FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
TESIS DOCTORAL
Detección de Helicobacter pylori y su resistencia antibiótica:
métodos fenotípicos, genotípicos y secuenciación del genoma completo
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Ana Miqueleiz Zapatero Directora
Teresa Alarcón Cavero Madrid
© Ana Miqueleiz Zapatero, 2021
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
TESIS DOCTORAL
Detección de Helicobacter pylori y su resistencia antibiótica: Métodos fenotípicos, genotípicos y secuenciación
del genoma completo
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Ana Miqueleiz Zapatero
Directora
Teresa Alarcón Cavero
Departamento de Microbiología
Detección de Helicobacter pylori y su resistencia antibiótica: Métodos fenotípicos, genotípicos y secuenciación
del genoma completo
Tesis Doctoral
Doctoranda
Ana Miqueleiz Zapatero
Directora
Teresa Alarcón Cavero
Madrid, 2021
“Al final todo saldrá bien, y si no sale bien, es que aún no es el final”
La película: El exótico Hotel Marigold
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, quiero agradecer a la Dra. Teresa Alarcón, porque sin ella no hubiera sido posible realizar esta tesis. Gracias por haberme dado la oportunidad de terminarla a distancia, por tu dedicación, tu entrega y por tanto apoyo durante todos estos años. Es una suerte que además de ser mi Directora de Tesis pueda considerarte también mi amiga. Mil gracias de corazón por todo.
A la Dra. Mónica Oleastro, por acogerme tan cariñosamente en su Laboratorio del Instituto de Salud Nacional Dr. Ricardo Jorge en Lisboa. A la Dra. Kaisa Thorell por su ayuda y colaboración. También a todos los facultativos de Microbiología que participaron en el desarrollo de la encuesta nacional de H. pylori.
A todo el personal del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario La Princesa, por haberme tratado siempre con tanto aprecio y haber hecho que los cuatro años que pasé allí formándome como residente merecieran mucho la pena, no sólo a nivel profesional, sino, lo que es más importante, a nivel personal. Al Dr. Diego Domingo por ser una excelente persona y alegrarnos los días a todos con su gran sentido del humor. Ha sido un lujo haber trabajado a tu lado. Gracias Diego también por “acompañarme” a tantas “finales de Champions” (¡Hala Madrid! y ¡Aúpa Osasuna!). Al Dr. Ventura Buendía, por el afecto y los buenos ratos de cachopos los viernes en el Ordás. A Vero, por su inmejorable labor como técnico de laboratorio encargada de H. pylori. A Claudio, por su infinita paciencia y disposición para explicarme sus conocimientos bioinformáticos. A las residentes (mis queridas princesitas), por ser las mejores y por tantos momentos juntas, con una mención especial a Sandra, ya que no podría haber tenido una mejor co-R (nuestra
estancia en Perú la recordaré siempre), y a Belén, por su constante apoyo y palabras de ánimo durante toda la tesis. Os siento cerca, aunque geográficamente estemos lejos.
A Silvia, por no haber sido sólo una compañera de piso en Madrid, sino una gran amiga.
Qué suerte que “Francoise Silvele” nos uniera.
A mis residentes y compañeros del Servicio de Microbiología del Complejo Hospitalario de Navarra (Marta, Irati, Esti, Iosu, Cristina y Camino), por tantas horas de buenas charlas de desconexión en el hall con un café en la mano y por hacer el día a día tan agradable.
Por último, me gustaría agradecer a mi familia. A mis padres, por todo vuestro esfuerzo para que yo haya podido llegar hasta aquí, en especial a mi madre, por ser mi pilar en la vida y desvivirse siempre por mí. A mis hermanos, mis cuñados y mis sobrinos. Me siento la más afortunada del mundo por teneros.
A todos vosotros: GRACIAS.
ÍNDICE
1. RESUMEN ... 2
2. SUMMARY ... 8
3. INTRODUCCIÓN ... 13
3.1 Helicobacter pylori ... 13
3.1.1 Antecedentes históricos ... 13
3.1.2 Características microbiológicas ... 17
3.1.3 Características genómicas ... 18
3.1.4 Patogenia y factores de virulencia ... 18
3.1.5 Epidemiología ... 28
3.1.6 Manifestaciones clínicas ... 30
3.1.7 Métodos diagnósticos ... 35
3.1.8 Tratamiento... 48
3.1.9 Resistencia antibiótica... 54
3.2 Secuenciación de ácidos nucleicos ... 67
3.2.1 Antecedentes históricos ... 67
3.2.2 Técnicas de secuenciación masiva ... 68
3.2.3 Análisis de resultados ... 76
3.2.4 Aplicaciones de la secuenciación masiva en el ámbito de la microbiología clínica ... 78
3.2.5 Aplicación de la secuenciación masiva en el estudio de resistencia ... 78
4. OBJETIVOS ... 81
5. MATERIAL Y MÉTODOS ... 83
5.1 Encuesta nacional ... 83
5.2 Biopsias ... 84
5.2.1 Selección de pacientes y muestras ... 84
5.2.2 Transporte de las muestras ... 84
5.3 Cepas ...85
5.4 Procesamiento de las muestras... 85
5.4.1 Cultivo ... 85
5.4.2 Estudio fenotípico de sensibilidad antimicrobiana ... 86
5.4.3 Extracción de ácidos nucleicos ... 87
5.4.4 PCR-hibridación: GenoType® HelicoDR test ... 89
5.4.5 Secuenciación masiva ... 93
5.5 Análisis bioinformático ... 94
5.5.1 Análisis de los genomas completos de las 20 cepas ... 94
5.5.2 Análisis de los genomas completos de las 22 parejas de cepas antro-cuerpo ... 96
5.6 Análisis estadístico ... 98
6. RESULTADOS ... 100
6.1 Encuesta nacional ... 100
6.1.1 Centros participantes ... 100
6.1.2 Métodos y técnicas diagnósticos de H. pylori ... 101
6.1.3 Sensibilidad antibiótica ... 104
6.2 Cultivo vs PCR ... 106
6.2.1 Detección de H. pylori ... 106
6.2.2 Estudio de sensibilidad antibiótica ... 107
6.3 Análisis de genomas completos ... 112
6.3.1 Características clínico-demográficas de los pacientes ... 112
6.3.2 Características de los genomas secuenciados ... 113
6.3.3 Análisis de determinantes genéticos de resistencia ... 114
6.3.3.1 Mutaciones de resistencia encontradas ... 114
6.3.3.2 Concordancia entre método fenotípico y genotípico... 121
6.3.3.3 Análisis de mutaciones de resistencia: ResFinder y RGI ... 123
6.4 Análisis de genomas antro vs cuerpo ... 125
6.4.1 Multilocus Secuence Typing (MLST) ... 125
6.4.2 Análisis filogenético ... 127
6.4.3 Sensibilidad antimicrobiana de las cepas antro-cuerpo ... 130
7. DISCUSIÓN ... 135
7.1 Diagnóstico de H. pylori ... 135
7.1.1 Métodos diagnósticos: Encuesta nacional ... 135
7.1.2 Detección H. pylori: PCR vs cultivo ... 138
7.2 Sensibilidad antibiótica ... 141
7.2.1 Sensibilidad antibiótica: Método fenotípico ... 141
7.2.2 Sensibilidad antibiótica: Método genotípico ... 151
7.2.2.1 Detección de resistencia a claritromicina y levofloxacino por PCR ... 151
7.2.2.2 Detección de resistencias: PCR vs Cultivo ... 153
7.3 Análisis de determinantes genéticos de resistencia mediante WGS en genomas completos 155 7.3.1 Determinantes genéticos y su relación con el fenotipo... 155
7.3.2 Detección de determinantes genéticos de resistencia antibiótica con herramientas virtuales: ResFinder y RGI ... 167
7.4 Análisis de cepas antro vs cuerpo ... 171
8. CONCLUSIONES ... 177
9. BIBLIOGRAFÍA ... 182
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Interpretación de las CMIs para H. pylori según criterios EUCAST ... 87
