Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
“Control de calidad microbiológica del agua para
consumo.”
Álvarez Guevara Julieta; Gallo Mirta Alicia; Elichiribehety Élida.-
“Control de Calidad microbiológica del agua para consumo”.
Tesina de la Orientación: Tecnología de los Alimentos, presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Álvarez Guevara, Julieta.-
Tutora: Veterinaria, Gallo Mirta Alicia.
Directora: Veterinaria, Elichiribehety Élida Liliana.
Resumen
:Los componentes físicos, químicos y microbianos pueden alterar las características propias del agua sin afectar necesariamente de forma directa la salud. Para determinar la potabilidad del agua será necesario evaluarle diferentes parámetros los cuales deberán cumplir con los requisitos establecidos en el CAA, anexándose los requisitos de envasado en el caso de aguas embotelladas. Este trabajo tiene como objetivo analizar la presencia de Pseudomonas aeruginosa en aguas de consumo para determinar la inocuidad de la misma. La Pseudomonas aeruginosa es una bacteria oportunista con afinidad por el agua y posee alta resistencia al cloro, afectando individuos inmunocomprometidos así como fábricas lácteas y elaboradoras de agua envasada. Para determinar su presencia en aguas se trabajó con todas las muestras (pozo, red, de red que pasaron por tanque, de pozo que pasaron por tanque, de mesa envasada) recibidas en el laboratorio en un periodo de tiempo preestablecido, realizándose las pruebas presuntivas y confirmatorias correspondientes. Se llegó a la conclusión que salvo las muestras de red que pasaron por tanque, el resto dio presencia de Pseudomonas
aeruginosa, por lo que se propusieron algunas recomendaciones para obtener aguas seguras.-
Índice:
Página Resumen
1 Introducción 1
2 Objetivo 8
3 Materiales y Métodos 8
4 Desarrollo 13
5 Resultados 15
6 Conclusión 16
7 Anexos: 18
-Fotos 18
-Fotos maquinarias 20
-Anexo 1. 23
-Anexo 2. 24
1
Introducción:
“Para evaluar la calidad del agua de bebida, los consumidores se basan en su composición principalmente en sus sentidos. Los componentes microbianos, físicos y químicos del agua pueden afectar a su aspecto, olor o sabor. Aunque estas sustancias pueden no producir ningún efecto directo sobre la salud, son rechazadas por su condición organoléptica. En casos extremos, los consumidores pueden evitar consumir agua de bebida que sea inaceptable por motivos estéticos y consumir en cambio agua de otras fuentes cuyo aspecto sea más agradable pero que puede ser insalubre. Los cambios en la apariencia, olor y sabor del agua de bebida de un sistema de abastecimiento con respecto a sus características organolépticas normales pueden señalar cambios en la calidad del agua sin tratar de la fuente o deficiencias en las operaciones de tratamiento y deben ser investigadas” (OMS, 2006).
El término agua generalmente se refiere a la sustancia en estado líquido, aunque también puede hallarse en su forma sólida (hielo) y gaseosa (vapor), cubre el 71% de la superficie de la corteza terrestre, el 97% corresponde al agua salada y solo un 3% al agua dulce. Del total del agua dulce solo el 1% se encuentra disponible y en estado líquido y es utilizada en su mayoría para la agricultura (70%) seguida de la industria (20% en tareas de refrigeración, transporte, disolvente) y solo lo restante (10%) es de consumo doméstico.
El agua subterránea, es la que se encuentra debajo de la superficie terrestre en una zona de saturación (son formaciones geológicas capaces de almacenar y transportar agua) denominada acuífero
2 El agua subterránea se desplaza lentamente desde la zona de alimentación (permeable) a la zona de descarga (mar, cauce de ríos, otros acuíferos, manantiales, etc.), es un recurso natural renovable, lo que significa que su uso actual no ocasionara límites en su uso futuro, siempre y cuando no se afecte la calidad del agua o la tasa de renovación natural del acuífero.
El ciclo natural de recarga y descarga del acuífero se puede ver afectado por: el riego en exceso, por el vertido de desechos líquidos, por el aumento de zonas impermeables (asfalto), por la extracción desmesurada de agua subterránea, etc. El agua cuya composición química es: 2 átomos de Hidrógeno y 1 átomo de Oxígeno, es esencial para la supervivencia de todas las formas conocidas de vida.
