Facultad de Cienci as Experi mentales Trabajo Fin de Grado
DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE DE
PLANTAS AROMÁTICAS.
LAVANDULA ANGUSTIFOLIA
Alumna: María Sierra Diego
Junio, 2022
Trabajo Fin de Grado
DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PLANTAS AROMÁTICAS.
LAVANDULA ANGUSTIFOLIA
Alumna: María Sierra Diego
Jaén, Junio, 2022
ÍNDICE
1. RESUMEN/ABSTRACT ... 1
2. INTRODUCCIÓN ... 2
2.1. Plantas aromáticas ... 2
2.2. Estrés oxidativo y compuestos antioxidantes ... 3
2.2.1. Clasificación de los compuestos antioxidantes ... 5
2.3. Caracterización y clasificación de compuestos fenólicos ... 6
2.4. Lavandula angustifolia ... 10
2.5. Extracción de compuestos fenólicos ... 12
2.5.1. Pretratamiento de la muestra ... 13
2.5.2. Metodologías de extracción ... 14
2.5.2.1. Metodologías convencionales de extracción ... 14
2.5.2.2. Metodologías no convencionales de extracción ... 16
2.6. Metodologías de extracción de aceite esencial ... 17
2.7. Métodos de evaluación de la actividad antioxidante ... 19
2.7.1. Método de Folin-Ciocalteu ... 20
2.7.2. Método DPPH ... 21
2.7.3. Método ABTS ... 22
2.7.4. Método ORAC ... 23
2.7.5. Método FRAP... 24
2.7.6. Método TBARS ... 24
3. OBJETIVOS ... 25
4. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DEL ACEITE ESENCIAL DE LAVANDULA ANGUSTIFOLIA ... 25
5. CONCLUSIONES ... 37 6. REFERENCIAS ... 38
1 1. RESUMEN/ABSTRACT
Las plantas aromáticas han tenido gran importancia a lo largo de la historia debido a numerosas propiedades beneficiosas, derivadas de sus fitoquímicos, que han propiciado el uso de sus extractos y aceites esenciales como remedios naturales. Una de las propiedades de las plantas aromáticas que ha cobrado importancia en la actualidad es la actividad antioxidante, ya que los radicales libres y el estrés oxidativo han demostrado representar una amenaza para la salud, al estar relacionados con numerosas enfermedades y el proceso de envejecimiento. Como respuesta, se está estudiando el uso de extractos y aceites esenciales de las plantas aromáticas como antioxidantes, sustituyendo a los antioxidantes sintéticos.
En el presente trabajo de fin de grado se ha llevado a cabo la revisión bibliográfica de la actividad antioxidante del aceite esencial de Lavandula Angustifolia y sus métodos de evaluación. Se ha revisado, además, la clasificación y métodos de extracción de los compuestos fenólicos, relacionados con su actividad antioxidante. Asimismo, se ha estudiado el efecto de diversos factores en la actividad antioxidante del aceite esencial de esta especie, concluyendo que posee una actividad antioxidante notable y, en consecuencia, representa un buen candidato como aditivo para productos de las industrias cosmética, alimenticia y farmacéutica.
Aromatic plants have had great importance throughout history due to their numerous beneficial properties, produced by their phytochemicals, which has promoted their extracts and essential oil usage as natural remedies. One of the most important properties of aromatic plants nowadays is antioxidant activity, because free radicals and oxidative stress have been shown to represent a menace to wellbeing since they are related to numerous diseases and the ageing process. As response, the use of extracts and essential oils of aromatic plants as antioxidants is being studied in substitution to synthetic antioxidants.
In the present end of degree project, a bibliographic revision was carried out for antioxidant activity of Lavandula Angustifolia essential oil and its evaluation methods. In addition, the classification and extraction methods of phenolic compounds related to antioxidant activity has been reviewed. Furthermore, the effect that diverse factors have in antioxidant activity has been studied, reaching the conclusion that Lavandula Angustifolia essential oil poses a remarkable antioxidant activity and, consequently, represents a great candidate as an additive for products in the cosmetic, food and pharmaceutic industries.
2 2. INTRODUCCIÓN
2.1. Plantas aromáticas
Las plantas aromáticas y sus extractos y aceites esenciales han tenido una gran importancia para el ser humano desde hace siglos debido a sus variados usos, ya sea como especias y condimentos para los alimentos, o como medicinas y conservantes. Hoy en día su uso sigue teniendo una gran importancia ya que, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), en torno al 80% de la población mundial, especialmente en países en desarrollo, depende de las medicinas derivadas de plantas aromáticas para el cuidado de su salud. (Christaki et al., 2012)
Los compuestos bioactivos conceden a las plantas aromáticas propiedades bactericidas, antimicrobianas, antifúngicas y antioxidantes, entre otras, y han producido un gran interés por parte de industrias como la alimentaria, cosmética y farmacéutica gracias al posible uso de sus extractos y aceites esenciales como aditivos y fármacos. (Fig. 2.1). Estos compuestos, denominados generalmente como fitoquímicos, son metabolitos secundarios y, al igual que las toxinas y feromonas, poseen funciones específicas en la planta como protección, señalización, atracción de polinizadores...etc. Los principales compuestos bioactivos con propiedades antioxidantes en las plantas aromáticas son los compuestos fenólicos, flavonoides, carotenoides y vitaminas (Duda et al., 2015).
Figura 2.1: Actividades y usos de las plantas aromáticas y sus extractos y aceites esenciales. Fuente:
(Christaki et al., 2012)
El interés de la población actual por productos y aditivos de origen natural y el aumento de casos de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo como el cáncer y el
3 alzhéimer, han dado fama a las plantas aromáticas, debido a que sus componentes bioactivos han demostrado proteger del daño causado por el estrés oxidativo, además de prevenir enfermedades inflamatorias y cardiovasculares. Su consumo está recomendado por médicos y, aunque se consuman en pequeñas cantidades, el impacto biológico que producen es notable (Carvalho Costa et al., 2015; Nikšić et al., 2017).
Por otro lado, otra de las aplicaciones de los extractos y esencias de las plantas aromáticas que está cobrando mucha importancia actualmente en la industria alimentaria es como posibles sustituyentes a los aditivos artificiales, ya que algunos de uso común han demostrado poder causar efectos perjudiciales en la salud (Yalcin et al., 2017).
Además, los extractos y esencias de plantas aromáticas representan un futuro prometedor como componentes de los envases activos debido a sus propiedades antioxidantes y antimicrobianas (Martuccia et al., 2015).
