Selección de cepas de Pleurotus ostreatus (Jacq:Fr.) P.
Kumm. y Pleurotus pulmonarius (Fr.) Singer, a partir del
crecimiento micelial en viruta de pino y obtención de
nuevas cepas por entrecruzamiento: comparación de la
producción de carpóforos
T E S I S
QUE PARA OPTAR POR EL TITULO DE
MAESTRA EN
ECOLOGÍA FORESTAL
PRESENTA
María Tomasa Rosalía Pérez Merlo
DIRIGIDA POR
MC. Juan Alba Landa
CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ... iii
RESUMEN ... v
SUMMARY... vi
1. INTRODUCCIÓN ... 1
1.1. El cultivo de los hongos comestibles ... 1
1.2. Uso potencial de la madera de pino para el cultivo de hongos ... 2
1.3. Conservación de los recursos genéticos ... 3
2. OBJETIVOS ... 5 2.1. Objetivo General ... 5 2.2. Objetivos Específicos ... 5 3. REVISIÓN DE LITERATURA ... 6 3.1. Ecología y distribución ... 6 3.2. Morfología ... 6 3.3. Taxonomía ... 7 3.4. Valor Nutricional... 8 3.5. Producción ... 9
3.6. Cultivo del hongo...10
3.6.1. Substratos frescos ... 11 3.6.2. Substratos fermentados...12 3.6.3. Substratos mezclados ...13 3.7. Sexualidad en hongos...13 3.8. Ciclo de vida ...14 4. MATERIAL Y MÉTODOS ...16 4.1. Cepas estudiadas ...16 4.2. Fase de laboratorio ...19
4.2.1. Selección de cepas de acuerdo al crecimiento micelial obtenido en un medio de cultivo sólido enriquecido con derivados solubles de lignina (Indulin AT; Sigma) ...19
4.2.2. Selección de cepas de acuerdo a la medición del área micelial alcanzada en su cultivo in vitro en viruta de pino ...19
4.2.3. Aislamiento de cultivos monospóricos ... 21
4.2.4. Determinación de los tipos de apareamiento ... 21
4.2.5. Estimación del área micelial de los cultivos monospóricos ... 22
4.2.6. Obtención y selección de los dicariones (cruzas intra e inter-especimen) .... 22
4.2.7. Diseño y Análisis estadísticos de los Datos ... 23
4.3. Fase de planta piloto... 24
4.3.1. Preparación del spawn ... 24
4.3.2. Siembra ... 24
4.3.3. Incubación ... 24
4.3.4. Evaluación de la producción de las fructificaciones ... 25
4.3.5. Diseño y análisis estadísticos de los datos... 26
5. RESULTADOS ... 27
5.1. Fase de Laboratorio ... 27
5.1.1. Selección de cepas ... 27
5.1.2. Aislamiento de monospóricos y determinación de los tipos de apareamiento 28 5.1.3. Estimación del área micelial de los cultivos monospóricos ... 31
5.1.4. Obtención y selección de los dicariones (cruzas intra e inter-especimen) .... 32
5.2. Fase de Planta Piloto ... 34
5.2.1. Preparación del spawn, siembra e incubación ... 34
5.2.2. Aparición de primordios y duración del ciclo de cultivo ... 35
5.2.3. Cosechas obtenidas ... 38
5.2.4. Evaluación de la producción de cuerpos fructíferos ... 41
6. DISCUSIÓN ... 44
7. CONCLUSIONES ... 47
8. RECOMENDACIONES ... 48
9. LITERATURA CITADA ... 49
ANEXO 1 ... 56
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Pleurotus ostreatus fructificando sobre paja de cebada. ... 4
Figura 2. Ciclo de vida de Pleurotus ostreatus. 1. Basidiosporas, 2. Germinación de basiodosporas, 3. Micelio monocarión, 4. Plasmogamia, 5. Dicarión, 6-7. Cuerpo fructífero. 8. Cariogamia y meiosis y 9. Liberación de basidiosporas. (Mestizo-Valdés, 1997) ...15
Figura 3. Metodología empleada en este trabajo (modificación de Guzmán, et al. 1994) ...18
Figura 4. Metodología empleada para la selección de cepas de acuerdo a la medición del área micelial (modificación de Mata y Savoie, 2001). ...20
Figura 5. Germinación de esporas ...22
Figura 6. Cruzas de Pleurotus ostreatus ...22
Figura 7. Metodología empleada para la evaluación de la producción de cuerpos fructíferos (modificación de Guzmán, et al. 1993) ...25
Figura 8. Spawn a los 15 días de incubación ...35
Figura 9. Colonización del micelio sobre los substratos ...35
Figura 10. Primordios de Pleurotus ostreatus en paja de cebada ...38
Figura 11. Primordios de Pleurotus ostreatus en viruta de pino ...38
Figura 12. Fructificaciones de Pleurotus ostreatus en paja de cebada ...42
Tabla 1. Contenido de proteína, carbohidratos, grasas y fibra de las principales especies
cultivadas de hongos comestibles. ... 9
Tabla 2. Producción estimada (peso fresco) de Pleurotus spp. en algunos países de América
(1998)... 10
Tabla 3. Registro y procedencia de las cepas utilizadas en este trabajo ... 17 Tabla 4. Área promedio (mm2) en viruta de pino de las 19 cepas de Pleurotus, a los 7 días de incubación. ... 27
Tabla 5. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 8 de P.
ostreatus. ... 29
Tabla 6. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 38 de P.
ostreatus. ... 29
Tabla 7. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 49 de P.
ostreatus. ... 30
Tabla 8. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 239 de P.
ostreatus. ... 30
Tabla 9. Área micelial promedio en mm2 ( y desviación estándar) de los monospóricos de las cepas IE 8 e IE 38 en viruta de pino, a los 7 días de incubación. ... 31
Tabla 10. Área micelial promedio en mm2 ( y desviación estándar) de los monospóricos de las cepas IE 49 e IE 239 en viruta de pino, a los 7 días de incubación ... 32
Tabla 11. Área promedio en mm2 de las cruzas intra-especimen de las cepas de P. ostreatus en viruta de pino , a los 7 días de incubación ... 33
Tabla 12. Área promedio en mm2 de las cruzas inter-especimen de las cepas de P. ostreatus en viruta de pino , a los 7 días de incubación. ... 34
Tabla 13. Comportamiento de las cepas de Pleurotus ostreatus cultivadas en paja de cebada .... 36 Tabla 14. Comportamiento de las cepas de Pleurotus ostreatus cultivadas viruta de pino ... 36 Tabla 15. Producción de fructificaciones (%) por cosecha de P. ostreatus en paja de cebada ... 39 Tabla 16. Producción de fructificaciones (%) por cosecha de P. ostreatus en viruta de pino ... 39 Tabla 17. Porcentaje de la producción de fructificaciones por grupo de tamaño de las cepas de P.
ostreatus en paja de cebada y viruta de pino ... 41
Tabla 18. Eficiencias biológicas (%) y tasa de producción (%) de las cepas de P. ostreatus en
RESUMEN
Por la gran cantidad de desechos forestales que se generan en el estado de Veracruz, se estudió la posibilidad de utilizarlos para el cultivo de hongos comestibles.
Se estudió la factibilidad de cultivar Pleurotus ostreatus y Pleurotus pulmonarius en un substrato a base de viruta de pino, realizando entrecruzamientos para obtener nuevas cepas con alta capacidad de adaptación a dicho substrato. Para ello, primero se estimó el desarrollo micelial a nivel caja de Petri de P. ostreatus en viruta de pino. Posteriormente se seleccionaron cepas, de las cuales se obtuvieron micelios monospóricos de cada una de ellas y se les estimó el área micelial en viruta de pino, seleccionándose los de mayor área para realizar las cruzas inter-especimen.
Las cepas parentales y las cruzas fueron cultivadas en planta piloto en paja de cebada y viruta de pino. Los parámetros de evaluación fueron: aparición de primordios, tamaño de las fructificaciones, número de cosechas, eficiencia biológica (EB) y tasa de producción (TP).
Se obtuvieron 3 cosechas en ambos substratos, alcanzando eficiencias biológicas de 69.26 a 106.04% y de 27.98 a 36.09% en los parentales en paja de cebada y viruta de pino respectivamente y de 73.00 a 93.98% en paja de cebada y de 38.02 a 53.53% en viruta de pino en las cruzas obtenidas; mientras que las tasas de producción en los parentales en paja de cebada fueron de 1.53 a 2.46% y en cruzas de 1.61 a 1.99% y para viruta de pino de 0.63 a 1.12% en parentales y en cruzas de 0.82 a 1.13%.
