N° 32
EL PRIMER VICEPRESIDENTE EN EL
EJERCICIO DE LA PRESIDENCIA DE LA REPUBLICA,
De conformidad con lo que dispone el artículo 1° de la ley N° 1698 de 26 de noviembre de 1953 y por recomendación del Comité de Normas y Asistencia Técnica Industrial,
DECRETA:
Artículo 1°–Aprobar la siguiente
Norma Oficial para Gelatina Comestible I.–DEFINICION Y GENERALIDADES:
A.–Definición:
Para los efectos de esta Norma, se entiende por gelatina comestible la sustancia sólida, hialina, inodora e insípida obtenida por hidrólisis alcalina o ácida de los tejidos conectivos, cartilaginosos y óseos, en buen estado, procedentes de animales sanos, y elaborados siguiendo normas higiénicas.
B.–Generalidades:
1.–Propiedades y usos:
La gelatina comestible se presenta comercialmente en forma de láminas, hojuelas, gránulos, filamentos o polvo fino, incolora o amarillenta.
La gelatina se ablanda y aumenta de volumen en agua fría y sólo con agua caliente forma una solución coloidal.
La gelatina comestible se usa en la elaboración de productos alimenticios y farmacéuticos, en terapéutica, en laboratorios y diversas industrias.
II.–ESPECIFICACIONES GENERALES:
A.–Químicas y Físicas:
Para los efectos de esta Norma, la gelatina comestible debe ajustarse a las siguientes especificaciones:
Humedad máxima... 14.5 %
Cenizas totales máximo... 2 % Nitrógeno mínimo... 14 %
Acidez en pH (Solución al 1%)... 5-8 Punto fusión... 26-30°C
Viscosidad (relativa al agua), de jalea
al 15% a 35°C... 2,66 aprox.
Anhidrido sulfuroso... 0,2 % As2O3... 1,4 ppm Cobre... 30 ppm Plomo... 10 ppm
Zinc... 100 ppm
La jalea de gelatina al 1% debe ser inodora, insípida e incolora o ligeramente amarillenta.
B.–Bacteriológicas:
1.–El número total de colonias no debe ser superior a 10.000 por gramo de gelatina en envase cerrado al salir de la fábrica.
2.–Escherichia coli. No deberá desarrollarse ninguna colonia de Escherichia coli en siembras que correspondan a 0.01 g de gelatina tomada de envases cerrados en la fábrica.
3.–Bacterias Anaerobias. No deben existir en 0.1 g de gelatina.
III.–MUESTREO Y METODOS DE ANALISIS:
A.–Muestreo:
Las muestras se tomarán en la siguiente forma:
1.–Cuando se trate de producto envasado, se tomará al azar un número de envases iguales a la raíz cuadrada del lote total; de los envases separados se tomarán tres de cada diez, de éstos se obtendrá la muestra de gelatina, ya sea el contenido total de los envases pequeños o porciones aproximadamente iguales de la parte superior, media o inferior de los envases grandes.
2.–Cuando se trate del producto a granel, se tomarán porciones de diversos lugares distribuidos uniformemente de una misma partida. En ambos casos las porciones se mezclan bien y se dividen en tres partes iguales de no menos de 200 gramos cada una y se colocan en frascos de vidrio que se tapan, sellan y marcan con números y claves necesarias para su fácil identificación. Estas muestras se entregarán una al laboratorio respectivo, otra a la autoridad que ordenó el análisis
y la tercera al fabricante, vendedor o persona física o jurídica que la solicite justificadamente.
B.–Método de Análisis:
1.–Determinación de humedad:
a) Aparatos:
Balanza analítica, Erlenmeyer, trampa de Dean y Stark.
b) Procedimientos:
Se pesan 25 g de muestra, se colocan en un matraz Erlenmeyer de 300 a 500 ml de capacidad, se añaden 50 ml de xilol. Se conecta una trampa de Dean y Stark se destila hasta que no se colecte más agua en el tubo receptor.
Se deja enfriar a la temperatura ambiente, se lee el volumen de agua que se encuentra bajo la capa de xilol.
c) Cálculos:
Humedad % = 4 x ml de agua.