2.2. Estrés oxidativo y compuestos antioxidantes
El oxígeno es generalmente considerado imprescindible para la vida, ya que participa en múltiples procesos biológicos. Sin embargo, hay ocasiones en las que puede generar problemas para el ser humano, principalmente por la formación de compuestos conocidos como especies de oxígeno reactivo (ROS). En la literatura encontramos en ocasiones el uso de los términos “radicales libres” y “ROS” indistintamente y, mientras en algunos casos es correcto, realmente son términos distintos (Lushchak, V. I., 2014). Los radicales libres son moléculas muy reactivas, debido a la ausencia de un electrón en su capa de valencia, cuya existencia es breve pero capaz de provocar reacciones en cadena. Por otro lado, las ROS incluyen moléculas con oxígeno, tanto radicalarias como no radicalarias con una gran capacidad oxidante, que se generan en el cuerpo humano por procesos metabólicos como la respiración celular (Jaydeokar et al., 2012). Existen más tipos de especies reactivas, siendo las más importantes a nivel celular las ROS, nitrógeno y cloruro (Carvajal Carvajal, 2019). Esto se puede observar en la Fig. 2.2, donde se recogen las principales especies reactivas:
4 Figura 2.2: Especies reactivas de interés biológico. Fuente: (Carvajal Carvajal, 2019)
Podemos encontrar diversas fuentes de radicales libres, tanto endógenas como exógenas, como, por ejemplo, procesos metabólicos como la respiración celular, el estrés, factores ambientales como contaminantes en el aire o radiación, ciertas medicinas, consumo de tabaco… estando muy relacionado con nuestro estilo de vida. En condiciones normales las ROS juegan un importante papel en procesos celulares como la fagocitosis, apoptosis y mecanismos de protección, manteniendo la homeostasis celular y mediando en los mecanismos (Qazi & Molvi, 2018).
El organismo posee mecanismos para controlar la generación y eliminación de estas especies, generando un equilibrio. Sin embargo, este equilibrio puede alterarse debido a dos principales situaciones: Un aumento de los factores, endógenos o exógenos, generadores de ROS, o un deterioro o disminución de los sistemas de protección ante la oxidación. Este desequilibrio puede producirse de forma pasajera, pero, en el caso de que ocurra de forma extendida, se genera el llamado estrés oxidativo, que es perjudicial para la célula e incluso puede llevar a su destrucción. (Lushchak, V. I., 2014; Flieger et al., 2021). En los últimos años se ha encontrado relación entre el estrés oxidativo y un gran número de afecciones como trastornos neurodegenerativos, enfermedades
5 cardiovasculares, inflamatorias, cáncer (Qazi & Molvi, 2018) además de relacionarse con el proceso de envejecimiento (Birch‐Machin & Bowman, 2016).
Uno de los sistemas que tiene el organismo para contrarrestar las especies reactivas y radicales libres son los compuestos antioxidantes. Al presentarse en pequeñas concentraciones, los antioxidantes inhiben significativamente el proceso oxidativo de las ROS oxidándose ellos mismos, y detienen las reacciones en cadena radicalarias eliminando los intermedios. Por lo tanto, son sustancias capaces de proteger las células del estrés oxidativo inhibiendo o ralentizando el efecto de los radicales libres al reaccionar con ellos, para formar un radical más estable que no tienda a reaccionar con el oxígeno (Rasheed & Azeez, 2019).
2.2.1. Clasificación de los compuestos antioxidantes
Teniendo en cuenta el origen de los antioxidantes los podemos clasificar en naturales y sintéticos. Los antioxidantes sintéticos suelen ser compuestos fenólicos para- disustituidos, siendo algunos de los más utilizados el butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT) y terbutilhidroquinona (TBHQ). Para poder llevar estos antioxidantes al mercado es necesario comprobar la completa ausencia de toxicidad y carcinogénesis de los mismos y sus posibles productos de reacción (Pokorný, 2007).
Recientemente se ha empezado a prestar atención no solo a los posibles efectos de estos antioxidantes y sus derivados a largo plazo, sino al potencial peligro que representa para al medio ambiente y la población la acumulación de los mismos que se está produciendo (Liu & Mabury, 2020; Wang et al., 2021).
Por otro lado, nos vamos a centrar en los antioxidantes naturales, para los que existen numerosos tipos de clasificaciones. De acuerdo a su origen y función biológica, podemos diferenciar (Flieger et al., 2021):
• Antioxidantes naturales endógenos: Forman parte de las defensas de nuestro cuerpo ante las especies oxidantes y radicales libres. Dentro de este grupo podemos diferenciar dos tipos: enzimáticos, como la superóxido dismutasa o glutatión peroxidasa y no enzimáticos, como las vitaminas C y E, proteínas, coenzimas o aminoácidos.
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• Antioxidantes naturales exógenos: Entre ellos encontramos compuestos como vitaminas, elementos traza, compuestos fenólicos o carotenoides. Los adquirimos principalmente en la dieta y actúan como apoyo a los anteriores.
De acuerdo a su mecanismo de actuación podemos encontrar estabilizadores del hidroperóxido como los polifenoles, compuestos que producen sinergias como el ácido cítrico, quelantes como el ácido fosfórico, inhibidores del oxígeno singlete como el betacaroteno, entre otros (Sarkar & Ghosh, 2016).
El empleo de antioxidantes naturales en lugar de sintéticos es un avance prometedor en el que hay un interés creciente, pero no debemos ignorar que también poseen desventajas, como el hecho de que el que se presenten en diversos alimentos no significa que sean completamente seguros, lo que implica la necesidad de estudiar su toxicidad e interacciones a diferentes concentraciones al igual que los sintéticos. En la misma línea, uno de los principales inconvenientes de los antioxidantes naturales que se está tratando en la actualidad, es la diferencia de actividad antioxidante in vitro e in vivo, debido a que al entrar al organismo son metabolizados perdiendo gran parte de la actividad antioxidante prevista en base a los estudios in vitro (Poprac et al., 2017; Sarkar & Ghosh, 2016).
2.3. Caracterización y clasificación de compuestos fenólicos
Existen más de 8000 compuestos fenólicos procedentes de plantas, formados en su metabolismo secundario, responsables de propiedades como la pigmentación, protección contra radiación UV o plagas, atracción de polinizadores, o señalización, resultantes de su estructura. Estos compuestos constituyen gran parte de la planta, dependiendo su concentración de muchas condiciones como la especie, riego, condiciones de cultivo, estado de maduración, condiciones de almacenamiento… etc. Todos los compuestos fenólicos tienen en común al menos un benceno, aunque, al ser un conjunto muy extenso con notables diferencias estructurales, podemos clasificar estos compuestos en dos grandes grupos: flavonoides y no flavonoides (Albuquerque et al., 2021; Laura et al., 2019).
7 Figura 2.3: Estructura básica de los flavonoides y estructura de los distintos tipos de flavonoides. Fuente:
(Nishiumi et al., 2011)
Los flavonoides son los compuestos fenólicos más abundantes en frutas y vegetales, La estructura básica de los flavonoides consiste en un esqueleto de 15 carbonos dispuestos como C6-C3-C6, como se puede observar en la Fig. 2.3. Las diferentes uniones y sustituciones en esta estructura dan lugar a una serie de subclases dentro de este grupo (Vuolo et al., 2019):
• Flavonoles
• Flavonas
• Flavanonas
• Isoflavonas
• Flavanonoles
• Antocianinas
Por otra parte, los no flavonoides consisten en un conjunto de compuestos fenólicos con una mayor diversidad estructural, en general más simples que los flavonoides. Entre ellos podemos encontrar:
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• Fenoles simples: Son derivados del fenol con dos o tres grupos hidroxilo en el anillo de benceno. Poseen una importante actividad antioxidante, entre otras actividades, como antibióticos o citotóxicos (Vila et al., 2014).
Figura 2.4: Estructura de algunos fenoles simples. Fuente: (Vila et al., 2014)
• Ácidos fenólicos: Se trata del grupo más abundante dentro de los no flavonoides, constituyendo junto con los flavonoides la mayoría de los compuestos fenólicos presentes en nuestra dieta. Contienen un grupo fenilo sustituido por un grupo carboxílico y uno o más grupos hidroxilo. Se pueden dividir a su vez en ácidos hidroxibenzoicos e hidroxicinámicos dependiendo del ácido del que deriven (Laura et al., 2019).