Los resultados de producción de las cruzas fueron satisfactorios considerando que la eficiencia biológica de algunas de ellas fueron superiores a la de los parentales, por lo que se consideran tener amplias posibilidades de producción.
SUMMARY
The feasibility was studied of cultivating Pleurotus ostreatus and Pleurotus pulmonarius in a substratum with the help of pine chip; for that which you/they were carried out interbreeding to obtain new strains with high capacity of adaptation to this substratum. For it, first he was considered the development mycelia to level Petri dishes of P. ostreatus in pine chip. Later on strains were selected, of which mycelium monosporics was obtained of each one of them, to which were estimated the area mycelia in pine chip, being selected those of more area to carry out the you cross inter -specimen.
The strains parent and you cross them they were cultivated in plant pilot in barley straw and pine chip. The evaluation parameters were primordia appearance, size of the fruit bodies, number of crops, biological efficiency (EB) and production rate (TP).
3 crops were obtained in both substrata, reaching biological efficiencies from 69.26 to 106.04% and of 27.98 to 36.09% in the parent in barley straw and pine chip respectively and of 73.00 to 93.98% in barley straw and of 38.02 to 53.53% in pine chip in you cross them obtained; while the production rates in the parent in barley straw went from 1.53 to 2.46% and in you cross from 1.61 to 1.99% and it stops pine chip from 0.63 to 1.12% in parent and in you cross from 0.82 to 1.13%.
The production results of you cross them they were satisfactory considering that the biological efficiency of some of them went superior to that of the parent, for what you/they have wide possibilities of being exploited.
1. INTRODUCCIÓN
1.1. El cultivo de los hongos comestibles
El cultivo de hongos comestibles es una actividad que se ha manifestado como una alternativa en la obtención de alimentos para el consumo humano, mediante técnicas sencillas, de bajo costo y en cortos períodos de tiempo (Martínez-Carrera y Larqué-Saavedra, 1990).
El cultivo de hongos a nivel mundial se ha incrementado notablemente en las últimas décadas, basta citar que en 1986 la producción fue de 2 millones de toneladas métricas y para 1991 ésta había superado los 4 millones (Chang, 1993). Entre las especies más cultivadas se encuentran algunas del género Pleurotus como son P. ostreatus (Jacq: Fr.) Kumm. la cual es la especie más conocida entre los llamados hongos ostra, seguida de P. djamor (Fr.) Boedijn., P. cystidiosus Miller., P. citrinopileatus Singer., P. cornocopiae (Paul.) Roll., P. sajor-caju (Fr.) Singer y P. ostreatus var florida Eger., éstos dos últimos sinónimos de P. pulmonarius (Fr.) Quél.
El desarrollo y función de las diferentes cepas de Pleurotus, nos hace pensar en la posibilidad de producir con mayor eficiencia el hongo como fuente alimentaria y generadora de recursos; usando las bondades de una estrategia en la que la selección y la cruza intervengan de manera determinante para obtener una variedad de cepas para cada substrato disponible.
Es a partir de 1974 que se inició el cultivo comercial de Pleurotus en México, empleando cepas y tecnologías europeas, denominándoseles en el mercado como setas, aunque anteriormente se les conocía con los nombres vernáculos de orejas blancas, orejas de cazahuate y hongo de maguey, entre otros (Guzmán et al., 1993).
En México, los estudios sobre el cultivo de hongos del género Pleurotus se han enfocado a evaluar la viabilidad de producción, empleando para ello una gran variedad de desechos lignocelulósicos disponibles, considerando la producción de fructificaciones como el principal
parámetro de evaluación. Así que, cepas de Pleurotus se han cultivado en pulpa de café (Martínez-Carrera; 1987, Martínez-Carrera et al., 1985, 1988; Hernández-Ibarra et al., 1995), en bagazo de caña de azúcar (Guzmán-Dávalos et al., 1987a), en hojas de caña de azúcar (Mata y Gaitán-Hernández, 1995), bagazo de maguey tequilero (Guzmán-Dávalos et al., 1987b) y sobre fibra de coco (González et al., 1993), entre otros substratos.
1.2. Uso potencial de la madera de pino para el cultivo de hongos
Pleurotus ha sido reportado como parásito de varios árboles, reportándose 7 especies sobre 30 diferentes hospederos: P. albolanatus sobre Pseudotsuga; P. cystidiosus sobre Acer, Liquidambar, Populus, Quercus y Salix; P. dryinus sobre Carya, Liquidambar, Malus y Quercus; P. levis sobre Acer, Betula, Juglans, Liquidambar y Salix; P. minutus sobre Betula, Carya y Quercus; P. ostreatus sobre Abies, Acacia, Acer, Alnus, Betula, Carpinus, Carya, Castanea, Laurocerasus, Liquidambar, Liriodendron, Lupinus, Magnolia, Malus, Morus, Nyssa, Ostrya, Pandanus, Picea, Pistacia, Populus, Pseudotsuga, Quercus, Salix, Tilia, Ulmus y Wisteria; y P. septicus sobre Heteromeles (Guzmán, 2000).
Dentro de la riqueza forestal de México los pinares constituyen un recurso de gran importancia por la demanda que existe de su madera, por la factibilidad de su explotación y por la extensa área de distribución que presentan los bosques en el país. Las especies maderables más explotadas son: P. ayacahuite Ehrenb. Pinus arizonica Engelm. Pinus pseudostrobus Lindl. P. montezumae Lamb. P. durangensis Martínez (Rzedowski, 1978).
En 1995 la producción maderable en México fue de 6,302,417 m3, en la que las especies de pino representaron el 88%, las maderas de encino y latifoliadas el 8% y las maderas preciosas el 4%. La industria de aserrío absorbió el 75% de la producción, la de celulosa el 19% y se destinó 6% a la producción de postes, durmientes y combustibles (leña, carbón); generándose con esto aproximadamente 3.5 millones de m3 de residuos, que son subutilizados (SEMARNAP, 1998).
La madera es un material de complejidad anatómica y química, que puede soportar una gran cantidad de especies microbianas. Los principales constituyentes de la madera son la celulosa, hemicelulosa, lignina, extractivos (resinas, gomas, taninos, alcaloides), minerales y agua; siendo las tres primeras las principales fuentes de carbono y componentes estructurales.
La celulosa representa poco más del 50% de la madera; está organizada en filamentos microfibrilares y es la responsable principal de la fuerza de tensión y estructura. El contenido de hemicelulosa en la madera varía de 20 a 35%; no tiene una organización fibrilar y es responsable de la rigidez de las paredes celulares antes de la lignificación. La lignina representa del 15 al 35% de la madera; protege los polisacáridos de las paredes celulares de la hidrólisis microbiana, excepto en el caso de microorganismos como los basidiomicetes y ascomicetes que pueden modificar o degradar lignina (Higuchi, 1990).
1.3. Conservación de los recursos genéticos
En el área de investigación de Pleurotus en nuestro país, pocos trabajos se han basado en el entrecruzamiento genético de cepas, ya sea para la obtención de cepas mejoradas; como para confusiones en la determinación de las especies del género (Guzmán et al., 1994; Guzmán, 1997).
Para un eficiente cultivo de cepas de las especies del género Pleurotus, se consideran actividades previas de importancia básica: la selección de variedades adaptadas a diferentes substratos y condiciones de cultivo, la mejora genética así como la preparación de la semilla. Por los estudios realizados, la hibridación es un método controlable por medio del cual algunas características genéticas deseadas presentes en diferentes cepas pueden ser combinadas. Es el medio de obtener nuevas cepas y nuevas variedades con características mejoradas (rendimiento, calidad ) y resulta conveniente para los materiales y climas en los que se piensa cultivar (Fig.1).
La mejora genética se hace por medio de cruzamientos que permiten obtener nuevos genotipos, es decir la fusión de 2 individuos homocarióticos genéticamente compatibles
(plasmogamia), la que se utiliza porque produce un micelio dicariótico capaz de diferenciarse y dar lugar a un basidiocarpo.
Para un eficiente programa de cruzamiento, se deben considerar cuidadosamente tres puntos:
a) la definición del objetivo, es decir las características del hongo deseado tales como textura, color, tamaño, entre otras.
b) el uso de un método de cruzamiento adaptado al objetivo y a los hongos preexistentes. c) un buen conocimiento del ciclo de vida del hongo estudiado y los puntos del ciclo de vida
importantes para la diferenciación de los cuerpos fructíferos los cuales son el producto comestible y comercial (Labarére y Bois, 2002).