2.–Determinación de Cenizas Totales:
a) Aparatos:
Balanza analítica, crisol de cuarzo o porcelana, mufla y desecador.
b) Procedimiento:
Pésese alrededor de 5 g de gelatina, desmenuzada, en un crisol a peso constante. Colóquese el crisol en una mufla y caliéntese gradualmente para lograr la carbonización completa de la sustancia. Una vez carbonizada se eleva la temperatura alrededor de 600°C durante 20 minutos. Enfríese en el desecador y pésese.
c) Cálculos:
El % de cenizas totales se obtiene por medio de la siguiente fórmula:
% Cenizas totales = 100 (c-b) a-b
a = Peso del crisol más la muestra.
b = Peso del crisol.
c = Peso del crisol más cenizas.
3.–Determinación de Nitrógeno:
a) Reactivos (Analíticos):
Acido sulfúrico q.p.
Sulfato de cobre anhidro.
Sulfato de potasio anhidro.
Solución de NaOH al 50%.
Solución 0.1 N de NaOH.
Solución 0.1 de HC1.
S.R. de rojo de metilo.
b) Procedimiento:
Pésense de 1 a 3 g de gelatina, colóquese en un matraz Kjeldahl, añádanse de 20 a 25 ml de ácido sulfúrico, 1 g de sulfato de cobre y 10 g de sulfato de potasio y unas pocas cuentas de vidrio. Caliéntese el matraz suavemente primero y con mayor intensidad después, hasta lograr la completa digestión de la sustancia, es decir, que el contenido del matraz quede transparente.
Logrado esto, enfríese, dilúyase con 200 ml de agua destilada, agréguese tres gotas de fenolftaleína, 0.5 g aproximadamente de zinc en granalla de 20 mallas y la cantidad suficiente de solución de NaOH al 50% para alcanzar ligera alcalinidad .
Colóquese inmediatamente en un aparato de Kjeldahl para la destilación del amoníaco, destílense 250 ml del líquido y recójanse en un matraz Erlenmeyer que contenga 50 ml de HCl 0.1 N y 3 gotas de S.R. de rojo de metilo. Titúlese el excedente de HC1 colocado en el matraz, con solución de NaOH 0.1 N.
Hágase un blanco y luego las deducciones del caso
c) Cálculos:
Calcúlese el % de Nitrógeno por medio de la siguiente fórmula:
% Nitrógeno = 100 ( aF – bf ) 0.0014 c
a = Número de ml de HCl usados.
F = Factor de la solución de HC1 usada.
b = Número de ml de NaOH usados.
f = Factor de la solución de NaOH usada.
c = Peso de la muestra en gramos.
NOTA: La determinación de Nitrógeno carece de importancia para conocer de la calidad de gelatina, pero sí es necesario cuando se desea apreciar el grado de pureza de la misma.
4.–Determinación del pH:
a) Aparatos:
Potenciómetro.
b) Procedimiento:
Disuélvase 1.0 g de la muestra de gelatina en una pequeña cantidad de agua destilada, recientemente hervida, llévese a un matraz de vidrio neutro de 100 ml, afórese con agua hervida y tibia, agítese y déjese enfriar a la temperatura ambiente y determínese de inmediato el pH, empleando un potenciómetro a fin de evitar en lo posible la absorción de CO2 del aire.
5.–Punto de Fusión de Jalea:
a) Aparatos:
Matraz Erlenmeyer de 150 ml.
Tubitos de ensayo cortos y con una señal de nivel.
Termómetro de 50°C dividido en décimas.
b) Procedimiento:
Durante no menos de 12 horras se dejan 25 g de gelatina en 50 ml de agua en un matraz Erlenmeyer y después, caliente al baño de María durante diez minutos a 65°C. La disolución de gelatina se vierte en tres tubos de ensayo, de dimensiones y marcas de nivel uniformes y se deja enfriar en ellos. Los tubitos de ensayo con las jaleas se colocan con otro tubo de ensayo vacío, en el cual se introduce un termómetro de 50°C dividido en décimas, en un baño de aire en el cual pueden ser fácilmente observados y puede leerse la temperatura del termómetro y verse la fusión de la jalea. El baño de aire es
calentado por un baño de María, de tal manera que la temperatura se eleve paulatinamente, y se determina el punto de fusión.
6.–Determinación de la Viscosidad:
a) Procedimiento:
La determinación de la viscosidad se hace en el Viscosímeto de Engler.
