Caracterizaciión bioquímica preliminar del veneno de Bothrocophi a s microphtalmus

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(1)UNIVERSIDA D DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAM ENTO DE BIOLOGÍA PROGRAM A DE BIOLOGÍA. ROBERTO PATRICIO RAM ÍREZ BOTERO. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍM ICA PRELIM INAR DEL V ENENO DE Bothrocophias microphtalmus.

(2) CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PRELIMINAR DEL VENENO DE Bothrocophia s microphtalmus. Roberto Patricio Ramírez Botero. Director Alfredo Uribe Director centro de investigaciones bioquímicas ( CIBI). Codirector Os car Ramos Universidad de Los Andes Grupo GECOH. Universidad de los Andes Bogotá D.C., Agosto 2005.

(3) Trabajo presentado como prerrequisito par a optar el título de Biólogo. Roberto Patricio Ramírez Botero Código 199912715. Director Alfredo Uribe. Codirector Os car Ramos. Bogotá D.C., Agosto de 2005.

(4) AGRADECIMIENTO Este tr abajo fue realiz ado gr ac ias al apoyo de Alfredo Uribe y Oscar Ramos direc tor y codir ector. Además de esto quier o agradec er muy es pec ialmente a Juan Eduardo Ruiz por haber colabor ado en todo el proc eso de labor ator io de manera des interes ada. A Ana Cr istina palma por todo lo que hiz o tanto en la tes is c omo en el resto de la carr era. Sin su ayuda ni es te ni ningún tr abajo habr ía s ido pos ible. Igualmente a las patojas y a los matute por estar siempre pendientes de todo y dis puestos a colaborar . Al CIBI, genética de poblac io nes, genética humana y al CIMIC. Su apoyo fue de vital impor tancia en diferentes mo mentos . A Jaime Ramírez y a Juan Manuel Renjifo por aportar al tr abajo con un poc o de s u c onoc imiento. A Esteban Ross i y a mis amigos por el interés que mostr aron a lo lar go del trabajo. Finalmente a mi papa y a mi ma ma por soportar a las culebras y por ser los pr incipales pr omotor es de c osas buenas a lo lar go de mi v id a..

(5) TABLA DE CONTENIDO AGRADECIMIENTOS ...........................................................................................4 TABLA DE CONTENIDO......................................................................................4 Introd ucció n.............................................................................................................6 OBJ ETIVOS ............................................................................................................9 Objetivos general es.................................................................................................... 9 Objetivos específi cos.................................................................................................. 9. MARCO TEORICO...............................................................................................10 Característi cas prin cipales de B oth rocophias microph tal mus. ................................ 10 Clasi ficación taxonómica...............................................................................................................................................10. Característi cas del ven eno ....................................................................................... 11 Constituyentes no proteicos ..........................................................................................................................................11 Constituyentes org ánicos ...............................................................................................................................................12 Constituyente prot eico ....................................................................................................................................................13. Mecanismo de acción d el venen o ............................................................................. 15 Actividad proteolítica ......................................................................................................................................................15 Acción sobre la coagulación y sobre las plaquetas ..............................................................................................15 Actividad hemorrágica....................................................................................................................................................16. Técnicas d e an álisis.................................................................................................. 16 Electrofo resis ......................................................................................................................................................................16 Sistema discontinuo .........................................................................................................................................................17 Condiciones d esnaturalizantes .....................................................................................................................................17. Materia les y Métodos .............................................................................................18 Extracción del ven eno.............................................................................................. 19 Pu rificación y preservación del ven eno .................................................................... 19 Determi naci ón de l a concentración de proteín a por Folin -Lowry ............................ 19 Capa fina (ascenden te) ............................................................................................ 20 Electroforesis en gel discon tinu o d e poliacrilamid a y dodecil sulfato d e sodio (PAGE SDS ). ....................................................................................................................... 20 Tratami en to d e las mu estras.................................................................................... 20. Resultado s ..............................................................................................................21 Electroforesis (S DS -PAGE) ..................................................................................... 23 Cromatografía de cap a fina ..................................................................................... 26. Análisis de resultado s ............................................................................................28 Carácterísti cas físi cas .............................................................................................. 28 Electroforesis........................................................................................................... 28 Cromatografía de cap a fina ..................................................................................... 30. Co nclusio nes ..........................................................................................................30 BIBLIOGRAFÍA. ..................................................................................................31.

