UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Bioquímica del olivo:
triterpenos pentacíclicos
Alumno: Isabel María Fernández León
Julio, 2014
Facultad de Ciencias Experimentales
Facultad de Ciencias Experimentales
UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Bioquímica del olivo:
triterpenos pentacíclicos
Alumno: Isabel María Fernández León
Julio, 2014
Índice:
1. Resumen ... 1
2. “Abstract” ... 3
3. Introducción ... 5
4. Objetivos ... 12
5. Material y métodos ... 13
5.1. Recogida de muestras ... 13
5.2. Extracción y análisis de los triterpenos pentacíclicos ... 13
5.3. Métodos para determinar la actividad biológica de los triterpenos ... 15
5.3.1. Cultivos celulares ... 15
5.3.2. Ensayo de proliferación celular ... 15
5.3.3. Estudios morfológicos ... 16
5.3.4. Detección de apoptosis ... 16
5.3.5. Análisis de citometría de flujo ... 17
5.3.6. Pruebas de invasividad y viabilidad celular ... 17
5.3.7. Modelos experimentales ... 18
6. Resultados y discusión ... 19
6.1. Localización y concentración de los triterpenos pentacíclicos en Olea europaea………. 19
6.2. Actividad biológica……… 27
6.2.1. Efectos anti-cancerígenos…………..……….. 27
6.2.2. Efectos sobre la diabetes…………...……….…. 34
6.2.3. Efectos sobre enfermedades cardiovasculares………. 37
6.2.4. Efectos en el tratamiento del dolor e inflamación……… 39
6.2.5. Efectos sobre la infección por VIH y parásitos……….. 42
7. Conclusiones ... 45
8. Bibliografía ... 46
ABREVIATURAS:
AM: ácido maslínico AO: ácido oleanólico AU: ácido ursólico EO: eritrodiol UO: uvaol
OS: (3S)-2,3-oxidoescualeno
LDL: lipoproteínas de baja densidad HDL: lipoproteínas de alta densidad
HPLC-MS: cromatografía líquida de alta resolución- espectrometría de masas HPLC-UV/vis: cromatografía líquida de alta resolución-ultravioleta-/visible GP: glucógeno fosforilasa
PI: ioduro de propidio MM: metil maslinato
IC50: concentración inhibitoria máxima media ID50: concentración infecciosa máxima media EC50: concentración efectiva máxima media TNF-α: Factor de necrosis tumoral α
IL-1β: interleucina-1β IL-6: interleucina-6 I-309: citoquina I-309
1. RESUMEN.
Los triterpenos pentacíclicos son metabolitos secundarios localizados ampliamente en numerosas especies del Reino Vegetal. Se trata de compuestos presentes en altas concentraciones en órganos y productos derivados del olivo, por tanto, muy abundantes en la dieta mediterránea. Nuestro estudio se basará fundamentalmente en los triterpenos encontrados en hojas, aceitunas y aceite de Olea europaea. Los triterpenos pentacíclicos presentan propiedades anti-tumorales, modulan el metabolismo glucídico y lipídico, propiedades cardiovasculares, anti- inflamatorias, anti-parasitarias, etc. Actualmente se encuentran en el punto de mira de múltiples estudios ya que, debido a su gran actividad biológica en diversos campos, están siendo considerados como productos naturales que pueden sustituir o complementar la acción de fármacos convencionales en el tratamiento de diversas patologías.
2. ABSTRACT.
Pentacyclic triterpenes are secondary metabolites widely localized in many species of the plant kingdom. These compounds are found in high concentration in organs and olive products, therefore, they are very abundant in the Mediterranean diet. Our study will be based on triterpenes found in leaves, olives and oil from Olea europaea. Pentacyclic triterpenes have anti-tumor properties, modulate lipid and glucose metabolism, cardiovascular properties, anti-parasitic, anti-inflammatory, etc.
They are currently in the focus of many studies since, due to its high biological activity in various fields, are being considered as natural products that can replace or supplement the action of conventional drugs in the treatment of various diseases.
3. INTRODUCCIÓN.
Las plantas medicinales han sido usadas desde hace cientos de años en muchas culturas como la China, Mexicana, Coreana o India. Todas estas culturas tenían en común el uso de partes o extractos de estas plantas medicinales con el fin de utilizarlos como fármacos en el tratamiento de personas o animales enfermos. En las últimas décadas se han realizado miles de estudios con el fin de encontrar nuevos beneficios a aquellas hierbas medicinales. De esta forma han surgido nuevos compuestos naturales con características muy preciadas farmacéuticamente para combatir enfermedades como la diabetes, el cáncer, así como procesos inflamatorios.
Los triterpenos pentacíclicos han sido identificados como uno de los principales componentes de las plantas medicinales utilizadas de forma tradicional y han mostrado, entre otros, efectos analgésicos, hepatoprotectores, antitumorales, anti-inflamatorios, antioxidantes y efectores del sistema inmune, tanto en su forma libre como formando conjugados denominados aglicanos.
Estos compuestos representan un amplio grupo de metabolitos secundarios en numerosas especies distribuidas ampliamente en el Reino Vegetal. Se trata de moléculas constituidas por 30 carbonos agrupados en ciclos de cinco o seis carbonos con diferentes sustituyentes.
Figura 1. Estructura de los compuestos triterpénicos más importantes: ácido oleanólico, ácido maslínico, ácido ursólico, eritrodiol y uvaol (Peragón et al. 2013; Wen et al. 2005).
Los triterpenos se sintetizan a través de la vía citoplasmática de acetato/mevalonato a partir del acetil-CoA, el cual se transforma en unidades de isopreno activo (Figura 2). La condensación de seis moléculas de isopreno activo y un precursor común, (3S)-2,3-oxidoescualeno (OS), da lugar a los triterpenos (Peragón et al. 2013). OS sirve como substrato de numerosas ciclasas OS como la β-amirina sintasa. Esta enzima cataliza la conversión de OS en β-amirina (12- oleanan-3b-ol), uno de los precursores más comunes de los triterpenoides. Esta β- amirina será el precursor del eritrodiol, ácido oleanólico y ácido maslínico. De igual forma, la α- amirina será el precursor del uvaol y el ácido ursólico (Stiti et al. 2007).
Figura 2. Ruta de biosíntesis de los principales Triterpenos pentacíclicos (Stiti et al. 2007).
De estos compuestos, los más estudiados, por encontrarse a una mayor concentración den los productos del olivo, son los ácidos oleanólico (AO), maslínico (AM) y ursólico (AU); y los alcoholes eritrodiol (EO) y uvaol (UO) (Figura 1).
El primer compuesto que se forma a partir de la β-amirina es el eritrodiol (12–
oleanano-3b,28–diol, C30H50O2). Este compuesto, cuya masa molecular es 442,7 es
el precursor de los triterpenos pentacíclicos más importantes: ácido maslínico y ácido oleanólico.
El ácido oleanólico, (ácido 3β-hidroxi-olea-12-en-28-oico C30H48O3,). Un compuesto de 5 anillos de seis carbonos cuyo peso molecular es 456,7 Da que se caracteriza por presentar un grupo carboxilo en el carbono 28 y un grupo hidroxilo en el carbono 3.
El ácido maslínico (ácido (2α,3β)-2,3-dihidroxiolean-12-en28-oico, C30H48O4) es un compuesto de 5 anillos de seis carbonos que posee dos sustituyentes hidroxilo en los carbonos 2 y 3, así como un grupo carboxilo en el carbono 28 y un doble enlace sobre los carbonos 12-13. Se trata de un ácido con nueve centros asimétricos, una masa molecular de 472,67 Da y un punto de fusión de 269-271ºC (Wen X et al. 2005).
Por otro lado, a partir de la α-amirina, se obtiene otra serie de compuestos de gran interés. El primero de ellos es el uvaol (2-Ursan-3-beta,28-diol, C30H50O2), con una masa molecular de 442,7. El uvaol es el precursor del ácido ursólico (ácido 3- beta-3-hidroxi-ursan-12-en-28-oico, C30H48O3 ) con una masa molecular de 456,70.
Este estudio se ha centrado principalmente en Olea europea ya que representa un papel importante en la dieta Mediterránea característica de países como España, Francia, Italia, Grecia, Marruecos, etc. Olea europea es una especie mediterránea adaptada al clima de la zona que ha sido cultivada desde hace décadas y utilizada como planta medicinal gracias a sus propiedades.