Figura 2.5: Estructura base de los ácidos fenólicos, hidroxibenzoicos (izda.) e hidroxicinámicos (dcha.). Fuente: (Albuquerque et al., 2021)
• Xantonas, estilbenos y benzofenonas: Se encuentran en diversas partes de muchas plantas. La estructura que tienen en común es dos anillos de benceno unidos por una cetona (Vila et al., 2014).
Figura 2.6: Estructura benzofenona, xantona y estilbeno. Fuente: (Vila et al., 2014)
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• Cumarinas: También conocidas como 1,2-benzopironas, consisten en un anillo de benceno unido a un anillo de pirona. Tienen un gran potencial en el ámbito farmacéutico debido a sus numerosas propiedades antioxidantes y antibacterianas (Kostova et al., 2011).
Figura 2.7: Estructura base de las cumarinas. Fuente: (Kostova et al., 2011)
• Lignanos: Son compuestos con diversidad de estructuras. La estructura base es un dímero de fenilpropanoides (C6-C3). Se encuentran principalmente en semillas y tienen notables propiedades beneficiosas (Albuquerque et al., 2021).
Figura 2.8: Monómero lignano (izda.) y dímero (dcha.). Fuente: (Albuquerque et al., 2021)
• Taninos: Consisten en polímeros fenólicos situados principalmente en los tejidos de las plantas. Estas moléculas son conocidas por conferir un sabor amargo a las frutas. Se subdividen en hidrolizables y condensados (Albuquerque et al., 2021).
Figura 2.9: Estructura taninos hidrolizables (izda.) y condensados (drcha.). Fuente: (Albuquerque et al., 2021)
10 Los compuestos fenólicos son antioxidantes naturales exógenos que actúan generalmente como neutralizadores de radicales libres, inhibiendo la fase de iniciación de las reacciones en cadena que provocan o directamente interrumpiendo la propagación de la oxidación de los lípidos frenando el proceso de enranciamiento (Shahidi &
Ambigaipalan, 2015). Este proceso puede ocurrir principalmente mediante dos mecanismos: el radical libre se desactiva tomando un átomo de hidrógeno del antioxidante, dependiendo la reacción de la fortaleza del enlace O-H, o produciéndose una transferencia electrónica entre el antioxidante y el radical, dependiendo la reacción del potencial de ionización. En ambos casos el antioxidante pasará a ser un radical más estable por resonancia en su estructura. Esta capacidad depende de la estructura de los compuestos fenólicos respecto a número y posición de hidroxilos, dobles enlaces y sustituyentes (Vuolo et al., 2019).
2.4. Lavandula angustifolia
La especie Lavandula Angustifolia, también conocida como Lavandula Vera o Lavandula Officinalis, es un arbusto procedente del sur de la zona del mediterráneo, con un aroma característico, tallos leñosos muy ramificados y una altura de unos 50 cm. Sus hojas son estrechas y alargadas, con un tacto aterciopelado y sus flores son pequeñas y de un color azul grisáceo. Las glándulas aromáticas de esta planta se localizan en pequeños pelos que cubren sus tallos, hojas y flores (Gallego Iradi, 2016). El género Lavandula está constituido por 39 especies, entre las que encontramos la L. stoechas o L. spica, además de numerosos híbridos como L. x intermedia. El nombre genérico Lavandula hace referencia a lavare, lavar, limpiar, bañarse, debido al uso de infusiones de estas plantas para perfumar en el lavado. Asimismo, Angustifolia viene del latín de “hojas estrechas” y el otro nombre que se le da, Officinalis, indica su uso medicinal. La taxonomía de la Lavandula Angustifolia se presenta en la tabla 2.1.
11 Clasificación taxonómica
Reino Plantae
División Tracheophyta
Subdivisión Spermatophytina
Clase Magnoliopsida
Superorden Asteranae
Orden Lamiales
Familia Lamiaceae
Género Lavandula
Especie Lavandula
Angustifolia
Tabla 2.1: Clasificación taxonómica de la lavandula angustifolia. Elaboración propia (Integrated Taxonomic Information System on-
line database, 2022)
Figura 2.10: Lavandula Angustifolia
Debido a su aroma característico, el género Lavandula es uno de los cultivos para aceite esencial más conocidos del mundo, siendo Europa, Oriente Medio, Asia y el norte de África las principales regiones productoras. Francia y Bulgaria encabezan la producción y países como España, Turquía, Italia y Marruecos también producen ciertas cantidades.
Dentro de este género, cuatro especies destacan por su valor comercial: L. angustifolia, L. spica, L. intermedia y L. latifolia (Kıvrak Ş. , 2018). Para la extracción del aceite esencial de este género, la especie que se usa comúnmente es Lavandula Angustifolia debido a que, aunque no es la que más aceite esencial produce, su aceite esencial posee mayor calidad (Wells et al., 2018).
El género Lavandula, centrando la atención en la Lavandula Angustifolia, posee numerosas propiedades beneficiosas otorgadas por sus numerosos fitoquímicos. El aceite esencial y extractos de Lavandula Angustifolia han demostrado tener propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, antimicrobianas, antifúngicas, antisépticas, bactericidas, e incluso algunos estudios han relacionado propiedades antimutagénicas con sus constituyentes (Nikšić et al., 2017; Woronuk et al., 2011). Entre los constituyentes de la
12 Lavandula Angustifolia podemos encontrar una gran variedad de moléculas, principalmente derivados de monoterpenos y sesquiterpenos, además de compuestos fenólicos. Entre los compuestos volátiles que emite esta especie, los más abundantes en sus extractos y aceites esenciales son el linalool y el acetato de linalilo, terpenos oxigenados que le otorgan su olor y poseen propiedades antioxidantes. Paralelamente, entre los compuestos fenólicos que los componen podemos encontrar (Héral et al., 2021):
• Flavonoides: Podemos encontrarlos tanto en su forma libre como conjugados.
Dentro de este grupo podemos encontrar flavonas, flavonoles, flavanonas y antocianinas, responsables estas últimas de la coloración. Los más abundantes son las flavonas derivadas, constituyendo en torno al 50% de los compuestos fenólicos.
• Ácidos fenólicos: Constituyen otra gran parte dentro de los compuestos fenólicos de esta especie. Encontramos tanto hidroxibenzoicos como hidroxicinámicos, habiendo más variedad entre los últimos.
• Cumarinas: Principalmente se encuentran en el tallo y las hojas.
Las propiedades beneficiosas que otorgan estos fitoquímicos han hecho que el uso de los extractos y aceites esenciales de Lavandula Angustifolia se extienda en las industrias como la del perfume, cosmética, alimenticia, hasta la farmacéutica. Entre estos usos destaca el aceite esencial como aromatizante en numerosos productos cosméticos y del cuidado de la piel como cremas, jabones, perfumes, desodorantes… etc., como aditivo en los alimentos y cosméticos para su preservación, y su extendido empleo en la aromaterapia, debido a la relación existente de la inhalación y el masaje del aceite esencial con la reducción de síntomas como ansiedad, depresión, estrés e insomnio (Wells et al., 2018).