(6) Introducción Parte de la importancia de estudios en venenos de ofidios se debe a la grav edad y frecuenc ia c on que se pr esentan los c asos de mor deduras de serpientes en humanos. En Colombia ex isten 222 es pec ies de ser pientes, de las cuales el 10 % s on consider adas venenos as par a el hombr e ( INS. 2005). En Colombia estas ser pie ntes venenos as pertenec en a 2 familias y 9 géner os y se pueden enc ontrar por debajo de los 2.500 m.s.n.m. De las 36 es pecies, sólo una se enc uentra en el mar Pelamis pl aturus , única serpiente que se localiza exc lusivamente en el Oc éano Pac íf ico. ( INS. 2005). Los accidentes caus ados por ser pientes en el mundo se estiman en unos 5.400.000. c as os. anuales,. de. los. cuales,. 2.682.500. pr oducen. env enenamiento y de es tos mueren apr ox imadamente unas 125.345 pers onas ( INS. 2005). En Latinoamér ic a se producen 150.000 accidentes con envenenamiento y de los cuales la tasa de mortandad es es timada en unas 5.000 pers onas ( INS. 2005). En Colombia, durante el per iodo de 1975 a 1999, se rec opiló la infor mac ión de 1.771 acc identes (INS., 2005). De los acc identes infor mados el (21.63%) corres ponden al Departamento de Meta, s eguido por los. Departamentos de Putumayo (11.29%),. Santander (10.78%), Cesar ( 8.70%), Arauc a (8.41%), Nor te de Santander (8.13%) y Boyacá (4.91%). De los acc identes reportados el 1.92% produjeron la muer te. De todos los accidentes informados el 59.91% corres ponde a Bothr ops, el 2.09% a Micrurus y el 1.3% corr esponde a Crótal us. ( INS. 2005). La impor tanc ia de Bothroc ophias microphtalm us. s e debe a su amplio. rango de distr ibución geográfic a ( Fig.1) , que c oinc ide con centr os urbanos cercanos a la capital del país , que son visitados frecuentemente con fines recreativos por gr an cantidad de pers onas ( La Calera, Fómeque, Ubaque.

(7) y Choachí). La ausenc ia de es tudios llev ados a c abo con esta especie es otr o factor que deter mina su importancia, al igual que el. poco. conoc imiento del géner o Bothr oc ophias , por lo que es de vital importancia empez ar a realizar estudios que ayuden a incr ementar su conocimiento. B. microphtalmus junto con Bothriechis schlegelii es una de las dos espec ies v enenosas de nuestro país que se enc uentr an en localidades altas s obr e el nivel del mar (INS. 2005). Habita en las cuestas amazónicas de los Andes de Amér ica del Sur, r eportando su pres encia en Colombia, Ec uador, Per ú y pos iblemente Br asil. En nuestr o país s e ha repor tado en los Departamentos de Boyac á, Casanar e y Cundinamarc a. Se suele enc ontr ar des de los 1000 has ta los 2350 msnm. Habita la montaña baja, bos que húmedo/ bosque nublos o ( Cambell & Lamar. 2004). siendo de gran importancia epidemiológic a en los Departamentos de Cundinamarca, Boyac á y en Munic ip ios aledaños a Bogotá como lo son La Calera, Choachí, Ubaque y Fómeque y en algunos no tan c ercanos c omo lo son Gar agoa y Tenza; donde incluso se han pr esentado c asos de mor deduras y debido al la poca infor mac ión que ex iste s obre Bothroc ophias microphtalmus, es difícil suministr ar el tratamiento adecuado en el mo mento de una emergencia ( Renjifo, c om. personales).

(8) Figur a 1. Mapa de la distr ib ución geográfica del géner o Bothr ocophias. ( Cambell & Lamar. 2004). De ac uerdo con algunos casos r eportados en Per ú, se sabe que el env enenamiento por B. microphtalmus tiene las siguientes caracter ístic as: edema, eritema, hipertensión, hematur ia (pr esenc ia de sangr e en la orina), pr esencia de ampollas y daños en el sis tema de coagulación de a sangr e. Sin des arrollar necr osis loc al o sangrado sistémico ( Demar in i. 2002). La cercanía de algunos de los municipios donde se enc uentr a B. microphtalmus a la capital del país, y la grav edad del envenenamiento hac en de és ta una espec ie de gr an impor tanc ia epidemiológica, y es un primer paso par a pr omover el estudio de ofidios en la Univ ers idad de los Andes. Por otro lado, en el c ampo de la far macología, el es tudio químico.

