencia de diferentes tipos de scrapie (Bruce y Dickinson, 1987).

plantea es que la proteína salvaje actuaría como un receptor con escasa afinidad para el agente desencadenante del scrapie, mientras que la proteína mutada (PrPSc) tendría una mayor afinidad por dicho agente, de tal manera que sólo los portadores del genotipo mutado padecerían la enfermedad.

Hoy resulta evidente la existencia de un determinismo genético para la resistencia o la susceptibilidad a la enfermedad en la especie ovina asociado a la combinación de determinados amino-ácidos en las posiciones 136, 154 y 171 de la proteína PrP. En la especie ovina, el gen prp codifica una proteína de 256 aminoácidos. En este gen se han descrito una serie de mutaciones (Figura 1), 7 de ellas en la región codificante que originan cambio amino-acídico, y una en el extremo 3’ no traducido (3’-UTR) detectable mediante la enzima EcoR1 (Hunter et al., 1991). Los polimorfismos ubicados en la región codificante y asociados con la susceptibilidad a la enfermedad afectan al codón 136 (Clouscard et al., 1995; Ikeda et al., 1995) y a los codones 154 y 171 (Clouscard et al., 1995; Ikeda et al., 1995; Hunter et al., 1996).

En la especie ovina, a diferencia de la especie bovina, se ha encontrado asociación entre determinados haplotipos del gen prp y la aparición de la enfermedad. Así, por ejemplo, se asocia los haplotipos V136R154Q171, A136R154Q171y A136R154H171, con la susceptibilidad a padecer la enfermedad, y los haplotipos A136R154R171 y A136H154Q171 con la resistencia a padecer la enfermedad (ver en la tabla 1 el significado de los diferentes símbolos).

Tabla 1.- Relación entre aminoácido y su símbolo

Aminoácido Símbolo

está asociado a una elevada susceptibilidad en ovejas de la raza Suffolk (Westaway et al., 1994) y otras razas francesas (Barillet et al., 2002).

Figura 1.- Posición de algunas de las mutaciones descritas en el gen prp

En prácticamente todos los países europeos, incluido España, se ha llevado a cabo, o se está llevando, un genotipado sistemático de los tres codones mediante diferentes técnicas: PCR-RFLP (Hunter et al., 1994; Yuzbasuyan-Gurkan et al., 1999), PCR alelo-específica (Okayama et al., 1989) o Primer Extension (Syvänen, 1999) con el fin de disponer de información sobre la frecuencia de las diferentes variantes génicas y de los diferentes genotipos.

Recientemente, el 14 de febrero se publicó en el DOUE (Diario Oficial de la Unión Europea) una Decisión de la Comisión por la que se fijan los requisitos mínimos para el establecimiento de programas de cría de ovinos resistentes a las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). De acuerdo con esta Decisión, el primero de enero de 2004 tendrán que estar disponibles programas de mejora en todas las razas ovinas encaminados a incrementar la resistencia a las EET, así como un criterio para el reconocimiento del nivel de resistencia a estas EET.

La participación de los rebaños en los programas de mejora podrá ser voluntaria, a criterio del país, hasta el primero de abril de 2005, siendo obligatoria a partir de esa fecha. Los programas de mejora consistirán, básicamente, en el incremento de la frecuencia de los individuos ARR/ARR, genotipo que se considera el de mayor resistencia al scrapie, y la reducción de aquellas variantes genéticas asociadas a la susceptibilidad que son fundamentalmente la VRQ y ARQ. De hecho cualquier reproductor que presente la variante del gen VRQ no sólo no podrá ser

utilizado para la reproducción, sino que no podrá salir de la explotación salvo para ser sacrificado.

Aunque parece evidente que la susceptibilidad/resistencia al scrapie se mueve en una cierta escala entre los diferentes genotipos cuyos valores, posiblemente con pocas variaciones, pueda ser diferente entre razas (ver tabla 2) el objetivo que parece claramente imponerse es el de disponer de animales homocigotos para el alelo ARR. De hecho, la reciente Decisión publicada considera rebaños de nivel I los formados en su totalidad por animales de genotipo ARR/ARR y los rebaños de nivel II serán aquellos en los que la progenie proviene de moruecos de genotipo también homocigoto ARR/ARR, es decir, se garantiza que la progenie será portadora de al menos un alelo ARR.