Figura 3. Aceite, aceitunas y hojas de Olea europaea (http://mejorconsalud.com/aceite-de-oliva-lo-mejor-de-la-dieta-mediterranea/).
Tanto en las hojas como en las aceitunas y el aceite de oliva se pueden encontrar una gran variedad de compuestos triterpénicos. En las aceitunas y las hojas podemos encontrarlos en forma libre o esterificados con ácidos grasos.
Mientras que en el aceite de oliva virgen y en el orujo se encuentran estos compuestos en la fracción insaponificable (Rodriguez-Rodriguez et al. 2006).
Los triterpenos son compuestos que se encuentran en gran abundancia en la piel del fruto de Olea europaea, protegiendo su integridad frente a insectos y agentes antimicrobiológicos. EL compuesto que aparece a mayor concentración en las aceitunas es el ácido maslínico seguido del ácido oleanólico (Guinda et al. 2010;
Peragón et al. 2013) Ambos componentes se localizan únicamente en el epicarpo del fruto en una concentración significativamente menor que en las hojas.
El consumo de aceitunas de mesa y de aceite de oliva está generalizado en la región mediterránea, siendo una importante fuente de compuestos con muchas propiedades biológicas. Sin embargo, tras el procesado de las aceitunas, los niveles de ácido maslínico y ácido oleanólico descienden considerablemente (Romero et al.
2010; Peragón et al. 2013).
A diferencia de lo que ocurre en el fruto, en la hoja de olivo, el ácido triterpénico más abundante es el ácido oleanólico seguido de ácido maslínico y unos niveles menores de eritrodiol, ácido ursólico y uvaol (Guinda et al. 2010; Peragón et al. 2013). La abundancia de estos compuestos así como sus perfiles varía con la ontogenia de la hoja.
El aceite de oliva virgen es un producto típico de las zonas mediterráneas siendo ampliamente utilizado en la dieta típica mediterránea. Según estudios (Allouche et al. 2009), los triterpenos más abundantes del aceite de oliva virgen son el ácido maslínico y el oleanólico, aunque también se encuentra eritrodiol en cantidades traza en algunas variedades de olivar. Según este estudio, la proporción de estos compuestos está determinada genéticamente según cada especie. De esta forma mediante un análisis químico se puede caracterizar el aceite de oliva virgen monovarietal.
El orujo es un subproducto obtenido tras la maceración de las aceitunas durante su procesado hasta aceite. Contiene fundamentalmente la pulpa de las aceitunas y el hueso. Este subproducto contiene mayor concentración de ácidos triterpénicos y alcoholes que el aceite de oliva virgen. De hecho las concentraciones
de estos compuestos son un indicativo de la pureza del orujo (Rodriguez-Rodriguez et al. 2006).
Los triterpenos se han convertido en el punto de mira de numerosas investigaciones ya que son unos compuestos con un gran potencial farmacéutico gracias a sus propiedades biológicas y terapéuticas. Años atrás se han utilizado como remedios caseros frente a diversas enfermedades pero estudios recientes corroboran estos efectos sobre la salud. En la Figura 4 se muestran los principales efectos sobre la salud que presentan los triterpenos:
Figura 4. Principales propiedades funcionales de los triterpenoides del olivo y mecanismos fundamentales sobre los que actúan. Esta figura resume todos los mecanismos en los que están implicados los triterpenos (Rodriguez-Rodriguez et al. 2006).
Los triterpenos tienen propiedades beneficiosas para la salud y la prevención de enfermedades, entre ellas destacan sus efectos antioxidantes (Montilla et al.
2003; Perona et al. 2005) suprimiendo la generación de aniones superóxidos (Leu et al. 2004), la capacidad de protección frente a enfermedades hepáticas, ulceras, VIH, obesidad, diabetes, hiperlipidemia, aterosclerosis, etc. Estudios realizados sobre el metabolismo de la glucosa y lípidos muestran que los triterpenos pentacíclicos tienen un efecto modulador en estos procesos. En estudios realizados por Wen et al.
2005, se demostró que los triterpenos producen una disminución de la concentración de glucosa en sangre de ratones inducidos a hiperglucemia. Otros artículos mostraron que el ácido maslínico poseía propiedades hipoglucemiantes (Jalil et al.
1986) e hipoinsulínicas (Liu et al. 2007. a, b) en modelos experimentales en ratones.
También Teodoro el at. 2008 publicó que el ácido oleanólico induce la secreción de insulina desde el páncreas. Por otro lado el ácido oleanólico y maslínico, pueden controlar los niveles de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y aumentar el nivel de lipoproteínas de alta densidad (HDL) en el metabolismo lipídico (Keys et al. 1986;
Willett, 1990). De esta forma se puede prevenir la hipertensión y la aterosclerosis.
Además, el ácido oleanólico y el ursólico producen una disminución de la resistencia a la insulina en modelos experimentales de rata (Somova et al. 2003).
Los triterpenos pentacíclicos también juegan un papel importante en el combate frente al cáncer. En los últimos años se han realizado numerosos estudios in vivo e in vitro sobre su acción anticancerígena frente a diversas células tumorales humanas. Diversos estudios muestran que tanto el eritrodiol como el ácido maslínico tienen una actividad anti-proliferativa, inducen a la apoptosis celular y además de una baja toxicidad frente a células de carcinoma colorrectal HT-29 (Reyes-Zurita et al. 2011; Juan et al. 2008). Por otro lado, ensayos con ácido oleanólico en células epiteliales tumorales HaCaT, (George et al. 2012), obtuvieron los mismos resultados que los obtenidos en los trabajos anteriormente citados.
A pesar de la amplia distribución de los triterpenos en el mundo vegetal, se encuentran pocos estudios sobre sus propiedades cardiovasculares (Rodriguez- Rodriguez et al. 2006). Sin embargo, el estudio de estas propiedades está en progreso. Los triterpenos poseen una actividad biológica en enfermedades cardiovasculares y son agentes químicos con un gran futuro en la prevención de dicha enfermedad. Estos compuestos tienen actividad vasodilatadora y anti-arrítmica así como efectos cardiotónicos. Estudios in vitro realizados en aorta de rata demuestran que estos compuestos presentan vasodilatación arterial en ratas hipertensas (Rodriguez-Rodriguez et al. 2008). Por otro lado, estudios in vivo realizados por Somova et al. en 2003 y 2004 demuestran que la administración intraperitoneal de ácido oleanólico en ratas previene el desarrollo de hipertensión en ratas. Este efecto puede ser atribuido a sus propiedades reguladoras en el metabolismo de lípidos y glucosa así como a su propiedad antioxidante.
Estos compuestos también tienen efectos beneficiosos frente a diversos síntomas generalizados en diversas enfermedades, por ejemplo el dolor y la inflamación. Numerosos estudios proponen diversos mecanismos de acción de los
triterpenos en la mediación de la inflamación. Safayhi y Sailer (1997); propusieron al ácido oleanólico como principal atenuador de la histamina liberada por los mastocitos en procesos inflamatorios. Lee et al (2004); han publicado un artículo sobre el efecto inhibidor del ácido oleanólico en el complejo del complemento en las respuestas inflamatorias. También Marquez-Martin et al. (2006), determinaron que el ácido oleanólico es un agente modulador de las citoquinas liberadas en procesos inflamatorios por los macrófagos. Todos estos efectos inhibidores de los triterpenos han sido también estudiados en diferentes modelos de inflamación en ratón obteniendo unos resultados positivos. Por otro lado, en relación a la respuesta al dolor de los compuestos triterpenoides, un estudio realizado por Nieto et al. en 2013, obtuvo unos resultados esperanzadores en modelos de ratón. Utilizó ácido maslínico para aliviar el dolor inducido con distintos químicos y obtuvo una respuesta satisfactoria.
Los triterpenos pentacíclicos tienen también propiedades antivirales y antiparasitarias. Estudios realizados por Herrera et al (2006) muestran la actividad inhibitoria del ácido oleanólico y el maslínico contra la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana. El equipo de Huang (2013) descubrió 5 nuevos triterpenos extraídos de Excoecaria acerifolia, todos ellos fueron analizados mediante espectrofotometría y mostraron una moderada actividad anti-VIH. De Pablos et al (2010), pusieron de manifiesto la actividad antiparasitaria del ácido maslínico frente a taquizoitos de Toxoplasma gondii. Los parásitos tratados con el ácido maslínico mostraron una mayor mortalidad y una alteración de su estructura debido a este compuesto. La inhibición de las proteasas por parte del ácido maslínico produjo una reducción de la infectividad de Toxoplasma.