2.5. Extracción de compuestos fenólicos
En el análisis de los compuestos fenólicos encontramos dos etapas que son fundamentales: pretratamiento de la muestra y extracción del analito. Para estas etapas del análisis no se puede establecer un procedimiento generalizado debido a la
13 heterogeneidad del grupo de los compuestos fenólicos, variando de simples a polimerizados, con mayor o menor estabilidad térmica y pudiendo estar en forma libre o conjugados a otras biomoléculas. En consecuencia, es necesaria la adaptación del método a cada muestra, especialmente en la etapa de extracción (Dai & Mumper, 2010).
2.5.1. Pretratamiento de la muestra
La etapa de pretratamiento de la muestra consiste en un sometimiento a procesos físicos y químicos que pueden cumplir varias funciones: aumento de la eficiencia del análisis, eliminación de interferencias de la matriz, aumento de la concentración de analito en el extracto o transformación del analito en un derivado más fácilmente detectable (Luthria, 2006). En el análisis de compuestos fenólicos existen varios pretratamientos (Azwanida, 2015):
• Trituración (o molturación) de la muestra: La reducción del tamaño de partícula aumenta la superficie de contacto entre la muestra y el disolvente, aumentando la eficacia de la extracción. El tamaño final de partícula es optimizable.
• Secado de la muestra: En el análisis de compuestos fenólicos en material vegetal el secado de la muestra es preferente al uso de muestra fresca debido a la degradación que sufren en poco tiempo al ser la mayoría inestables frente a la oxidación y enzimas. Existen una variedad de métodos de secado en función de las propiedades del analito:
o Secado en horno: Secado a alta temperatura durante horas. Los compuestos termolábiles se ven afectados.
o Secado al aire: Se realiza a temperatura ambiente, conservando componentes termolábiles, pero se trata de un proceso de semanas en el que se pueden producir contaminaciones.
o Secado por microondas: Secado mediante microondas rápido, aunque puede degradar algunos fitoquímicos.
o Liofilización: Método basado en la congelación de la muestra para posteriormente producir la sublimación del agua disminuyendo la presión.
Es el mejor método para analitos termolábiles y sensibles, aunque requiere un proceso más complejo y, en consecuencia, costoso.
14 2.5.2. Metodologías de extracción
La extracción de los compuestos fenólicos depende de numerosos factores como la temperatura, tiempo de extracción, composición y características de la matriz, polaridad del disolvente, solubilidad, y degradación por oxidación. La extracción sólido-líquido es la técnica más extendida en la separación de estos compuestos, empleándose disolventes de distintas polaridades y mezclas acuosas (Dai & Mumper, 2010). Los disolventes orgánicos más utilizados para la extracción de compuestos fenólicos son metanol, cloroformo, n-hexano, etanol, propanol, etil acetato y acetona. La polaridad de estos disolventes influye en su poder de extracción, y es posible mezclarlos para optimizar sus propiedades (Oluwaseun et al., 2021).
En consecuencia, existen numerosas metodologías para asegurar la óptima extracción de compuestos fenólicos. Las metodologías convencionales son las más extendidas debido a su relativa sencillez, aunque poseen importantes inconvenientes como el alargado tiempo de extracción, el uso de grandes volúmenes de disolventes y la contaminación. Recíprocamente, las metodologías no convencionales están ganando popularidad al contrarrestar dichos inconvenientes mediante el uso de instrumentos y procesos más complejos (Oreopoulou et al., 2019).
2.5.2.1. Metodologías convencionales de extracción
• Prensado en frío
El prensado en frío consiste en el sometimiento del material vegetal a una presión que produce la rotura de sus tejidos, obteniendo una emulsión acuosa que a continuación se filtra. Las ventajas de este método consisten en que es económico y no necesita altas temperaturas (Sousa et al., 2022).
• Maceración, infusión, decocción:
La maceración consiste en la introducción del material en un disolvente durante un mínimo de 3 días, a temperatura ambiente y con agitación, para posteriormente filtrarlo.
La correcta elección del disolvente es fundamental, debido a que sus características determinarán el compuesto extraído. La infusión y decocción siguen el mismo principio,
15 variando en que en la infusión se añade agua en ebullición y en la decocción se hierve el material. Estas metodologías son las más sencillas, no obstante, el gran volumen de disolventes a menudo utilizado representa un gran inconveniente y el uso de altas temperaturas conlleva limitaciones (Azwanida, 2015).
• Percolación:
Esta metodología es similar a la maceración, pero es necesario un equipo específico llamado percolador, en el que se introduce un cartucho con la muestra pulverizada y posteriormente el disolvente caliente pasa a través de ella. En este caso no es necesario el filtrado posterior, ya que la muestra ya sale filtrada y su aplicación solo es recomendada para analitos resistentes a altas temperaturas, teniendo limitaciones similares a la maceración (Alara et al., 2021).
• Extracción Soxhlet:
En esta metodología se introduce la muestra en un cartucho de celulosa y el cartucho se coloca en el aparato Soxhlet, que permite realizar extracciones en un proceso continuo con el mismo volumen de disolvente, mediante una combinación de evaporación, condensación y sifonado. Esta metodología utiliza una menor cantidad de disolvente que la maceración y similares, pero tiene la desventaja de la exposición que produce a disolventes orgánicos, así como emisiones potenciales considerándose perjudicial para el medio ambiente. Por otro lado, hay varios factores a tener en cuenta para la optimización de esta metodología, siendo recomendables las muestras secas y pulverizadas (Azwanida, 2015).
• Hidrodestilación
La hidrodestilación es una metodología muy utilizada en la extracción de aceites esenciales de muestras vegetales. La extracción se produce por tres procesos fisicoquímicos: hidrodifusión, hidrólisis y descomposición por calor, por lo que compuestos termosensibles pueden degradarse. Existen tres tipos de hidrodestilación dependiendo del medio: destilación con agua, con vapor de agua y con agua y vapor (Oreopoulou et al., 2019).
16 2.5.2.2. Metodologías no convencionales de extracción
• Extracción asistida por ultrasonidos
En esta técnica se usan ultrasonidos de 20 a 2000 kHz para producir una cavitación que aumenta la superficie de contacto entre el disolvente y la muestra y permeabiliza las paredes celulares de la matriz vegetal para facilitar la extracción. La técnica es relativamente sencilla y barata y se puede aplicar a pequeña y gran escala. Las desventajas que representa es que el uso de frecuencias superiores a 20 kHz puede inducir a la formación de radicales libres que afectan a los fitoquímicos, además de la importancia del tiempo de sonicación, que puede afectar a los compuestos fenólicos en el caso de ser demasiado largo (Azwanida, 2015; Alara et al., 2021).
• Extracción asistida por microondas
Esta técnica consiste en la utilización de microondas para calentar la mezcla de disolvente y muestra, ayudando este calentamiento a la difusión del disolvente en la muestra vegetal para acelerar la extracción de los compuestos fenólicos. El factor más importante en esta técnica es la elección del disolvente adecuado en base a la interacción con la muestra y la absorción de microondas. Las principales ventajas que posee son el reducido tiempo de extracción y el menor consumo de disolvente, permitiendo obtener buenos rendimientos en la extracción de compuestos fenólicos, aunque con la limitación de que solo se puede aplicar a compuestos pequeños para evitar la degradación de los mismos (Alara et al., 2021).