Tabla 2. Condiciones de la PCR... 89
Tabla 3. Métodos y técnicas empleadas para el diagnóstico de H. pylori y su positividad en 2016…101 Tabla 4. Métodos empleados para el diagnóstico de H. pylori y su positividad en función del número de muestras analizadas en 2016 ... 102
Tabla 5. Número de laboratorios que prueban cada antibiótico y método utilizado……….105
Tabla 6. Resistencia antibiótica de H. pylori en función de las muestras analizadas en 2016 ... 105
Tabla 7. Resultados del cultivo y la PCR para la detección de H. pylori ... 106
Tabla 8. Resultados del estudio fenotípico de sensibilidad antibiótica realizado mediante E-test ... 107
Tabla 9. Determinación genotípica de mutaciones de resistencia a claritromicina y levofloxacino por PCR ... 108
Tabla 10. Presencia o no de mutaciones por PCR para claritromicina y levofloxacino frente a los resultados de sensibilidad o resistencia mediante E-test ... 110
Tabla 11. Porcentajes de sensibilidad y resistencia a claritromicina y levofloxacino según el método ... 111
Tabla 12. Características clínico-demográficas de los 20 pacientes. ... 112
Tabla 13. Características de los 20 genomas secuenciados ... 113
Tabla 14. CMI y fenotipo para claritromicina de las 20 cepas de H. pylori y mutaciones de resistencia encontradas en el gen ARNr 23S en los 20 genomas ... 115
Tabla 15. CMI y fenotipo para metronidazol de las 20 cepas de H. pylori y mutaciones de resistencia encontradas en los genes rdxA/frxA en los 20 genomas ... 117
Tabla 16. CMI y fenotipo para levofloxacino de las 20 cepas de H. pylori y mutaciones de resistencia encontradas en los genes gyrA/gyrB en los 20 genomas ... 118
Tabla 17. CMI y fenotipo para amoxicilina de las 20 cepas de H. pylori y mutaciones de resistencia encontradas en los genes pbp1A/pbp2/pbp3 en los 20 genomas ... 119
Tabla 18. CMI y fenotipo para tetraciclina de las 20 cepas de H. pylori y mutaciones de resistencia encontradas en el gen ARNr 16S en los 20 genomas ... 120
Tabla 19. CMI y fenotipo para rifampicina de las 20 cepas de H. pylori y mutaciones de resistencia encontradas en el gen rpoB en los 20 genomas ... 121
Tabla 21. Mutaciones detectadas por ResFinder (v 3.2 y v 4.1) y RGI (v 5.1.1) y perfil de
sensibilidad antibiótica de las 20 cepas de H. pylori secuenciadas... 124 Tabla 22. MLST de las 22 parejas de cepas de H. pylori de antro y cuerpo ... 127 Tabla 23. Estudio de sensibilidad fenotípica de las 22 parejas de cepas antro-cuerpo de H. pylori.
Mutaciones de resistencia encontradas en las cepas resistentes a claritromicina, rifampicina y metronidazol ... 132
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Prevalencia de resistencia a claritromicina en H. pylori en los distintos países en el
periodo 2012-2016 ... 63
Figura 2. Prevalencia de resistencia a metronidazol en H. pylori en los distintos países en el periodo 2012-2016 ... 64
Figura 3. Prevalencia de resistencia a levofloxacino en H. pylori en los distintos países en el periodo 2012-2016 ... 65
Figura 4. Proceso realizado en las PCR en emulsión ... 70
Figura 5. Proceso de PCR puente y “template walking”. ... 71
Figura 6. Proceso de amplificación con nanobolas de ADN en solución ... 72
Figura 7. Proceso de secuenciación con las plataformas 454 (7a) e Illumina (7b) ... 75
Figura 8. Incubador TwinCubator donde tiene lugar la hibridación ... 91
Figura 9. Ejemplos de patrones de bandas y su interpretación con la PCR GenoType® HelicoDR (Hain) ... 93
Figura 10. Mapa de España con el número de centros que han participado en la encuesta por comunidades autónomas ... 100
Figura 11. Mutaciones detectadas con PCR para claritromicina en el gen ARNr23S ... 109
Figura 12. Mutaciones detectadas con PCR para levofloxacino en el gen gyrA ... 109
Figura 13. Árbol filogenético de las 22 parejas de cepas antro-cuerpo de H. pylori ... 129
RESUMEN
1. RESUMEN
INTRODUCCIÓN
La infección por H. pylori, bacteria Gram negativa espiral, puede causar gastritiscrónica, úlcera péptica, y cáncer gástrico. Su diagnóstico se puede realizar mediante métodos invasivos (requieren la realización de endoscopia digestiva con toma de biopsia gástrica) o no invasivos.
En los últimos años, las tasas de resistencia antibiótica en H. pylori frente a los antibióticos más empleados para su tratamiento han sufrido un importante aumento.
En la actualidad, la secuenciación de genomas bacterianos completos mediante técnicas de secuenciación masiva tiene múltiples aplicaciones en microbiología clínica, como la detección de determinantes genéticos de resistencia o el tipado molecular de cepas.
OBJETIVOS
Los objetivos de este trabajo se pueden agrupar en 3 bloques. Uno de los principales objetivos es realizar la primera encuesta nacional sobre H. pylori para conocer los métodos diagnósticos empleados en los Servicios/Laboratorios de Microbiología Clínica en España, así como datos de resistencia antibiótica. A su vez, otro objetivo es comparar la PCR GenoType® HelicoDR frente al cultivo de biopsias gástricas en el diagnóstico de H. pylori y en la detección de la resistencia a antibióticos. El tercer gran bloque de objetivos consiste
en utilizar la secuenciación masiva de genomas para, por una parte, comprobar si determinados determinantes genéticos pueden considerarse predictores de resistencia antibiótica y, por otra parte, para comparar cepas de H. pylori de dos localizaciones distintas del estómago, antro y cuerpo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se elaboró la primera encuesta nacional sobre métodos diagnósticos (serología, detección de antígeno en heces, cultivo de biopsias gástricas y PCR) de H. pylori en los Servicios/Laboratorios de Microbiología Clínica de España. A su vez, en la encuesta también se preguntaba acerca de la realización de pruebas de sensibilidad antibiótica y porcentajes de resistencia.
Se incluyeron 616 biopsias gástricas para realizar un estudio comparativo de PCR versus cultivo y se utilizó la PCR GenoType® HelicoDR, la cual permite la detección de H. pylori y su resistencia a claritromicina y levofloxacino a partir de biopsia gástrica. A todas las biopsias positivas por cultivo se les realizó estudio fenotípico de sensibilidad antibiótica mediante E- test.
En el estudio de genomas de H. pylori se incluyeron 20 cepas para el análisis de marcadores de resistencia y 22 parejas de cepas obtenidas de muestras de antro y cuerpo del mismo paciente. La secuenciación masiva de los genomas completos se llevó a cabo con el equipo MiSeq (Illumina). Para la detección de mutaciones de resistencia se utilizaron dos herramientas bioinformáticas virtuales: ResFinder y Resistance Gene Identifier (RGI). En los genomas de cepas antro-cuerpo se llevó a cabo análisis Multilocus Sequence Typing
(MLST) con la herramienta virtual MLST 2.0 del Center for Genomic Epidemiology y análisis filogenético con el software MEGA. A todas las cepas se les realizó también estudio fenotípico de sensibilidad antibiótica.