Dada la gran cantidad de desechos forestales que se generan en el estado de Veracruz, específicamente en la zona del Cofre de Perote, este trabajo analiza la capacidad que presentan algunas cepas de Pleurotus que se obtendrán por entrecruzamiento genético, para ser cultivadas en madera de pino, y evaluar sus fructificaciones con el propósito de seleccionar las de más rápido crecimiento y alta producción, propias para su explotación comercial.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
Evaluar la factibilidad del cultivo de cepas de Pleurotus ostreatus y Pleurotus pulmonarius que muestren mayor adaptación en desechos de madera de pino, a partir de la estimación del crecimiento micelial.
2.2. Objetivos Específicos
Obtención de nuevas cepas por entrecruzamiento y selección de los dicariones que muestren mayor desarrollo en viruta de pino.
Evaluación de la producción de fructificaciones de las cepas obtenidas intra e inter-especimen, en comparación con sus parentales y selección de las cepas más productivas.
3. REVISIÓN DE LITERATURA
3.1. Ecología y distribución
Las especies del género Pleurotus se desarrollan tanto en bosques de coníferas como en selvas tropicales, subtropicales y en zonas semiáridas (Guzmán, et al., 1994).
Pleurotus ostreatus es una especie que se encuentra distribuida en Europa, Asia y Norteamérica. Esta especie crece sobre troncos en descomposición de diversos árboles, de ahí que a sus fructificaciones se les conozca en nuestro país con los nombres populares de orejas de palo, orejas de patancán, orejas de izote, orejas de cazahuate, orejas blancas y en el mercado se les conozca como setas, mientras que en el extranjero se les denomina hongos ostra (Guzmán et al., 1993; Guzmán, 1997). Aunque las formas silvestres son desconocidas en México (Guzmán, 1996) su cultivo sobre diversos residuos lignocelulósicos, empleando cepas extranjeras, ha tenido un gran desarrollo en los últimos años (Martínez-Carrera, 1987; Salmones et al., 1997).
Pleurotus pulmonarius se encuentra distribuido en el este de EUA y Europa en elevaciones entre 1200-3000 msnm), creciendo principalmente sobre madera en descomposición de coníferas (Abies y Picea) en primavera y verano (Stamets, 1993). A pesar de que México cuenta con altitudes apropiadas y una gran diversidad de especies maderables, entre ellas Abies, no se conoce creciendo en forma silvestre (Guzmán, et al., 1994) ya que al parecer es una especie introducida para su cultivo comercial.
3.2. Morfología
Pleurotus ostreatus. Presenta un sombrero o píleo liso convexo, casi siempre en forma de ostra o concha. El píleo puede medir entre 5 y 12 cm de diámetro, está formado como una expansión lateral del ápice del estípite, extendiéndose en estadios maduros o viejos hasta llegar a casi plano. Su color es muy variable, desde café intenso hasta café pálido o crema. La intensidad
del color puede alterarse de acuerdo a cambios en los factores medioambientales, como por ejemplo la luz y la temperatura. El estípite es corto, excéntrico o lateral, engrosado gradualmente hacia el lado del sombrero o píleo, algunas veces no se presenta. El himenio es la parte inferior del píleo y está formada por láminas estrechas, delgadas, decurrentes. En las láminas se producen los basidios, los cuales son estructuras especializadas que soportan las basidiosporas (Chang y Miles, 1989; Stamets, 1993; Guzmán et al., 1994).
Pleurotus pulmonarius, es una especie morfológicamente parecida a P. ostreatus de ahí que ha sido confundida en repetidas ocasiones con esta especie. Su color es variable de café pálido a color crema, así como tonos azulados. La coloración de sus primordios se expresa de diversas maneras sobre todo de acuerdo a la intensidad de la luz, por lo que pueden ser blanquecinos, café pálido, gris-azulados, incluso esta variabilidad de colores se puede observar algunas veces en el píleo de los adultos. El estípite es corto, de consistencia carnosa y generalmente delgado, estos hongos se caracterizan por crecer en racimos (Guzmán et al.,op.cit. 1994).
3.3. Taxonomía
La taxonomía del género es muy compleja debido a un alto grado de variabilidad morfológica de los basidiocarpos, lo cual es atribuido principalmente a diversos factores ambientales. Debido a esta situación, una misma especie puede ser identificada bajo diferentes nombres. Esta falta en el entendimiento taxonómico de las especies cultivadas de Pleurotus hace difícil la aplicación de la tecnología de mejoramiento genético y de cultivo en dichas especies. Más de 1000 especies de Pleurotus han sido descritas alrededor del mundo. Sin embargo, solo aproximadamente 50 especies son reconocidas como Pleurotus. En México más de 20 especies son reportadas, pero solo 7 de ellas son válidas ya que las demás se consideran sinónimos (Guzmán, 2000).
Se han realizado enormes esfuerzos para clasificar las especies del género Pleurotus por medio de criterios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y genéticos (Anderson et al., 1973;
Han et al., 1974; Zervakis et al., 1994). Sin embargo, aunque han generado valiosa información sobre la distribución taxonómica dentro del género, estos no han sido completamente satisfactorios y concluyentes.
La clasificación taxonómica del género Pleurotus es el siguiente:
Reino Fungi División Basidiomicotina Clase Holobasidiomicete Subclase Hymenomicete Orden Agaricales Familia Tricholomataceae Género Pleurotus
Especie ostreatus, pulmonarius
Un estudio integral de la sistemática del género Pleurotus involucraría estudios de incompatibilidad y de variabilidad genética entre cepas, ya que dos cepas de hecho presentan variación (ADN fingerprinting) y no pueden interpretarse como especies diferentes.
Los estudios morfológicos, de incompatibilidad y moleculares entre cepas son los criterios importantes en la determinación y correcta interpretación de las especies en estudio (Calvo-Bado, 2002).
3.4. Valor Nutricional
En diversos estudios se ha observado que los hongos del género Pleurotus y otras especies comestibles, son un alimento de alto valor nutritivo por su contenido de proteínas, grasas, fibra, carbohidratos, vitaminas y minerales (Tabla 1).
En general el valor nutricional de los hongos comestibles se considera aceptable e incluso recomendable para las poblaciones con deficiencias dietarias, ya que poseen todos los
aminoácidos esenciales para el hombre, son de valor nutritivo más alto que las proteínas de plantas, con una calidad muy cercana a la proteína animal (Lelley, 1987). Los hongos contienen carbohidratos como el glucógeno y la quitina, y varios compuestos carbonados como la glucosa, fructosa, galactosa, trealosa y muchos otros. Contienen un amplio rango de vitaminas tales como la tiamina (vitamina B1), riboflavina (vitamina B2), ácido pantoténico (B3) y ácido ascórbico
(vitamina C) (Chang y Miles, 1989). Con respecto a los minerales, el fósforo y el potasio se encuentran en altas cantidades, aunque también poseen calcio, fierro, cadmio, zinc y cobre. El contenido de grasas es de 0.9 a 1.8% en base a su peso seco (Bano y Rajarathnam, 1982).
Tabla 1. Contenido de proteína, carbohidratos, grasas y fibra de las principales especies cultivadas de hongos
comestibles.
Hongo Proteína (Nx4.38)
Carbohidratos
(Total) Grasa Fibra
Valor Energético (Kcal) Agaricus bisporus 23.9-34.8 51.3-62.5 1.7-8.0 8.0-10.4 328-381 Agaricus campestris 33.2 56.9 1.9 8.1 354 Lentinula edodes 13.4-17.5 67.5-78.8 4.9-8.0 7.3-8.0 387-392 Pholiota nameko 20.8 66.7 4.2 6.3 372 Pleurotus ostreatus 10.5-30.4 57.6-81.8 1.6-2.2 7.5-8.7 345-367 Pleurotus sajor-caju 9.9-26.6 50.7-54.4 2.0-7.7 10.3-17.5 300-337 Pleurotus florida 8.7-37.2 56.6-58.0 1.7-5.8 9.0-14.5 265-336 Volvariella volvacea 21.3-43.0 50.9-60.0 0.7-6.4 4.4-13.4 254-374 Volvariella diplasia 28.5 57.4 2.6 17.4 304 Flammulina velutipes 17.6 73.1 1.9 3.7 378 Auricularia spp. 4.2-7.7 79.9-87.6 0.8-9.7 11.9-19.8 347-384 Los valores son presentados como porcentaje del peso seco, excepto los valores energéticos los cuales se presentan como Kcal por 100 g de peso seco (Buswell y Chang, 1993).