Se determina el tiempo de salida de 200 ml de gelatina al 15% en agua y a la temperatura de 35°C y luego el de 200 ml de agua destilada a la misma temperatura y se tendrán para el valor de la viscosidad la relación de los tiempos.
b) Cálculos:
Valor de la Viscosidad = T t
T = Tiempo de salida del caldo de gelatina.
t = Tiempo de salida del agua.
NOTA: La viscosidad también podrá ser determinada por otro de los métodos conocidos.
7.–Análisis de la Jalea al 1%:
a) Procedimiento:
A la dilución de un g en 100 ml, una gelatina rica en glutina posee la propiedad de constituir al enfriarse, una jalea. Para disolver la gelatina, se emplea agua destilada a unos 60°C de temperatura y la disolución obtenida se enfría lo más rápidamente posible. La jalea formada se observa y ella debe ser inodora, insípida e incolora o ligeramente amarillenta, para una gelatina comestible normal.
8.–Determinación de SO2:
Aparatos:
Matraz balón de 1500 ml de capacidad, provisto de dos cuellos Refrigerante.
Tubo Peligot.
Matraces Erlenmeyer.
Procedimiento:
Ajústese a uno de los cuellos del matraz un tubo de vidrio que llegue a 1.3 cm del fondo, por el que pasará una corriente de CO2. En el otro cuello ajústese un refrigerante y conéctese al extremo libre del refrigerante, por medio de un tubo de vidrio, con un matraz Erlenmeyer que a la vez está en conexión con dos tubos Peligot. Háganse todas las conexiones empleando tubos de vidrio y hule. Fig. N°
1.
Figura N° 1
Colóquese 10 ml de Peróxido de hidrógeno al 3% (agua oxigenada) libre de sulfatos, en el matraz Erlemneyer y la misma cantidad el primer tubo Peligot. Al segundo tubo agréguese 5 ml de una mezcla de agua oxigenada y solución de cloruro de bario, ligeramente acidulada con HC1. En el matraz balón, colóquense 500 ml de agua destilada y 20 ml de HC1 concentrado. Caliéntese poco tiempo, haciendo pasar una corriente de CO2. Déjese enfriar sin suspender la corriente de CO2. Caliéntese por poco tiempo, agréguese 32 g de la muestra pulverizada, caliéntese ligeramente hasta que la gelatina esté en solución. Pásese la corriente de CO2. Justamente antes de terminar la destilación, suspéndase la corriente de agua que pasa por el condensador, para evitar que el SO2 se quede en el refrigerante y sea devuelto al matraz de destilación. Enfríese éste poniéndolo en un vaso con agua. Tan pronto como el extremo del condensador se encuentre caliente al tacto, desconéctese y lávese con agua destilada, recogiendo el agua del lavado en el matraz Erlenmeyer y el contenido del primer tubo Peligot. Titúlese el contenido con una solución de NaOH 0.1 N empleando azul de bromofenol como indicador. La solución del segundo tubo de Peligot deberá permanecer completamente clara. Si se forma un precipitado de sulfato de bario, la prueba será repetida aumentando la cantidad de agua oxigenada puesta en el matraz Erlenmeyer y el primer Peligot.
Cálculos:
p.p.m. anhídrido sulfuroso = Mililitros de NaOH x 100.
9.–Determinación de arsénico:
El arsénico se determinará de acuerdo con el método “Gutzeit” considerando los siguientes detalles:
a) Destrucción de la materia orgánica:
Figura N° 2
Colóquese 5 g de la muestra en un matraz Kjeldahl, Fig. N° 2, añádanse 20 ml de ácido nítrico concentrado. Caliéntese ligeramente hasta que se formen vapores nitrosos y la muestra se disuelva. Añádanse 10 ml de ácido sulfúrico concentrado y continúese el calentamiento hasta que el líquido tome color negro y la materia orgánica se carbonice. Durante el calentamiento agréguese ácido nítrico, gota a gota, usando un embudo ajustado al cuello del matraz, hasta que el líquido se clarifique. En estas condiciones auméntase el calentamiento hasta la formación de vapores blancos y el líquido se vuelva incoloroso o amarillento no será necesario agregar más de 35 ml de ácido nítrico en total.
Si persiste un color amarillo, será necesario agregar unas gotas de solución de peróxido de hidrógeno al 30% en peso volumen a calentar.