RESULTADOS
En total, 51 centros de 29 provincias españolas respondieron a la encuesta y 48 de ellos realizaban algún tipo de técnica de diagnóstico de H. pylori en su laboratorio. En cuanto a las técnicas empleadas, el cultivo de biopsia gástrica fue el más utilizado (37/48), seguido de la detección de antígeno en heces (35/48), la serología (19/48) y la PCR (5/48). Respecto a la sensibilidad antibiótica, se observaron altas tasas de resistencia, especialmente a claritromicina y metronidazol (superiores al 33%).
En el estudio comparativo PCR vs cultivo, el 49,7% de las biopsias fueron positivas para H. pylori con la PCR GenoType® HelicoDR, frente al 38,3% que lo fueron por cultivo. En cuanto a la detección de resistencias, la PCR, respecto al cultivo, arrojó una sensibilidad del 99,1% y una especificidad del 80% para la detección de resistencia a claritromicina y una sensibilidad y especificidad del 100% para levofloxacino. La mutación de resistencia a claritromicina más frecuente fue A2147G en el gen ARNr 23S y para levofloxacino N87K en gyrA. El estudio fenotípico de sensibilidad antibiótica realizado sobre 236 aislamientos mostró elevados porcentajes de resistencia a claritromicina (52%) y metronidazol (30%).
En el análisis de determinantes genéticos de resistencia de los 20 genomas, para claritromicina y levofloxacino existió una elevada concordancia entre el método genotípico y el fenotípico, mientras que fue menor para metronidazol, amoxicilina y rifampicina. A su
vez, con la herramienta RGI sólo fue posible detectar mutaciones de resistencia a claritromicina y con la herramienta ResFinder a rifampicina.
Las parejas de cepas antro-cuerpo de H. pylori presentaron el mismo perfil de sensibilidad antibiótica y sólo se observó un caso de heterorresistencia.
El análisis MLST de los genomas de las 22 parejas de cepas de H. pylori antro-cuerpo arrojó que en 9 pacientes la cepa de antro y la de cuerpo tenían el mismo sequence type (ST), y en los otros 13 presentaban distinto ST, pero se trataba prácticamente del mismo perfil alélico en ambas localizaciones. En el análisis filogenético las dos cepas de cada pareja antro-cuerpo agruparon juntas en el árbol filogenético.
CONCLUSIONES
El cultivo de biopsia gástrica y la detección de antígeno en heces son los métodos diagnósticos de H. pylori más empleados en los Servicios/Laboratorios de Microbiología Clínica de España.
Los datos de resistencia antibiótica obtenidos, tanto a través de la encuesta nacional como, en el estudio fenotípico de sensibilidad realizado, muestran unos porcentajes de resistencia muy elevados a los dos antibióticos de primera línea, claritromicina y metronidazol.
La PCR GenoType® HelicoDR tiene más sensibilidad que el cultivo de biopsia gástrica en la detección de H. pylori. Respecto a la detección de resistencia a claritromicina y levofloxacino, la sensibilidad de esta PCR es tan elevada como la del cultivo.
Los determinantes genéticos de resistencia a claritromicina y levofloxacino identificados mediante secuenciación del genoma de H. pylori se correlacionan significativamente con la resistencia fenotípica, siendo muy buenos predictores de resistencia.
En los pacientes con infección por H. pylori las cepas de antro y cuerpo presentan el mismo patrón de MLST lo que indican que proceden de un mismo clon.
SUMMARY
2. SUMMARY
TITLE
Detection of Helicobacter pylori and its antibiotic resistance: Phenotypic methods, genotypic methods and whole genome sequencing.
INTRODUCTION
H. pylori infection, a spiral Gram-negative bacterium, can cause chronic gastritis, peptic ulcer, and gastric cancer. It can be diagnosed by invasive methods (which require endoscopy with gastric biopsy) or non-invasive methods.
In recent years, antibiotic resistance rates of H. pylori to the most commonly used antibiotics for its treatment have increased significantly.
Currently, bacterial whole genome sequencing (WGS) has multiple applications in clinical microbiology, such as the detection of genetic determinants of resistance or molecular typing of strains.
OBJECTIVES
One of the main goals of this study is to carry out the first national survey on H. pylori in order to know the methods and techniques used for the diagnosis of H. pylori in the different Clinical Microbiology Services/Laboratories in Spain, as well as antibiotic
resistance data. Another aim is to compare PCR vs culture of gastric biopsies in the diagnosis of H. pylori and in the detection of antibiotic resistance. The other major group of aims of this study is to use whole genome sequencing to analyze the role of some genetic determinants as predictors of antibiotic resistance and to compare H. pylori strains from two different regions of the stomach, antrum and corpus.
MATERIALS AND METHODS
The first national survey on diagnostic methods (serology, stool antigen detection, gastric biopsy culture and PCR) of H. pylori in Clinical Microbiology Services/Laboratories in Spain was developed. The survey also requested information about the performance of antimicrobial susceptibility testing and antibiotic resistance rates.
A total of 616 gastric biopsies were studied in the comparative PCR vs culture study and the GenoType® HelicoDR PCR was used, which allows the detection of H. pylori and the detection of clarithromycin and levofloxacin resistance from gastric biopsies. Phenotypic antibiotic susceptibility testing was performed in all culture-positive biopsies.
20 strains for genetic resistance determinants analysis and 22 antrum-corpus strain pairs were included in the H. pylori genome study. WGS was performed using the MiSeq (Illumina) platform. Two bioinformatic tools were used to detect resistance mutations:
ResFinder and Resistance Gene Identifier (RGI). Multilocus Sequence Typing (MLST) analysis was performed on the genomes of antrum-corpus strains with the bioinformatic tool MLST 2.0 of the Center for Genomic Epidemiology and phylogenetic analysis with the
MEGA software. Phenotypic antibiotic susceptibility testing was also performed on all strains.
RESULTS
Overall, 51 centers from 29 regions of Spain answered the survey and 48/51 provided H. pylori microbiological diagnostic testing. Concerning the microbiological methods used to diagnose H. pylori infection, the culture of gastric biopsies was the most frequent (37/48), followed by stool antigen detection (35/48), serology (19/48) and biopsy PCR (5/48). Regarding antibiotic resistance, high resistance rates were observed, especially in metronidazole and clarithromycin (over 33%).
In the comparative PCR vs culture study, 49.7% of biopsies were positive for H. pylori with the GenoType® HelicoDR PCR, compared to 38.3% by culture. In terms of resistance detection, PCR, compared to culture, showed a sensitivity of 99.1% and a specificity of 80%
for the detection of clarithromycin resistance and a sensitivity and specificity of 100% for levofloxacin. The most frequent clarithromycin resistance mutation was A2147G in the 23S rRNA gene and in case of levofloxacin it was N87K in the gyrA gene Phenotypic antibiotic susceptibility testing performed on 236 isolates showed high percentages of resistance to clarithromycin (52%) and metronidazole (30%).
In the analysis of genetic resistance determinants of the 20 genomes, there was high concordance between genotypic and phenotypic methods for clarithromycin and levofloxacin, whereas for metronidazole, amoxicillin and rifampicin there was less concordance. Furthermore, only clarithromycin resistance mutations could be detected with the RGI tool and rifampicin mutations with ResFinder.
H. pylori antrum-corpus strain pairs showed the same antibiotic sensitivity profile and only one case of heteroresistance was observed.
MLST analysis of the genomes of the 22 H. pylori antrum-corpus strain pairs showed that in 9 patients the antrum and corpus strains had the same sequence type (ST), and the other 13 patients had different ST but they had almost the same allelic profile at both stomach regions. In the phylogenic analysis, the two strains of each antrum-corpus pair clustered together in the phylogenic tree.