3.5. Producción
Las especies del género Pleurotus ocupan el tercer lugar en la producción mundial de hongos comestibles, constituyendo el 16.3% del total (Chang, 1996). Los géneros de hongos comestibles más importantes cultivados en América Latina son Agaricus (95%) y Pleurotus (5%). En México la producción de Pleurotus incrementó un 413% durante 1990 y 1997 (Martínez-Carrera, 2000). En este último año se estimó una producción de 1825 toneladas, lo cual
significó un nivel de producción comercial de unas 5 ton/día. Por esta razón se ha considerado a México como el principal productor de América (Royse y Sánchez, 2002) (Tabla 2).
Tabla 2. Producción estimada (peso fresco) de Pleurotus spp. en
algunos países de América (1998).
País Toneladas % México 1,825 47.53 Estados Unidos 908 23.65 Canadá 568 14.79 Brasil 450 11.72 Guatemala 22 0.57 Venezuela 18 0.47 Cuba 12 0.31 Colombia 9 0.23 Otros 28 0.73 Total (América) 3,846 100.00
Fuente: Royse y Sánchez 2002.
3.6. Cultivo del hongo
El cultivo de Pleurotus spp. ha experimentado un desarrollo muy rápido, de tal manera que en la actualidad se cultiva en casi todas las latitudes del mundo. Las especies de este género tienen una calidad organoléptica excelente, crecen sobre una gran diversidad de substratos en un amplio rango de temperaturas, son fáciles de cultivar sobre gran cantidad de desechos agroindustriales, además de que representan una alternativa alimenticia para el autoconsumo y la venta.
3.6.1. Substratos frescos
Guzmán y Martínez-Carrera (1987), estudiaron inicialmente el uso de la pulpa de café como substrato potencial para el cultivo de Pleurotus y reportan eficiencias biológicas del 113.3% en 4 cosechas durante un período de 40-45 días. Martínez-Carrera et al. (1986), cultivaron Pleurotus ostreatus sobre hojas usadas en la extracción de aceites esenciales como la pimienta, zacate limón y las hojas de canela. Las eficiencias biológicas obtenidas fueron mayores en zacate limón 113.01% y en hojas de canela 81.85%; menores en hojas de pimienta 56.79%. Los primordios se obtuvieron a los 18 días en zacate limón, 15 y 21 días para las hojas de pimienta y canela, respectivamente.
Morales (1987), usó la pulpa de cardamomo como substrato obteniendo una eficiencia biológica de 113.64%, la formación de los primordios se logró a los 17 días como promedio.
Acosta-Urdapilleta et al. (1988), estudiaron el bagazo de caña para el cultivo de hongos. La eficiencia biológica fue muy baja, 15.7%. También estudió el olote y el tamo de maíz reportando eficiencias de 186% para el tamo y 50% para el olote en 3 cosechas para ambos. Requirieron de 20 a 30 días para crecer en el olote y de 40 a 50 días para el tamo de maíz.
González-Bernabé et al. (1991), usando otra cepa de Pleurotus ostreatus y olote de maíz, obtuvieron eficiencias biológicas de 172.9% en 3 cortes y de 19 a 23 días para la colonización del substrato.
Tellez et al. (1991), estudiaron el residuo de orégano una vez que se le ha extraído el aceite esencial. Obtuvieron 117.31% de eficiencia biológica en 5 cosechas, requiriendo 21 días para la fructificación.
Villaseñor et al. (1993), evaluaron la potencialidad del papel de oficina mezclado con bagazo de maguey fermentado por 20 días, tomando como testigo el mismo papel al 100%, con lo que obtuvieron eficiencias biológicas de 33.57% para la mezcla y 13.84% para el testigo. Ellos
hacen mención de la importancia del uso de mezclas de substratos para incrementar las eficiencias biológicas.
3.6.2. Substratos fermentados
Martínez-Carrera et al. (1985), estudiaron la posibilidad de mejorar la calidad física y química de la pulpa de café mediante el proceso de fermentación y mejorar con ello los rendimientos de producción. Fermentando de 3 a 5 días la pulpa alcanzaron eficiencias biológicas de 132.10-159.95% en 4 cosechas y 118.90% para 10 días de fermentación con solo 2 cosechas.
Guzmán-Dávalos et al. (1987a), encontraron que fermentando el bagazo de caña de azúcar por 5,6 y 7 días alcanzaban eficiencias de 43.94%, 42.25% y 49.08%, respectivamente.
González-Bernabé et al. (1991), trataron la fibra de coco fermentada a diferentes períodos de fermentación (3, 5 y 7 días), alcanzando eficiencias biológicas de 78.7%, 69.3% y 27.8% respectivamente.
De León et al. (1993), estudiaron el lirio acuático (hojas y tallo) como substrato de cultivo a 1, 4 y 6 días de fermentación con eficiencias biológicas de 41.55%, 58.71% y 110.48%.
Martínez-Carrera et al. (1990) estudiaron el uso de mezclas de bagazo de caña enriquecida con pulpa de café y paja de cebada, logrando eficiencias de 96.96% y 65.05% respectivamente.
González-Bernabé et al. (1991) probaron una mezcla fermentada de fibra de coco y olote de maíz relación (1:1) con lo que obtuvieron eficiencias de 90.4, 83.5 y 69.5% para 3, 5 y 7 días de fermentación.
Villaseñor et al. (1993) evaluaron la potencialidad del papel de oficina mezclado con bagazo de maguey fermentado por 20 días y obtuvieron una eficiencia de 33.57%.
3.6.3. Substratos mezclados
Martínez-Carrera et al. (1985), experimentaron el cultivo de P. ostreatus en una mezcla de pulpa de café con paja de cebada (relación 2:1), alcanzando eficiencias biológicas de 99.75%, 102.68% para 5 y 10 días de fermentación respectivamente.
Soto-Velazco et al. (1989) cultivaron P. ostreatus sobre una mezcla de bagazo de maguey tequilero con paja de trigo (relación 2:1), con eficiencias de 96.4%.
3.7. Sexualidad en hongos
La reproducción en los hongos se efectúa sexual y asexualmente. La mayoría de los hongos, excepto Deuteromycotina que carecen de reproducción sexual, muestran estos dos tipos de reproducción (Herrera y Ulloa, 1990). Para seleccionar y/o mejorar cepas de hongos con características deseables, es necesario conocer el ciclo de vida del organismo, puesto que para establecer un método de entrecruzamiento se requiere de manipulación genética.
Respecto a su compatibilidad sexual, los hongos se pueden dividir en 2 grupos: Homotálicos y Heterotálicos. En los organismos homotálicos el micelio que surge de una espora puede completar el ciclo de vida con la formación de estructuras reproductoras sexuales, es decir; son autocompatibles, mientras que en los organismos heterotálicos se necesita de dos micelios compatibles para desarrollar la fase sexual (Herrera y Ulloa, 1990).
El homotalismo puede ser primario o secundario. En el homotalismo primario una basidiospora germina para formar micelio, el cual se organiza en segmentos binucleados. Los dos núcleos existentes en cada célula son compatibles por lo que el micelio tiene la capacidad de formar cuerpos fructíferos. El homotalismo secundario es aplicado a hongos que producen basidiosporas con dos núcleos postmeióticos, cuyos factores de apareamiento son compatibles y el micelio dicariótico tiene la capacidad de fructificar ( Raper, 1978).
En los organismos heterotálicos se pueden distinguir dos condiciones: el heterotalismo bipolar también conocido como heterotalismo unifactorial y el heterotalismo tetrapolar conocido como heterotalismo bifactorial. Los primeros se caracterizan por presentar un solo factor (A) con dos alelos (A1, A2); la segregación de los dos alelos en el proceso de la meiosis asegura que una espora lleve sólo un alelo. Por otro lado, en las especies heterotálicas tetrapolares, la compatibilidad es controlada por dos factores (A, B) situados en cromosomas homólogos y con dos alelos en cada locus (A1, A2, B1, B2) (Miles, 1993; Raper, 1978).