Tabla 2.- Consideraciones sobre la utilización como reproductores de los diferentes genotipos en la Plan Nacional contra el Scrapie de Gran Bretaña1

Genotipo Susceptibilidad/Resistencia ARR/ARR Se considera el genotipo más resistente al

scrapie ARR/AHQ

ARR/ARH ARR/ARQ

Animales considerados genéticamente resistente pero que deben manejarse con cuidado si pretenden ser utilizados como reproductores ARQ/ARH ARQ/AHQ AHQ/AHQ ARH/ARH AHQ/ARH ARQ/ARQ*

Animales con escasa resistencia al scrapie que podrán ser utilizados como reproductores libremente sólo hasta finales del año 2004. Posteriormente, con la excepción de los señalados con * se utilizarán para reproducción por un período máximo de 3 años o hasta el final de su vida.

ARR/VRQ Animales genéticamente susceptibles al scrapie pero que podrían ocasionalmente ser utilizados como reproductores en el contexto de un programa de mejora aprobado2.

AHQ/VRQ ARH/VRQ ARQ/VRQ VRQ/VRQ

Animales muy susceptibles al scrapie que deberán ser sacrificados o castrados

*

Este genotipo es cuidadosamente vigilado y curiosamente en España, hasta donde tenemos información, es el que aparece en la mayoría de los animales afectados de scrapie

1

Es posible que algunas de estas consideraciones se vean modificadas después de la publicación de la Decisión de la Comisión

2

En este caso se valora positivamente la posibilidad que tienen estos animales de transmitir el alelo ARR que confiere resistencia al scrapie.

3 y puede observarse una drástica reducción de la frecuencia de animales clínicamente enfermos. Esta gran reducción parece explicarse, en gran medida, porque las placentas de las hembras resultaron negativas incluso cuando la oveja era positiva al scrapie si sus corderos eran heterocigotos u homocigotos resistentes. Tabla 3.- Resultados de la utilización sistemática de moruecos ARR/ARR sobre la incidencia y el riesgo relativo al scrapie

Año de nacimiento Nº de ovejas % ovejas nacidas de

moruecos ARR/ARR Incidencia de scrapie Riesgo relativo1 1997 1998 1999 2000 98 92 92 73 3,1 % 5,4 % 100,0 % 100,0 % 27 20 0 0 1,000 0,975 0,856 0,184

1 _{Se refiere al cociente entre la proporción de afectados en el año 1997 dividido por la proporción de afectados en}

los otros años. Así, por ejemplo, el riesgo o probabilidad de padecer scrapie es 5,4 veces menor si se ha nacido en el año 2000 que si lo ha hecho en el año 1997.

En el Laboratorio de Genética de la Facultad de Veterinaria de Madrid hemos analizado (ver protocolo de análisis en cuadro1) durante los últimos 2 años un número aproximado de 300 animales de diferentes razas ovinas autóctonas, incluida la raza Assaf aún no oficialmente reconocida pero con programas de mejora bastante desarrollados. Los resultados de las frecuencias obtenidas se presentan en la tabla 4 y se representan gráficamente en la figura adjunta.

Tabla 4.- Frecuencias de las variantes alélicas y genotípicas

Variante del gen ARR ARQ ARH AHQ VRQ

Algunos comentarios en relación con estos resultados pueden ser de interés. La frecuencia de animales homocigotos para el alelo ARR, los únicos que se proponen como reproductores aceptables en los rebaños del nivel más elevado, es inferior al 5 %. Evidentemente una medida que pretendiera utilizar sólo este 5 % de reproductores podría dar lugar a una drástica reducción de las ganancias genéticas esperadas para los caracteres de interés económico si no se actúa con buen criterio, y esto aunque éstas características no tuvieran ninguna asociación con los diferentes alelos del gen prp.