CONCLUSIONS
Culture of gastric biopsies and stool antigen detection are the most commonly used diagnostic methods for H. pylori in clinical microbiology laboratories in Spain.
Antibiotic resistance data, obtained from the national survey and from the phenotypic antibiotic susceptibility testing, show very high percentages of resistance to the two first- line antibiotics, clarithromycin and metronidazole.
The GenoType® HelicoDR PCR is more sensitive than gastric biopsy culture in the detection of H. pylori. Regarding the detection of clarithromycin and levofloxacin resistance, the sensitivity of this PCR is as high as that of culture.
Genetic resistance determinants to clarithromycin and levofloxacin identified by H.
pylori whole genome sequencing correlate significantly with phenotypic resistance, so they can be considered very good predictors of resistance.
In patients with H. pylori infection, the antrum and corpus strains are nearly the same, they are derived from the same clone.
INTRODUCCIÓN
3. INTRODUCCIÓN
3.1 Helicobacter pylori
3.1.1 Antecedentes históricos
Diferentes estudios genómicos han demostrado que todas las cepas humanas de H.
pylori provienen de un ancestro común africano de hace más de 60.000 años y que, mediante el fenómeno de las grandes migraciones humanas, esta bacteria consiguió expandirse desde el Este de África por el resto de continentes.1,2 Pero, a pesar de haber estado colonizando al hombre desde tiempos remotos, el descubrimiento de esta bacteria y su implicación con patología digestiva no ha sido una realidad aceptada hasta finales del siglo XX. La ‘culpa’ de esto se debe, en gran parte, a la teoría tan extendida durante muchos años de que el estómago, debido a su elevada acidez, no era posible que albergara bacterias.
En 1875 el investigador alemán G. Bottcher y su colaborador francés M. Letulle observaron bacterias curvadas en los márgenes y en la base de úlceras gástricas y fueron los primeros en sugerir que la etiología de estas úlceras podía ser bacteriana3. Sin embargo, como no pudieron cultivar la bacteria la comunidad científica ignoró su teoría.
En 1893, el patólogo italiano G. Bizzozero describió bacterias espirales en la mucosa gástrica de perros y gatos4.
H. Salomon, en 1896, visualizó espiroquetas en mucosa gástrica de perros, gatos y ratas y consiguió colonizar con esta bacteria a ratones blancos administrándoles por vía oral moco gástrico de perros colonizados5.
El médico polaco W. Jaworski, de la Universidad Jaguelónica en Cracovia, en 1899 describió una bacteria espiral en el estómago humano a la que llamó Vibrio regula y sugirió su posible rol patogénico en enfermedades gástricas en el libro Handbook of gastric diseases6. Este libro, al estar publicado en polaco, pasó bastante inadvertido para la comunidad científica y no tuvo repercusión.
En 1906, el alemán W. Krienitz, identificó los mismos bacilos curvados en el estómago de pacientes con carcinoma gástrico7.
A principios del siglo XX la idea de que la causa de las úlceras gastroduodenales era la hiperclorhidria se encontraba ya bastante extendida3 y no es hasta 1938 cuando J. Doenges llevó a cabo el primer estudio sistemático en busca de las bacterias helicoidales en estómagos humanos y observó que esas bacterias sólo se encontraban en la mucosa estomacal y no en la intestinal8. En 1940, A.S Freedberg y L. Barron publicaron un trabajo relacionando estas bacterias con úlceras gástricas al haberlas observado con más frecuencia en estómagos con úlceras que en estómagos sanos9.
En 1954, tuvo gran repercusión un artículo publicado por el gastroenterólogo estadunidense E.D Palmer en el que, tras analizar 1100 biopsias gástricas humanas y no encontrar evidencia de bacterias espirales en ninguna, afirmaba que no había bacterias en el estómago y que los hallazgos anteriores eran fruto de contaminaciones con microbiota oral10. A partir de su publicación la comunidad científica asumió que el estómago era un órgano estéril y que ningún microorganismo podía sobrevivir en este ambiente ácido y por lo tanto no se podía asociar a ninguna patología gástrica. Durante los siguientes 20 años las úlceras gástricas se atribuyeron únicamente a factores como las comidas picantes o el estrés11,12.
En 1975, gracias a la introducción de la microscopía electrónica, los investigadores H.W Steer y C. Jones visualizaron bacterias espirales en el interior de leucocitos polimorfonucleares de la mucosa gástrica en pacientes con úlceras gástricas, volviendo en ese momento a resurgir la idea de la asociación de esta bacteria con respuesta inflamatoria en el estómago 13.
En Australia, en 1981, el patólogo Robin Warren y su joven estudiante el gastroenterólogo Barry Marshall decidieron llevar a cabo en el Royal Perth Hospital un estudio prospectivo en pacientes con úlceras gástricas para conseguir cultivar esa bacteria espiral por primera vez. Warren llevaba años visualizando esta bacteria en úlceras gástricas y estaba convencido de su implicación etiológica. Para realizar el cultivo siguieron la metodología utilizada por Martin Skirrow para el aislamiento y cultivo en condiciones de microaerofilia del género Campylobacter, debido a la similitud morfológica14. Los primeros intentos fueron fallidos porque H. pylori necesita más tiempo de incubación que Campylobacter y las 48 horas propuestas por Skirrow eran insuficientes. Pero la casualidad hizo que durante las vacaciones de Semana Santa de 1982 dejaran en la estufa las placas durante 7 días y así fue como se consiguió el primer aislamiento de H. pylori de la historia15. Warren y Marshall denominaron a esa bacteria Campylobacter pyloridis, la cual fue renombrada posteriormente en 1987 como Campylobacter pylori por una corrección gramatical latina16. Con el cultivo de H. pylori quedó demostrado que esta bacteria vivía en el estómago, pero quedaba por demostrar que era el agente causal de las úlceras y gastritis y no un mero colonizador. Para demostrarlo Marshall ingirió en 1984 una infusión de la bacteria, desarrollando los días posteriores síntomas de gastritis como náuseas, vómitos y dolor abdominal. A los 10 días se le realizó una endoscopia y los hallazgos histológicos
reflejaron signos de gastritis y se le tomo una biopsia en la que creció H. pylori. Tras la toma de antibióticos Marshall consiguió la erradicación de la bacteria3.
En España el primer trabajo donde se describe el cultivo y aislamiento de H. pylori a partir de biopsia gástrica de pacientes con úlcera duodenal fue publicado en 198517.
Desde que fue cultivada por primera vez se sospechó que quizás C. pylori no era realmente un Campylobacter debido a la disposición de sus flagelos y a las características lipídicas y proteicas de su pared. Finalmente, en 1989, tras la secuenciación de la región del 16S del ARN ribosómico de la bacteria se demostró que no pertenecía al género Campylobacter y fue reclasificada dentro de un nuevo género, Helicobacter18. Se le denomino así en referencia al movimiento en forma de hélice de sus flagelos. De esta forma la bacteria pasó a denominarse Helicobacter pylori. El nombre de la especie, pylori, viene del latín pylorus y hace referencia al píloro (válvula inferior del estómago que lo conecta con el duodeno).
En 1989 el gastroenterólogo T. J Borondy describió por primera vez la triple terapia para el tratamiento de úlceras duodenales19
En 1994, el Instituto Nacional de Salud de los Estado Unidos relacionó H. pylori con la úlcera péptica y recomendó el uso de antibióticos para su erradicación20. Ese mismo año, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) incluyó a H. pylori dentro del grupo de agentes carcinogénicos de clase 121.
En 2005, la comunidad científica reconoció el gran trabajo realizado por R. Warren y B.