Sólo es fértil la unión sexual en que se reúnen los cuatro alelos diferentes para formar un micelio heterocigótico con los alelos A1 A2 B1 B2. Un talo con este juego de alelos puede producir esporas de cuatro genotipos diferentes: A1B1, A2B2, A1B2 y A2B1. También es posible que se produzcan esporas de solamente dos tipos si la combinación de los caracteres se efectúa de la manera siguiente: A1B1, A1B1, A2B2, A2B2; o bien, A1B2, A1B2, A2B1 y A2B1. Esto depende del arreglo de los cromosomas homólogos durante la meiosis y del entrecruzamiento de un par o de ambos pares de cromosomas (Raper, op.cit.; Herrera y Ulloa, 1990).
Los hongos heterotálicos se prestan bien a la mejora genética debido a que es relativamente fácil obtener micelios homocarióticos, y por lo tanto, es fácil controlar los cruzamientos que se deseen hacer con ellos (Labarére y Bois, 2002).
3.8. Ciclo de vida
Tanto Pleurotus ostreatus como Pleurotus pulmonarius presentan un patrón de sexualidad heterotálico, es decir; no son autofértiles, ya que para su reproducción requiere de la unión de dos micelios monocarióticos compatibles; por lo cual el micelio producido por la germinación de una basidiospora no puede dar origen al desarrollo de los cuerpos fructíferos. Además, es tetrapolar (también conocido como bifactorial) ya que forma 4 esporas, cada una con un juego de caracteres genéticos o dos pares de factores A y B; de modo que al fusionarse por el
proceso de plasmogamia (unión de dos micelios) los micelios que se producen forman un cigoto tetrafactorial, dando las posibles combinaciones para cada gen (A1B1, A2B2, A1B2 y A2B1).
El ciclo de vida del hongo inicia cuando las basidiosporas son liberadas, éstas germinan y dan origen a un micelio monocariótico (también llamado primario u homocariótico) haploide, que al encontrarse con otro micelio compatible ocurre la plasmogamia o fusión de dos micelios monocariones compatibles, para dar origen a un micelio dicarión (llamado también secundario o heterocariótico), con dos núcleos haploides sexualmente compatibles. Bajo condiciones ambientales óptimas, el dicarión produce el primordio; posteriormente se desarrolla el cuerpo fructífero para formar el píleo, el estípite y el himenio el cual está formado por las láminas. En el himenio se lleva a cabo la cariogamia y la meiosis para la formación de los basidios y las basidiosporas y cuando las basidiosporas son liberadas y encuentran las condiciones adecuadas para su germinación, el ciclo de vida se reinicia (Raper, 1978) (Figura 2).
Figura 2. Ciclo de vida de Pleurotus ostreatus. 1. Basidiosporas, 2. Germinación de basiodosporas, 3. Micelio
monocarión, 4. Plasmogamia, 5. Dicarión, 6-7. Cuerpo fructífero. 8. Cariogamia y meiosis y 9. Liberación de basidiosporas. (Mestizo-Valdés, 1997)
4. MATERIAL Y MÉTODOS
Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Cultivo de Hongos Comestibles del Instituto de Ecología, A.C., de Xalapa, Veracruz., y se realizó en dos etapas (Figura 3).
1) Fase de Laboratorio en donde se evaluó el crecimiento micelial de las cepas en un medio de cultivo adicionado con derivados solubles de lignina, medición del área micelial en su cultivo in vitro en viruta de pino y aislamiento de monospóricos determinando los tipos de apareamiento para la obtención y selección de dicariones.
2) Fase de Planta Piloto en donde se evaluó la capacidad de producción de fructificaciones por parte de las cepas seleccionadas.
4.1. Cepas estudiadas
Este trabajo inicialmente partió de una selección previa que se hizo de un lote de 30 cepas de hongos comestibles adscritas al género Pleurotus las cuales se hicieron crecer en un medio de cultivo que contenía derivados solubles de lignina y se escogieron aquellas que presentaron una mayor cantidad de lacasa la cual es una enzima que está relacionada en la degradación de lignina (Salmones, 2000). Este fue un parámetro para seleccionar las primeras 19 cepas que formarían parte de este trabajo puesto que al ser las más productoras de lacasa presentarían mayor adaptabilidad a la madera de pino por ser este un substrato rico en lignina. Por otra parte, se realizaron los entrecruzamientos de los micelios monospóricos de estas cepas seleccionadas para la obtención de dicariones y poder evaluar sus fructificaciones con el propósito de seleccionar las de más rápido crecimiento micelial y alta producción, propias para su explotación .
Se seleccionaron 19 cepas, 9 de ellas pertenecen a P. pulmonarius y 10 a P. ostreatus las cuales se encuentran conservadas en nitrógeno líquido y depositadas en el Cepario de Hongos Comestibles del Instituto de Ecología de Xalapa, Ver., México.
Todas las cepas extranjeras que se trabajaron, excepto las obtenidas por entrecruzamientos previos aquí en México, fueron obtenidas por donaciones realizadas por otras instituciones.
Los datos de procedencia y registro de las cepas se encuentran en la Tabla 3. Todas las cepas se mantienen en medio de cultivo sólido de malta agar (MA).
Tabla 3. Registro y procedencia de las cepas utilizadas en este trabajo Especie Procedencia Registro
P. pulmonarius Alemania IE 4
P. ostreatus Europa IE 8
P. ostreatus Hong Kong IE 38
P. ostreatus Guatemala IE 49 P. pulmonarius USA IE 115 P. ostreatus Japón IE 129 P. ostreatus Japón IE 131 P. pulmonarius Checoslovaquia IE 135 P. pulmonarius Checoslovaquia IE 136 P. ostreatus Checoslovaquia IE 137 P. pulmonarius USA IE 140 P. pulmonarius Grecia IE 167
P. pulmonarius Cruza 4x136 (4-12) México IE 225
P. pulmonarius Cruza 4x115 (4-3) México IE 226
P. pulmonarius Cruza 4x115 (5-2) México IE 227
P. ostreatus Cruza 38x126 (3-3) México IE 238
P. ostreatus Cruza 38x126 (11-6) México IE 239
P. ostreatus Cruza 38x126 (12-8) México IE 240
FASE DE LABORATORIO FASE DE PLANTA PILOTO
Selección de cepas
P. ostreatus y P. pulmonarius Elaboración del spawn
Cepas parentales seleccionadas IE 8, IE 38, IE 49 e IE 239 Siembra e incubación del substrato Obtención de monospóricos Evaluación de la producción Eficiencia biológica Tasa de producción Grupo de tamaño
Estimación del área micelial en viruta de pino
Obtención de tipos de apareamiento
Selección in vitro de micelios dicarióticos en viruta de pino
Evaluación de la producción de los micelios dicarióticos
4.2. Fase de laboratorio
4.2.1. Selección de cepas de acuerdo al crecimiento micelial obtenido en un medio de cultivo sólido enriquecido con derivados solubles de lignina (Indulin AT; Sigma)
Las cepas se hicieron crecer en un medio de cultivo con Indulin AT y la concentración de fenoles solubles se ajustó a 1mol/l. Dicho medio de cultivo se preparó siguiendo la técnica de Mata y Savoie et al. (1998) disolviendo 3 g de Indulin AT en 800 ml de agua destilada, calentando la solución en agitación hasta hervir durante 5 minutos a partir del punto de ebullición; posteriormente esta solución se filtró en papel filtro del número 1 recuperándose el filtrado y ajustándose a 1000 ml.
Posteriormente se midió la concentración de fenoles de la solución siguiendo la técnica descrita por Box (1983). Una vez que la solución se ajustó a 1mol se le agregaron los ingredientes del medio de cultivo YMEA-WSLD los cuales son: extracto de malta (2%), extracto de levadura (0.2%) y agar bacteriológico (1.5%) disueltos en 1000 ml de la solución enriquecida con derivados solubles de lignina (WSLD).
4.2.2. Selección de cepas de acuerdo a la medición del área micelial alcanzada en su cultivo in vitro en viruta de pino
En esta etapa se trabajaron 19 cepas que fueron las seleccionadas en la primera fase (4.2.1) son las que inicialmente formaron parte de este trabajo. Se procedió a la medición del área micelial alcanzada en su cultivo in vitro en viruta de pino, la cual se realizó siguiendo la metodología descrita por Mata et al. (2001).
Cinco cajas Petri por cepa, que contenían 10 g peso húmedo de substrato (viruta de pino) hidratada al 80% de humedad y estéril, se inocularon con un implante de 7 mm de diámetro de agar bacteriológico invadido por el micelio de las cepas en estudio, con la finalidad de poder
seleccionar aquellas que tuvieron la capacidad de adaptarse a la viruta de pino a partir de un inóculo que no contiene nutrientes como lo es el agar bacteriológico. Dichas cajas se incubaron a 28 °C durante 7 días. Pasado este tiempo, se procedió a marcar sobre la superficie de la caja de petri el área micelial alcanzada por cada una de las cepas, dicha marca se calcó en papel bond y este papel se pasó por un medidor de área foliar marca Li-cor Modelo 3100 con la finalidad de obtener el área (Figura 4).