(9) por medio del fracc ionamiento de los venenos es de gran importancia, ya que los v enenos de las ser pientes y de otr os animales se estudian activamente par a la pr oducción de nuevos medicamentos y otros productos par a la salud humana. La car acteriz ación bioquímic a. preliminar del veneno de Bothroc ophias. microphtalmus es un primer paso para gener ar conocimiento s obre esta espec ie, enc ontrar algunos posibles c omponentes del v eneno, y as í aportar infor mac ión de este géner o tan poc o estudiado. Por último, son importantes las investigaciones en v enenos , debido a su gran aplic ación a la salud humana. Lamentablemente en los últimos años los f ondos par a la inves tigación en ofidios s e han visto r educidos y por lo tanto las investigac iones han s ido afectadas. Estudios como este pueden ser un pr imer paso par a pr omov er y reanudar la investigación c on ofidios en el país.. OBJET IVOS Objetivos generales - Caracter izar. bioquímic amente. el. veneno. de. Bothroc ophias. microphtalmus, mediante pr oces os de c uantific ación y separac ión de proteínas.. Objetivos especí fi cos - Aplic ar técnicas de purificac ión de soluciones proteicas heterogéneas y biología molec ular para el estudio de venenos de ofid ios. - Deter minar algunas c aracter ístic as físicas del v eneno de Bothroc ophias microphtalmus, tales como color y consistencia. - Ex plorar la precis ión de las técnic as de electr ofor esis y cromatogr af ía de capa fina, usadas en la c ar acteriz ación del veneno..

(10) MARCO TEORICO Característi ca s pri ncipales de Bothrocophias microphtalmus. Clasificación taxonómica Familia: V iper id ae Subf amilia: Cr otalinae Ge nero: Bothr ocophias Especie: microphtalmus Bothroc ophi as microphtalmus , conocida comúnmente como sapa o taya X o cuatr onarices, es una s erpiente ponz oñosa pertenec iente a la familia Viperidae, subfamilia Cr otalinae ( Pineda. 2002) Ésta s erpiente pres enta foceta loreal, importante ór gano termo-r eceptor, característica tax onómica de las es pecies de la s ubfamilia Cr otalinae. Además tiene contextur a r obusta, con una longit ud máx ima de hasta 130 cm en las hembras . Es de v ariado color, la c abeza y el c uer po van de colores castaños a castaños c laros , los adultos son más oscur os con la edad. Pr esenta una línea post-oc ular negr a, el ir is es dorado grisác eo a par do, la pupila es afilada y dor ada, tiene entr e 18 y 21 manc has dorsomediales y dors almente tiene for mas tr apez oidales . Las esc amas gulares e infralabiales var ían de amarillo a café osc uro con manchas amar illas. La par te v entr al media pres enta manchas c afé oscur as especialmente en los costados de las esc amas (Cambell & Lamar . 2004). Pr es enta de 137 a 168 escamas ventr ales , 44 a 59 s ubcaudales div ididas, ausencia de escama lacunolabial, de 4 a 8 intr as upr aoculares , de 7 a 8 supralabiales, de 8 a 11 infrala biales, 2 cantales, de 3 a 4 inter oculabiales y en ocasiones presenta esc ama cantor ostr al ( Ca mbell & Lamar. 2004). Sus alimentos pr incipales son r oedor es y lagartijas. Tienen fec undac ión interna y reproducción ovov ivípara (Cambell & Lamar. 2004)..