Marshall otorgándoles el Premio Nobel de Medicina por el descubrimiento de la bacteria Helicobacter pylori y su papel en la gastritis y en la úlcera péptica22.
3.1.2 Características microbiológicas
El género Helicobacter pertenece a la familia Helicobacteraceae, orden Campylobacterales, clase Epsilonproteobacteria, filo Campylobacterota (reclasificada recientemente desde el filo Proteobacteria)23. Hasta la fecha se han identificado unas 30 especies en este género.
H. pylori es un bacilo Gram negativo con forma de espiral y un tamaño de 0,5-1 µm x 2- 4 µm. Su característica morfología se vuelve menos espiral en cultivos recientes, llegando en ocasiones a adoptar una forma cocoide en cultivos viejos. Algunos estudios relacionan esta forma cocoide con estructuras de resistencia frente a condiciones ambientales adversas24, mientras que otros autores sugieren que se trata de productos de degeneración celular no viables25.
H. pylori es una bacteria microaerofílica que requiere para su crecimiento en cultivo una atmosfera con las siguientes condiciones: 5-10% de O2, 5-10% de CO2, 80-90% de N2 a 35-37°C y una humedad del 90-95%. H. pylori es capaz de crecer en medios de cultivo no selectivos siempre que contengan sangre o derivados de ésta. El tiempo de incubación debe ser de hasta 10 días antes de considerar negativo el cultivo. Las colonias de H. pylori son pequeñas, con un diámetro de 1 a 2 mm, translúcidas y ligeramente brillantes.
En cuanto a la movilidad, H. pylori presenta de 4 a 7 flagelos monopolares envainados de unos 3 mm de longitud. Estos flagelos son los responsables de su característica movilidad
“en sacacorchos”.
Respecto a sus características metabólicas, H. pylori es una bacteria quimiorganotrofa con un metabolismo respiratorio. Es asacarolítica (no fermenta ni oxida azúcares) a excepción de la glucosa. Presenta actividad ureasa, catalasa y oxidasa, y la positividad a estas tres pruebas es muy útil para su identificación bioquímica.
3.1.3 Características genómicas
La secuenciación del primer genoma completo de H. pylori (cepa 26695) tuvo lugar en 199726. Desde entonces se han secuenciado muchas otras cepas y en 2017 eran cerca de 700 los genomas completos de H. pylori disponibles en la base de datos de GeneBank27.
La secuenciación del genoma completo de H. pylori ha permitido conocer que consiste en una sola molécula circular de ADN, con un tamaño de entre 1,5-1,8 Mpb y unas 1590 secuencias codificantes (CDS)26. El genoma de H. pylori presenta zonas de plasticidad que explican la gran diversidad genética entre cepas27.
3.1.4 Patogenia y factores de virulencia
La patogenicidad de H. pylori depende de la interacción multifactorial entre los factores de virulencia bacterianos y los factores del hospedador que modulan su respuesta inmune28. El mecanismo de patogenia de H. pylori requiere la colonización de la mucosa gástrica y la liberación sustancias tóxicas que dañan esa mucosa y generan una respuesta inmunológica local con liberación de mediadores químicos que llevan a una inflamación tisular.
Los factores de virulencia son proteínas bacterianas que intervienen en todo este proceso de colonización y daño al tejido, contribuyendo así a la patogenicidad.
3.1.4.1 Factores que contribuyen a la colonización de la mucosa gástrica
a) Ureasa
Es la enzima producida en más cantidad por H. pylori y representa alrededor del 10%
de sus proteínas totales celulares29. Su importancia radica en que es la responsable de la supervivencia de H. pylori en el extremadamente ácido ambiente estomacal. La ureasa es una metaloenzima citoplasmática que cataliza la hidrólisis de urea presente en el estómago obteniéndose dióxido de carbono y amoniaco (según la reacción (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3). La actividad de la ureasa está condicionada por el pH existente alrededor de la bacteria de la siguiente forma. La entrada de urea en la bacteria se encuentra regulada por un transportador específico de urea en la membrana interna, UreI, que es ácido dependiente. Este canal se abre sólo cuando el pH externo es menor de 6 (su máxima apertura es a pH 5,0), permitiendo la entrada de urea en el interior de la célula. Fruto de la reacción catalizada por la ureasa se generan grandes cantidades de amonio que es enviado a la membrana interna para neutralizar los protones que entran desde el estómago hasta el espacio periplasmático, consiguiendo así el aumento del pH del entorno hasta valores de 6 - 730. Cuando se alcanzan estos valores el transportador UreI se inactiva porque un exceso de alcalinidad debida al amonio sería perjudicial para la bacteria provocándole la muerte.
La ureasa además de ser un factor que contribuye a la colonización es también un factor de patogenicidad ya que el amonio que se libera es tóxico para las células epiteliales de la mucosa gástrica y daña la microcirculación provocando necrosis tisular y favoreciendo en el desarrollo de gastritis atrófica crónica31,32.
b) Flagelos
H. pylori posee entre 4 y 7 flagelos monopolares y cada uno se compone de tres elementos estructurales: cuerpo basal, gancho y filamento flagelar. El cuerpo basal está incrustado en la pared celular y tiene función energética. El gancho está formado por la proteína FlaE y su función es unir el cuerpo basal con el filamento flagelar. Este filamento es un copolímero de dos proteínas, flagelina FlaA y flagelina FlaB. FlaA es la más abundante y se localiza en el exterior, mientras que FlaB se localiza en la base del flagelo33.
La gran movilidad que le otorgan a H. pylori sus flagelos es fundamental para colonizar la mucosa gástrica, según se ha demostrado en estudios en modelos animales en los que les infectaban experimentalmente con variantes de H. pylori aflageladas y por tanto no móviles.34
La morfología espiral o helicoidal de H. pylori también facilita su movimiento por el viscoso moco gástrico.
c) Adhesinas
Las adhesinas son proteínas localizadas en la superficie de la membrana externa bacteriana mediante las cuales se adhiere a receptores de las células epiteliales gástricas.
La adherencia de H. pylori a la mucosa gástrica es de gran importancia tanto para la colonización inicial, como para la persistencia de la bacteria en el estómago humano. La adhesión es fundamental, ya que le confiere a la bacteria protección frente a la acidez gástrica, el peristaltismo, el vaciado gástrico y el desprendimiento de la capa mucoide por regeneración35.
Las adhesinas pertenecen al grupo de proteínas denominadas proteínas de membrana externa (OMPs). El análisis de los genomas de H. pylori ha mostrado que aproximadamente el 4% codifica para OMPs36 Las adhesinas de H. pylori más importantes son las siguientes:
• BabA (blood antigen binding adhesion)
También denominada HopS u OMP28, es la adhesina mejor caracterizada de H. pylori.
Se une a los antígenos Lewis B fucosilados (Leb) que se expresan en las células epiteliales gástricas37. BabA está codificada por los genes babA1 y babA2, pero sólo babA2 es funcionalmente activo38. La unión de esta adhesina con el receptor promueve una respuesta inmune inespecífica y el desarrollo de autoanticuerpos frente a las células productoras de ácido, lo que contribuye a la gastritis crónica y a la pérdida de células parietales. Además, la adherencia mediada por BabA interviene en la liberación de factores de virulencia que dañan el tejido estomacal, pudiendo llevar al desarrollo de úlcera y cáncer gástrico39.
• SabA (sialic acid binding adhesion)
También se le conoce como HopP o OMP17. La infección por H. pylori induce la expresión de carbohidratos sialilados en el tejido gástrico inflamado que son la diana de SabA40.