Hipótesis y justificación del trabajo.
De todo lo expuesto se infiere que los compuestos triterpénicos presentes en órganos y productos del olivo tienen una importancia elevada en la fisiología de la planta y presentan importantes propiedades beneficiosas para la salud que deben ser conocidas y estudiadas para conseguir un mejor aprovechamiento y revalorización de productos como la aceituna de mesa o el aceite de oliva. Con este trabajo se pretende realizar una revisión e investigación bibliográfica para conocer el conjunto de nuevos experimentos, métodos y resultados relativos a: 1) la extracción,
análisis y presencia de los compuestos triterpénicos presentes en el olivo, así como 2) los conocimientos existentes sobre las nuevas propiedades biológicas de estos compuestos que los hacen beneficiosos para la salud y prevención de enfermedades. Se trata de compuestos naturales presentes en productos alimenticios básicos en nuestra alimentación, con un extraordinario potencial farmacéutico o terapéutico que se están utilizando como base para poder actuar sobre determinadas patologías. En los últimos años, es mucho el interés que están despertando y mucha la experimentación que se está realizando centrada en estos compuestos, se considera de mucho interés hacer un resumen de los principales descubrimientos obtenidos sobre ellos. El conocimiento de todo ello puede servir para conocer mejor y poner en valor productos como la aceituna de mesa o el aceite de oliva.
4. OBJETIVOS:
El objetivo del presente trabajo fin de grado es realizar un trabajo de revisión e investigación bibliográfica, a partir de artículos originales, para conocer de primera mano los compuestos triterpénicos pentacíclicos que se encuentran en los órganos y productos del olivo (ácimo maslínico -AM-, ácido oleanólico -AO-, ácido ursólico - AU-, eritrodiol -EO- y uvaol -UO-) así como las características de sus propiedades biológicas relacionadas con la salud y la prevención de enfermedades. Este objetivo general se puede concretar en los siguientes objetivos particulares:
1. Resumir el conocimiento actual sobre qué compuestos triterpénicos se encuentra presentes en los principales órganos del olivo y cómo cambia su concentración a lo largo del desarrollo, maduración o en respuesta a determinadas condiciones culturales o ambientales.
2. Resumir el conocimiento actual sobre las propiedades anti-cancerígenas del AM, AO, AU, EO y UO.
3. Resumir el conocimiento actual sobre los efectos cardio-circulatorios del AM, AO, AU, EO y UO.
4. Resumir el conocimiento actual sobre los efectos anti-diabéticos del AM, AO, AU, EO y UO.
5. Resumir el conocimiento actual sobre los efectos anti-parasitarios del AM, AO, AU, EO y UO
5. MATERIAL Y MÉTODOS.
5.1 Recogida de muestras.
Para realizar la extracción y la determinación de los triterpenos pentacíclicos el primer paso es diseñar un método experimental para recoger las muestras necesarias para nuestro ensayo. Los triterpenos se encuentran fundamentalmente en las hojas y en el epicarpo de las aceitunas, por tanto se deberán recoger estos dos componentes de Olea europaea.
Para determinar la variación del perfil de los distintos triterpenos durante la ontogenia de hojas y frutos, se realizarán tomas de muestras durante el periodo de maduración de las aceitunas. Para ver la ontogenia de las hojas bastará con realizar tomas de muestras de las hojas en diversas partes de las ramas: hojas pequeñas de la yema apical, hojas cercanas a la yema apical, hojas verde oscuro un poco más lejanas de la yema, hojas verdes oscura de las ramas y hojas adultas presenescentes (Guinda et al. 2010). De esta forma obtendremos muestras representativas de cada estadio ontogénico de ambas partes.
Para valorar la cantidad de compuestos triterpenoides en las aceitunas de mesa, es decir, después del procesado que sufren desde su recogida hasta su comercialización; se recogerán y se analizarán muestras de los distintos tipos de aceitunas que queremos medir directamente del olivo. Tras el procesamiento de las aceitunas de mesa, volvemos a medir los mismos valores para determinar su variación y su contenido. Obtenemos así la cantidad de triterpenos pentacíclicos que realmente ingerimos con nuestra dieta al consumir aceitunas de mesa.
Los triterpenos pentacíclicos también se encuentran en el aceite de oliva virgen refinado así como en el orujo. La determinación de estos compuestos también se puede llevar a cabo utilizando muestras de aceite de los distintos olivares.
5.2 Extracción y determinación de los triterpenos pentacíclicos.
Las hojas se lavan con agua destilada a temperatura ambiente y se secan en una estufa de vacío a 35ºC y una presión de 10 mm de Hg durante 24 horas.
Posteriormente se trituran y se extraen con hexano o etanol mediante dos procedimientos: en Soxhlet durante 6 horas o bien mediante maceración en 100 mL durante 48 horas (Guinda et al. 2002). El extracto de los triterpenos pentacíclicos se obtiene mediante la filtración de la disolución anterior.
Para la extracción de estos compuestos en las aceitunas se emplea una técnica similar a la descrita anteriormente. En este caso, las aceitunas se cortan y se deshuesan para proceder a su maceración completa. Se centrifugan con etanol o metanol y se separa la fase líquida de la sólida (Peragón et al. 2013).
Para obtener el extracto del aceite de oliva se realiza un procedimiento similar: la pasta de aceitunas se amasa durante 30 min a 28ºC y a continuación se centrifugan. Finalmente se deja decantar y se filtra (Allouche et al. 2009).
Figura 5. Esquema del procedimiento te extracción de los triterpenos
Una vez obtenidos los extractos necesarios se procede a la determinación de los triterpenos presentes en la muestra así como su cuantificación. Para ello se suelen utilizar dos técnicas similares: cromatografía líquida de alta resolución- ultravioleta-/visible (HPLC-UV/vis) o bien cromatografía líquida de alta resolución- espectrometría de masas (HPLC-MS). La cromatografía líquida es una técnica utilizada para separar componentes basándose en los diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna. La columna actúa como una fase estacionaria a través de la cual pasa una fase móvil mezclada con pequeñas cantidades inyectadas de la muestra a analizar. Los componentes de la muestra se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones físico- químicas que se produzcan con la fase estacionaria y la fase móvil.
Los resultados se pueden obtener de distintas formas acoplando un detector determinado a esta cromatografía. En el caso de la HLPC-UV/vis se utilizan detectores UV para medir la capacidad de absorción lumínica de cada sustancia.
Esta absorción es característica de cada compuesto y podemos diferenciarlos por los valores obtenidos. La HLPC-MS tiene acoplado un detector que nos informa de LAVAR CON
AGUA DESTILADA
SECAR AL VACÍO Y TRITURACIÓN
HPLC-UV/vis
HPLC-MS EXTRACCIÓN CON
ETANOL O HEXANO Y FILTRACIÓN
la masa molecular de cada compuesto que atraviesa la columna. Esta técnica confiere una gran fiabilidad ya que tiene una exactitud menor a 1 ppm, evitando de esta manera falsos positivos.
5.3 Métodos para determinar la actividad biológica de los triterpenos.
5.3.1 Cultivo celular.
Para realizar estudios de actividad biológica sobre células cancerígenas se utilizan cultivos celulares de líneas tumorales para estudiar su respuesta frente a un compuesto. Estudios de Reyes-Zurita et al. (2008) y Juan et al. (2008) utilizan células de carcinoma colorrectal HT-29. Estas células se obtienen de “American Type Culture Collections”. Se utiliza un medio de cultivo suplementado con un 10%
de suero fetal de ternera y 2nM de glutamina. Además se añadieron los antibióticos necesarios: 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron en una atmósfera humidificada con un 95% de aire y un 5% de CO2 a 37ºC. El medio de cultivo se retiraba cada dos días y se sustituía por medio de cultivo nuevo.