El agua puede clasificarse según diferentes criterios: 1-Por su Origen:
*Agua Superficial (ríos, lagos, lagunas)
*Agua Subterránea (atravesaron un estrato rocoso y mantos de tierra hasta cierto nivel y fueron naturalmente filtradas de bacterias y partículas en suspensión)
2-Por la concentración de minerales de origen subterráneo: *Agua Muy Blanda (< 71 mg / litro de CaCO3)
3 3-Desde el punto de vista microbiológico:
*Potable
*Residual (tiene la calidad afectada negativamente ej: líquido industrial, minería, residuos)
4-Por el uso: *Entubada
*Agua de mesa envasada
*Potable (tiene un valor equilibrado de minerales que no son dañinos para la salud)
*Purificada (es la tratada para fines específicos de ciencia e ingeniería ej: agua destilada, agua des ionizada).
Vemos que el término “POTABLE” se encuentra en dos de los cuatro criterios de clasificación de agua ¿qué significa “Agua Potable”? el Código Alimentario Argentino (CAA) en el capítulo XII artículo 982 define como agua potable de suministro público y uso domiciliario a aquella que es APTA para la alimentación y uso doméstico, la misma no deberá contener sustancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales que la hagan peligrosa para la salud, debiendo cumplir además con los siguiente requisitos: A) Parámetros Físicos:
4 - Sólidos Disueltos (a 105ºC, valor máx. aceptable: 1500 mg / litro).
Los cuatro primeros parámetros se evalúan directamente y a simple vista.
B) Parámetros Químicos: (Anexo a- Fotos) *El pH (valores normales entre 6.5 y 8.5)
*Nitratos (concentración máx. permitida 45 mg / litro) *Nitritos (concentración máx. permitida 0.10 mg / litro) *Amonio (Valor máx. permitido: 0.20 mg / litro)
*Cloruros (valor máx. 350 mg/ litro) *Alcalinidad:(mg / litro)
En Carbonatos. En Bicarbonatos.
*Sulfatos (Valor máx. permitido: 400 mg / litro de SO-2 4 ). *Dureza (Valor máx. aceptado: 400 mg / litro de CaCO3) *Cloro libre residual (Valor min exigido: 0.2 mg / litro)
C) Parámetros Microbiológicos:
*Bacterias coliformes: el número más probable (NMP) a 37ºC – 48 horas (caldo Mac Conkey) en 100 ml: igual o menor a 3.
*Ausencia de Escherichia coli en 100 ml.
5 Para agua potable de uso domiciliario de pozo ubicada en los reservorios y depósitos domiciliarios, se determina el número de bacterias mesófilas viables en agar (PCA 24 horas a 32 – 35ºC) por el método del recuento en placa el cual no podrá superar las 500 UFC/ ml. Se realiza siembra en profundidad.
Con respecto al agua embotellada, el CAA en el artículo 983 la define como agua de origen subterráneo o proveniente de un abastecimiento público que se comercializa envasada en botellas, contenedores u otros envases adecuados provistos de rotulación reglamentaria y que cumplan con las exigencias del presente artículo. Además, deberá ser obturada con tapones, tapas de metal (coronas), tapa rosca y deberán contar con un sistema de cierre o dispositivo inviolable que evite toda posibilidad de falsificación y/o contaminación.
Las aguas embotelladas deberán por consiguiente ser potables, es decir, libres de patógenos, de sustancias tóxicas y no deberá presentar olores, tonalidades o sabores anómalos ni turbidez.
Tratamiento del agua embotellada:(Anexo b- fotos maquinarias)
El agua que ingresa a la fábrica, es filtrada sucesivamente para eliminarle partículas en suspensión, polvos finos y microorganismos, se desclorifica mediante el uso de filtros de carbón activado, luego se desmineraliza utilizando un equipo de ósmosis inversa o uno de intercambio iónico. El último paso antes del envasado es el tratamiento microbiológico que se lleva a cabo mediante procesos de ionización y ozonificación, el ozono entra en contacto con el agua en una torre de absorción durante un tiempo adecuado para lograr la acción bactericida. Luego el agua es mineralizada mediante el uso de bombas dosificadoras que pueden ser mecánicas o electrónicas y van al depósito de agua pre envasada.
6 (ambos tienen acción bactericida), luego los envases son llenados con el agua que previamente fue tratada y almacenada (agua pre envasada) mediante un circuito cerrado de tuberías, todo esto ocurre dentro de una estructura que trabaja a presión positiva.