Enfríese el liquido y agréguense 15 ml de una solución saturada de oxalato de amonio. Caliéntese hasta que vuelvan a aparecer los humos blancos.
Dilúyase el residuo con 7 ml de agua, procédase a la destilación y purificación del arsénico.
b) Destilación y purificación:
Añádanse al líquido frío 5 g de una mezcla de cloro-bromo-hidrazina, cuidadosamente, sin que se quede adherido al cuello del matraz. Colóquese el condensador que se ilustra en la Fig N° 2 y recíbase el destilado en una mezcla fría de 10 ml de agua destilada y 2 ml de ácido nítrico y continúese la destilación hasta que el volumen se reduzca a la mitad. El destilado se evapora a sequedad en un baño de María, evapórese el residuo a sequedad empleando 5 ml de agua para quitar el ácido nitrico. Disuélvase calentando, con 3 ml de ácido sulfúrico concentrado, diluído a 25 ml. Transfiérase esta solución preparada, a un aparato “Gutzeit”.
La cloro-bromo-hidrazina se prepara de la siguiente manera: se mezclan 5 g de cloruro de sodio, 0.5 g de sulfato de hidrazina y 0.02 g de bromuro de potasio y esta mezcla puede guardarse por mucho tiempo en un frasco herméticamente cerrado.
c) Aparato de “Gutzeit”:
Se ilustran en la Fig. 3.
d) Reactivos y soluciones requeridas:
Solución patrón de arsénico.
Se disuelve 1 g de anhidro arsenioso resublimado, AS2O3, en 25 ml de solución de hidróxido de sodio al 20% (privada de arsénico) y se neutraliza con ácido sulfúrico diluido. Esta solución se diluye con agua destilada hasta un volumen de 1000 ml, habiéndose agregado previamente 10 ml de ácido sulfúrico de 95%. 10 ml de esta solución se diluyen a 1000 ml con agua destilada conteniendo la misma proporción de ácido sulfúrico que equivale a 0.01 mg de AS2O3 por 1 ml y finalmente 100 cc. de esta última solución es diluida a 1 litro de agua destilada conteniendo la misma proporción de ácido.
1 cc. de la solución final contiene 0.001 miligramos de AS2O3 y constituye la solución patrón.
Papeles patrón de arsénico.
Se hace una serie de papeles patrón para determinaciones de AS2O3 entre los límites 0.001 a 0.02 miligramos de acuerdo con los siguientes valores.
Aparato de Gutzeit. Cantidades de: cc. de solución patrón de As2O3 Pequeño para determinación de
AS203 mg. Volumen de solución 50 cc. y 25 g de Zn en granalla.
0.001 mg.
0.002 ” 0.004 ” 0.005 ” 0.006 ” 0.010 ” 0.015 ” 0.020 ” 0.025 ”
1 cc. de sol de As2O3
2 ” 1cc. = 0.001 mg.
4 ” 5 ” 6 ” 10 ” 15 ” 20 ” 25 ”
Estos papeles patrón se harán poniendo en el aparato pequeño de Gutzeit las cantidades de reactivos anotados en la Tabla y procediendo exactamente como para una determinación común.
Las tiras de papel coloridas, se impregnan en parafina fundida (libre de humedad) y enseguida se pegan en orden creciente en una hoja de papel blanco, la cual se enrolla con las tiras coloridas hacia afuera, de manera que se forme un cilindro, que se guarda en un frasco cilíndrico bien seco, en el que se pone un poco de anhidrido fosfórico o lacre para evitar la humedad.
Es conveniente guardar patrones fuera de la luz para evitar su descoloración.
Papel sensibilizado al cloruro mercúrico.
Se cortan trozos de papel filtro de 30 x 30 cm hechos en papel sueco N° 0 en cuatro partes iguales.
Para el uso de los aparatos chicos de Gutzeit la solución debe contener 0.35% de cloruro mercúrico. El papel deberá tener una uniformidad completa en su estructura y grueso, pues cualquier irregularidad hace que se fije desigualmente el reactivo mercúrico produciendo irregularidades en la coloración. Cuando está seco se corta en tiras de 12 cm x 2.5 cm y se conserva en tubos de ensayo o frascos perfectamente tapados y secos.
Solución de sulfato férrico amónico.