5.3.2 Ensayo de proliferación celular.
Para evaluar el efecto de los compuestos triterpénicos en la proliferación celular se utilizan cultivos celulares con una densidad celular de 5x103 células/pocillo en placas de 24 pocillos. Estos cultivos se incuban a 37 ºC hasta su completa adhesión durante 24 horas. El medio de cultivo es sustituido por medio fresco con concentraciones crecientes del extracto de triterpenos pentacíclicos. Se dejan incubar las placas durante 24, 48 y 72 horas para ver la variación de la proliferación celular con respecto al tiempo y la concentración de triterpenos.
El análisis se realiza con un lector multiplaca, para ello las células son lisadas con Triton X-100 al 1% en un medio isotónico de NaCl. Posteriormente el ADN se tiñe con SYTOX-Green. Este compuesto fluorescente tiene gran afinidad por las cadenas de ADN, al lisar las células el SYTOX-Green penetra hasta el núcleo y se obtiene una medida del ADN total. La fluorescescencia es medida con un lector multiplaca el cual muestra un valor total de células (Juan et al. 2008; George et al.
2012).
5.3.3 Estudios morfológicos.
El análisis morfológico se realiza con un procedimiento similar al anteriormente descrito. Se cultivan las células con una densidad similar a ensayo anterior y se introduce en el medio una concentración determinada de triterpenos. El cultivo se deja incubar durante 24, 48 y 72 horas a 37ºC. Posteriormente se pueden observar los cambios morfológicos que experimentan con respecto al control, para ello se utiliza un microscopio de contraste de fases a 20x aumentos (George et al.
2012).
5.3.4 Detección de apoptosis.
La detección de la apoptosis celular inducida por un compuesto se lleva acabo utilizando dos técnicas diferentes. Por una parte la apoptosis puede ser medida utilizando la actividad de la Caspasa-3. Se trata de una proteína que actúa como mediador esencial de la apoptosis celular o muerte programada. Para realizar un análisis utilizando esta técnica es fundamental obtener los extractos citosólicos de las células utilizadas ensayo. Anteriormente se expusieron las células a diferentes concentraciones de del extracto de triterpenos pentacíclicos a evaluar y se realizó una lisis celular con Triton. Las células lisadas se centrifugan a 2500xg durante 10 minutos obteniendo de esta manera los extractos citosólicos.
Posteriormente se añaden otros compuestos a la mezcla y substrato fluorescente de Caspasa-3. Mediante lector multiplaca se puede valorar la actividad de la proteína (Juan et al. 2008).
Por otro lado, el análisis de la apoptosis celular también se puede realizar mediante un análisis de ELISA (George et al. 2012). En este caso se utiliza un kit de ELISA para la fragmentación celular. Las células HaCaT, en densidad 1x105 células/ml, fueron marcadas con 10 µM de BrdU. 100 µL del cultivo celular marcado con BrdU fue tratado con distintas concentraciones de OA durante un periodo de 4 horas. Posteriormente las células se lisaron y se obtuvieron los fragmentos apoptóticos mediante centrifugación a 1500 rpm. El extracto anterior fue transferido a una microplaca con anti-DNA e incubado durante 90 min a 15-25 ºC.
Posteriormente el AND se desnaturalizó mediante la utilización de microondas y se añadió 100 µl de solución anti-BrdU-POD. Por último se añadió un sustrato coloreado, TMB. Los resultados se obtuvieron por espectrofotometría a 450 nm tras añadir la solución de parada de la reacción.
5.3.5 Análisis de citometría de flujo.
La citometría de flujo se utiliza como una herramienta para medir la ploidia del ADN asís como para medir las alteraciones del ADN en cada fase del ciclo celular, o el número de células que se encuentra en cada fase del ciclo. Para realizar esta técnica se cultivan las células en una densidad de 175 x 103 células/pocillo en un medio de cultivo adecuado y se incuban durante 24 horas a 37ºC. Posteriormente se tratan con distintas concentraciones crecientes del compuesto a analizar durante 72 o 96 horas. Tras una tripsinización celular y posterior tinción del ADN con ioduro de propidio (PI), se realiza una estimación mediante fluorescencia del número de células en cada fase del ciclo celular midiendo en un citómetro de flujo (Reyes-Zurita et al. 2011).
Figura 6. Equipo de citometría de flujo
(http://www.uam.es/cs/ContentServer/es/1242663063124/1242666607631/UA M_Laboratorio_FA/laboratorio/Laboratorio_de_Citometria_de_Flujo.htm)
5.3.6 Pruebas de invasividad y viabilidad celular.
Las pruebas de invasividad se utilizan fundamentalmente en ensayos con parásitos. De Pablos et al. (2010) estudió el efecto del ácido maslínico en la capacidad infectiva de Toxoplasma gondii. En este ensayo los taquizoitos de Toxoplasma fueron cultivados a diferentes concentraciones de ácido maslínico y posteriormente se pusieron en contacto con células Vero para ver su capacidad infectiva. Tras una incubación durante 24 y 48 horas a 37ºC se realizó una microscopía de luz para determinar el porcentaje de parasitismo por célula.
En este mismo trabajo se realizaron ensayos de motilidad del parásito tras aplicar el tratamiento con ácido maslínico. Se realizó un procedimiento similar al
anterior y se midieron y registraron las longitudes recorridas por los taquizoitos mediante microscopía confocal.
5.3.6 Modelos experimentales.
Los ensayos de la actividad biológica de diferentes compuestos también pueden ser evaluados mediante la utilización de modelos experimentales in vitro. En este caso se utilizan ratones a los cuales se inducen los factores que queremos evaluar mediante compuestos químicos o variaciones en su alimentación. Se trata de obtener una representación fiel de las enfermedades o características que presentaría un humano con el fin de testar nuevos fármacos o productos. En el campo de los ensayos de las características biológicas de los triterpenos pentacíclicos se han utilizado ratones en muchos trabajos para demostrar su eficiencia frente a diabetes, procesos inflamatorios, efectos cardiovasculares. En todos estos casos los ratones son inducidos químicamente a las distintas enfermedades y se analiza su progresión tras el uso de un determinado tratamiento.
De esta forma se puede ver de forma general en todo el organismo el mecanismo de acción de un producto determinado.
Para diabetes Mellitus tipo 2, se usaron ratones diabéticos inducidos siguiendo el protocolo publicado por Jalil et al. 1986, el cual se basa en la utilización de streptozotocina. También se utilizan ratones hipoglucémicos inducidos por adrenalina (Wen et al. 2005). Así mismo se utilizan modelos experimentales con dietas basadas en un alto contenido de colesterol para valorar la acción de los triterpenos pentacíclicos en el metabolismo lipídico y glucídico (Liu et al. 2007a,b).
Para testar la acción de compuestos como el ácido maslínico en estudios de nocicepción en ratones se utilizan modelos experimentales a los cuales se les induce mediante ácido acético, formalina o capsicina distintas fases de dolor (Nieto et al. 2013).
En diferentes estudios sobre los efectos cardiovasculares de los compuestos triterpénicos se utilizan ratones genéticamente hipertensos (Somova et al. 2003).
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
6.1 Localización y concentración de los triterpenos pentacíclicos en Olea europaea.
Los triterpenos pentacíclicos son compuestos que se pueden encontrar en gran cantidad en hojas y aceitunas de Olea europaea. Se trata de metabolitos secundarios sintetizados a partir de escualeno. A estos compuestos se les atribuyen propiedades defensivas y antibacterianas frente al ataque externo de las hojas y las aceitunas. Además tienen características beneficiosas para la salud como por ejemplo: anti-inflamatorias, anti-oxidantes, cardiovasculares, reguladores del metabolismo de la glucosa y los lípidos, anti-cancerígenas, etc.
Diferentes autores han estudiado y caracterizado la presencia de estos compuestos en diferentes muestras de olivo y en diferentes situaciones. En primer lugar, las hojas de Olea europaea contienen grandes cantidades de ácido oleanólico, seguido de una cantidad significativa de ácido maslínico y unos niveles menores de eritrodiol, ácido ursólico y uvaol (Guinda et al. 2010). En la Figura 7 se muestra un cromatograma típico de muestras de hoja.
Figura 7. Imagen del análisis cromatográfico de los triterpenos pentacíclicos en una hoja adulta: eritrodiol (1), uvaol (2), ácido oleanólico (3), ácido ursólico (4), ácido maslínico (5), y 18β-glycirrhetinic acid (IS) (Guinda et al. 2010).