• Extracción con fluidos supercríticos (SFE)
Esta técnica aprovecha las características de los fluidos supercríticos, los cuales comparten características físicas del estado líquido y gaseoso al estar en las condiciones de presión y temperatura de su punto crítico. Concretamente, los fluidos supercríticos se comportan generalmente como gases, pero tienen la capacidad de solvatación de los líquidos, teniendo aplicaciones muy prometedoras en la extracción de compuestos fenólicos. Uno de los compuestos usados como fluido supercrítico es el dióxido de carbono (SCE) debido a su bajo precio y toxicidad. En esta técnica, las condiciones de presión, temperatura y tiempo de extracción son optimizadas para el analito permitiendo
17 conseguir muy altos rendimientos, siendo el principal inconveniente de la misma el alto coste del equipamiento necesario para llevarla a cabo (Azwanida, 2015).
2.6. Metodologías de extracción de aceite esencial
A la hora de extraer aceites esenciales, hay dos metodologías predominantes: La hidrodestilación, en la que se diferencian la destilación con agua y con vapor, y la extracción con CO2 supercrítico. Aunque las dos son válidas y extensamente empleados, la farmacopea europea recomienda la hidrodestilación durante tres horas en un aparato Clevenger (Filly et al., 2016).
La hidrodestilación es el nombre que se le suele dar a la hidrodestilación con agua, y es la metodología más utilizada para la extracción del aceite esencial. La operación se lleva a cabo en un aparato Clevenger, en el que se coloca el material vegetal junto con el agua en un matraz y se lleva a ebullición. Así, las paredes celulares del material vegetal se rompen dejando salir el aceite esencial y este se evapora junto con el agua para luego condensar, permitiendo su separación (Sousa et al., 2022). Por otro lado, la destilación a vapor sigue un principio similar, pero no hay contacto entre la muestra vegetal y el agua, ya que el vapor que genera el agua en ebullición, situada debajo de la muestra, es el que extrae el aceite esencial para luego condensar ambos (Filly et al., 2016).
Figura 2.11: Aparato Clevenger (drcha.) y montaje empleado para la destilación a vapor (izda.). Fuente:
(Sousa et al., 2022)
18 Unos componentes relacionado con estas metodologías que están captando importancia en el ámbito de la cosmética son los hidrolatos o hidrosoles. Los hidrolatos consisten en el producto acuoso de la destilación de plantas aromáticas y contienen algunos de los fitoquímicos de la muestra, entre ellos, compuestos fenólicos que les propician actividad antioxidante. Concretamente, los hidrolatos son una mezcla de una pequeña cantidad de aceite esencial y metabolitos secundarios volátiles y solubles en agua (Jakubczyk et al., 2021).
Los hidrolatos tienen un olor más suave y menor actividad biológica que los aceites esenciales. Sin embargo, la popularidad que están captando se debe a su composición química y seguridad de uso, ya que, al contener pequeñas cantidades de aceite esencial es seguro utilizarlos directamente sobre la piel o ingerirlos. Se suele suponer que los hidrolatos poseen las mismas propiedades biológicas que los aceites esenciales de los que proceden, pero en la actualidad estas propiedades no se han estudiado en la suficiente extensión, siendo un campo prometedor de cara a futuras investigaciones (Prusinowska et al., 2016).
Continuando con las metodologías de extracción, la extracción de aceite esencial con CO2 supercrítico se ha extendido en los últimos años debido a la mayor calidad y rendimiento que proporciona. Esto se debe a que, mientras en la hidrodestilación se tienen que utilizar altas temperaturas, que pueden degradar los componentes del aceite esencial, en la extracción con CO2 supercrítico es posible controlar la presión, permitiendo operar a temperaturas más bajas (Danh et al., 2013). De este modo, se pueden optimizar la presión, temperatura y tiempo de extracción, para obtener mejores resultados.
Una vez especificadas las condiciones, el CO2 supercrítico se hace pasar por la muestra disolviendo el aceite esencial y extrayéndolo, para a continuación, bajar la presión por debajo del punto crítico (31.21ºC y 72.9 atm) y que el CO2 pase a estado gaseoso y se separe del aceite esencial debido a la pérdida de propiedades de solvatación (Sousa et al., 2022).
19 2.7. Métodos de evaluación de la actividad antioxidante
La actividad antioxidante de plantas y alimentos es un parámetro complejo debido a la gran variedad de antioxidantes y métodos de evaluación de los mismos, anteriormente discutidos. En consecuencia, a lo largo de los años han surgido una variedad de métodos para evaluar esta actividad, creándose la necesidad de adoptar un método estandarizado, como se manifestó en el Primer Congreso Internacional sobre Métodos Antioxidantes celebrado en Orlando, Florida (Londoño, 2012). Sin embargo, todavía no se ha podido establecer un método estándar debido a las diferencias entre los métodos existentes respecto al proceso que se mide o equivalencia de resultados entre ellos por lo que, a la hora de medir la actividad antioxidante, es recomendable usar varios métodos, conociendo sus principales ventajas y limitaciones, para obtener resultados completos (Montealegre Cespedes, 2021).
A la hora de interpretar las medidas, es importante distinguir entre actividad neutralizadora de radicales libres y actividad antioxidante. La primera refleja la reactividad de un compuesto ante radicales libres, viéndose reflejado como velocidad de reacción, y por otro lado, la actividad antioxidante se refiere a la capacidad del antioxidante de aplacar la degradación oxidativa. Estos dos conceptos no están ligados, habiendo compuestos con una gran actividad neutralizadora de radicales libres, pero con poca actividad antioxidante. Por ende, la actividad antioxidante dependerá de la reactividad del antioxidante, capacidad del mismo para acceder al sitio de reacción y la estabilidad del producto formado después de la estabilización del radical (Londoño, 2012).
Uno de los métodos para clasificar la actividad antioxidante es en base al mecanismo de reacción. Se ha comentado anteriormente que los antioxidantes pueden estabilizar radicales libres mediante dos mecanismos: transfiriendo átomos de hidrógeno (HAT) o transfiriendo electrones (ET), determinando las características del antioxidante el mecanismo que se seguirá. Entre los métodos populares basados en la transferencia de átomos de hidrógeno, encontramos el método ORAC (Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno) y entre los métodos basados en la transferencia de electrones encontramos el método FRAP (Poder de Reducción Antioxidante del Ión Férrico).
20 Figura 2.12: Esquema de reacción de los mecanismos de estabilización de radicales libres ET (izda.) y
HAT (drcha.). Fuente: (Soto Leiva, 2015)
Paralelamente podemos destacar métodos que combinen los dos mecanismos como el ABTS (basado en el nombre del radical 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico)), DPPH (basado en el nombre del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo). Además, podemos destacar métodos basados en la medición directa de la inhibición de la peroxidación lipídica como el TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) y métodos de medida del contenido total de compuestos fenólicos como el método de Folin- Ciocalteu (Londoño, 2012). A continuación, se describirán más extensamente las características de estos métodos.
2.7.1. Método de Folin-Ciocalteu
Este método, propuesto por Folin en 1927, está basado en la oxidación de los compuestos fenólicos presentes en la muestra mediante la adición de una disolución básica del anión molibdotungstofosfórico. En la medida de la actividad antioxidante, el Molibdeno del complejo se reduce de Mo(VI) a Mo(V) por la donación de un electrón del antioxidante y se produce una coloración azul. Este producto posee una absorbancia máxima entre 750 y 765 nm, la cual se puede medir en un espectrofotómetro.