Cuadro 1.- Protocolo de análisis

El ADN se extrajo a partir de sangre y de semen siguiendo protocolos estándar. La amplificación de 639 pb de ADN genómico correspondiente al gen prp se realizó en un volumen de 25 µL con la siguiente composición: 5 µl de la lisis alcalina, 0,5 unidades de Taq polimerasa (Biotools), 10 pmol de cada cebador: SCRAPOV-for:

(GTGAAAAGCCACATAGGCAGTTGG) y SCRAPOV-rev: (GCTCCACCACTCGCTCCATTATCTTG), 1,5 mM de MgCl2, Buffer 1x y 200 µM de

dNTPs. Después de purificar el producto amplificado por precipitación con etanol (con el objetivo de eliminar los restos de oligonucleótidos y dNTPs no incorporados) se llevó a cabo una minisecuenciación para la que se emplearon oligonucleótidos específicos diseñados a partir de la secuencia de PrP ovina AJ223072 (Goldmann et al., 1990), con distintas longitudes para evitar el solapamiento entre productos finales (ver Tabla). Esta reacción en múltiplex se llevó a cabo en un volumen final de 10 µL, con la siguiente composición: 5 µL de kit SNaPshot (Applied Biosystem), 1 µL de PCR purificada (0.4 pmol total) y 1 µL de cada cebador a 5 µM. Previo a su carga en el secuenciador automático ABI PRISM 3100 se purificó mediante precipitación con etanol. El análisis de los fragmentos se llevó a cabo mediante el software Genescan 3.7.1®. El tamaño relativo de los fragmentos se determinó por comparación con el estandar interno de tamaño GeneScan 120-LIZ (Applied Biosystems). En la figura 3 pueden observarse la lectura de dos genotipos correspondientes a dos imágenes obtenidas mediante este método de análisis.

Tabla.- Oligonucleótidos diseñados para el análisis del gen PrP ovino.

Cebador Secuencia(1) _Resultado(2)

Prp136 GTGGCTACATGCTGGGAAGTG negro (C:A) / rojo (T:V)

Prp154 TATACATTTTGGCAATGACTATGAGGACCGTTACTATC azul (G:R)/ verde (A:H)

Prp171.2 TATATCCAAGTGTACTACAGACCAGTGGATC azul (G:R)/ verde (A:H o Q)

Prp171.3 GCTACAGACCAGTGGATCA azul (G:H) / rojo (T:Q) 1) _{Todas las secuencias tienen una orientación 5’-3’}

2)

El resultado indica en primer término el color de la señal, y entre paréntesis, el nucleótido detectado (en cursiva) y correspondencia amino-acídica (en negrita).

en evaluación y que necesitamos elegir a los 5 mejores para ser utilizados posteriormente mediante inseminación artificial. Si suponemos una distribución uniforme de los genotipos resistentes entre la clasificación por mérito genético de los 100 moruecos, los 5 machos con genotipo ARR/ARR estarían situados a lo largo de todo el rango de variación de esos 100 moruecos, por lo que la media del valor genético de estos 5 moruecos sería prácticamente igual a la media de los 100 moruecos, es decir, la intensidad de selección sería nula y nulo el progreso genético que se lograría.

Figura 3.- Imágenes proporcionadas por un ABI PRISM 3100 de dos genotipos, AA136RH154HQ171 en la parte superior y AA136RR154RQ171 en la inferior

Tal vez el resultado más preocupante de los que presentamos pueda ser esa elevada frecuencia de animales homocigotos para el considerado alelo salvaje ARQ (46 %), que ha sido el genotipo de casi todos los animales a los que se ha diagnosticado el scrapie. La frecuencia media de este alelo es de casi el 71 % y en todas las razas analizadas el valor es siempre muy elevado, entre el 60 y el 82 %. Por el contrario, la variante genética VRQ es muy poco frecuente en todas las poblaciones analizadas en nuestro laboratorio, incluso en la mayoría de las razas francesas la frecuencia de este alelo es inferior al 10 %.

Tenemos la sensación que desde Bruselas se han precipitado decisiones que, aunque podrían tener una justificación en algunos paises, no estamos convencidos de que el coste de un programa de estas características tenga la prioridad que necesariamente tendrá que imponer nuestra administración. Necesitaremos algún tiempo para conocer con suficiente precisión cual es la frecuencia de la enfermedad, con que genotipos se asocia en las diferentes razas, y si la selección basada en estos genotipos es, como debiera, para resistencia a la enfermedad o para retrasar la aparición de la misma.