De acuerdo a los resultados obtenidos en esta segunda selección, se trabajó con las cepas que presentaron la mayor área en su cultivo in vitro .
Viruta de pino hidratada al 80% de humedad
Esterilización 1h 121 °C
Envasado en caja Petri 10 g peso húmedo
Inoculación con implante de agar de 7 mm
Incubación a 28 °C 7 días
Marcado del área Medición del área
Figura 4. Metodología empleada para la selección de cepas de acuerdo a la medición del área micelial
4.2.3. Aislamiento de cultivos monospóricos
El aislamiento de los micelios monospóricos se realizó a partir de esporadas obtenidas de las fructificaciones de las cepas seleccionadas, las cuales se cultivaron en paja de cebada previamente para tal fin. Las esporadas se obtuvieron colocando el píleo de la fructificación con las láminas sobre papel filtro estéril, tapándolo con un cristalizador para favorecer un ambiente húmedo y la descarga de las esporas en el papel. Pasadas 24 h, las esporadas se secan en un horno a 28°C durante 24 h y se conservaron en una bolsa de polietileno que contenía un sobre con silicagel para que absorbiera la humedad, se selló herméticamente la bolsa.
Posteriormente se tomaron fragmentos de 1 cm² de la esporada que se suspendieron en agua destilada estéril preparándose diluciones 1x102, 1x104 y 1x106 (esto con la finalidad de obtener la germinación de las esporas de una manera más separada y facilitar así su aislamiento). Se tomaron 0.5 ml de cada dilución de esporas y se inocularon en cajas de Petri conteniendo medio de cultivo malta agar incubándose a 28 °C hasta la germinación de las esporas. Una vez germinadas, se aislaron de 20 a 25 esporas por cepa que se resembraron independientemente en cajas con medio de cultivo y se incubaron hasta que el micelio cubrió la superficie total del medio. El carácter monospórico de los aislamientos se corroboró microscópicamente por la ausencia de fíbulas (Eugenio y Anderson, 1968) (Figura 5).
4.2.4. Determinación de los tipos de apareamiento
De las esporas germinadas se tomaron 12 al azar de cada una de las cepas para determinar los tipos de apareamiento, siguiendo la metodología propuesta por Eger (1978). Para ello los cultivos monospóricos se cruzaron entre sí, evitando cruzas recíprocas dando como resultado 66 combinaciones. Un apareamiento se consideró compatible cuando se observaron fíbulas y consecuentemente la ausencia de fibulación indicó incompatibilidad. De esta manera los monospóricos se separaron en clases de incompatibilidad (Figura 6).
Figura 5. Germinación de esporas Figura 6. Cruzas de Pleurotus ostreatus
4.2.5. Estimación del área micelial de los cultivos monospóricos
Con la finalidad de seleccionar los monospóricos de mayor crecimiento micelial para la obtención de los dicariones y paralelamente a la determinación de los tipos de apareamiento, los 12 monospóricos de cada una de las cepas, se hicieron crecer en medio de cultivo (MA), tomándose fragmentos de 7 mm de diámetro que se inocularon por quintuplicado en cajas de petri que contenían viruta de pino estéril y se incubaron a 28 °C. Siete días después se realizó la medición del área micelial.
4.2.6. Obtención y selección de los dicariones (cruzas intra e inter-especimen)
De acuerdo a los resultados de la estimación del área micelial de los monospóricos y su separación en tipos de apareamiento, se eligieron aquellos que presentaron mayor crecimiento y se realizaron los posibles entrecruzamientos intra-especimen para cada una de las cepas. De igual manera, se escogió sólo el monospórico que presentó mayor crecimiento de cada una de las cepas
para realizar los entrecruzamientos inter-especimen. La selección se realizó en base a la medición del área micelial en viruta de pino de cada una de los dicariones.
4.2.7. Diseño y Análisis estadísticos de los Datos
Se realizó un estudio experimental de 4 cepas, con un diseño completamente al azar, en el cual la unidad de estudio fue la caja de petri. Los factores fueron las 4 cepas y los12 monospóricos de cada una de las cepas. Los tratamientos fueron 48 con 5 réplicas cada uno y la variable respuesta fue el área micelial. Este diseño se aplicó únicamente en la fase de laboratorio.
Modelo Estadístico: ijk ε (i)j M i C ijk y Donde: i = 1, 2, 3, 4 j = 1,2,. ,12 k = 1,2,.…,5 ijk y = área micelial = Media general i
C = Efecto de la i-ésima cepa
j i
M() = Efecto del j-ésimo monospórico dentro de la i-ésima cepa
ijk
ε = Error experimental
Todos los resultados obtenidos , se sometieron a un análisis de varianza del 95% de confianza y para determinar las diferencias entre las medias se aplicó un análisis de rangos múltiples de Tukey, utilizando el paquete STATISTICA versión 6.
4.3. Fase de planta piloto
4.3.1. Preparación del spawn
Para la elaboración del spawn (Figura 7), se utilizaron semillas de sorgo (Sorghum vulgare Pers.) las cuales se limpiaron mediante enjuagues continuos con abundante agua y se hidrataron 24 hrs, posteriormente se escurrieron y se envasaron en bolsas de polipapel, esterilizándose 1 h a 121 °C (Guzmán et al.,1993). Para la inoculación se tomó una pequeña porción de micelio de cada una de las cepas y se depositó sobre las semillas. Las bolsas inoculadas se incubaron a 28 °C en obscuridad por espacio de 15 días, para ser utilizadas en la siembra de los substratos.
4.3.2. Siembra
Como substrato testigo se utilizó paja de cebada. Tanto la paja como la viruta de pino se hidrataron por espacio de 18 h. Pasado dicho tiempo, se envasaron 15 bolsas de 1 kg peso húmedo de cada uno de los substratos y se esterilizaron 1 h a 121 °C. El substrato ya estéril y frío se sembró con una proporción de 5% de spawn; este proceso se realizó bajo estrictas condiciones de asepsia (Figura 7).
4.3.3. Incubación
Las bolsas sembradas se trasladaron a una zona de incubación con obscuridad a una temperatura entre 25-28 °C. Un día después de la siembra a cada muestra se le realizaron alrededor de 200 pequeñas perforaciones hechas con agujas de disección, para facilitar la respiración del micelio. Una vez que el substrato fue cubierto por el micelio y aparecieron los primordios, las muestras se trasladaron al área de producción en donde se mantuvieron las condiciones adecuadas de luz (12 h/día), temperatura (20-28 °C), humedad relativa (80-85%) y aereación.
Se consideró como período de incubación el tiempo transcurrido a partir de la siembra de las muestras hasta la formación de primordios.
Figura 7. Metodología empleada para la evaluación de la producción de cuerpos fructíferos (modificación de
Guzmán, et al. 1993)
4.3.4. Evaluación de la producción de las fructificaciones
Se registró el número de días que requirieron cada una de las cepas para la formación de los primordios, número de cosechas obtenidas, así como el peso fresco de las fructificaciones.
La producción de cuerpos fructíferos se determinó en términos de eficiencia biológica (EB), expresando en porcentaje la relación entre el peso fresco de los hongos producidos y el peso seco del substrato (Chang y Miles, 1989) y con la tasa de producción (TP), la cual se
determinó mediante la relación de la eficiencia biológica entre el número total de días de evaluación, a partir del día de inoculación (Royse y Valer, 1989).
Los cuerpos fructíferos se clasificaron en tres grupos de tamaño de acuerdo al diámetro del píleo. G1: (menores de 5 cm); G2: (de 5 a 9.9 cm) y G3: (mayores de 10 cm) (Mata y Guzmán, 1993).
4.3.5. Diseño y análisis estadísticos de los datos
Se realizaron 15 réplicas/cepa/substrato y a los datos de producción se les aplicó un análisis de varianza . Los resultados de eficiencia biológica de todas las cepas, se sometieron a un análisis de varianza al 95% de confianza y para determinar las diferencias entre las medias se realizó un análisis de rango múltiple de Tukey, utilizando el paquete STATISTICA, versión 6.