Desde una tolva ingresan las tapas que son colocadas automáticamente en los envases que son transportados por una cinta transportadora, luego se coloca el rótulo y el precinto que se sella con calor, el envase así es embolsado individualmente y salen de la sala listos para comercializarse.
La calidad del agua embotellada se evalúa mediante la determinación de coliformes (bacterias aerobias anaerobias facultativas que fermentan la lactosa con producción de gas, fáciles de cultivarse y diferenciarse por lo que son indicadores ideales).
Los microorganismos que suelen encontrarse son de tipo Gram negativos ya que tienen la capacidad de sintetizar mayor cantidad de sustancias lo que les permite subsistir en sustratos con solo trazas de materia orgánica.
Pseudomonas aeruginosa forma parte de éste grupo y es, el microorganismo más preocupante que puede encontrarse en las aguas embotelladas, sin embargo, la incidencia de esta bacteria se reduce notablemente al ozonizar estas aguas. Es aquí donde la frase “Prevenir o Reducir la entrada de patógenos a los recursos hídricos” adquiere relevancia, la seguridad del agua se mejora mediante la implementación de barreras múltiples, ¿de qué manera?
1-Protegiendo el recurso hídrico
2-Seleccionando y aplicando correctamente operaciones de tratamiento
3-Controlando los sistemas de distribución (tuberías) para mantener y proteger la calidad del agua tratada.
7 estrategia eficaz para lograr un agua de calidad podría representarse con la siguiente fórmula:
Desinfección + Aplicación de Barreras = Agua de Calidad
La Pseudomonas aeruginosa es una bacteria con forma de bacilo (bastón) recto o ligeramente curvado, Gram negativo, aerobio, móvil (flagelo polar), capaz de formar un biofilm que le permite la adherencia, colonización y resistencia a antibióticos, razón por la cual, las cañerías de fábricas lácteas y de elaboración de aguas envasada son el ambiente ideal para el desarrollo de esta bacteria.
Secreta diferentes pigmentos como fluoresceína, piorrubina y piocianina, esta última le da a la colonia una coloración verde característica (aunque existen algunas cepas no pigmentadas), es capaz de sintetizar sus propios factores de crecimiento o vitaminas y crecer a bajas temperaturas (refrigeración), no tolerando las altas temperaturas. Es un microorganismo ubicuo, se lo encuentra en el suelo, agua, plantas, animales, se la ha aislado de baños, duchas, jabón de tocador, bañeras de hidromasaje, sistemas de distribución de agua así como de catéteres, soluciones para lentes de contacto y soluciones de diálisis, de las heces, piletas, peceras, etc. Este patógeno oportunista cuando encuentra las condiciones adecuadas (personas inmunocomprometidas) es capaz de producir enfermedad (tiene la capacidad de infectar heridas producto de cirugías o quemaduras, provocar otitis, dermatitis, foliculitis, conjuntivitis, sinusitis, etc.).
8
Objetivo
:Analizar la presencia de Pseudomonas aeruginosa en agua de pozo, tanque y agua de mesa envasada para determinar la inocuidad de la misma.-
Materiales y Métodos
:Para realizar el análisis bacteriológico de aguas en el laboratorio fue necesario contar con los siguientes elementos: 1-La muestra de agua (aportada por el interesado), 2-Tubos de ensayo grandes (16 cm de longitud y 30 ml de capacidad) 3-Gradillas porta tubos de ensayo, 4-Placas de Petri, 5-Pipeta de vidrio de 10 ml., 6-Ansa en Aro, 7-Mechero a gas, 8-Estufa para cultivo, 9-Agua Bi destilada, 10-Discos de oxidasa y 11-Diferentes medios de cultivos (Caldo Mac Conkey, agar cetrimide, Agar para recuento en placa y agar EMB). Por otro lado, se utilizó el reactivo ortotolidina (cancerígeno) para detectar cloro libre residual en agua y la escala colorimétrica con concentraciones de cloro conocida para comparar sobre fondo blanco.
El personal auxiliar del laboratorio se encargó de preparar, fraccionar en recipientes y esterilizar los medios de cultivos en autoclave a 121ºC durante 15 minutos, una vez que los medios se enfriaron, se retiraron del autoclave y se conservaron en heladera.
9 A las personas que se acercaron al laboratorio zonal de bromatología con intenciones de analizar bacteriológicamente el agua de su domicilio particular o empresa, se les entregó (por escrito) el siguiente instructivo de procedimiento:
Para la toma de muestra de Agua para BACTERIOLOGÍA (DEBERÁ UTILIZAR UN RECIPIENTE ESTÉRIL).