Se mezclan 84 g de FeNH4 (SO4)2. 12H2O con 10 cc. de ácido sulfúrico y se disuelven en agua destilada y se diluye a un litro. 10 ml de esta solución contienen aproximadamente 0.5 g de Fe2O3.
Acetato de plomo.
Solución de acetato de plomo al 1% en agua destilada conteniendo suficiente cantidad de ácido acético para que permanezca transparente.
Zinc.
Granalla de zinc libre de arsénico, cuyo tamaño sea de 4 a 8 mm tratada con ácido clorhídrico q.p. hasta que la superficie quede completamente limpia y brillante; enseguida se lava perfectamente con agua destilada y se guarda cubierta de agua, en un frasco bien tapado.
Mezcla ácida.
A un volumen de ácido sulfúrico concentrado (libre de arsénico) se agregan cuatro volúmenes de agua destilada y 10 g de NaCl por cada 10 ml de solución.
80 g de cloruro estanoso se disuelve en 100 ml de agua destilada conteniendo 5 ml de ácido clorhídrico concentrado (densidad 1.2 libre de arsénico). Esta solución se prepara en el momento de efectuar la determinación.
Ácido clorhídrico libre de arsénico.
Acido clorhídrico comercial se trata con clorato de potasio para oxidar el arsénico a su más alto grado de oxidación, y se destila. El aparato para esta destilación debe estar formado por una retorta unida a un condensador que se introduce en un frasco grande y haciendo gotear lentamente el ácido clorhídrico concentrado; el frasco grande deberá estar unido a otros semejantes, donde en la menor cantidad de agua destilada se recibe el ácido clorhídrico destilado.
Papel reactivo al acetato de plomo.
Se mojan unas hojas de papel filtro para cualitativo en una solución de acetato de plomo y se secan, se cortan en tiras de 7 x 5 cm y se conservan en frascos bien tapados.
A la hora de hacerse el trabajo deberán hacerse algunas pruebas testigo con este papel para ver que los reactivos están libres de arsénico. Este papel tiene por objeto quitar las trazas de H2S que pudieran contener los distintos reactivos y soluciones.
e) Procedimiento:
Se coloca en el aparato “Gutzeit” el destilado preparado 25 ml de ácido sulfúrico 1:8, se añaden 2 ml de la solución de fierro y 0.5 ml de la solución de cloruro astanoso; inmediatamente después de añadir la granalla de zinc, se tapa el frasco con el resto del aparato, el cual debe estar listo con el papel y solución de acetato de plomo y con la tira de papel sensibilizado con el cloruro mercúrico.
Se agita de tiempo en tiempo el aparato, para que la reacción se lleve al cabo regularmente, cuidando que la temperatura se mantenga 25 y 27°C (lo que se logra sumergiendo el frasco del aparato, en agua fría, o caliente, según el caso) durante una hora y en caso de que la mancha del papel sensible no cambie en intensidad y tamaño, se prolonga por 40 minutos más hasta que la mancha se estabilice; enseguida se saca la tira de papel sensibilizado, se sumerge en parafina fundida y se procede a la comparación con los patrones.
p.p.m. de AS2O3 = 1000 E P Siendo:
E = miligramos de AS2O3 en el patrón igualado por la muestra.
p = peso de la muestra tomada, expresada en g.
10.–Determinación de los metales pesados: Cobre, Plomo y Zinc.
Si la muestra no está completamente pulverizada, emplear un mortero de porcelana para lograrlo.
a) Preparación de la solución:
Incinérense 20 g de la muestra de gelatina en una cápsula de platino, hasta obtener cenizas de color blanco. Añádanse 5 ml de HCl concentrado, evapórese a sequedad en baño de María.
Se debe cuidar la temperatura al hacer la incineración, 510° a 565°C, pues temperaturas elevadas originan la volatilización de los metales y las temperaturas bajas producen cenizas con carbón que son causa de error.
