Técnicas básicas de ingeniería genética en plantas

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(1)TECNICAS BASICAS DE INGENIERIA GENETTCAEN PLAMAS * Alejandro Calderón xx I.. INIRODUCCIO}I. Existen dos fornas de definír un gen. l,a prinera es una definición genética. Se dice que un gen es un "CISTRON'Io 1a unidad mínima de recombinación. En otras palabras, esto quiere decir que solamente genes díferentes (identificados nediante mutaciones) se pueden recombinar, La segunda definición es físÍca y sería: el segmento d.e ADN involucrado en Ia producción de una cadena pol.ipeptidícá, lncluyendo sus secuencias reguladoras como pronotor y seña1es de poliadenilación y terminación, A pesar de que exiaten marcadas diferencias entre los genes en prokarioEes y eukarlotes, en ellos se pueden identifícar 3 regiones conunes fundamentaLes: l) Prornotor, 2)-Gen estruc_ y tural 3) Las señales de poJ-iadenilación y terninación. Genes en prokariotes. En los genes prokarióticos existe una precisa colinearidad entre la nolécula de ADN y su producto final, es decir, 1a proLeína (Figura l). Geues en eukarioies. Los genes eukarióticos (hasta ahora no existe evidencia en genes prokariotes) se encuentran fragmentados o dÍvídidos, es decir, su gen estrucLural está dividido por secuencias alternas que se traducen y secuencias que no se traducen a Droteínas. La mo1écu1a de ADN es transcrita a un ARN intermediario que se llarna hnARN(ARN nuclear heterogéneo), el cual después de sufrii un proceso de ttPODAtt,que elimina 1as sec uencias que no se traducirán, es transportado al citoplasma para ser traducido a proteína (Figura 2). Tanto 1os genes prokariotes como los eukariotes necesítan de secuen_ cias controladoras que son identificadas por 1a maquinaria de la cé1ula para transcribir la información genética. Estas secuencias controladoras son, como ya se dijo, Los promotores y las señaLes de poliadenilación y terrni.nación. Un gran avance en Ia tecnoloeía de ADN recombinante ha sido poder TTCONSTRUIR" genes quÍméricos (eio_. Contribución. Centro Internacj-ona1. de Agricultura. Bió1ogo M.Sc. Unidad de Biotecnología,. Tropical,. CIAT.. A . A . 6 7 1 3 Cali , CoLombia ..

(2) Promolor. Tcf mtnoctoT. Ftg.t - Es¡ructu¡a dt la untdod & ,rcasc pctón ca prokorlo¡tdQ,. 11,. ,t. ,I. ,..",,::,.-. Enhoncc?(t)/Sit r|€la.E. -....-. .,. i. .,-.'.,. Promors?. D¡Vá+---1 a^it. -ao. AtO. ?^t^. -60. -30. -to. it S.curñc¡o codt¡tco(Wo. Fig.2- Eel¡uclu¡o det gan euho¡idttco co/, tos dllarentes ¡eglonas que to componea. 178. 1----ona.

(3) cando La bestia de la mitología griega que combinaba cuerpo de cabra, cabeza de león y cola de serpienie).Eétos genes quinérilo" truyen de acuerdo a 1as necesidades de1 invótigadtr "..or,rl y pueden poseer un proúocor y una secuencia de poliadenilaclón y ierrninación qrre es identificado por la naquinaria dé un eukariote (una planta) cont;o_ lando 1a expresÍón de un gen estructüraL proveníente dá un piokariote (una bacteria). II.. SISIE.ÍAS DE INIIODU@ION DE GENESEN VEGETAI¡S. Toda la Ingeniería Genética en plantas ee fundamenta en poder introdu_ cir 1os genes conatruldos en un tubo de ensayo, dent.ro de una cél-u1a planta y a pa¡tir de el1a regen"rá, una planta completa. *: .tl. -sn ra pranta regenerada de _ _eata manera, todas suj células poseen y_ expresan e1 gene introducido. . En Ia Figura 3 se nuestra 1as posi_ bles vlae para int,roducción de ADNdentro d-e las Dlantas. Introducció¡ directa de genee. En esta categoría se encuentran 1as técnices basadas en la 1¡ltroducción cle nolécuias de ADl,¡directanente dentro de Ia cé1ula sin utilizar ningún otro organÍsmo cono mediad.or de la introducción. Se pueden desmür la nicrJ inyección, Ia elec_ troporación y'el bonbardeo con partlculas de tungsteno. rgas de vidrío de calibre muy pequeEe, en prlncipio, en protoplastos, upos de céLulas como pro-embriones, rudo microinyectar protoplastos de erar plantas transformados (Crosswa neses denostraron que no sólo Ios pueoen ser uELllzados para microinyectar sino que también se puealen usar células intactas (Non"r. et;1 19g6). Én L9g7 De la Peña y colaboradores (De La peia et al l9g7) demásLraron qo" podía obtener plantas transgénicas utilizando estructuras ". más desarrol1adas, como tal1os florales. Una gran desventaja de la microinyec_ -céluIas ción es que la viabilidad de las inyectadas es nuy baja. Tanbié¡ se requiere ctel uso rle un equipo muy sofÍstícado q.re sól.*uite-está a disposición en laborarorios d. inu""iil".ión muy .;;;r;;;".'Electroporaci6n. Una de las linitaciones de 1a microinyeccíón es que sólo se pueden inyectar células uo" por-un". Cono consecuencia exÍsten otros nétodos alternativos que ofrecen la posibilidad de introduci.r sinultáneanente DNAdentro de muchas células. Desde 1982 (Krens et a1 1982) se utilizó un método químico para intro_ ducir mol-éculas de ADN dentro d.e células de pkrntas cqn una relativa_ mente baja frecuencia de transformación. (fó-)). El mótodo utiliza PEG ( poJ'ietilenglicol ) como agente que facilita 1a entrada de ADN dentro de 1as cétulas vegetalesl Aunque se ha demostrado integración 179.