En la Tabla 1 se muestra la proporción de cada uno de los compuestos encontrados en hojas adultas de tres olivares distintos. El AO representa un 3,00- 3,50% del peso seco de la hoja, el AM constituye el 0,5-0,75%, y el AU aproximadamente el 0,20-0,25% del peso seco. Además la tabla revela que el
contenido de estos componentes depende de la variedad de olivo que se analice. En este estudio la variedad Picual está caracterizada por presentar unos niveles de AM, AO y AU más elevados que el resto de variedades, sin embargo, la variedad Arbequina muestra concentraciones más altas de triterpenos dialcohólicos.
Tabla 1. Triterpenos pentacíclicos analizados en hojas adultas de olivares Picual, Hojiblanca y Arbequina (Guinda et al. 2010).
Los estudios realizados por Guinda et al. (2010) concluyen que en el proceso de ontogenia de las hojas, estudiada en la variedad Arbequina; las concentraciones de triterpenos varían durante su transcurso. En primer lugar el eritrodiol y el uvaol están ausentes en las primeras fases del desarrollo de la hoja (estadios 1 y 2), pero se detectan claramente en los estadios más tardíos a niveles de 1,5-2,0 mg/g. El ácido oleanólico, por otra parte, es el principal triterpeno presente en todos los estadios de la hoja y su concentración aumenta con la ontogenia. Las hojas más jóvenes presentan un contenido de 13,1±1,9 mg/g mientras que las hojas adultas muestran niveles 2,5 veces mayores. El ácido ursólico se puede medir en todos los estadíos, sin embargo no muestra modificaciones durante la ontogenia. Finalmente el ácido maslínico muestra una gráfica en forma de U con niveles de concentración altos durante las etapas jóvenes y las más adultas, 5,0 mg/g, Figura 8.
Estudios similares realizados por Peragón et al. (2013) muestran resultados similares obtenidos mediante el análisis de otras variedades de olivares.
Figura 8. Evolución de triterpenos pentacíclicos en las hojas de la variedad Arbequia durante su ontogenia. Representa los 5 estadios de maduración estudiados (Guinda et al. 2010).
Por otra parte, en las aceitunas, los triterpenos están exclusivamente localizados en el epicarpo en concentraciones 30 veces menores que en las hojas.
En este caso, el principal compuesto es el ácido maslínico y sólo está acompañado por el ácido oleanólico (Guinda et al. 2010). En la Figura 9 se muestra el análisis realizado por Guinda et al. (2010) en las diferentes partes de la aceituna, exactamente en la variedad Arbequina. Los triterpenos únicamente se detectaron en el análisis del fruto entero y en el análisis del epicarpo, siendo las únicas medidas obtenidas las del ácido maslínico y el ácido oleanólico. En los análisis de del mesocarpo y de la semilla no se detectó ningún triterpeno.
Durante la maduración de las aceitunas se produce una disminución del contenido de triterpenos presentes en el fruto. En la Tabla 2 se observa el cambio producido en la concentración de triterpenos durante la maduración de la aceituna en tres olivares distintos: Picual, Hojiblanca y Arbequina. El contenido de triterpenos en las aceitunas depende del estado de desarrollo en que se encuentre el fruto. En el trascurso entre la aceituna verde y la negra, los triterpenos disminuyen en un 20%, tanto el ácido maslínico como el oleanólico. También, el balance entre AM y AO depende del olivar analizado. En las variedades Picual y Hojiblanca, los niveles de maslínico fueron 2,5 veces mayores que los de ácido oleanólico. Sin embargo, en el caso de Arbequina, el balance AM/AO fue a razón de 4,0 (Guinda et al. 2010).
Figura 9. Cromatografía en columna de gas de los triterpenos pentacíclicos analizados en las distintas partes de aceitunas Arbequina: (A) aceituna entera, (B) epicarpo, (C) mesocarpo y (D) semilla. (3) Ácido oleanólico y (5) ácido maslínico (Guinda et al. 2010).
Tabla 2. Triterpenos pentacíclicos detectados en aceitunas Picual, Hojiblanca y Arbequina (Guinda et al. 2010).
La concentración de triterpenos disminuye también durante el procesado de las aceitunas de mesa. Estudios de Romero et al. (2010) mostraron que los niveles de triterpenos en aceitunas de mesa comerciales oscilaban entre 460 hasta 1470 mg/kg. Esto se debe a que la solución de NaOH utilizada durante el procesado de las aceitunas de mesa reducía la concentración de estos compuestos. Aceitunas negras de mesa, no tratadas con NaOH, muestran valores más elevados de 2000 mg/kg. En la Figura 10 se muestra la concentración de OA y AM de distintas variedades de aceitunas destinadas a ser procesadas para el consumo. La concentración de maslínico y oleanólico varía entre 1500 hasta 3000 mg/kg, siendo el oleanólico el componente en mayor concentración.
Figura 10. Concentración de ácidos triterpénicos de varias variedades de aceituna cruda destinada a aceitunas de mesa. Las barras indican la desviación estándar (Romero et al. 2010).
En las Figuras 11 y 12 se puede apreciar cómo disminuye la concentración de triterpenos según los dos estilos de procesado español: aceitunas verdes y aceitunas negras respectivamente.
Figura 11. Concentración de triterpenos ácidos en las diferentes soluciones generadas durante el procesado español realizado a aceitunas verdes de las variedades Manzanilla, Hojiblanca y Gordal (Romero et al. 2010).
Por otra parte, Allouche et al. (2009) realizaron un estudio sobre 40 olivares para determinar la composición de triterpenos pentacíclicos (Uvaol, Eritrodiol, Oleanólico, Maslínico y Ursólico) en el aceite de oliva virgen. El análisis de los dialcoholes triterpénicos mostró que los cultivos presentaban una concentración de eritrodiol y uvaol en un rango de 8,15 hasta 85,05 mg/kg, siendo el primero el más abundante con una representación del 78% del total. Su concentración está determinada dentro de un rango de 5,89 hasta 73,78 mg/kg, mientras que la concentración de uvaol oscila entre 1,50 hasta 19,35 mg/kg. Los diferentes cultivos fueron establecidos en 5 grupos según su concentración de eritrodiol, Tabla 4.
Figura 12. Concentración de triterpe- nos ácidos en las diferentes soluciones generadas durante el procesado español de aceitunas blancas de las variedades Manzanilla y Hojiblanca (Romero et al. 2010).
Tabla 4. Composición de dialcoholes triterpénicos en aceite virgen de oliva de 40 cultivos diferentes (Allouche et al. 2009)
El análisis del contenido en ácidos triterpénicos estableció al ácido ursólico como el componente presente en la mayoría de los aceites como elemento traza, llegando incluso a no encontrarse en algunas variedades. El ácido oleanólico y el
maslínico se encuentran en grandes cantidades en el aceite virgen siendo el oleanólico el más abundante en la mayoría de los casos, Tabla 5 (Allouche et al.
2009).
Tabla 5. Composición de ácidos triterpénicos en aceite virgen de oliva de 40 cultivos diferentes (Allouche et al. 2009)
Los datos obtenidos muestran la composición de dialcoholes triterpénicos y ácidos en los aceites de oliva virgen de diferentes variedades de olivo, así como las diferencias entre las muestras de aceite de los distintos olivares, todos ellos crecidos bajo las mismas condiciones climáticas y las mismas prácticas agrícolas, así como el
mismo protocolo de extracción. Se concluye que la variabilidad observada en el aceite de oliva en cuanto a la composición de los triterpenos es debida a factores genéticos. Además la aplicación de métodos quimiométricos muestra que los componentes triterpénicos son capaces de discriminar entre el aceite de los distintos olivares y pueden ser considerados como una herramienta para evaluar el aceite de oliva virgen (Allouche et al. 2009).
6.2 Actividad biológica.
6.2.1 Efectos anti-cancerígenos.
Como ya se ha comentado anteriormente, los triterpenos pentacíclicos tienen propiedades biológicas relacionadas con la salud. Es el caso de numerosos estudios realizados para comprobar y validar la capacidad antitumoral de estos compuestos
Juan et al. (2008) y Reyes-Zurita et al. (2011) realizaron estudios similares sobre la actividad del eritrodiol y el ácido maslínico como agentes antitumorales en células humanas de carcinoma colorrectal HT-29.