• OipA (Outer Inflammatory Protein)
La proteína proinflamatoria OipA, también llamada HopH u OMP13, es al igual que BabA y SabA, un factor de virulencia de fase variable, es decir, que el gen está presente en todas las cepas, pero puede expresarse o no en distintas fases del crecimiento o distintas condiciones ambientales. La expresión de esta adhesina se asocia a una mayor producción
de IL-8, aunque no se sabe su contribución real a la inflamación gástrica ya que suele estar asociada a las cepas cagA +41
• HpaA (Helicobacter pylori adhesin A)
Esta adhesina media la unión a conjugados glicosilados con ácido siálico presentes en la superficie de las células epiteliales gástricas y en la de neutrófilos42. HpaA es un antígeno de membrana que es reconocido por los anticuerpos humanos por lo que puede ser usado en los ensayos serológicos y para la elaboración de vacunas. Se ha comprobado también que esta adhesina es reconocida por las células presentadoras de antígeno humanas estimulando la proliferación de los linfocitos B y T 43.
• HomB
La presencia de esta adhesina, cuyo papel en la adherencia no está todavía del todo claro, se asocia a un incremento de la producción de IL-8 por parte de las células epiteliales gástricas. También se asocia a la presencia de CagA, a inflamación y a atrofia del cuerpo gástrico, lo que sugiere que puede ser considerado un marcador de cepas particularmente virulentas44.
d) Sistemas antioxidantes
H. pylori es muy vulnerable al oxígeno al tratarse de una bacteria microaerofílica. La colonización gástrica de H. pylori promueve una fuerte respuesta inflamatoria mediada por neutrófilos y macrófagos, que generan una cantidad de metabolitos reactivos del oxígeno45. Para la detoxificación de estos compuestos H. pylori cuenta con una serie de enzimas antioxidantes:
o Superóxido dismutasa: cataliza la transformación del superóxido en peróxido de hidrógeno según la reacción 2O2− + 2H+ →H2O2 + O2
o Catalasa o peroxidasa: cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno según la reacción 2H2O2→ 2H2O+ O2
o Peroxirredoxinas: catalizan la reducción de peróxido de hidrógeno,peroxinitrito y otros hidroperóxidos orgánicos a sus correspondientes alcoholes.
o Flavoproteína MdaB: es una NADPH quinona reductasa, que H. pylori expresa cuando hay ausencia del resto de mecanismos antioxidantes.
Se ha comprobado que la actividad enzimática de la catalasa, la superóxido dismutasa y las peroxiredoxinas está incrementada en las cepas cagA positivas46.
En ocasiones los mecanismos de detoxificación no son suficientes y puede producirse daño oxidativo. Para combatirlo, H. pylori cuenta con sistemas de reparación de ADN como endonucleasas y el sistema missmatch-repair (formado por las proteínas MutS, MutL y MutH). Además, para reparar el daño oxidativo producido en las proteínas H. pylori posee la enzima metonín sulfóxido reductasa47.
e) Proteasa
Enzima que degrada la estructura polimérica del moco facilitando el avance de H. pylori por la mucosa gástrica.
3.1.4.2 Factores que contribuyen al daño de la mucosa gástrica
a) Citotoxina vacuolizante VacA (vacuolating citotoxin)
Esta toxina, codificada por el gen vacA y formada por dos subunidades (p33 y p55), induce la vacuolización del citoplasma de las células epiteliales gástricas. Presenta una estructura hexamérica y se ensambla en la bicapa lipídica celular del hospedador formando un canal transmembrana selectivo de aniones. Este canal origina un gradiente de pH que atrae hacia el interior sustancias alcalinas provocando la captación de agua por ósmosis, lo que conduce a una vacuolización alrededor del núcleo y posteriormente a un estallido y muerte celular48.
Además de la vacuolización, VacA induce numerosos fenómenos celulares en el hospedador, como la apoptosis o muerte celular programada. Ésta se produce por la interacción de VacA con la membrana mitocondrial, reduciendo su potencial de membrana, lo que provoca la liberación del citocromo C al citoplasma originando una cascada de activación de caspasas49. Algunos estudios también indican que VacA activa las proteínas proapoptóticas de la familia Bcl-2, Bax y Bak, que contribuyen a la liberación del citocromo C50.
La citotoxina VacA es capaz también de inducir la expresión del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), lo que puede desencadenar procesos tumorigénicos. El VEGF está implicado en la neoangiogénesis vía sistema TLR2/TLR9 y se encuentra sobreexpresado en carcinomas humanos51.
Otro efecto celular de VacA es la amplificación de la respuesta inflamatoria de la mucosa gástrica induciendo la síntesis de citoquinas proinflamatorias como TNFα, IL-1β, IL-
52
macrófagos, neutrófilos y células T. La sobreexpresión de COX-2, VEGF y el aumento de citoquinas proinflamatorias son mecanismos a través de los cuales respuesta inmune inducida por H. pylori contribuye a la carcinogénesis gástrica, ya que originan alteraciones morfológicas que llevan al desarrollo de gastritis atróficas y metaplasia gastrointestinal51,53. Aunque el 80% de los aislamientos de H. pylori tienen un gen vacA funcional, sólo en el 50% se detecta efecto citotoxico54. La diferente toxicidad de esta proteína se asocia a la estructura tipo mosaico que tiene el gen vacA y que le permite varias posibles formas de presentación o polimorfismos. Se pueden distinguir 4 formas (s1a, s1b, s1c y s2) en base al análisis de la secuencia del extremo 5’ del gen (codifica la región señal N-terminal de la proteína), 3 formas (m1 y m2a y m2b) en la región media que codifica parte de la subunidad de unión a células epiteliales p55 y 2 formas en la región intermedia (i1, i2). Las distintas combinaciones de todas estas formas generan distintos genotipos que podrían tener comportamientos más o menos agresivos55. Se considera que las cepas que poseen los alelos s1, m1 e i1 de vacA generan cuadros clínicos más graves como úlcera o cáncer gástrico48,56,57.
b) CagA (citotoxin-associated gen A)
Esta proteína, codificada por el gen cagA, es uno de los factores de virulencia más estudiados de H. pylori. Este gen no está presente en su forma completa en todas las cepas y se considera un marcador de virulencia, clasificándose las cepas en dos grupos: cagA positivas y cagA negativas, siendo las primeras más virulentas que las segundas. Las cepas cagA positivas se relacionan, con síntomas más graves, como son la gastritis severa, la atrofia de la mucosa, úlceras y cáncer gástrico28. La prevalencia de cepas cagA positivas
varía en función de la localización geográfica. En Asia y África prácticamente todas las cepas son cagA positivas, a excepción del sur de África, donde son cagA negativas. En Europa, América y Australia se estima que un 60% son cagA positivas.58
El gen cagA forma parte de la isla de patogenicidad Cag (cagPAI). Esta isla de patogenicidad de 40 Kb contiene 32 genes que codifican para un conjunto de proteínas que conforman un sistema de secreción tipo IV (T4SS)59. Este sistema de secreción es el encargado de introducir la proteína CagA en el citoplasma de las células epiteliales gástricas.
Una vez introducida, esta proteína es fosforilada en la cara interna de la membrana celular por quinasas de la familia Src y la quinasa c-Abl. Las regiones que van a ser fosforiladas son unas secuencias específicas de aminoácidos: glutamato (E), prolina (P), isoleucina (I), tirosina (Y) y alanina (A) denominadas “motivos EPIYA”. Una vez fosforilada, CagA se integra en la membrana y se une a una tirosina fosfatasa, la proteína SHP-2. Al interaccionar, se produce la activación de SHP-2 y se desencadenan una serie de fenómenos celulares38:
- Reordenamiento del citoesqueleto y pérdida de las uniones celulares vía RAF.
- Fenotipo celular alargado (hummingbird) de las células del epitelio gástrico por activación de la vía ERK1/2.