(Para la destrucción de la materia orgánica se puede hacer la oxidación en igual forma que se realiza para la determinación de arsénico). Disuélvase el residuo en HCl (1:4), fíltrese; lávese con la misma solución de HCl, júntese el filtrado y las aguas del lavado y agréguense 8 g de ácido cítrico puro y 10 mg de sulfato ferroso cristalizado.
b) Al filtrado que aproximadamente será igual a 40 ml añádanse 3 gotas de indicador universal y amoníaco hasta tener un pH cercano a 8, que se logra cuando la solución toma un color verde. El valor del pH es erróneo si la determinación se realiza en caliente. Pásese una corriente de H2S por la solución durante 20 a 30 minutos, fíltrese a través de un papel filtro Whatman N° 2. Lávese el precipitado con una solución de sulfhídrico alcalinizado con amoníaco y en seguida con agua.
c) Separación:
Pásese el contenido del papel filtro, que es el precipitado de los sulfuros, a un matraz que contenga 25 ml de agua y 2 ml de HNO3 concentrado;
caliéntese en una parrilla. Fíltrese y lávese con agua caliente. Añádase al filtrado, que será entre 40 y 50 ml, 1 g de sulfato de amonio, caliéntese hasta un punto cercano al de ebullición; el hierro precipítese agregando 15 ml de hidróxido de amonio al 15%, continúese el calentamiento hasta que se coagule el hidróxido de hierro formado. Cuídese que el calentamiento no sea muy prolongado porque entonces precipitaría el cobre. Fíltrese, el precipitado lávese con agua caliente y una solución de amoníaco al 2%.
d) Determinación del plomo:
Pásese el papel filtro que contiene el precipitado obtenido en “c” a un matraz que contenga 20 ml de agua y 2 ml de ácido nítrico concentrado y caliéntese en una parrilla. Cuando se disuelva el precipitado, fíltrese y lávese el papel filtro con agua caliente. Pásese el filtrado en un embudo de separación; cuando se haya enfriado, agréguense 5 ml de una solución saturada de sulfocianuro de amonio. Agréguense 5 ml de alcohol amílico y 15 ml. de éter. Agítese vigorosamente. Cuando las dos capas se hayan separado, sepárese la capa acuosa. Hágase una segunda extracción con 10 ml. de éter y 10 ml. de alcohol amílico.
Sepárese la capa acuosa una vez más y alcalinícese la solución empleando amoníaco, agréguese 1 ml de una solución de cianuro de potasio al 10%.
Pasése a un tubo de Nessler y agréguense 2 gotas de una solución de sulfuro de sodio al 10%, afórese con agua destilada hasta la marca del tubo, agítese.
La comparación se hace con soluciones preparadas, poniendo en el tubo de Nessler 1 ml de solución de sulfuro de sodio al 10%, añadiendo una cantidad conocida de nitrato de plomo, afórese.
e) Determinación de cobre y zinc.
El filtrado obtenido en “c” se afora a 100 ml. En 20 ml. se determina por medio de la dietil-ditio-carbamato de sodio. Si hay cobre, debe ser removido antes de la determinación del zinc.
Determinación de cobre por el método de la dietil-ditio-carbamato de Sodio.
Se usará como reactivo una solución de dietil-ditio-carbamato de sodio al 0.1% preparado por interacción del CS2 y dietilamina en presencia de un álcali en solución acuosa.
Con una solución de cobre que contenga 0.1 p.p.m. de cobre, el reactivo da un color café oro distintivo y con una solución que contenga 1 p.p.m. de cobre, la solución adquiere un color café oro muy fuerte y se hace nebulosa.
El método es el siguiente:
Disuélvanse 2 g de ácido cítrico en la solución, añádanse amoníaco hasta un pH de 9 o más, dilúyase a 70 ml. Añádanse 10 ml de reactivo y extráigase inmediatamente con 4 porciones sucesivas de 2.5 ml cada una, de tetracloruro de carbono. Si el extracto final contiene más que trazas, comparar el color desarrollado en un colorímetro con soluciones tipo preparadas en forma similar.
El método se puede aplicar a la solución que contenga Al ó Zn hasta 0.5 g, Cr hasta 2 g. Si no están presentes trazas de hierro. El color es estable por
lo menos una hora; el reactivo es estable por varias semanas, si se guarda en frascos de color ámbar.