(11) Bothrocophias microphtalmus Foto: Patricio Ramírez. Característi cas del veneno El v eneno es producido por las glándulas de v eneno de las serpientes, y contiene una gran variedad de sustanc ias tóxic as, enz imátic as y otros componentes, este se acumula en el lumen de las glándulas y es expelido dur ante la mor dida ( Lee. 1979) Debid o a la naturaleza hidrolítica de las enzimas pr esentes en el v eneno de las ser pientes, se pr oduce daño en el tejido de la pr esa lo que fac ili ta la eventual digestión (exodigestión) ( Tu. 1977 en Quevedo.1999). Los componentes pr esentes en el veneno de las s er pientes pueden v ariar de una espec ie a otra, y dentro. de la mis ma es pec ie. Sin embargo, a. continuac ión se pr esenta la compos ición típica de los venenos teniendo en cuenta que las sus tanc ias presentes se clasifican en proteic as y no proteic as.. Constituyentes no proteicos Dentr o de los componentes no proteic os de los venenos, s e encuentran sustanc ias or gánic as e inorgánicas. Los metales son los principales componentes in orgánicos y a que los mayor es constituyentes del v eneno son las pr oteínas, ( macr omoléculas c ar gadas), r az ón por la cual el v eneno de ser piente contiene varios cationes y aniones para neutralizar es tas cargas. De los metales el s odio esta pres ente en may or cantidad, los iones monovalentes no tienen gran signif icado en tér minos biológicos ni en actividades enz imáticas. El c ontenido de los metales var ía de un.

(12) veneno a otro, pero los que generalmente s e enc uentr an son: calc io, zinc, magnesio, potas io, cobre, hierro y níquel. El calc io , metal div alente, se enc uentra pr esente en cantidades moder adas en los v enenos , parte de este es us ado para la actividad fosfolipas a 2 ( PLA2) ( Mirsalikhov a et al. 1975).. Constituyentes orgánicos Los venenos contienen pequeñas c antidades de aminoácidos li br es. Se han encontr ado diferencias de acuerdo c on el v eneno, en algunos se tienen 7, en otros 11 y en otros 13 aminoácidos. En gener al s e encuentran los siguientes aminoác idos : glicina, ser ina, cisteina, lisina tirosina, ac ido aspártico, leusina, etc. En cuanto a los péptidos pres entes en el v eneno, se han ais lado péptidos ric os en prolina, pir oglutamilpéptidos , entr e otr os. (Quevedo.1999). Se ha visto que los carbohidr atos en los venenos de las ser pientes están pres entes en for ma de glicoproteínas más que en for ma de az uc ares libr es. Ha sido r eportada su pr esencia en varios v enenos . (Bas u et al. 1970) En los venenos de ser piente, el contenido total de lípidos es bajo, y el componente que se encuentra en may or c antidad es el fosfolípido, fosfatidilc olina ( Quevedo.1999). Muc hos venenos tienen un color amarillo debido a la pr esenc ia de L-amino ácido oxidas a, la c ual c ontiene rib oflavina como gr upo pr ostético. Diversos inv estigadores han reportado que el veneno amarillo contiene 200 veces mas L-amino-ác ido –oxidasa que el veneno blanc o ( Tu. 1977 en Quev edo.1999). Dentr o de los componentes de los venenos, las aminas biogénicas son en algunas ocas iones las causantes de dolor es muy fuertes; en diferentes casos c línicos se ha obs ervado que la pr oducc ión de dolor en el sitio de la mordedur a de s erpiente es más c omún par a la familia V iper idae y par a la subfamilia Cr otalinae que par a Elapidae e hidr ophiliidae ( Quevedo. 1999).

(13) Constituyente proteico Cerca del 70 al 90% del veneno de las ser pientes s on polipéptid os y proteínas, causantes de los princ ipales efectos en las vic timas ( Pineda. 2002). La may oría de las enz imas son hidr ofílicas con la notable excepc ión de L- amino ác id o oxidasa, la c ual causa la deaminac ión oxidativa de aminoácidos. Cerca de 26 enz imas, han s ido detectadas en los venenos de s erpiente. De estas enzimas, 12 s e encuentran en todos los venenos, aunque sus c ontenidos difieren s ignificativamente, y el resto están pr esentes princ ipalmente en ciertos grupos tax onómicos o son característicos solo en algunas espec ies (Lee. 1979). Las enzimas pr esentes en los v enenos se pueden clas ificar de acuerdo con la acc ión de es tas sobr e algún tipo de sus trato, y el pes o molec ular es útil par a s u identificación ( Tabla 1). Tabla 1. A lgunas propiedades de las enz imas enc ontr adas en los v enenos (tomada de Lee, 1979) Nom bre trivial Fosfolipasa A2. Substrato. Peso. típico. molecular. Fosfatidilcolina. 11000. –. 15000 L-amino. ácido. L-amino ác ido. oxidasa. 100000 130000. Fosfodiesterasa. Olig onuc leotidos. 115000. 5´-nucleotidas a. 5´-. 100000. mononucleotido s Fosfomonoesteras a. pnitrofenilfosfato. Deox iribonucleas a. DNA y RNA. 100000. –.