Actualmente, no se conoce la naturaleza química exacta ni el potencial redox del reactivo de Folin, pero se conoce que es un oxidante fuerte que puede reducir de manera no específica muchos compuestos reductores, incluyendo compuestos fenólicos y no fenólicos (Apak et al., 2016).
21 Figura 2.13: Esquema de reacción del reactivo de Folin.
Las ventajas de este método incluyen la rapidez y facilidad con la que se emplea, su robustez y el hecho de que al tener un máximo de absorción definido se pueden minimizar efectos de la matriz. Por otro lado, entre los principales inconvenientes destacan la aplicación a un pH muy básico, que produce que los compuestos fenólicos se oxiden más fácilmente, además de la poca especificidad que posee a la hora de reducir los compuestos reductores. Esto produce una sobreestimación general de la capacidad antioxidante al medirla con este método (Apak et al., 2016).
2.7.2. Método DPPH
Este método, propuesto inicialmente por Brand–Williams en 1995 (Londoño, 2012), se basa en la reacción del antioxidante, o cualquier molécula con un enlace débil a un hidrógeno, con el radical DPPH, de color violeta oscuro. La disolución etanólica de este radical posee un máximo de absorción en torno a 520 nm, mientras que la forma reducida no tiene coloración por lo que, en la reacción, a medida que el antioxidante cede un átomo de hidrógeno al radical desactivándolo, se va produciendo una pérdida proporcional de la coloración violeta, pudiendo medirse en el espectrofotómetro en un intervalo de tiempo concreto (Montealegre Cespedes, 2021).
22 Figura 2.14: Reacción del radical DPPH con antioxidante (X-H). Fuente: (Amorati et al., 2013)
En este método se realiza la reacción de la muestra y el radical DPPH en una disolución de metanol/agua, facilitando la extracción de los compuestos antioxidantes de la muestra y constituyendo un método sencillo y rápido para la determinación de la capacidad neutralizadora de radicales libres de la muestra. Los resultados de este método suelen expresarse como IC50, referente a la concentración de antioxidante necesaria para producir una decoloración del 50% de la disolución inicial (Amorati & Valgimigli, 2018).
Por definición, un menor IC50 estará relacionado con una mayor actividad antioxidante.
Por otro lado, el principal inconveniente de este método es que depende del tiempo de reacción, por lo que no nos da ninguna información referente a la reactividad del antioxidante en cuestión, además de que los resultados dependen mucho de las condiciones de reacción, por lo que solo pueden ser comparables los que han sido realizados en las mismas condiciones (Amorati et al., 2013)
2.7.3. Método ABTS
Este método, inicialmente reportado por Miller y colaboradores, se basa en la neutralización del radical catiónico ABTS·+, resultando en una decoloración de verde muy oscuro a verde claro. Este radical se genera directamente antes de la reacción mediante la adición de persulfato potásico y tiene cuatro máximos de absorción: 645, 734, 815 nm, y el más usado a 415 nm (Re et al., 1999). Al añadir un antioxidante capaz de ceder un electrón o átomo de Hidrógeno, el radical se estabiliza disminuyendo la absorbancia en los máximos mencionados anteriormente, pudiendo controlarse la reacción espectrofotométricamente (Apak et al., 2016).
23 Figura 2.15: Generación del radical ABTS·+ y reacción con un antioxidante (AOH). Fuente: (Carrasco
Ruiz, 2015)
Este método a menudo se denomina Ensayo de la capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC), en el que la capacidad antioxidante de la muestra se compara con la del Trolox, un compuesto con propiedades antioxidantes análogo de la vitamina E. Los resultados en este caso se expresan como equivalentes de Trolox (Montealegre Cespedes, 2021).En el método ABTS los resultados se pueden expresar también de forma similar al método DPPH como IC50.
Las ventajas y desventajas de este método son similares a las del DPPH debido a su parecido, ya que ambos son sencillos y rápidos y generan el radical en el momento de la medida. Es importante tener en cuenta que, aunque sean métodos populares, la sencillez con la que se llevan a cabo tiene consecuencias a la hora de trasladar los resultados a datos reales (Antolovich et al., 2002)
2.7.4. Método ORAC
Este método utiliza una sonda fluorescente, normalmente fluoresceína, para someterla a degradación por acción de azo iniciadores que generan el radical peroxilo. Al añadir el antioxidante se podrá comprobar, mediante la medida de la pérdida de fluorescencia, la protección que proporciona contra los radicales libres generados (Amorati et al., 2013).
Lo que destaca este método en comparación con el resto es la capacidad de observar la acción del antioxidante durante su curso, en lugar de medir la actividad en un momento
24 concreto. Por otro lado, sus principales inconvenientes incluyen que solo se puede detectar la actividad antioxidante contra radicales concretos, no se caracteriza la reacción de los radicales y el hecho de que realmente no hay una seguridad de que únicamente los radicales libres estén involucrados en la reacción (Montealegre Cespedes, 2021).
2.7.5. Método FRAP
El método del poder de reducción antioxidante del ión férrico (FRAP) consiste en la medida de la reducción en medio ácido del hierro del complejo 2,4,6-Tripiridiltriazina Férrica (TPTZ) de Fe(III) a Fe(II), teniendo el último complejo un color azul intenso. Los resultados se pueden observar mediante la medida espectrofotométrica del aumento de absorbancia a 593 nm, constituyendo un método sencillo y automatizable (Antolovich et al., 2002).
La desventaja de este método consiste en que no puede detectar antioxidantes que actúan mediante la transferencia de átomos de Hidrógeno al ser un proceso puramente redox, por lo que las medidas sufren una subestimación de la actividad antioxidante de los compuestos que siguen dicho mecanismo (Londoño, 2012).
2.7.6. Método TBARS
Algunos autores consideran que, de los métodos mencionados, el TBARS es uno de los que mejor se aproximan a la actividad antioxidante real de los antioxidantes en alimentos (Marín et al., 2016). Este método se basa en la medida de la reacción de un producto secundario de la degradación de ácidos grasos poliinsaturados, el malondialdehído (MDA), con ácido tiobarbitúrico (TBA). El MDA en medio ácido reacciona con el TBA formando un aducto de color rojo con absorbancia máxima a 532 nm y fluorescente, con una longitud de onda de excitación de 530 nm y emisión a 550 nm (Carrasco Ruiz, 2015).
La adición de un antioxidante producirá una disminución de la concentración de aducto producida, la cual puede medirse tanto espectrofotométrica como fluorimétricamente (Antolovich et al., 2002).
Este método tiene el principal inconveniente de tener poca especificidad, ya que el MDA puede reaccionar con otros compuestos además del TBA. Sin embargo, es un método
25 ampliamente utilizado debido a su proximidad al modelo in vivo de la oxidación lipídica (Apak et al., 2016).
3. OBJETIVOS
• Generales
o Realizar una revisión bibliográfica de la capacidad antioxidante de la Lavandula Angustifolia.
o Revisión de las metodologías de extracción de compuestos antioxidantes en plantas.
o Revisión de los métodos de evaluación de actividad antioxidante.
• Específicos
o Evaluación de la influencia de variantes externas a la planta en la actividad antioxidante: parte de la planta, pretratamiento y concentración de aceite esencial empleada.
o Evaluación de la influencia del método de extracción del aceite esencial en la actividad antioxidante.
4. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DEL ACEITE ESENCIAL DE LAVANDULA ANGUSTIFOLIA
Se ha realizado la revisión de estudios que llevan a cabo la evaluación de la actividad antioxidante del aceite esencial de Lavandula Angustifolia extraído de diversas partes de la planta y mediante distintas metodologías. La información recopilada de una búsqueda bibliográfica comprendida entre 2009 y 2021 se ha recogido en la tabla 4.1. Debido a que existen diferentes estándares de referencia en los resultados obtenidos en la bibliografía, no se ha podido unificar al completo la información recopilada. Sin embargo, los resultados se han agrupado de un modo que facilita la comparación de las variables influyentes y los valores de capacidad antioxidante obtenidos.
26 A la hora de extraer el aceite esencial de Lavandula Angustifolia se utilizan principalmente las flores, las partes aéreas de la planta o la planta completa. En la extracción del aceite esencial, se utilizan normalmente las partes de la planta en plena floración, debido a que la calidad y concentración de aceite esencial se consideran mayores en dicho estado (Zheljazkov et al., 2012). Respecto a la parte de la planta empleada, al comparar los datos de la tabla, se puede observar que, en general, el aceite esencial de las flores tiene una mayor actividad antioxidante. Nurzyńska-Wierdak y Zawiślak (2016) llevaron a cabo el estudio de la actividad antioxidante del aceite esencial de las hojas, capullos y flores de la lavanda en mismas condiciones, obteniendo 77.5%, 85.9% y 86.3% de inhibición, frente al radical DPPH, respectivamente. A su vez, Smigielski et al. (2018) determinaron la actividad antioxidante de aceite esencial de flores y partes aéreas, obteniendo un IC50
de 22.11 ± 1.18 y 75.42 ± 7.02 mg/ml respectivamente. Por lo tanto, se deduce de estos datos que el aceite esencial de flores de Lavandula Angustifolia tiene una mayor actividad antioxidante al del resto de partes de la planta, ya que las flores son la parte de la planta en la que se encuentra una mayor cantidad de compuestos con propiedades antioxidantes. Esto está de acuerdo con las conclusiones de Nurzyńska-Wierdak y Zawiślak (2016), que lo achacan a una mayor concentración de linalool y acetato de linalilo en flores.
Otro aspecto a tener en cuenta es el tratamiento de la planta previo a la extracción del aceite esencial: la muestra vegetal se puede usar fresca o seca, almacenarse durante un periodo de tiempo y se puede molturar a distintos tamaños. Caprari et al., (2021) compararon la actividad antioxidante del aceite esencial de flores de lavanda frescas y almacenadas durante un año y para el aceite esencial de flores secas obtuvieron un porcentaje de inhibición del radical ABTS del 99.48%, ligeramente superior al aceite esencial de flores frescas, 96.88%.
27 Figura 4.1: Porcentaje de inhibición del radical ABTS por parte del aceite esencial de flores de lavanda frescas (■) y almacenadas durante un año (●), a diferentes concentraciones. Fuente modificada: (Caprari
et al., 2021)
Comparando otras referencias, Blažeković et al., (2018) determinaron la actividad antioxidante de aceite esencial de flores frescas sometidas a hidrodestilación, obteniendo para el ensayo DPPH un IC50 de 27.67 ± 0.56 mg/mL. Paralelamente, Smigielski et al., (2018) obtuvieron un IC50 de 22.11 ± 1.18 mg/ml, mediante el mismo ensayo y método de extracción, además de comparar la actividad antioxidante del aceite esencial de las partes aéreas de la planta frescas y secas. Para el aceite esencial extraído de las partes aéreas frescas y secas obtuvieron un IC50 de 77.11 ± 7.29 mg/mL y 75.42 ± 7.02 mg/mL respectivamente, para el ensayo DPPH. Continuando con la bibliografía en la que se emplea aceite esencial de las partes aéreas, Viuda-Martos et al., (2011) obtuvieron para dicho aceite esencial, aislado mediante hidrodestilación, 140.33 ± 2.36 GAE/(mg/mL) para el material fresco y Marín et al., (2016) obtuvieron con el mismo tratamiento 137.52
± 38.3 GAE/(mg/L) para el material seco, determinando ambos los fenoles totales mediante el método de Folin-Ciocalteu.
La molienda del material vegetal previo a la extracción del aceite esencial también ha demostrado tener importancia a la hora de evaluar la actividad antioxidante. Hussain et al., (2011) evaluaron la actividad antioxidante de aceite esencial de flores y partes aéreas, secadas y molidas, mediante el ensayo DPPH dando un IC50 de 289.0 ± 8.5 µg/mL, mientras que Niksic et al., (2017), en las mismas condiciones y sin moler el material seco,
28 obtuvieron un IC50 de 0.421 mg/mL (421 µg/mL), significativamente mayor. La gran diferencia entre estos resultados y los anteriores descritos se debe al empleo de distintos compuestos antioxidantes de referencia en el método.
En vista de los datos anteriores, relacionados con el pretratamiento, podemos inferir que el secado del material vegetal en general, previo a la extracción del aceite esencial, se relaciona con una actividad antioxidante ligeramente mayor. Además, la molienda del material vegetal seco se puede relacionar con un aumento de la actividad antioxidante del aceite esencial de dicho material. Se ha observado que, de forma generalizada, no se proporciona suficiente información sobre el tratamiento antes de la extracción y preservación del aceite esencial de la Lavandula Angustifolia, lo cual afecta a la dificultad de comparación de los resultados. Esto coincide con las conclusiones de Luthria, (2006), que recalca la importancia de documentar adecuadamente estos factores.
La concentración empleada de aceite esencial ha resultado ser de gran importancia a la hora de evaluar actividad antioxidante, ya que como reflejan los resultados de Avsar et al., (2018) y Da Silva et al., (2015), la actividad antioxidante del aceite esencial de Lavandula Angustifolia es dependiente de la concentración, lo que queda reflejado en la Fig. 4.2.
Figura 4.2: Porcentaje de inhibición del radical DPPH frente a la concentración de aceite esencial de lavanda (LEO) añadido. Fuente modificada: (Da Silva et al., 2015)
29 Por otro lado, en relación a la metodología de extracción de componentes bioactivos empleada, Danh et al., (2013) realizaron una comparación de actividad antioxidante de aceite esencial de Lavandula Angustifolia extraído mediante tres métodos: extracción con CO2 supercrítico, hidrodestilación y extracción con hexano en equipo Soxhlet. Los resultados que obtuvieron para el ensayo DPPH fueron expresados en porcentaje de inhibición y están reflejados en la Fig. 4.3, observándose el siguiente orden: SCE (63%)
> Hidrodestilación (48%) > Extracción con hexano en equipo Soxhlet (12%).
Figura 4.3: Porcentaje de inhibición del radical DPPH por parte del aceite esencial de lavanda extraído por CO2 supercrítico (SCE), hidrodestilación (Hidro.) y hexano en equipo Soxhlet (Hex.), comparados con
el de los antioxidantes α-tocoferol (A) y BHT (B). Fuente modificada: (Danh et al., 2013)
En cuanto a otros métodos de extracción, Gismondi et al., (2014) estudiaron la capacidad antioxidante del aceite esencial extraído mediante maceración, obteniendo 803.0 µmol/L equivalentes de ácido ascórbico para el ensayo ABTS y 752.1 µmol/L equivalentes ácido ascórbico en el ensayo de Folin-Ciocalteu para fenoles totales. Asimismo, Ertürk et al., (2020) evaluaron la capacidad antioxidante del aceite esencial adquirido de Foodstuffs Istanbul, (Turquía) aislado mediante prensado en frío, obteniendo resultados del 2.48%
de inhibición del radical DPPH y 22.62 µmol Trolox/g aceite (equivalentes de Trolox) en el ensayo ABTS. A su vez, Yang et al., (2010) evaluaron la actividad antioxidante de aceite esencial de Lavandula Angustifolia obtenido de Skinmate (Corea), aislado por destilación a vapor y obtuvieron una inhibición del 93.4 ± 1.55% del radical DPPH y 35,4
± 2.54% del radical ABTS.