Modelo Estadístico: ijk i ijk y C Donde: i = 1, 2, 3, 4 j = 1 k = 1,2,.…,15 ijk
y = Comportamiento en viruta de pino
= Media general
i
C = Efecto de la i-ésima cepa
ijk
5. RESULTADOS 5.1. Fase de Laboratorio
5.1.1. Selección de cepas
En la tabla 4 se muestra el comportamiento que presentaron las 19 cepas que inicialmente se trabajaron y de acuerdo a los resultados obtenidos se puede observar que las cepas de P. pulmonarius presentaron los valores más bajos de desarrollo micelial, siendo P. ostreatus la especie que presenta el mayor desarrollo.
Tabla 4. Área promedio (mm2) en viruta de pino de las 19 cepas de
Pleurotus, a los 7 días de incubación.
Especie Cepa Área *
P. pulmonarius IE 4 9.7 a 0.78 P. ostreatus IE 131 11.7 ab 0.38 P. pulmonarius IE 135 11.7 ab 0.35 P. pulmonarius IE 136 13.0 ab 1.47 P. pulmonarius IE 115 17.6 abc 3.45 P. pulmonarius IE 140 18.5 abc 5.28 P. pulmonarius IE 226 19.7 bc 6.24 P. pulmonarius IE 167 23.6 cd 3.36 P. pulmonarius IE 225 25.0 cd 5.12 P. pulmonarius IE 227 30.0 d 4.95 P. ostreatus IE 240 32.0 de 6.04 P. ostreatus IE 137 40.0 e 5.84 P. ostreatus IE 129 40.2 e 5.39 P. ostreatus IE 241 56.3 f 1.70 P. ostreatus IE 238 61.7 f 3.68 P. ostreatus IE 239 65.0 fg 3.40 P. ostreatus IE 8 66.3 fg 5.42 P. ostreatus IE 49 69.4 fg 4.95 P. ostreatus IE 38 77.9 g 5.36
Los valores representan el promedio de 5 réplicas . * Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas con la prueba de rangos
El análisis de comparación de medias por medio de la prueba de rango múltiple de Tukey, determinó diferencias significativas. Para las cepas de P. pulmonarius el promedio más bajo se obtuvo con la cepa IE 4 y el más alto fue con la cepa IE 227. Para el caso de P. ostreatus, el valor más bajo lo presentó la cepa IE 131 y el más alto está representado por la cepa IE 38.
En la misma tabla 4, las cepas marcadas en negritas y que pertenecen a P. ostreatus, son las que presentaron el mayor crecimiento micelial en la viruta de pino, por lo cual se decidió trabajar con estas cuatro cepas, por ser las que presentaron mayor adaptabilidad a la madera de pino.
Es importante aclarar que las cepas IE 238, IE 239, IE 240 e IE 241 (tal como se muestra en la Tabla 3), fueron cepas obtenidas anteriormente por entrecruzamiento de la cepa IE 38 x IE 126, por lo cual y a pesar de que presentaron buen desarrollo micelial en la viruta de pino, para evitar problemas de endogamia sólo se seleccionó una de ellas que fue la cepa IE 239 por ser la que presentó mayor desarrollo.
5.1.2. Aislamiento de monospóricos y determinación de los tipos de apareamiento
La germinación de esporas se observó entre los 3 a 4 días de incubación, lo cual coincide con lo reportado por Durán-Barradas (1997). De las 20 a 25 esporas aisladas de cada cepa parental, se escogieron al azar 12 para la realización de las cruzas intra-especimen. Las 66 combinaciones observadas de cada cepa, de acuerdo a la presencia o ausencia de fíbulas, se clasificaron en 4 tipos de apareamiento ( A1B1; A1B2; A 2B1 ;A2 B2 ) lo que indicó que las
cepas de P. ostreatus presentan un patrón de sexualidad heterotálico tetrapolar, ya que la obtención de micelios dicarióticos fértiles sólo fue posible cuando se reunieron los alelos compatibles de los factores A y B, tal y como lo reportaron Eugenio y Anderson (1968) ; Sobal y Martínez-Carrera (1988) ; Mestizo-Valdés (1997).
En las Tablas 5 a 8 se muestra el comportamiento que presentaron los monospóricos de cada una de las cepas y la clasificación de los mismos en los 4 tipos de apareamiento.
Tabla 5. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 8 de P. ostreatus. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 - - - + - - - + 2 - - - - + - - - - - 3 - + - - - + 4 + - - - + 5 + - - + + - - 6 - - - + 7 + - - + - 8 - - - - 9 - - + 10 - + 11 - 12
Tipos de Apareamiento Cruzas posibles
I 1 3 4 6 9 10 (1-5) (1-12) (3-5) (3-12) (4-5) (4-12)
II 2 8 11 (6-5) (6-12) (9-5) (9-12) (10-5) (10-12)
III 7 (2-7) (8-7) (11-7)
IV 5 12
Tabla 6. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 38 de P. ostreatus.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 - - - - + + - + - - - 2 + + - - - + 3 - - - + - 4 - - - + - 5 + + - + - - - 6 - + - + - - 7 + - + - - 8 + - - - 9 + - - 10 - - 11 + 12
Tipos de Apareamiento Cruzas posibles
I 1 5 8 10 (1-6) (1-7) (1-9) (5-6) (5-7) (5-9)
II 2 11 (8-6) (8-7) (8-9) (10-6) (10-7) (10-9)
III 3 4 12 (3-2) (2-4) (2-12) (11-3) (11-4) (11-12)
Tabla 7. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 49 de P. ostreatus. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 - - - + - + - - - - - 2 - - + - + - - - - - 3 - - - + - + 4 - - - + - + 5 + - + - - - - 6 + - - - - - 7 + - - - - 8 - - - - 9 + - + 10 + - 11 + 12
Tipos de Apareamiento Cruzas posibles
I 1 2 6 8 (1-5) (1-7) (2-5) (2-7) (6-5) (6-7) (5-8) (8-7)
II 3 4 9 11 (3-10) (3-12) (4-10) (4-12) (9-10) (9-12)
III 10 12 (11-10) (11-12)
IV 5 7
Tabla 8. Resultados del entrecruzamiento de micelios monospóricos de la cepa IE 239 de P. ostreatus.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 - - - + + + + 2 - - - + + - - - - - 3 - - + + - - - - - 4 - - - - + + + + 5 + + - - - - - 6 - - - - 7 - - - - - 8 + + + + 9 - - - 10 - - 11 - 12
Tipos de Apareamiento Cruzas posibles
I 1 4 8 (1-9) (1-10) (1-11) (1-12) (4-9) (4-10)
II 2 3 5 (4-11) (4-12)
III 6 7 (2-6) (2-7) (3-6) (3-7) (5-6) (5-7)
5.1.3. Estimación del área micelial de los cultivos monospóricos
En total se evaluaron 48 cultivos monospóricos, 12 por cada cepa parental. En las Tablas 9 y 10 se muestran las áreas promedio alcanzadas por los 48 monospóricos en su cultivo in vitro en viruta de pino. El análisis estadístico aplicado, indicó que los micelios monospóricos con mayor área micelial para la cepa IE 8 fueron los monospóricos: 1 y 5; para la IE 38: 9, 2, 6, 12, 8, 1, 3 y 5; para la IE 49: 4, 8, 1, 12, 9 y 11 y para la IE 239: 12, 4, 3, 7, 6 y 5. Estos monospóricos se relacionaron con su tipo de apareamiento (Tablas 5 a 8) correspondiente, para seleccionar las posibles cruzas intra-especimen.
Tabla 9. Área micelial promedio en mm2 ( y desviación estándar) de los monospóricos de las cepas IE 8 e IE 38 en viruta de pino, a los 7 días de incubación.