(14) Ribonuc leasa. RNA. Hialuronidasa. Ácido. 15900. hialur onico NAD- nucleosidasa. NAD. 100000. Arilamidas a. L-leusina. 100000. naftilamida Endopeptidas a Arginin a. ester. Cas eina,. 21400. hemoglobina. 95000. BAEE, TAME. 27000. hidr olas a Kininogenasa. – –. 30000 Plas ma. 33500. kininogeno, BAEE Enzima tipo tr ombin. Fibrinogeno,. 28000. BAEE. 33000. Factor X. 78000. Pr otr ombina. 56000. Factor V , BAEE. 20000. Acetilcolinesteras a. Acetilcolina. 126000. Fosfolipasa B. Lisolecitina. Activ ador del fator. –. X Activ ador protrombin Activ ador del factor V. Estas enz imas se diferencian además de la espec ificidad sobre el sustrato, por el tamaño molecular; y por el hec ho de ser pr oteínas su carga depende del pH del medio en el c ual s e enc uentre. Es tas difer encias se aprov echan par a dis eñar el pr oces o de separación ( Lee. 1979). Además de las enz imas entre los componentes proteicos de los venenos, se enc uentran las toxinas, como la c onv ulsina, la neur otox in a, entr e otr as..

(15) En cuanto a las no toxinas, no s e tiene información, debido a la dificultad par a estudiar las (Lee. 1979).. Mecani smo de acción del veneno Los venenos del las serpientes son unos de los más complejos de todos los venenos. Contienen 20 o más componentes difer entes y algo más del 90% del pes o sec o del veneno son proteínas, compr endido por gran variedad de enz imas, toxinas no enz imáticas y pr oteínas no toxicas , las cuales, en el c aso de Bothr ops, juegan diferentes papeles y tienen difer entes actividades en el envenenamiento ( Costa. 2003).. Actividad proteolítica También c onocida c omo activ idad inflamatoria aguda, es c ausada por un conjunto de fracc iones de veneno, bioquímic amente heterogéneas. Algunos ejemplos son: histaminas, pequeños peptideos, fosfolipasa A2, esteras a,. pr oteasas,. enz imas. liberadoras. de c ininas. (c alicreinas,. cininocr easas) y lectinas . Las fracciones de v eneno, frecuentemente tienen actividad indirecta, induc iendo o liberando potentes autacoides como la bradisinina, pr ostaglandina que actúan de manera c ompleja e interrelac ionada. En muchos cas os una sola fracción de veneno puede liberar var ias sustanc ias con ac tiv idad inflamator ia ( Costa. 2003) .. Acción sobre la coagulación y sobre las plaquetas El veneno bothropico posee la capacidad de activar factores de la coagulación s anguínea, ocasionando consumo de fibr inogeno y for mac ión de fibrina intr avascular, induc iendo frec uentemente inc oagulabilidad sanguínea. La may or ía de las ser pientes del gener o Bothrops pos een ais lada o simultáneamente, sus tanc ias capaces de ac tivar, fibrinogeno, protrombina y factor X. Nahas et al. realizar on exper imentos comparativos con v eneno de Bothrops s p enc ontrando var iac ión en la actividad coagulante en difer entes es pecies y subespecies ( Cos ta. 2003)..