Los estudios realizados por Juan et al (2008) determinaron en primer lugar que el eritrodiol no tenía un efecto citotóxico para las células. A concentraciones de 100µM un 94,5 ± 3.0% de las células eran viables. Sin embargo, a concentraciones superiores, a 150 µM, el número de células descendía a 86,3 ± 0,6% y a concentraciones de 300 µM descendía hasta 75,6 ± 1,4%, Figura 13.
Figura 13. Efectos del eritrodiol en la necrosis celular en HT-29 (Juan et al. 2008).
La actividad inhibitoria del crecimiento celular producida por el eritrodiol fue determinada exponiendo las células HT-29 a diferentes concentraciones durante 72 horas. El crecimiento celular fue completamente inhibido a concentraciones
superiores a 100 µM. Como se pude observar en la Figura 14, la concentración de eritrodiol que causa el 50% de la inhibicion del crecimiento celular (IC50) fue determinada a una concentración de 48,8 ±3,7 µM.
Figura 14. Efecto del eritrodiol en la proliferación de células HT-29 (Juan et al. 2008)
Por último se realizó un ensayo fluorogénico para determinar si la disminucion en el crecimiento celular observada en el tratamiento celular con eritrodiol era resultado del aumento de la apoptosis en células HT-29. Se utilizó la actividad Caspasa-3 como enzima diana para la vía apoptótica ya que se trata de un marcador de meurte celular programada. El eritrodiol ejerció una actividad pro- apoptótica dependiente de la dosis en células HT-29 con incrementos de 3,2-, 4,8- y 5,2- en las células control a concentraciones de 50, 100 y 150µM respectivamente, Figura 15.
Figura 15. Actividad caspasa-3 dosis-dependiente en células HT-29 (Juan et al. 2008).
Los estudios realizados por Reyes-Zurita et al. (2011) muestran resultados similares. En este caso el compuesto utilizado para analizar su actividad anti-tumoral fue el ácido maslínico. En primer lugar se determinó la integridad del ADN a distintas concentraciones de AM en células HT-29. Se realizaron 2 ensayos con concentraciones IC50 e IC80 y se midio los resultados a 24, 48 y 72 horas (Figura 16).
Tras 48h a concentración IC50, la mortalidad celular se incrementó al menos 6 veces.
Figura 16. Resultados observados tras el tratamiento con ácido maslínico en células HT-29 (Reyes-Zurita et al. 2011).
A la luz de la inhibición en la proliferación celular causada por el AM en trabajos anteriores, (Reyes et al. 2006); se investigó su efecto en el ciclo celular viendo la proliferación y la proporción de células en las diferentes fases del ciclo celular en 72 y 96 horas. Los resultados mostrados por los histogramas de ADN realizados revelaron que el AM induce un incremento dosis-dependiente del número de células en la fase G0/G1 con un máximo en IC80 (21,4±6,0%). Este incremento está acompañado de un descenso del porcentaje de proliferación celular de 17,7±5,4% en la fase S y de 3,3±1,4% en la fase G2/M. A concentración IC50 el incremento en la fase G0/G1 fue de 12,5±5,1% y el descenso en fase S fue de 9,4±4,4% y 3,7±1,1% en la fase G2/M, Figura 17.
Figura 17. Resultados observados tras el tratamiento con ácido maslínico en células HT-29 en las distintas fases del ciclo celular (Reyes-Zurita et al. 2011).
La actividad anti - tumoral de ácido maslínico podría ser producida a través de la apoptosis mediada por p53 actuando sobre los principales componentes de señalización que conducen al aumento de la actividad de p53 y la inducción del resto de los factor que participan en la vía apoptótica. Se encontró que, en las células HT29, el ácido maslínico activa la expresión de c –Jun Quinasa NH2 -terminal (JNK), induciendo así a p53 . El tratamiento de células tumorales con ácido maslínico también da lugar al incremento en la expresión de Bax y Bid , represión de Bcl - 2 , la liberación de citocromo C y el aumento de la expresión de caspasas -3 , -9 , y -7 . Además, el ácido maslínico produjo una actividad tardía de la caspasa -8, amplificando así la señalización apoptótica mitocondrial inicial. Para analizar la actividad de todos estos compuestos se realizó un Western blot para cada enzima a distintas concentraciones de AM (IC50, IC80) trascurridas 72 horas, Figuras 18 y 19.
Figura 18. Resultados obtenidos tras realizar un western blot a JNK (A), P53 (B) y Bid (C),, (Reyes-Zurita et al. 2011).
Figura 19. Resultados observados tras realizar un western blot a Bax (A), Bcl-2 (B) y citocromo-c (C (Reyes-Zurita et al. 2011).
Por otra parte, George et al. (2012) realizó un ensayo con ácido oleanólico sobre queratinocitos inmortalizados, HaCaT. En este caso se realizaron estudios para ver la actividad antioxidante del AO. Los estudios se realizaron con DPPH, un tipo de radical libre que cuando acepta un electrón o un hidrogenión se transforma en una molécula magnéticamente estable. Los datos mostraron que el AO tiene un moderado potencial de captación de radicales, a concentración de 200 µM se obtuvo un 28,82% de captación, Figura 20.
Figura 20. El AO muestra un moderado potencial de captación de radicales libres dosis-dependiente.
Se midió la viabilidad celular a 450 nm a diferentes concentraciones de AO tras 24, 48 y 72 horas. Como muestra la Figura 21, el AO muestra una moderada toxicidad en las células HaCaT. A la mayor concentración de AO, 200 µM, se obtuvo una toxicidad del 26.2% a las 72 horas de incubación.
Figura 21. Citotoxicidad del ácido oleanólico en células HaCaT estimada mediante ensayos XTT tras 24, 48 y 72 horas de incubación (George et al. 2012)
Por último, la muerte celular se caracteriza por cambios en la morfología así como la destrucción de la membrana, la condensación de los cromosomas, formación de cuerpos apoptóticos, etc. La exposición de las células HaCaT a la mayor concentración de AO mostró cambios en la morfología de la membrana celular así como un descenso del número de células. La apoptosis se midió mediante un análisis de fragmentación de ADN con ELISA a 450 nm. Como se puede observar en la Figura 22, el ácido oleanólico muestra una inducción a la apoptosis celular dosis-dependiente.
Figura 22. Inducción a la apoptosis en células HaCaT mediante la exposición a ácido oleanólico. En ensayo fue realizado mediante análisis de fragmentación de ADN usando el método ELISA (George et al. 2012).
6.2.2 Efectos sobre la diabetes.
Diabetes Mellitus tipo 2 es una enfermedad crónica caracterizada por altos niveles en sangre de glucosa que puede estar producida por que la producción de insulina pancreática es insuficiente o por la existencia de una resistencia a la acción de la insulina.. La hiperglucemia causa numerosas enfermedades mico y macrovasculares a diferentes órganos, incluyendo ojos, riñones, corazón y cerebro.
Además, este tipo de diabetes está asociado con una significativa mortalidad y morbilidad.
Según Wen et al. (2005), los triterpenos producen una disminución la concentración de glucosa en sangre en ratones inducidos a hiperglucemia mediante la utilización de adrenalina. En este estudio se utilizó dos compuestos distintos:
ácido maslínico y ácido corosólico. Éste último compuesto es un principio activo localizado en el extracto de una planta denominado Glucosol, el cual se ha comercializado en Japón y Estados Unidos ya que reduce los niveles de glucosa en sangre y ayuda en la pérdida de peso. Tiene una estructura similar al ácido maslínico, Figura 23.
Figura 23. El compuesto 1 corresponde a la representación del ácido corosólico y el compuesto 2 al ácido maslínico (Wen et al. 2005).
La glucógeno fosforilasa (GP) es la primera enzima que cataliza la degradación del glucógeno y juega un papel importante en el control del metabolismo de la glucosa. La GP del hígado es la principal enzima que controla la producción de glucosa hepática y su inhibición puede ser un enfoque terapéutico útil para la diabetes tipo 1 y 2, así como para la prevención de enfermedades vasculares y tumores (Wen et al. 2005). Este estudio midió la capacidad de inhibición de la GP en el hígado de ratón y en el músculo esquelético en conejos ya que ambas enzimas son bastante similares.