Evapórense los 80 ml restantes hasta tener un volumen de 20 ml, añádanse 5 ml de una solución de ácido clorhídrico 4 N, caliéntese para disolver las trazas de zinc que se adhieran a la pared. Enfríese la solución y pásese una corriente de H2S durante quince minutos para precipitar el cobre como sulfuro. Cuando solamente estén presentes trazas de cobre, agréguese 1 mg de cobre como sulfato, antes de pasar la corriente de H2S. Fíltrese el precipitado y lávese con agua sulfhídrica. Evapórese el filtrado hasta un volumen de 20 ml, determínese el zinc por método siguiente:
Añádase a la solución obtenida 5 ml de una solución de acetato de amonio al 20% y 2 gotas de indicador universal; ajustar el pH a 7.5, agregando amoníaco. Añadir 2 ml de una solución al 2% de 8 hidroxiquinolina, en ácido acético, caliéntese la solución a ebullición durante 5 minutos, póngase una tapa sobre el matraz. Después de la ebullición, déjese reposar durante 5 minutos, filtrese sobre papel filtro Whatman N° 2 tarado. En una hoja se filtra el precipitado obtenido, que se lava 2 veces con agua fría.
El otro papel se lava 2 veces con agua fría. Ambos papeles se secan a la estufa a una temperatura de 100°C. Pésense:
mg Zn = A x 0.185
siendo: A = Peso en mg. del precipitado de la oxima obtenida.
11.–Determinaciones bacteriológicas:
Pésense 5 g de la muestra en condiciones asépticas, colóquense en 100 ml de agua destilada esterilizada, déjese reposar durante dos horas. Pásese a un baño de María a 50°C durante 15 minutos; agítese para favorecer la solución.
Prepárese diluciones al 1:100, 1:1000 y 1:10000.
La dilución inicial de la gelatina en 1:20.
Para preparar la dilución 1:100, se toman 20 ml de solución 1:20, agréguese 80 ml de agua destilada esterilizada.
De la solución anterior tómense 10 ml y agréguense 90 ml de agua, para obtener una solución 1:1000. De la solución anterior, tómese otros 10 ml y afórense a 100, obteniéndose en esta forma la solución al 1:10000.
a) Cuenta total de colonias:
Colóquese 1 ml de cada una de las soluciones antes preparadas en sendas cajas de Petri. Agréguense a cada una de ellas 10 ml de agar nutritivo licuado a 46°C. Incúbense las placas a 37°C durante 48 horas. Empleando cuadrícula especial, cuéntese el número total de colonias. Calcúlese el número de colonias por gramo, considerando en cada caso la dilución.
b) Diferenciación de Escherichia coli:
Técnica. Siémbrese con 1 ml de las soluciones que se investigan sendos tubos de fermentación que contienen caldo lactosado. Incúbense estos cultivos en una estufa a 37°C. Hágase la observación a las 24 y 48 horas.
Si hay producción de ácido y gas, se hacen resiembras en cajas de Petri que contienen media de Endo, incubando a 37°C.
Si al cabo de 24 ó 48 horas de incubación se presentan en el medio de Endo colonias de color negro metálico, hágase una bacterioscopía de estas colonias; si los gérmenes que la constituyen son bacilos cortos Gram negativos que no esporulan, se hace una segunda siembra en medio caldo lactosado y se observa la fermentación, si hay producción de ácido y gas, la presencia de Escherichia coli se considera positiva.
c) Diferencia de bacterias anaerobias:
Pésese 1 g y 0.1 de gelatina pulverizada.
Póngase cada una de estas cantidades en un tubo que contiene como medio de cultivo leche tornasolada. Ciérrese el tubo con parafina. Caliéntese a 80°C en un baño de María durante 10 minutos.
Incúbese a 37°C durante 48 horas y obsérvese la coagulación de la leche, que es positiva en presencia de Clostridium Welchii. Se pueden realizar subcultivos en agar glucosado inclinado, incubando en atmósfera de hidrógeno para determinar la presencia de otras bacterias anaeróbicas obligadas.
Artículo 2°.–Esta Norma es de carácter obligatorio de conformidad con lo que dispone el artículo 5° de la ley N° 1698 de 26 de noviembre de 1953.
Artículo 3°.–Se deroga el decreto N° 22 de 18 de junio de 1953.
Artículo 4°.–Este decreto rige a partir de su publicación.
Dado en la Casa Presidencial.–San José, a los quince días del mes de noviembre de mil novecientos cincuenta y seis.
R. BLANCO CERVANTES
El Ministro de Agricultura e Industrias, BRUCE MASIS D.
La Gaceta N° 4 del 6 de enero de 1957.