(16) Actividad hemorrágica Es atribuida princ ipalmente a componentes es pec íf icos que s on conoc idos como hemorr aginas , metalopr oteinas que contie nen zinc. Son comunes en la familia V iper idae por un probable gen anc estral c omún. Las hemorr aginas pueden romper la integridad del endotelio vascular y tienen actividad desintegrina. Degr adan var ios componentes de la matriz extr acelular, c omo el colageno tipo 4, fibrolectina y laminina. También son inhibidoras de la agregación plaqueta ría. Tienen como posibles mecanismos de acc ión, la digestión enzimátic a de la lámina bas al de la microv asc ulatur a y la r uptura c ompleta de las c élulas endoteli ales ( Costa. 2003).. Técnicas de análisi s Electroforesis Es importante recor dar que no ex iste pr ueba alg una capaz de demos trar que una proteína es pura; s ólo existen para demostrar la pr esencia de impur ezas . Una de las téc nic as más usadas para deter minar los componentes de una muestra es la electr ofores is. La elec trofor esis es una téc nica en la cual las moléc ulas car gadas en solución, (pr oteínas, ácidos nuc leic os), migran bajo la influencia de un campo eléctr ico. Las pr oteínas es tán car gadas pos it iva o negativamente y la que pos ea la car ga mayor se mov erá mucho más r ápido en compar ación con las de menor c arga. La v eloc idad de migr ación a tr avés del campo eléctrico depende de la fuerz a del c ampo sobre la c ar ga neta, el tamaño y. la for ma de la molécula, así como la fuerza iónica, la. viscos idad, y la temperatur a del medio en el que las proteínas s e mueven (Sambr ook & Russell. 2001). Los geles de poliacrilamida han remplaz ado a los de almidón por s u mejor efecto como tamiz molecular y por proporc ionar el c ontrol de tamaña de sus poros utiliz ando conc entrac iones distintas de los monómer os de.

(17) par tida, además de pr es entar una ads orción despr ec iable del material proteic o. La poliacr ilamida es corrientemente el medio de sopor te más efectivo para la electrofores is de proteínas y pequeñas moléc ulas de RNA . El gel de poliacrilamida se pr epara mediante la polimer iz ación de archilamida con N 3N´-metilen- Bis- acrilamida, en un molde o y a en el recipiente en el que se va a r ealiz ar la electroforesis . La poliacr ila mida se prepara teniendo en cuenta dos parámetros : % T = ( acrilamida + bisacr ilamida) en gr por 100 ml % C = Bis- arcrilamida en ( gr/gr) ( agente entrecr uz ador) = Bis / ( acril + Bis) El %T se encuentr a entre valores de 5 – 20% y %C entr e v alor es de 2 – 10 % dependiendo de las nec es idades del tamaño del poro (Sambrook & Russell. 2001).. Sistema discontinuo El s istema de geles se prepara en una c olumna ver tic al ( o en plac a) y consiste en dos regiones: la s uper ior o gel c oncentrador y la infer ior o gel separ ador. El gel conc entrador esta menos conc entrado (tienen mayor tamaño de poro) que el gel s epar ador el gran tamaño de poro del gel concentrador per mite una may or mov ilidad de las par tículas de la muestra del gel separ ador. Este sis tema emplea difer entes iones de buffer en el gel comparado con los empleados en los depósitos de los electrodos. La mayor ía de estos sistemas tienen disc ontinuidad en la composición del buffer y en el pH. La muestr a es car gada s obre y a los largo del gel concentrador (s tac king) polimer izado s obr e la parte super ior del gel separ ador de pequeños por os ( Quev edo. 1999). Condiciones desnaturalizantes Klaus Wever y Mery Os born. demostr ar on en 1969 que los pesos. molec ular es de la may oría de las pr oteínas pueden ser deter minados al.