1) Saque de la canilla todos dispositivos que puedan producir salpicado y limpie la boca para eliminar cualquier suciedad.
2) Abra la canilla más cercana a la perforación obviando tanques intermedios si el agua procede de pozo, dejando salir agua durante 2 o 3 minutos. Si extrae agua provista por la red de obras sanitarias, saque la muestra de agua después de su pasaje por el tanque de reserva.
3) Caliente la canilla durante un par de minutos con la llama de un hisopo embebido en alcohol a fin de esterilizarla.
4) Abra la canilla y deje salir el agua de forma moderada, abra el recipiente estéril (frasco plástico de análisis de 250 cc con tapa a rosca), colóquelo bajo el chorro de agua y recolecte la muestra.
5) Cierre el recipiente inmediatamente.
6) La muestra DEBE SER REFRIGERADA (no congelada) hasta su llegada al laboratorio, no debiendo transcurrir más de 24 horas desde el momento de la recolección hasta su entrega.
10 Una vez que se recibieron la o las muestras de agua en el laboratorio, fueron rotuladas para su fácil identificación con un número, se labró el acta de inspección, se les realizó el control de Cloro libre residual (valor normal entre 0.2 y 0.5 mg / litro) y se las sembró dentro de tubos de ensayo con caldo Mac Conkey.
Recipiente de Acta de Inspección Escala colorimétrica para Cloro libre muestra
Procedimiento de análisis para determinar el Número Más Probable (NMP) /100 ml de Bacterias Coliformes Totales:
Utilizando la pipeta de vidrio se sembraron 9 tubos de caldo Mac Conkey (color violeta) atemperado y con campana de Durham de la siguiente manera:
*3 Tubos con caldo Mac Conkey a DOBLE concentración + 10 ml del agua problema en cada uno de los tubos.
*3 Tubos con caldo Mac Conkey a simple concentración + 1 ml del agua problema en cada uno de los tubos.
11 Los tubos fueron rotulados con el mismo número que la muestra para identificarlos, se le colocó un tapón plástico a cada uno, se los acomodó en una gradilla en filas de 3 de mayor a menor concentración de agua y se llevaron a estufa de 32ºC durante 48 horas.
Gradilla con tubos con Caldo Estufa de Cultivo a 32ºC Mac Conkey sembrados
El caldo Mac Conkey posee lactosa que es fermentada por las bacterias coliformes formando gas (más de 10% se considera positivo) y ácido (se ve un viraje en el color del violeta al amarillo). Se determina con los tubos positivos el NMP utilizando la tabla de Hoskins (Anexo 1)
12 Aislamiento e Identificación de Pseudomonas aeruginosa:
A las 48 horas se retiraron los tubos con caldo Mac Conkey de la estufa y se los observó a cada uno buscando la presencia de formación de un VELO en la superficie del líquido. De los tubos positivos (tenían velo) se eligió 1 tubo (generalmente es uno a doble concentración porque tiene más muestra de agua) y con ayuda de un ansa en aro, que previamente se flameó y enfrió, se procedió a sembrar una muestra de velo en una placa de Petri con agar cetrimide (medio para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa). Este previamente fue atemperado a baño maría y se pasó del tubo a la placa donde se dejó enfriar y solidificar. En el cetrimide se realizaron estriaciones con el ansa en aro de manera de lograr colonias separadas (Diagrama Nº 1) luego de la incubación. La placa se llevó a estufa de 32ºC por 24 – 48 horas.
Mac Conkey con formación de VELO Agar Cetrimide
13 una ansada y se sembró por estriado en la placa con Agar EMB (color rojizo, sirve para confirmar la presencia de bacterias coliformes) y se llevó a estufa de 32ºC por 24 horas.
Al día siguiente se observaron las placas, en el caso del EMB el desarrollo de colonias confirmó la presencia de coliformes. En el caso del cetrimide el desarrollo de colonias y/o pigmentación verdosa en el medio de cultivo confirmaron la presencia de Pseudomonas aeruginosa en el agua problema.
Cetrimide con Pseudomonas aeruginosa Disco Oxidasa +
Seguidamente se realizó la prueba del disco de oxidasa que consistió en enfrentar dentro de un tubo de ensayo con agua bi destilada 1 disco de oxidasa con 1 colonia extraída por barrido con el ansa en aro (flameada y enfriada previamente) del agar cetrimide. La prueba se consideró positiva cuando se observó el cambio de color del agua bi destilada de transparente a rosado intenso.