(4) . DNA PURIF'CADO. 'r'\ -/\. IPA¡'SFEFEIVC'Á URECTA OE 6E'VES. EMBR'ON. MERIS7EMA. rFÁ'VSFEFE'VCIÁMEOIADA POR A6ROAACTERIUM. PROTO. CELULA TEANSFúMAOA. I. I. CALLO. II. Y REOE'V€FáC'4\'. CELULA rRÁ,VS'FOR¡üÁAÁ. PI-AN7A TRANSGENICA. F¡9. S- Dlf c¡ea/.s vlot ADN cn e;tulac. o ¿lelcmat paÍo ta ln!¡oducctón &t (h plontat. r80.

(5) Fig. q - Mdtodo da micrcinycccidn utilizando p?o¡optotto.. de las moléculas de ADNextraño dentro del genornade 1a planta transfornada, la baja frecuencia de transformación impulsa a seguir buscando otroa nétodos de transformación. otro de tales nétodos es la en Ia cual se aplica un impulso de alto voltaje electroporación, a r¡na solucfón que contiene las células que se quiere transfornar, la permeabilidad en la membranaplasnática con el objetivo de invertir creando pequeños poros tenporales a través de los cuales el ADN puede penetrar al interior de Ia céluIa (Figura 5). Bombardeo coo partículas Es un método nuevo y revolude Tungsteno. cionario desarrollado en la Universidad de Cornell. Consiste en el, recubriniento de tungsteno con moléculas de ADNformando partícuIas que después son acelerados a alta velocidad. Estas partículas aceleradps se dirigen hacia su blanco que pueden ser diferentes tipos de explantes: hojas, ca1los, ernbriones, etc. (Figura 6). Hasta ahora este método ha sido utilizado con mucho éxito para realizar Ia introducción de mo1éculas de ADN dentro de las células de la planta para detectar su expresión in vivo. Una nodificación a este nétodo que partlculas de oro aceleradas en un canpo eIéctrico ha sido utiliza para transfort¡ar y obtener plantas transgénicas de soya utilizado (McCabe, er al 1988) .. 181.

(6) ELECTROCHOOW. Peg r Co. PoO+ Co. Ftg.5- ñcprescnlocidn esqucmdllco dal mitodo dt tlcct¡oPo¡oción. Ptoco paro ('aleaer .l proyectlltlc nYbn "---i---\. Pln dlspomctor. | É77r7't ra. (h avbn. il:l:'¡:'. "Q. Flg.6- Discflo de un oporoto poro bombardeocm portlculas d. ¡uags¡año 182. te!t"o,.