- Aumento de la proliferación celular por la activación de la vía ERK/MAP quinasas.
- Apoptosis celular por actividad mantenida de SHP-2 que conlleva una regeneración continúa del epitelio gástrico. Esta regeneración provoca la acumulación de mutaciones por las sucesivas rondas de replicación del ADN y, por lo tanto, contribuye en el desarrollo tumoral60.
Además de estos efectos regulados por la fosforilación, la proteína CagA puede por vías independientes provocar más efectos celulares48:
- Pérdida de polaridad celular por pérdida de la actividad quinasa de Par1b/MARK2.
- Alteración de la unión celular de la mucosa gástrica (interaccionando con ZO-1)61 - Internalización bacteriana por la formación del complejo CagA, c-Met, E-cadherina y p120-catenina.
- Diferenciación celular por secuestro de E-cadherina, que provoca la acumulación de β-catetina, un factor con potencial oncogénico.
- Desarrollo de linfoma MALT por disminución de la transcripción de p53 y la consecuente inhibición de la apoptosis de linfocitos B.
- Inflamación crónica por activación de NF-κB que induce la producción de IL-8.
Todos estos efectos provocan un grave daño en el tejido gástrico y H. pylori ha desarrollado un mecanismo feed-back para mantener un cierto equilibrio. Consiste en que CagA fosforilada es también capaz de unirse y activar a la quinasa carboxi-terminal (CSK), la cual inactiva a quinasas Src bloqueando así la fosforilación de CagA e interrumpiendo sus efectos fosforilación dependientes60.
3.1.4.3 Otros factores
a) Lipopolisacárido (LPS)
Al igual que el resto de bacterias Gram negativas, H. pylori cuenta con un LPS formado por tres dominios: el lípido A o endotoxina, el núcleo oligosacárido y la cadena polisacárida externa o antígeno O.
El LPS de H. pylori presenta dos características que pueden explicar la capacidad que tiene el microorganismo para evitar provocar una respuesta inmunológica eficaz del huésped:
- El antígeno O tiene una estructura similar a los antígenos de Lewis, lo que ayuda a la evadir la respuesta inmune e induce la formación de autoanticuerpos, que contribuirían al desarrollo de gastritis atrófica62.
- El lípido A, debido a que presenta una estructura modificada, presenta resistencia a péptidos catiónicos antimicrobianos (CAMPs) del hospedador, lo que disminuye su toxicidad y contribuye a evadir la respuesta inmune63.
Al inducir una baja respuesta inmunológica, la infección por H. pylori puede persistir durante más tiempo que aquéllas causadas por bacterias más agresivas, produciendo una infección crónica.
b) Tip α (TNF-α inducing protein)
Esta proteína secretada por H. pylori, actúa penetrando en el núcleo celular y uniéndose al ADN. Aunque sus mecanismos de acción aún no están del todo determinados, se ha comprobado que presenta una potente actividad carcinogénica induciendo la expresión de TNF-α , IL-1b, IL-8 y la activación de NF-kβ64,65.
3.1.5 Epidemiología
H. pylori es una bacteria ubicua y en la actualidad se estima que es la infección humana más frecuente en el mundo, afectando aproximadamente al 50% de la población mundial66. Los países o áreas geográficas con un bajo desarrollo socioeconómico presentan las cifras de prevalencia más altas (el 60-80% de la población en edad adulta está infectado por Hp);
en cambio, en las zonas con un alto desarrollo socioeconómico, la tasa de infección en población adulta se sitúa en torno al 30-50%67. La mayor prevalencia se sitúa en África (79.1%), Sudamérica y Caribe (63.4%), y la menor en Norteamérica (37.1%) y Oceanía (24.4%)68. Respecto a la situación en Europa, los países del Sur y del Este, como Portugal o Polonia, tienen la mayor tasa de prevalencia, mientras que los países del Norte tienen la más baja69,70. En España varios estudios han situado la prevalencia de Hp por encima del 50%68,70.
En la mayoría de casos la infección por H. pylori cursa asintomática y sólo un pequeño porcentaje de personas presenta manifestaciones clínicas como: gastritis, úlcera péptica (entre un 10-15 % de los individuos afectados), linfoma asociado a mucosa (MALT) y adenocarcinoma gástrico (1-3%)71,72.
El ser humano se considera el huésped natural de H. pylori, y la mucosa gástrica su
“nicho” ecológico natural. Se ha investigado mucho sobre la existencia de un reservorio medioambiental de la bacteria y, aunque no se sabe con exactitud, parece que el agua podría actuar de reservorio73.
La trasmisión de H. pylori se considera que es persona a persona y puede realizarse a través de tres vías: fecal-oral (la más frecuente en los países con bajo nivel socio- económico), oral-oral (la más frecuente en los países con elevado desarrollo socio- económico) y gástrica-oral (se da principalmente en la población infantil al entrar en contacto el vómito de una persona infectada con la cavidad oral de otra). Algunos autores apuntan a que la transmisión en el núcleo familiar, constituye el principal mecanismo de propagación de la bacteria74.
También se ha descrito la transmisión iatrogénica de esta infección a través de dispositivos sanitarios como sondas o endoscopios que no se han desinfectado adecuadamente75.
Se ha aislado H. pylori en las heces, vómitos, saliva y placa dental de personas infectadas.
Se ha descrito la infancia como la edad en la que se adquiere con mayor frecuencia la bacteria, aunque existen diferencias entre los países en función de su nivel socioeconómico.
En los países con elevado desarrollo la seroprevalencia en la niñez es baja y se va incrementando con la edad. Por el contrario, en los países con bajo nivel de desarrollo la mayor tasa de infección se produce durante la infancia76.
3.1.6 Manifestaciones clínicas
Aunque H. pylori coloniza al 50% de la población mundial, en la mayoría de los casos sólo causa gastritis subclínica, permaneciendo los individuos asintomáticos de por vida.
Sólo un pequeño porcentaje de los individuos colonizados presentan algún tipo de sintomatología y las complicaciones principales (úlcera péptica, adenocarcinoma y linfoma gástrico) sólo se desarrollan en una minoría de las personas infectadas. Todavía no se conoce claramente por qué en unos pacientes la enfermedad es asintomática mientras que en otros se producen enfermedades digestivas de diferente gravedad77. Parece que algunos factores genéticos, ambientales o los factores de patogenicidad de la propia bacteria pueden tener su efecto en el desarrollo de la enfermedad78.
3.1.6.1 Manifestaciones clínicas digestivas
a) Gastritis
Tras la colonización por H. pylori se produce en todos los casos una gastritis histológica que puede cursar de forma asintomática o bien como un episodio autolimitado de gastritis aguda (náuseas, dolor epigástrico y vómitos)79. La duración de la gastritis aguda es de 7 - 10 días y tras esta fase inicial algunos pacientes desarrollan una gastritis crónica superficial (el 70-80% de los pacientes que tienen gastritis crónica están infectados por H. pylori)80. La gastritis crónica se caracteriza por una infiltración inflamatoria mixta de polimorfonucleares, linfocitos y células plasmáticas, con presencia de folículos linfoides. La gastritis crónica por H. pylori es un proceso dinámico que evoluciona hacia la fase de atrofia que comienza generalmente en el antro y se extiende hacia el cuerpo del estómago81.
La sintomatología de la gastritis por H. pylori es muy variable. Puede manifestarse como un cuadro de dispepsia no ulcerosa, con síntomas como náuseas, vómitos, sensación de plenitud y dolor en epigastrio o hemiabdomen superior.
b) Úlcera péptica
La asociación de H. pylori con las úlceras duodenales y gástricas es clara, ya que el 90- 95% de los pacientes con úlcera duodenal y el 70% de los pacientes con úlcera gástrica presentan esta bacteria y se curan tras erradicarla82. El resto de úlceras gástricas se asocian principalmente al consumo extendido de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs)83.