Cepa IE 8 Cepa IE 38
Monospórico Área * Monospórico Área *
6 3.3 (0-69) a 4 11.7 (0.19) a 12 9.2 (1.36) ab 10 15.6 (4.58) ab 2 10.2 (2.97) ab 7 16.0 (7.97) ab 4 10.8 (3.69) ab 11 17.2 (3.52) abc 3 14.8 (7.79) abc 5 17.9 (5.69) abcd 7 15.9 (1.14) bc 8 22.5 (7.35) abcd 9 17.3 (6.18) bc 3 25.0 (8.91) abcd 11 17.5 (6.18) bc 1 25.4 (8.8) abcd 10 18.4 (9.58) bc 12 25.6 (7.93) abcd 8 18.5 (6.45) bc 6 29.2 (8.22) bcd 5 24.8 (1.06) cd 2 31.7 (9.62) cd 1 34.0 (8.74) d 9 32.5 (3.01) d
Los valores representan el promedio de 5 réplicas . * Valores que no comparten una misma letra en cada columna indican diferencias significativas con la prueba de
Tabla 10. Área micelial promedio en mm2 ( y desviación estándar) de los monospóricos de las cepas IE 49 e IE 239 en viruta de pino, a los 7 días de incubación
Cepa IE 49 Cepa IE 239
Monospórico Área * Monospórico Área *
3 11.9 (0.29) a 11 3.8 (0.63) a 7 19.1 (4.26) ab 2 4.8 (1.05) a 5 19.4 (3.91) ab 1 5.3 (1.16) ab 2 24.7 (6.78) ab 8 6.7 (1.11) ab 10 25.2 (4.77) ab 10 7.7 (1.09) abc 6 26.7 (7.98) abc 9 10.8 (1.36) abc 11 29.6 (8.97) bc 5 12.8 (2.53) abcd 9 31.9 (8.06) bc 6 14.7 (4.03) abcd 12 32.5 (7.96) bc 7 15.9 (3.97) bcd 1 34.3 (8.76) bc 3 17.4 (3.91) cd 8 41.3 (12.49) c 4 17.9 (8.90) cd 4 41.9 (5.9) c 12 28.0 (5.28) d
Los valores representan el promedio de 5 réplicas . * Valores que no comparten una misma letra en cada columna indican diferencias significativas con la prueba de rangos
múltiple de Tukey ( = 0.05%)
5.1.4. Obtención y selección de los dicariones (cruzas intra e inter-especimen)
De acuerdo a la compatibilidad existente entre los monospóricos que presentaron mayor área micelial de cada cepa, las cruzas intra-especimen obtenidas fueron 20, de las cuales 2 son de la cepa IE 8; 8 de la IE 38; 5 de la IE 49 y 5 de la IE 239 (Tablas 5 a 8 marcadas en negritas). A cada una de estas cruzas se les asignó un código de identificación para facilitar su posterior descripción.
En la Tabla 11 se muestra el área micelial de cada una de las cruzas intra-especimen obtenidas. El análisis estadístico muestra que para el caso de la cepa parental IE 8 con un área de 66.3 mm2, de las dos cruzas obtenidas de ella, la IE A2 la superó puesto que alcanzó un área promedio de 88.0 mm2. Para la IE 38 con un área de 77.9 mm2, solo la cruza IE B8 la superó con un área de 89.6 mm2. De la cepa IE 49 cuya área fue 69.4 mm2 la cruza IE C5 la superó con 70.1 mm2. Para la cepa IE 239 con un área de 65.0 mm2, 3 de las 5 cruzas obtenidas de ella la
superaron, siendo la IE D3 con 66.3 mm2; la IE D4 con 73.0 mm2 y la cruza IE D5 con un área de 80.1 mm2.
Tomando en cuenta estos resultados, se seleccionaron las 4 cruzas con mayor área, las cuales están marcadas en negritas en la misma tabla 11 (1 cruza por cada cepa parental).
Tabla 11. Área promedio en mm2 de las cruzas intra-especimen de las cepas de P.
ostreatus en viruta de pino , a los 7 días de incubación
Cepas Código de Identificación Área * IE 8 (8-7) IE A1 63.2 a 20.63 IE 8 (5-1) IE A2 88.0 b 2.88 IE 38 (1-6) IE B1 57.8 a 11.90 IE 38 (8-6) IE B2 58.1 a 14.99 IE 38 (1-9) IE B3 61.5 a 8.01 IE 38 (8-9) IE B4 68.9 ab 19.21 IE 38 (3-2) IE B5 69.3 ab 6.68 IE 38 (5-6) IE B6 71.1 ab 9.54 IE 38 (5-9) IE B7 72.2 ab 16.04 IE 38 (12-2) IE B8 89.6 b 0.60 IE 49 (4-12) IE C1 30.2 a 9.15 IE 49 (5-8) IE C2 31.0 a 5.65 IE 49 (1-5) IE C3 64.8 b 15.89 IE 49 (11-12) IE C4 69.2 b 9.88 IE 49 (9-12) IE C5 70.1 b 8.59 IE 239 (5-6) IE D1 49.5 a 10.11 IE 239 (3-7) IE D2 55.1 ab 8.28 IE 239 (4-12) IE D3 66.3 abc 11.60 IE 239 (5-7) IE D4 73.0 bc 15.74 IE 239 (3-6) IE D5 80.1 c 9.66
Los valores de área representan el promedio de 5 réplicas. * Valores que no comparten una misma letra en la columna para cada cepa indican diferencias significativas con la
Para la obtención de las cruzas inter-especimen, se utilizó el monospórico más rápido de cada cepa parental (ver tablas 9 y 10) y se entrecruzaron entre ellos dando como resultado 6 cruzas 100 % compatibles. Los datos del área micelial alcanzada por cada una de éstas cruzas se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12. Área promedio en mm2 de las cruzas inter-especimen de las cepas de P. ostreatus en viruta de pino , a los 7 días de incubación.
Cepas Código de identificación Área IE 8 x IE 239 (1-12) IE AD 32.1 a 10.78 IE 239 x IE 49(12-4) IE DC 33.0 a 4.13 IE 38 x IE 239(9-12) IE BD 40.4 a 4.49 IE 8 x IE 49(1-4) IE AC 67.1 b 5.45 IE 38 x IE 49(9-4) IE BC 79.5 c 2.91 IE 8 x IE 38(1-9) IE AB 81.6 c 5.26
Los valores de área representan el promedio de 5 réplicas . * Valores que no comparten una
misma letra indican diferencias significativas con la prueba de rangos múltiple de Tukey ( =
0.05%)
Con los resultados obtenidos se escogieron las cruzas IE AC, IE BC y IE AB para evaluar la producción de sus fructificaciones en planta piloto.
Los números encerrados entre paréntesis indican el número de monospórico utilizado de cada una de las cepas que se entrecruzaron.
5.2. Fase de Planta Piloto
5.2.1. Preparación del spawn, siembra e incubación
El spawn utilizado para la siembra de las muestras en ambos substratos, se incubó durante 15 días; tiempo suficiente para lograr una buena colonización del mismo. En esta fase no se presentaron problemas de contaminación por bacterias u otros hongos (Figura 8 y 9).
Figura 8. Spawn a los 15 días de incubación Figura 9. Colonización del micelio sobre los substratos
En todas las cepas la propagación del micelio sobre el substrato de paja fue más denso y compacto que en viruta de pino. El período de incubación de las cepas parentales fue entre 17 a 21 días para paja y de 18 a 25 días para pino. Estos datos son similares a lo reportado por Mata et al. (1993) y Woolrich (1993) para cepas de P. ostreatus cultivadas en paja de cebada.
Para el caso de las cruzas intra-especimen, el período de incubación en paja de cebada fue entre los 20 a 21 días y en viruta de pino a los 22 días. En las cruzas inter-especimen para paja fue de 20 días y para pino de 19 a 22 días (Figura 8).
5.2.2. Aparición de primordios y duración del ciclo de cultivo
En las tablas 13 y 14 se presenta el comportamiento que presentaron las cepas parentales, cruzas intra e inter-especimen con respecto a los días para la aparición de primordios, 1ª cosecha y ciclo de cultivo (días).
Tabla 13. Comportamiento de las cepas de Pleurotus ostreatus cultivadas en paja de
cebada
Cepas Aparición de
primordios (días) 1ª Cosecha (días) Ciclo de cultivo
IE 8 20 26 45 IE 38 21 27 43 IE 49 21 26 45 IE 239 17 21 40 IE A2 20 26 47 IE B8 21 38 48 IE C5 21 26 47 IE D5 20 25 42 IE AB 20 25 43 IE AC 20 26 44 IE BC 20 26 42
Tabla 14. Comportamiento de las cepas de Pleurotus ostreatus cultivadas
viruta de pino Cepas Aparición de primordios (días) 1ª Cosecha (días) Ciclo de cultivo IE 8 25 31 44 IE 38 19 23 41 IE 49 25 28 41 IE 239 18 23 31 IE A2 22 30 47 IE B8 22 29 48 IE C5 22 29 47 IE D5 22 30 49 IE AB 22 28 45 IE AC 22 29 44 IE BC 19 23 40
De las cepas parentales la IE 239 fue la más rápida en cuanto desarrollo de primordios, 1ª cosecha y días de cultivo. Los primordios alcanzaron la madurez a los 4 días para la paja y a los 5 días para pino.