La actividad de la enzima se midió a través de la detección de la liberación de fosfato a partir de glucosa-1-fosfato. El ácido corosólico (IC50=20µM) y el ácido maslínico (IC50=28µM) mostraron una moderada actividad inhibitoria de la GP en el músculo de conejo. Estos resultados fueron 4 veces mayores que los resultados obtenidos mediante la utilización de cafeína (IC50=114µM), Figura 24. Así mismo, en los ensayos realizados con la GP hepática fueron similares, el ácido corosólico y el ácido maslínico obtuvieron un IC50 de 101µM y 99µM respectivamente. La cafeína resultó ser un inhibidor 6 veces menos potente que los compuestos anteriores (IC50=648µM), Figura 25. Otros estudios, como los realizados por Jalil et al. (1986), ya habían expuesto anteriormente el efecto hipoglucemiante del ácido maslínico.
Figura 24. Inhibición de la GP en músculo en conejo producido por ácido corosólico (Cuadrado), ácido maslínico (rombo) y cafeína (triangulo), a distintas concentra- ciones de cada compuesto (Wen et al. 2005).
Figura 25. Inhibición de la GP hepática en ratón producido por ácido corosólico (Cuadrado), ácido maslínico (rombo) y cafeína (triangulo), a distintas concentraciones de cada compuesto (Wen et al. 2005).
Un estudio realizado por Liu et al. (2007) obtuvo resultados más concretos sobre el efecto hipoglucemiante en ratones KK-Ay, un animal modelo genético de la diabetes tipo 2. En este caso se realizaron dos estudios distintos. En primer lugar se administró a los ratones oralmente distintas concentraciones de AM (3, 10 y 30 mg/kg) disueltas en disolución CMC-Na. Posteriormente se tomaban muestras de sangre trascurridas 2, 4 y 7 horas para determinar la glucosa en sangre. En la Figura 26 se puede observar que, a concentraciones de 10 y 30 mg/kg, la glucosa en sangre se reduce considerablemente tras la administración del tratamiento. Además a concentración 30 mg/kg los niveles de glucosa a las 4 y 7 horas después del tratamiento disminuyen considerablemente a comparación con los ratones control, sin tratamiento.
Figura 26. Efectos del tratamiento con AM en las concentraciones de glucosa en sangre en ratones KK-Ay , una sola dosis (Liu et al. 2007).
Por otro lado los ratones fueron tratados con AM por vía oral (10, 30 mg/kg), una dosis de la solución durante dos semanas. Al igual que en el caso anterior se obtuvieron muestras de sangre para determinar la concentración de glucosa cada semana. Como se muestra en la Figura 27, los ratones muestran una disminución de la glucosa en sangre tras una o dos semanas de tratamiento.
Figura 27. Efectos del tratamiento con AM en las concentraciones de glucosa en sangre en ratones KK-Ay, una dosis al día durante dos semanas (Liu et al. 2007).
Tras analizar la respuesta a la administración del AM tras su administración y durante el transcurso del tratamiento durante dos semanas, se comprobó su capacidad hipoglucémica. El ácido maslínico puede ser una gran promesa para el tratamiento de la diabetes tipo dos debido a que se trata de un agente natural.
6.2.3 Efectos sobre enfermedades cardiovasculares.
Liu et al. (2007) examinó los efectos terapéuticos de los triterpenos pentacíclicos: ácido oleanólico y ácido maslínico, en la hiperlipidemia en modelos de ratas con una diete rica en colesterol. Las ratas inducidas a hipercolesterolemia presentaban un 92% de TG, 838% de TC, 265% de HDL y un 2594% de LDL a comparación del grupo de ratas con dieta normal, control. Estos modelos fueron suplementados por AM y AO (100 mg / kg peso corporal / día) durante 15 días y se obtuvieron los resultados representados en la Tabla 6 Como se puede observar, tras el tratamiento los niveles de todos los compuestos fueron reducidos en más del 50%.
Tabla 6. Efectos del tratamiento con AM y OA en ratas control e inducidas a hiperlipidemia durante 15 días (Liu et al. (2007).
La oxidación de ácidos grasos es una de las principales fuentes de energía metabólica en los seres humanos, sin embargo, el excesivo consumo de estos compuestos puede conducir hiperlipidemia resultando en las complicaciones de la enfermedad vascular (Saleh et al. 1999). Los triterpenos pentacíclicos pueden ser unos agentes prometedores en la regulación de la lipidemia evitando la aterosclerosis y, por tanto, numerosas enfermedades cardiovasculares (Liu et al.
(2007).
Además, los triterpenos pentacíclicos poseen efectos cardiotónicos y anti- arrítmicos. Somova et al. (2004) utilizaron ácido oleanólico, ácido ursólico, uvaol y metil maslinato (MM). El experimento se llevó a cabo usando modelo de ratas para valorar la actividad de estos compuestos. Estas ratas fueron anestesiadas usando 40 mg/kg de peso corporal de Tiopental de sodio. Se logró una respiración mecánica de las ratas mediante la introducción de una cánula traqueal y un respirador para rodeores. Se indujeron a cada rata 0,2 ml por 100g de peso de un fármaco sintetizado a partir de los triterpenos y se realizó un electrocardiograma para ver su efecto. Estos compuestos mostraron una baja toxicidad así como un efecto vasodepresor dosis-dependiente que dura más de 60 min con un máximo a los 20 min de la aplicación (Tabla 7). La LC50 fue 0.50, 0.95 y 1.10 mg/ml respectivamente.
Tabla 7. Cambios en el ritmo cardiaco y presión arterial tras la aplicación intraperitoneal de diferentes dosis de ácido oleanólico, ursólico, metil maslinato y uvaol (Somova et al. 2004)
Se comprobó que el AO y el MM actuaban como antagonistas β-adrenérgicos bloqueando el efecto de la adrenalina y la isoprenalina. Los efectos anti-arrítmicos fueron evaluados en arritmias inducidas químicamente por adrenalina y CaCl2 así como en arritmias por isquemia-reperfusión. El AO y el AU muestran efectos anti- arrítmicos en ambos tipos de arritmia química y el AO y UV muestran los mismos efectos en dosis de 40mg/kg en la arritmia por isquemia-reperfusión.
6.2.4 Efectos en el tratamiento del dolor e inflamación.
Los síntomas de la inflamación (enrojecimiento, edema, calor, dolor, y la función del tejido alterado) son el resultado de complejos procesos fisiopatológicos que incluyen aumento del flujo sanguíneo y la permeabilidad vascular, la activación de mecanismos de defensa humoral y celular, sensibilización y activación de los nociceptores. Estos procesos están mediados por una variedad de señales moleculares producidas por mastocitos, macrófagos, granulocitos, plaquetas, linfocitos, terminaciones nerviosas, células endoteliales, etc,
Márquez-Martin et al (2006) determinó que el ácido oleanólico es un agente modulador de las citoquinas liberadas en procesos inflamatorios por los macrófagos.
Para ello utilizó cultivos de células sanguíneas periféricas mononucleares estimuladas para ensayar la actividad biológica de los triterpenos frente a la inflamación. Se obtuvo sangre de voluntarios sanos y se trataron con diferentes concentraciones (10-100µM) de eritrodiol, uvaol, ácido maslínico y ácido oleanólico.
Posteriormente los cultivos fueron analizados midiendo TNF-α, IL-1β, IL-6 y I-309 usando kits ELISA. Se observó que el ácido oleanólico producía una inhibición dosis-dependiente de IL-1β. Por otro lado el ácido maslínico y el uvaol no afectaban significativamente a la liberación de la citoquina. Sin embargo, el eritrodiol era el compuesto que mostraba una mayor inhibición a la liberación de esta citoquina, Figura 28.
Se obtuvieron efectos similares respecto a TNF-α, IL-6 y I-309 en los cuales el efecto del ácido oleanólico siempre era bastante significativo. Los datos obtenidos en el análisis de TNF-α mostraron una gran inhibición por parte del AO y el uvaol.
Por otra parte, los resultados obtenidos tras el análisis determinaron una fuerte inhibición tras la aplicación de uvaol, eritrodiol y AO, Figura 29.