(7) Introdu.cióD de genes ryqi"_qg por ¡probacterium. Agrobacteriun u¡rplacisrs, que una bacteria GRAM-NEGATIVA de1 suelo causa la enfernedad de es la agalla de Ia corona en 1a nayoría de las plantas dicotiledóneas. las cétulas de la aga1la de la corona tienen dos características importantes: l. Producen una amplia varíedad de compuestos llanados opinas que no están presentes en células normales y 2. Presenta habilidad de proliferar indefinida¡nente en cultivo in vitro sin la necesidad de ñormonas. Las opinas son derivados de-iilEñediarios conunes en el metabolisno. la producción de opinas específicas (nopa1lna u octopina) depende de la cepa de Aqrobacterium que induce el tunor y nó de la especie de planta afectada. Estos compuestos son usados por 1a bacteria cono fuente de carbón y nitrógeno. I¿ transformación de las cé1ulas de 1a planta llevada a cabo por Aprobacteriuo se debe a un p1ásmido de gran tamaño que posee 1a bacteria (pIásmido Ti. Figura 7). En realidad una parte del plásnido es transferido y expresado en eI genoma de 1a planta, El fragmento transferido se denonina T-DNA. Para que este fragnento se integre en el ADN de 1a planta, existe una secuencia de 25 pares de bases localizadas e¡¡ los extrenos de T-DNA identÍficados cono sitios de reconbinación, Otros fragnentos importantes del plásmÍdo Ti, para que se realice la transferencia, es eL denoninado fragnento "VIR" (por virulencia). Sin enbargo e1 fragmento "VIR" ¡q se transfiere al genomade 1a planta. EI fragrnento VIR codifíca los genes VIR que actúan en TTTBANS'' para promover Ia transferencia de1 T-DNA (Figura 7). Esta asociación parasítica entre la pl-anta huésped tan particular y una cepa de AFrobacterium, que dicho sea de paso es eI único ejernplo de transferencia genética de un procariote a un eukariole, ha sido de gran valor ecológico para la bacteria. En realidad Agrobacteriun, que utiliza los opinas como elenento, puede infectar plantas susceptibles, transferj-r el T-DNA a las células de 1a planta e inducir la fornación de tunores. Este proceso está asociado con la síntesi.s de opinas, por 10 Lanto los tumores inducidos, constituyen un nicho ecológico para la bacteria donde solamente el1a y no Ia planta se beneficia de 1a síntesis de opinas. Esto lógicamente 1e dá adicionales ventajas a Agrobacterium con respecto a otras bacterias del suelo. de parasitismo ha sido Este caso particular Ila-nado colonización genética (Sche1l et a1 1979). Figura 8. Los plásnidos Ti han Vectores cointegrantes y vectores binarios. para desarrollar diferentes sistemas de vectores sído utilizados Describiré dos de los más para introducir genes en 1as plantas. conunes. El sistema de los vectsores cointegrantes utilizan un vector internediario el cual no se replica en Agrobacteriurn pero puede cointegrarse con un plásmj-do Ti que se encuentra presente en 1a bacteria y para el cual las secuencias del T-DNA han sido reemplazados por que es e1 vector de clona:¡iento PBR322. Este vector internediario un derivado del vector PBR322y que 1leva los marcadores de selección ya descritos, se introduce dentro de Agrobacterium por medio de un Posteriornente 1a integración Droccso conocido como novilización. 183.

(8) A-PtosmidoTi de lo noPolino. catobolismode lo orginino obotismodc lo noPolino Tronsferenciodel Plosmido. agroclinoPino. {,0y Sinúasisde lo ogroPino B- PlosmidoTide lo octoplna Cotobolismode la octoPino. otobotismode lo ogroPino oRl. Fisuro7- @. PtosmidoTi de tiPo NoPalino PlosmidoTide tiPo OctoPino 184.

(9) t. .E q. I lr E t o. I g. (,o. ;I !l. SE. fo 8f. qo. a¡5. TE. ri+. d. ! I t. c. o. ,t. I (¡. i. -t€. s€ ¡ $E t. <¡. s(¡¡. S". St. - co (J. tr g E t. sh¡ c. s' o. a-. C). "d:". o. !. o. a c. a-. É. r., <t. o. 00. tF¡. 5 5 (¡¡ lJ-. ie¡.