Finalmente se redactó el protocolo de análisis (Anexo 2) con los resultados por duplicado, uno de los ejemplares se entregó al interesado registrándose el número de protocolo con fecha y nombre en el cuaderno de salidas, el otro ejemplar quedó archivado en el laboratorio por un periodo de 6 meses que es lo que establece el CAA para el análisis bacteriológico de agua.-
Desarrollo:
14 11/07/2016 y el 05/10/2016 (lapso que coincidió con el tiempo de residencia). En total se analizaron 130 muestras de agua de procedencias varias, por lo tanto se decidió agruparlas de la siguiente manera:
*Aguas de Pozo *Aguas de Red
*Aguas de red que pasaron por tanque *Aguas de pozo que pasaron por tanque *Aguas de mesa envasadas
Gráfico Nº 1.
Agua de Pozo
Agua de Red
Agua de red que paso por tanque
Agua de pozo que paso por tanque
15
Resultados
:Del total de personas que trajeron a analizar su agua, la mayoría poseía agua de pozo, sin embargo de los análisis realizados se obtuvieron los siguientes resultados (solo para Pseudomonas aeruginosa):
Las muestras de red que pasaron por tanque fueron el único grupo que tuvo ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 100 ml.-
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
71 29 18 6 6 Número
de muestras
Número de Muestras Positivas
16
Conclusión
:Considerando que Tandil tiene un acuífero freático en un medio poroso clástico formado por sedimentos pampeanos y post pampeanos sobrepuestos a un basamento cristalino compuesto principalmente por migmatitas graníticas y que el agua de pozo, consumida por la mayoría de las personas del muestreo, proviene de ahí, es conveniente la implementación de clorinadores a la salida de los pozos que sean correctamente utilizados y regularmente controlados para ayudar a prevenir la presencia de Pseudomonas aeruginosa. No obstante, existen algunos patógenos que son aún más resistentes que la Pseudomonas aeruginosa a la cloración como virus y quistes de protozoarios (como el de
Giardia lambia), razón por la cual se aconseja implementar para todas las aguas de bebida, el tratamiento de doble barrera: Floculación (separa materiales coloidales) Filtración (con filtros de arena o tierra de diatomea) seguida de desinfección química para inactivar a los patógenos residuales.
Por otro lado, se llegó a la conclusión de que consumir agua de mesa envasada no garantiza la ausencia de Pseudomonas aeruginosa, si ésta no fue debidamente procesada.
Debido a esto, algunas recomendaciones útiles para la población serían: -Analizar el agua de sus pozos al menos 1 vez por año.
-Potabilizar el agua que va a consumir hirviéndola por 5 minutos o agregándole 2 gotas de lavandina por litro de agua si es que desconoce la procedencia.
-Resguardar los dispenser de agua luego de su uso.
17 antibióticos, sumado al abuso en el autoconsumo de los mismos, torna al tratamiento engorroso.
18
Anexos:
a).Anexo Fotos:
Peachímetro
Kit para Nitritos (el tubo A es el testigo)
19
Prueba de Cloruros
Carbonato Bicarbonatos
20 b) Anexo Fotos Maquinarias (agua envasada):
Tratamiento del agua que ingresa a la planta para envasarse.-
Filtro Carbón Sistema Ósmosis Inversa Torre Activado Ozonizadora
Ingreso de los envases a la sala de llenado.-
21
(Vista Exterior Lavado).-
(Vista Interior Lavado).- Ingreso Pre Lavado Lavados de envases
22
Tolva con las tapas de los envases (colocado automático)
23 c) Anexo 1:
Tabla de Hoskins
Número de tubos positivos del total de:
3 tubos de 10 ml. 3 tubos de 1 ml. 3 tubos de 0,1 ml. Índice del NMP/100 ml.
0 0 1 3
0 1 0 3
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
24 d) Anexo 2:
25
Bibliografía y Sitios de Internet
:*Código Alimentario Argentino 1969 actualizado en 2012. Capítulo XII “Bebidas hídricas, aguas y aguas gasificadas” Disponible en: http://www.anmat.gov.ar/alimentos/Capitulo.XII
*Frazier, W.C y Westhoff, D.C (1993). Microbiología de los alimentos. 4ª Edición. *Guía de trabajos prácticos Nº2: Análisis Físico-Químico y Bacteriológico de Aguas. 2014. Materia Bromatología e Higiene Alimentaria. Universidad Nacional del Centro. Facultad de Ciencias Veterinarias.
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