El descubrimiento de H. pylori como principal agente causante de la úlcera péptica, supuso una verdadera revolución médica en el pronóstico y tratamiento de esta patología.
La progresión desde la gastritis inicial a la úlcera péptica depende de múltiples factores:
virulencia de la cepa, predisposición genética del hospedador y la influencia de sus hábitos y entorno.
Los pacientes con úlcera presentan síntomas típicos de dispepsia ulcerosa:
epigastralgia, dolor en hemiabodmen superior, vómitos, anorexia y adelgazamiento. La complicación más frecuente es el sangrado de la úlcera, el cual provoca hemorragia digestiva.
c) Carcinoma gástrico
Aproximadamente entre el 74,7-89,0% de los carcinomas gástricos están relacionados con la infección por H. pylori84. El cáncer gástrico es el cuarto más frecuente en el mundo y el segundo que más muertes ocasiona cada año (738.000)85. La incidencia varía geográficamente, las mayores tasas se dan en el Sudeste Asiático, China, Japón y América del Sur, y las más bajas en Norte América, Australia y Nueva Zelanda86.
El cáncer gástrico es la fase final de la progresión desde la gastritis inicial pasando por la atrofia, metaplasia y displasia. Algunos de los mecanismos moleculares de H. pylori que explican la evolución de las lesiones hasta desembocar en cáncer son: la liberación de radicales libres que dañan las células gástricas87, la hipergastrinemia que acompaña al estado de atrofia e induce la proliferación celular aumentando el riesgo de mutaciones en el ADN88 y la acción de determinados genes de virulencia como cagA y vacA89.
d) Linfoma gástrico del tejido linfoide asociado a mucosas (MALT)
El 90% de las personas que padecen linfoma MALT está infectada por H. pylori. Este linfoma se localiza preferentemente en la zona del antro gástrico, ya que es la zona con más tejido linfoide. Varios estudios apoyan la asociación de H. pylori con esta enfermedad
puesto que se ha observado la remisión del linfoma en entre un 60-80% de los pacientes tras la erradicación de la bacteria 90.
1.1.6.2 Manifestaciones clínicas extradigestivas
H. pylori se ha relacionado, además de con patología digestiva, con patologías a otros niveles. Las enfermedades extradigestivas para a las que, a día de hoy, hay más evidencia científica de su asociación con la infección por H. pylori son las siguientes:
a) Anemia ferropénica refractaria
La asociación entre la infección por H. pylori y la anemia ferropénica refractaria ha sido demostrada en varios estudios realizados en niños y adolescentes90–92. La erradicación de la bacteria permite la normalización de las cifras de sideremia y de los valores de ferritina en pacientes con anemia ferropénica refractaria portadores de una gastritis por H. pylori.
Los principales mecanismos involucrados en la asociación de la infección por H. pylori y la anemia ferropénica refractaria son93:
- La gastritis atrófica conlleva una bajada de la acidez y de los niveles de ácido ascórbico en el estómago, lo que provoca la disminución de la absorción de hierro a nivel intestinal porque se disminuye la reducción del hierro férrico a ferroso, que es la forma en la que absorbe el hierro.
- H. pylori posee múltiples sistemas de captación de hierro, que le permite tomarlo del microambiente de la luz gástrica, compitiendo con el hospedador por él.
- La infección de H. pylori produce un aumento de hepcidina, una hormona sintetizada en el hígado que regula el metabolismo del hierro. Cuando aumenta la producción de hepcidina, disminuye la liberación de hierro desde los eritrocitos y macrófagos.
b) Púrpura trombocitopénica idiopática
Es una enfermedad hematológica en la que el sistema inmune produce anticuerpos antiplaquetarios. Se ha observado que algunos pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática crónica han respondido a la erradicación de H. pylori con un incremento del número de plaquetas94. La explicación biológica de esta posible asociación es la similitud de los anticuerpos antiplaquetarios del suero con la citotoxina CagA del H. pylori. Así, los anticuerpos contra esta citotoxina pueden reaccionar de manera cruzada contra proteínas en la superficie de las plaquetas93.
c) Retraso en el crecimiento
Existen diversos estudios que han demostrado la asociación entre el retraso en el crecimiento y la infección por H. pylori95,96.
Una posible explicación de esta asociación sería el efecto de la gastritis en los niveles de dos hormonas gástricas: grelina y leptina. La gastritis provoca una disminución de los de grelina y un aumento de los de leptina. Esto conlleva una disminución del apetito, disminuyendo el aporte calórico y afectando secundariamente al índice de masa corporal97.
d) Otras manifestaciones extradigestivas
Otras enfermedades que se han relacionado con la infección por H. pylori son:
enfermedad isquémica coronaria98,99, Síndrome de Raynaud100,101, urticaria crónica102,103, Alzheimer104, Parkinson105...etc. Sin embargo, a día de hoy no existen suficientes evidencias que demuestren dicha causalidad y se requieren más estudios e investigaciones para avalar la asociación.
3.1.7 Métodos diagnósticos
El diagnóstico de la infección por H. pylori puede realizarse mediante métodos invasivos (requieren la realización de endoscopia digestiva con toma de biopsia gástrica) o no invasivos (no requieren la realización de endoscopia). El método diagnóstico perfecto sería uno no invasivo o mínimamente invasivo, barato, seguro, disponible en todos los centros, que sea capaz de diferenciar entre infección activa y pasada y que permita detectar sensibilidad antibiótica. Ninguno de los métodos que existen en la actualidad cumple todas estas características. Todos los métodos presentan ventajas e inconvenientes. A la hora de elegir el más adecuado hay que tener en cuenta el fin (epidemiológico, diagnóstico o de seguimiento), el centro sanitario dónde se realice el diagnóstico y las características del paciente106,107.
3.1.7.1 Métodos invasivos
Son aquellos para los que es necesaria la obtención de una biopsia gástrica tomada mediante endoscopia digestiva. Con los que respecta a la localización de la biopsia, siempre
se ha recomendado la toma de una biopsia de la zona del antro por ser la que alberga la que mayor cantidad de bacteria. Sin embargo, hay numerosos autores que recomiendan la toma adicional de una biopsia de la zona de gran curvatura del cuerpo gástrico, sobre todo en el caso de pacientes con atrofia severa del antro o ulcera o metaplasia duodenal, ya que en estas situaciones la carga bacteriana en el antro disminuye108–112. Además, si se quieren llevar a cabo distintos métodos de diagnóstico se recomienda la toma de más de una biopsia de cada localización113.
La sensibilidad de los métodos de diagnóstico invasivos disminuye si la carga bacteriana en el estómago es baja como ocurre con la toma previa de inhibidores de la bomba de protones (IBP), antiulcerosos (sales de bismuto) y antibióticos114. Por este motivo, para evitar la obtención de falsos negativos, el grupo europeo para el estudio de Helicobacter (European Helicobacter Study Group) recomienda antes de realizar la endoscopia suspender al menos 2 semanas antes la toma de IBPs y cuatro semanas antes la de antibióticos y antiulcerosos115.
La obtención de la biopsia gástrica permite:
- Analizar histológicamente el tejido - Realizar una tinción Gram de la biopsia
- Realizar la prueba rápida de la ureasa - Realizar el cultivo de la biopsia
- Realizar métodos moleculares directos a partir de la biopsia
a) Histología
El análisis histológico de la biopsia fue el primer método en ser utilizado para el diagnóstico de la infección de H. pylori. Su principal ventaja radica en que es el único