Figura 28. Inhibición de IL-1β producida en células sanguíneas periféricas mononucleares por uvaol (UV), eritrodiol (ER), ácido oleanólico (OA) y ácido maslínico (MA), (Márquez-Martin et al 2006)
Figura 29. Inhibición de IL-1β producida en células sanguíneas periféricas mononucleares por uvaol (UV), eritrodiol (ER), ácido oleanólico (OA) y ácido maslínico (MA), (Márquez-Martin et al 2006)
También se han realizado estudios sobre la nocicepción en ratones tras realizar un tratamiento con ácido maslínico. La administración sistémica del ácido maslínico reduce el dolor inducido por el ácido acético así como la fase inflamatoria
del dolor inducido por formalina en modelos experimentales de ratón (Nieto et al.
2013).
Los efectos de la administración sistémica AM fueron evaluados usando dos test de inducción al dolor: contorsiones inducidas por el ac acético y la prueba de la formalina. La administración intraperitoneal de ácido acético induce la inflamación visceral y somática de los tejidos induciendo la respuesta al dolor en forma de contorsiones. El tratamiento sistémico con AM inhibe un 60% de las contorsiones ocasionadas por el compuesto. En la Figura 30 se muestra una gráfica donde se puede observar el efecto del AM a distintas concentraciones. También se compara con el experimento control realizado con Ibuprofeno.
Figura 30. Efectos de la administración sistémica de ácido maslínico en modelos experimentales de ratón químicamente inducidos al dolor mediante una inyección intraperitoneal de ácido acético (Nieto et al. 2013).
Con una inyección intraplantar de formalina se inducen repuestas bifásicas nociceptivas (lamer la pata trasera). La primera fase es consecuencia de la estimulación directa de los nociceptores y la segunda es más compleja e implica un proceso inflamatorio agudo. El tratamiento no altero significativamente la primera fase del dolor agudo, pero las respuestas nociceptivas fueron reducidas en la segunda fase, Figura 31. Este ensayo también utilizó Ibuprofeno como experimento control al tratamiento con el ácido maslínico.
Figura 31. Efectos del ácido maslínico a la respuesta del dolor inducido por una inyección intraplantar a modelos experimentales de ratón (Nieto et al. 2013).
6.2.5 VIH e infección parasitaria.
Huang et al (2013) halló 5 nuevos triterpenos los cuales aislados del extracto de Excoecaria acerifolia. Sus estructuras fueron determinadas por análisis de datos espectroscópicos y se realizaron estudios anti-VIH. Se evaluaron cuatro compuestos (A, C, D y E) realizando ensayos in vitro para medir su actividad anti-VIH. Para ello se midieron los efectos citopáticos causados por VIH-1 sobre la línea celular C8166.
El compuesto A exhibió una moderada actividad a una concentración EC50 de 5,58 µM, sin embargo los restantes compuestos mostraron una actividad mucho más baja, Tabla 8.
Tabla 8. Actividad anti-VIH in vitro de Excocarinoles A, C, D y E (Huang et al. 2013).
Un estudio realizado por De Pablos et al. (2010) demostró que el ácido maslínico inhibe el crecimiento y la replicación celular de Toxoplasma gondii. Se trata de una inhibición dosis-dependiente. Tras un tratamiento con AM durante 24 horas, se observa que tras 24h de tratamiento con ácido maslínico se encuentra una dosis infectiva media (ID50) de 46 µM, mientras que a las 48h fue de 8µM, Figura 32.
Figura 32. Inhibición de la penetración de T. gondii en células tras 24 (A) y 48 horas (B) de tratamiento con AM (Pablos et al. 2010).
La inhibición ejercida por el ac maslínico en las proteasas presentes en los productos secretados también mostró una fracción dependiente de la dosis en su inhibición. Esta inhibición fue similar a la conseguida por los inhibidores clásicos.
La inhibición de la actividad de la proteasa a través del AM conduce a la obstrucción de los mecanismos implicados en la penetración de los taquizoitos en la célula huésped o de mecanismos necesarios para esta penetración. La inhibición de la capacidad de internalización podría considerarse un efecto indirecto, dada la acción del ácido en la motilidad de deslizamiento del parásito. El efecto de inhibidores de la proteasa que ejercen sobre la movilidad puede ser una consecuencia de la interacción de estos inhibidores productos de secreción.
Como se refleja en los resultados, Tabla 9, el ácido maslínico a una concentración de 50 µM inhibe la motilidad de deslizamiento hasta 100 %. Este mecanismo es, posiblemente, uno de los responsables de impedir la penetración de la célula huésped.
Tabla 9. Actividad in vitro del ácido maslínico en taquizoitos de Toxoplasma gondii (Pablos et al. 2010).
7. CONCLUSIONES:
1. Los triterpenos pentacíclicos tales como el ácido oleanólico, ácido maslínico, ácido ursólico, eritrodiol y uvaol se encuentran presentes en altas concentraciones en órganos y productos derivados del olivo. Su presencia y su concentración junto a sus efectos beneficiosos para la salud, hacen que la aceituna de mesa y el aceite de oliva sean alimentos saludables y recomendados a incluir en nuestra dieta.
2. Varios compuestos triterpénicos como el eritrodiol y el ácido maslínico provocan la inhibición selectiva de la proliferación celular de diversas líneas celulares procedentes de tumores humanos. Esta inhibición se ejerce por inducción de apoptosis celular selectiva en este tipo de células.
3. En experimentos realizados con animales, se ha demostrado que el ácido maslínico produce la disminución del dolor en una respuesta similar al tratamiento con ibuprofeno.
4. El ácido maslínico se puede considerar como una molécula de potencial utilidad para prevenir la parasitosis humana y animal en situaciones donde la infectividad esta mediada por proteasas, por ejemplo Toxoplasma, así como otras enfermedades causadas por protozoos Apicomplexa.
5. El ácido oleanólico y el uvaol presentan efectos beneficiosos para la función cardiovascular que los hacen buenos candidatos a tener en cuenta en el tratamiento convencional de la hipertensión, angina de pecho.
6. Debido a sus propiedades, los triterpenos pentacíclicos o/y algunos de sus derivados, están siendo considerados como productos naturales que pueden sustituir o complementar la acción de fármacos convencionales en el tratamiento de diversas patologías.
8. BIBLIOGRAFÍA:
Allouche Y, Jiménez A, Uceda M, Aguilera M, Gaforio J, Beltrán G. 2009. Triterpenic content and chemometric analysis of virgin olive oils from forty olive cultivars.
J. Agric. Food Chem. 57, 3604–3610.
Alqahtani A, Hamid K, Kam A, Wong K, Abdelhak, Razmovski-Naumovski V, Chan K, Li K, Groundwater P, Li G. 2003. The pentacyclic triterpenoids in herbal medicines and their pharmacological activities in diabetes and diabetic complications. Current Medicinal Chemistry. 13, 0929-8673.
De Pablos L, González G, Rodriguez R, Granados A, Parra A, Osuna A. 2010.
Action of a pentacyclic triterpenoid, maslinic acid, against Toxoplasma gondii.
J. Nat. Prod. 73, 831–834.
George V, Kumar DR, Suresh PK, Kumar R. 2012. Apoptosis-induced cell death due to oleanolic acid in HaCaT keratinocyte cells -a proof-of-principle approach for chemopreventive drug development. Asian Pacific J Cancer Prev, 13, 2015- 2020.
Guinda Á, Lanzón A, Albi T. 2002. Aislamiento y cuantificación de los componentes de la hoja del olivo: extracto de hexano. Grasas y Aceites 419. Vol. 53. Fasc.
4. 419-422.
Guinda A, Rada M, Delgado T, Gutiérrez-Adánez P, Castellano J. 2010. Pentacyclic triterpenoids from olive fruit and leaf. J. Agric. Food Chem., 58, 9685–9691.
Herrera M.D, Rodriguez-Rodriguez R, Ruiz-Gutierrez V. 2006. Functional properties of pentacyclic triterpenes contained in “orujo” olive oil. Curr. Nutr. Food Sci. 2, 45-50.
http://mejorconsalud.com/aceite-de-oliva-lo-mejor-de-la-dieta-mediterranea/
http://www.uam.es/cs/ContentServer/es/1242663063124/1242666607631/UAM_Lab oratorio_FA/laboratorio/Laboratorio_de_Citometria_de_Flujo.htm
Huang S, Zhang X, Ma Q, Zheng Y, Xu F, Peng H, Dai H, Zhou J, Zhao Y. 2013.
Terpenoids and their anti-HIV-1 activities from Excoecaria acerifolia.
Fitoterapia. 91, 224–230.