30 Para el aceite esencial del material vegetal seco y molido, extraído mediante CO2
supercrítico, (Danh et al., 2012) obtuvieron unos resultados de inhibición del radical DPPH entre 24% y 75% variando las condiciones de temperatura, tiempo de extracción y presión, con un máximo de 73.8 ± 0.4%. Para la inhibición del radical ABTS llegaron a un máximo de 94.5 ± 3.1%, variando entre 60% y 95% con las condiciones. Igualmente, Avsar et al., (2018) obtuvieron, mediante el mismo método de extracción un 40.9% de inhibición del radical DPPH por parte del aceite esencial del material vegetal seco sin moler. Se puede apreciar el mencionado efecto de la molienda del material vegetal sobre la actividad antioxidante en estos resultados.
Por lo tanto, en base a los resultados anteriores, podemos afirmar que, aunque la metodología más extendida para la extracción de aceite esencial de Lavandula Angustifolia sea la hidrodestilación, la metodología con la que se obtiene una mayor capacidad antioxidante de aceite esencial es la extracción con CO2 supercrítico debido a la posibilidad de optimización de las condiciones y el empleo de bajas temperaturas, de acuerdo con las conclusiones de Danh et al., (2012). Así, la hidrodestilación sería la técnica de extracción que le sigue junto con la destilación a vapor, siendo más económicas, y la maceración y prensado en frío, aunque son metodologías más sencillas, obtuvieron los resultados más bajos.
Por último, la información extraída de la literatura referente a los hidrolatos de la Lavandula Angustifolia se han recogido en la tabla 4.2. Las conclusiones que se pueden extraer de los resultados de Prusinowska et al., (2016) y Jakubczyk et al., (2021) son que los hidrolatos poseen una actividad antioxidante notable, aunque comparándola con los resultados del aceite esencial, bastante menor. Esto se debe a que están formados por agua y una mezcla de aceite esencial y metabolitos secundarios solubles en agua, reflejado en la concentración total de compuestos fenólicos de 3.36 mg/L y 41.32 mg/L.
Por otro lado, el empleo de cultivos orgánicos y fertilizantes aumenta notablemente la inhibición del radical DPPH y los compuestos fenólicos totales, de 4.43% a 39.87% y de 3.36 mg/l a 41.32 mg/l respectivamente, reflejando un aumento general de la actividad antioxidante de los hidrolatos.
31 Tabla 4.1: Evaluación de la actividad antioxidante de Lavandula Angustifolia. Fuente: elaboración propia.
Referencia Zona
Parte de la planta /
Origen
Pretratamiento Metodología de
extracción DPPH ABTS FRAP Fenoles
totales
Otros métodos
(Nurzyńska- Wierdak &
Zawiślak, 2016)
Lublin (Polonia)
Hojas
Secado a 35ºC Hidrodestilación durante 3h
77.5% - - - -
Capullos 85.9% - - - -
Flores 86.3% - - - -
(Da Silva et
al., 2015) Brasil
Aceite esencial adquirido de Bioessencia
- - IC50=51.05
mg/mL - - - -
(Danh et al., 2012)
Sídney
(Australia) Flores
Secado y molienda a diferentes grosores (media de
0.8mm)
Extracción con CO2 supercrítico
73.8 ± 0.4%
24-75% variando las condiciones
94.5 ± 3.1%
60-95%
variando las condiciones
- - -
(Niksic et al., 2017)
Herzegovina
(Bosnia) Flores Secado Hidrodestilación
durante 2.5h
IC50=0.421±0.03
mg/mL - - - -
(Kıvrak Ş. ,
2018) Turquía
Partes aéreas recién cosechadas
No Destilación a
vapor durante 2h
SC50= 91.56 ± 0.08 µg/mL
IC50= 61.23 ±
0.11 µg/mL - - -
32 Tabla 4.1 (continuación). Evaluación de la actividad antioxidante de Lavandula Angustifolia. Fuente: elaboración propia.
Referencia Zona
Parte de la planta /
Origen
Pretratamiento Metodología de
extracción DPPH ABTS FRAP Fenoles
totales Otros métodos
(Yang et al., 2010)
Tasmania (Australia)
Aceite esencial obtenido de
Skinmate (Corea)
- Destilación a
vapor 93.4 ± 1.55% 35,4 ±
2.54% - -
Actividad antioxidante en el sistema del ácido linoleico: Mayor
inhibición (58,2%) después de 10 días (Avsar et al.,
2018)
Mersin (Turquía)
Planta
completa Secado al aire Extracción con
CO2 supercrítico 40.9% - - - -
(Smigielski et al., 2018)
Wielkopolska (Polonia)
Flores y partes aéreas
Secadas durante 3 semanas a
25ºC
Hidrodestilación durante 4 horas
Flores:
IC50=22.11 ± 1.18 mg/mL
Partes aéreas:
IC50=75.42 ± 7.02 mg/mL
- - - -
Sometidas directamente a
extracción
Flores:
IC50=76.22 ± 9.47 mg/mL
Partes aéreas:
IC50=77.11 ± 7.29 mg/mL
- - - -
33 Tabla 4.1 (continuación). Evaluación de la actividad antioxidante de Lavandula Angustifolia. Fuente: elaboración propia.
Referencia Zona
Parte de la planta/
Origen
Pretratamiento Metodología
de extracción DPPH ABTS FRAP Fenoles
totales Otros métodos
(Ertürk et al., 2020)
Estambul (Turquía)
Aceite esencial adquirido
de Foodstuffs
Istanbul, Turkey
- Prensado en
frío 2.48%
22.62 µmol Trolox/g
aceite (equivalentes
Trolox)
15.21 µmol Trolox/g
aceite (equivalentes
Trolox)
- -
(Viuda- Martos et al., 2011)
El Cairo (Egipto)
Planta
entera - Hidrodestilación
durante 3h
52.05 ± 0.00%
IC50=48.7 g/L
-
Máx. 0.31 mmol/L
Trolox
140.33 ± 2.36 GAE/(mg/mL)
TBARS:
52.52%
EC50=34.92 g/L
(Marín et al., 2016)
Valencia (España)
Flores y
planta Secado Hidrodestilación IC50=31.30
g/L -
Máx.0.24 ± 0.01 mmol/L
Trolox (50g/l AE)
137.52 ± 38.3 GAE/(mg/L)
TBARS: 61.52 ± 0.21%
(Hamad et al., 2013)
Shaqllawa
(Iraq) Flores - Hidrodestilación
durante 6h
IC50=216
µg/mL - - -
(Hui et al.,
2010) China Partes
aéreas
Secado en horno a 30ºC
Destilación a vapor durante
4h
- - - -
Actividad antioxidante en
el sistema del ácido linoleico:
87.9% (4 mg/mL AE)