(10) de1 vecLor intermedíario dentro de T-DNA de1 plásnldo Ti ocurre por un proceso de recombinación homóloga. Üird uez que esto ha ocurrido ta bacteria está lísta para ser usada en experinentos de tr¿¡lsformación. El sisEema de vectores binarios se basa en la presencia de 2 plásmidos Uno de ellos posee los Senes en la mísma cepa de Agrobacterium. ttvir" que a.tu"rí"n del pronover Ia tiansferencia en--rEiáléFla-ra E1 pIásmido T-DNA que a su vez se encuentra en un segundo plásnido. que lleva el IT-DNA puede ser repllcado tanto en -Por coli colDo en E. -itanto e1 pueds y ser f ácil¡nente novilizado. ¡ElgglgLllg Áe basa en la eeparaclón de J"os genes "virt' y eJ;G;ema-binaríó T-DNAen dos pIásrnidos independientea pero conplenentarios. De todos de plantae. Ma¡cadorea de eeleccl6n para tranaforuaclóa Ios narcadores de eelección oás usadoe para tranafornación de Plantas el más ueado ha eido el gen ¡gq II. Este gen codÍfica Por Ia enzyma que no Ee encuentra preaente en plantas NEOMICINAFOSFOIIANSFERASA, Ia enzÍma conflere a au vez 1a capacidad nornsleE (no tranefornadae). del tlpo una amplla a varledad de antlblóticos de ser resistente La.enzima y tales Neorolcina. cono f,anánicina de los aolnogllcósfdoe, fosforlla uno .de los grupoe hidróxldo llbre de estos ant1blótlcoe. Por 1o lanto ung planta traneformada con este gen podrA crecer en presencia del antlblóttco Kananlcina o neoniclna ein ninSún probletra tóxlco . El1os son. Recientenente se han deearrollado doe nuevos narcadores. e1 gen "!g¡" y e1 gen "!id A". Figura 9.. f.. ¡g!. 2". bq. 3.. Vid. Figura 9.. II. Íleomyci,nphoaphotransfera6a Acetyltransf erasa (inactiva la PFT). phosphinothricin. (PAT). Inhibe. tr¡. PPT (Foefinotricina. sintelasa. la Glutamino ). - Glucuronidase. Tres marcadores de selección y su producto génico.. 186. para uso en plantas. (genes).

(11) El gen bar fué clonado del hongo St¡eptonvces hvgroscopicus y codifica (PAT), la cual acetj-da un nor- la enzi¡na FOSFINUIRICINATRANSFERASA (PPT)' para de esta herbicida FOSFIN0TRICINA anino libre de1 irupo PPI es un potenpreviniendo sus efectos tóxicos. ¡nanéra inactivarlo, te inhibidor de la glutominqsintetasa ' una enzima que tiene un papel central en 1a asimilación de /rM0NIo y en 1a regulación del metabolísrno de1 nitrógeno en plantas. El gen uid A clonado de E. coli codifica Por la enzina Seta-glucoromíque catallza el corte de una anplia dasa, la cual es una hidrolasa los cuales se consÍguen muchos de Beta-glucoronidos, de variedad fluorometria para eapectrofotometria, .otJ aubsEratos comercialnent. presencia puede J.a detectar se Histoquímicamente o hfstoquínica. X-GLUC cronogénico eI substrato adlcionando Beta-glucuronidasa Ia de pro?orciona cual planta el posible transgénica, extracto la de a un un precipitado azúI en un lugar de actlvidad enzinátlca. [a bacteria Bacíl1us thuringiensls a iBsectos. Plantas resistentes activo contra varios tipos un polípéptido es capaz de sintetizar Esta toxina producida por B. thuringÍensis se considera de insectos. un exceLerite sistena de biocontroL puesto que no se conocen efectos EL deletéreos contra organisnos que no sean su. blanco de acción. gen para la toxina d. E. !. fué clonado e introducitlo dentro de un Este vector ha sído utilizado vector Ti. Para transfornar plantas Puesto que l-a toxifia se produce en todas las de tabaco y otros. céIu1as de Ia planta ésta se Protege cottra e1 ataque de insectos. Figur:a 10. Otro sistena de protección contra insectos ea a través de los inhibiEstos inhibj-dores de proteínas son proteínas dores de proteasas. que se presenta una herida en la planta (causada inducídos después de proteína innediatanente después por un insecto). sintetizada la INDUCIOR DE IOS INHIBIde que se hace Ia herida es e1 tlamado "FAGIOR (PIIF). proteína a su vez desencadena una Esta DORESDE PROIEASAS" reacción en cascada para inducir la fornación de varios Ínhibidores de proteasas. Estos inhibidores son dirigidos contra Proieasas pertenecientes a los insectos que ocasionan heridas en la planta ínhibiendo E1 gen de1 inhibidor de de1 insecto. 1a digestión en e1 intestino introducido en tabaco papa e proteinasa II de 1a ha sido clonado gen, confiere resistencia al ataque en el cual Ia expresión de este por insectos. Plantas reaistentes a herbicidas. El uso de herbicidas para ninimizar pérdidas en los cultivos debido a 1as malezas, se ha convertido en parte integral de la agricultura moderna. Continuamente se están que sean altamente efectívos para desarrollando nuevos herbicidas que no tengan ímplicaciones deletéreas en el medio ambiente o en 1os aninrales. Una de estas nuevas generacj-ones de herbicidas actúan de algunos a¡ninoácidos en especial. inhibi-endo las vias biosintéticas. 187.

(12) H-ASMIDO DE NOPAUNA. PLAS¡TIIDOOE. CULTIrDA 370 cE -sa9 NT,. w Nft. 7Eá¡\'5COAA,'IEA¡'7E. @. @o. AAITIBOTiúOS. Frg-tO-a)so d.t. vacloÍ lt. pa¡o trantlo¡mactón. da Ptonlo.. da ¡omoto. Si-n enbargo, estos nuevos herbicidas no distinguen entre malezas y cultivo. Por 1o tanto, se necesita de un nétodo para modificar de tal modo que puedan ser resistentea a este nuevo los cultivos para protección tipo de herbÍcidas, y por ende puedan ser utilizados de los cultivos, Atrgrurosgrandes laboratorios ya han desarrollado plantas resistentes a herbici.das. Só1o para citar un ejenplo es el herbicida BASTA(producido por la Hoechst) cuyo principio activo es la phosphinotricina. Ya se han producido plantas de tabaco (que se usan sólo cono nodelo) por transformacíón con AProbacterium, que contlenen el gen bar. Este gen, como ya se nencionó antes, fué clonado de un hongo y produce una enzima llanada FOSFINOTRICINAACETILTRANSFERASA.Esta enzima en su Brupo amino 1ibre, inhibiendo puede acetilar 1a fosfínotricina Se ha denostrado que las plantas de este modo sus efectos tóxicos. transgénicas de1 herbicida. que poseen el gen ttbart' resisten concentraciones Figura 11. BASTA que de otro moilo las destruiría.. I88. altas.

(13) a Herbicidas. Plantas resistentes. - Herbicidas Biológicos - Fhosfinotricina (PPT) - Inhibe Glutanino Sintetasa - Gen clonado de ql4plgnyeeC (bar ) coalifica por : Fosfinotricína (PAT). hvgroscoDlas. Acetiltransferasa. - Plantas transgénícas con ttbartt presentan resiatencia al .herbicida PPT (Tabaco, Reoolacha). Figura 11.. Proúección a herbícídae Genética.. obtenidé a través. de Ingenietía. Las plantas resistentes Plantas resistentes a infeceiones virales. a virue se pueden obtener nediante Ia estrat.egia se basa en e1 hech (obtenidas pgr transfornacÍón cor tabaco, que expresaban los genes d en particular también conferían r del cual se había obtenitlo el gen de 1a cubierta protéica' - Los niveIes tan altos de protelna de cubierta del virus obtenidos por Ia planta transgénica ántes de 1a infección viral parecen actuar interfiriendo con el proceso de remoción de Ia cubierta del virus que l-nrecta. Figura 12. Una segunda opcíón para obtener plantas resisLentes a vÍrus es a -de son nol-éculas de ARN traués los ARN r.iélit.". Los ARN satélite EStos nucléico' áci,do asociados, a virus de plantas con ARN como Estas, virus' de1 para Ia replicación ARNsatélites ,ro .on n...""rios noléculas de ARN son replicadas dentro de la célu1a huésped a1 igual que el virus en el cual eLlas viajan y puesto que son eEpacadas con el vírus pueden vi.ajar de tejido enfermo a tejido sano.. 189.

(14) PLANTAS TOLERANTES A INFECCIONESVIRALES I-. PROTE'NA DE LA CUArcFTA. Pro¡€íao & to cublctro &l. I. vlrut. f. 2. FNA SATEL'TE ( C.UJ ,. F¡g.tz- Prolccción o ilrut. ob¡cnldo con md¡odot ó. tngant do gond¡¡co. lo particular de estas mo1éculas de ARN es que pueden atenuar loe síntomas reduclendo la severidad de una infecclón vfral. Ahora bien, se ha denostrado que plantas transgénicas en las cualee se ha introducido un fragnento de ADN que después de ser tranacrito, produce una nolécula de ARN satélite d€ un virus en particular, se presenta un alto grado de resistencia aL virus en el cual esa molécula de ARN viajaba. III.. BIBLIOGMFIA. 1." Crossway, A. et al, 1985. The potential of micromanipulatlon techniques for plant improveñent. In: Proc. Int. Symp. on nuclear techniques and ín vitro culture for plant inprovenent, p. 477. vienna (Ausrria).. 190.

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