(18) medir la movilidad en geles de poli acrilamida con el detergente dodisils ulfato sódico (SDS) . A pH neutro con SDS al 1% y merc aptoetanol 0.1 M la may or ía de las proteínas multicatenarias s e unen al SDS y se dis ocian. Los puentes de dis ulfur o se abr en gr acias al mercaptoetanol, per diéndos e así la estructura sec undar ia. Las pr oteínas tratadas de esta maner a se c omportan como si tuvier an una for ma s imilar he idéntica relación c arga/masa. Dando c omo resultado que la movilidad efec tiva se relacione únic amente con el pes o molec ular de la pr oteína a caus a de la acción del gel como tamiz molecular ( Quev edo.1999) Si varias pr oteínas de pes o molecular c onoc ido son sometidas a electr ofor esis en gel en plac a, s e s epar an en una s erie de bandas y la repr es entación gr áfica de la distanc ia r ecorrida en func ión del logaritmo del pes o molecular da una línea recta. De este modo s i una proteína de pes o molecular desc onocido es s ometida a una electr ofores is de este tipo, junto con otras dos de pes o molec ular c onocido, el peso de aquella puede ser calculado con una exactitud var iable entre el 90 y el 95%. Se obtiene una mayor ex ac titud cuando los valores c onoc idos quedan por encima y por debajo del peso molecular desconoc ido ( Hames and Ric kWord. 1994). Por es tas raz ones, par a deter minar el gr ado de purez a de las muestr as y establecer el pes o molecular de las mis mas, se utiliza electr oforesis en gel en condic iones desnatur aliz antes , utilizando tinción con c oomas ie.. Mate riales y Métodos El v eneno de Bothr ocophias microphtalm us fue obtenido de un espécimen hallado en la res erv a el secr eto Gar agoa- Boy acá (N 5º 07' 29.3'', W 73º 16' 41.6'' Altitud 2015 ms nm). La ser piente fue llevada al laborator io GECO H donde se mantuvo en cautiv erio y se r ealizaban las extracciones del veneno. Los análisis de cuantificac ión e identificación de pr oteínas fueron hechos. en el. Centr o de Inv estigac iones en Bioquímic a de la. univ ersidad de los A ndes ( CIBI)..

(19) Extracción del veneno El v eneno se ex trajo haciendo que la ser piente mordiera sobre un plástico grueso, s e exprimen manualmente las glándulas y luego se recoge el veneno en un recipiente de v idr io. La c antidad de veneno extr aída v ar ió entre 40 y 50 µl por extr acción. El total de la ex tracción fue de 150 µl apr oximadamente.. Purifi cación y preservación del veneno Debid o al alto contenido de pr oteasas, después de extraer el v eneno este se mantiene a - 80º C. Al finaliz ar la extracc ión del veneno, se purifico con un filtr o par a jer inga c on poro de 0.2 micras de diámetr o, después se liofilizo y se tuv o congelado a – 80º C para que no se alter ar a su composición químic a. Des pués de liofilizar y pur ificar el veneno se res us pendier on 10 mg en 1ml de agua miliQ y se realizar on tres alícuotas , c on estas mues tras se realizar on los diferentes anális is.. Determinación de l a concentración de proteína por FolinLowry El método de Folin- Low ry se utiliz ó par a la deter minac ión de la concentración de pr oteína en. la solución de veneno. Para r ealizar la. curva de calibr ación s e utilizar on s eis soluciones de albúmina cér ica bov ina de diferente c oncentración (25, 50, 100, 200, 400 y 450 mg/dl) . Se analiz aron cuatr o r eplicas de la muestr a de v eneno, y s e ley eron en un espectr ofotómetr o a 620 nm. Para esta pr ueba las mues tras fuer on incubadas a temper atur a ambiente dur ante 10 minutos. Después se les agr egó r eac tivo de Folin- Low ry y se dejaron incubando dur ante 5 minutos a 55º C.

(20) Capa fina (ascendente) Téc nic a de s epar ac ión e identific ación de s ustanc ias químicas por medio de un s olvente que se mueve sobre una c apa delgada de un absorbente adecuado; este abs or bente, generalmente con un adhes iv o, s e deposita sobr e una hoja de v idr io o de otr o material que ac túa como sopor te inerte de la capa. La fuerza de gr avedad limita el acens o de disolv entes y manchas, que s olo asc ienden entre 10 y 18 c m s obre el punto de or igen, por lo general colocado de 10 a 15 mm del borde infer ior de la plac a, la cual s e acomoda en frasc os de v idrio de fondo plano, el borde inferior de la plac a s e sumerge unos 5 a 10 mm en el disolv ente, sin que llegue a la línea de or ig en. El inter ior de las cámaras de pequeño volumen se satura rápidamente de los. vapor es. del disolvente, lo cual acelera. la. cromatogr afía y aumenta la res olución ( Fons eca. 1998).. Electroforesi s en gel disconti nuo de poli acril amida y dodecil sul fato de sodio (PAGE- SDS). En la elec trofores is se uso 5 % de acrilamida en el gel superior con un pH de 6.8 y 12% de archilamida y pH 8.8 en el gel de s eparac ió n. La elec trofor esis fue realiz ada en un equipo de electr ofores is v ertical mini PROTEAN®, en pr es enc ia de dodesil s ulf ato de sodio (SDS) y en condiciones r educidas con β mercaptoetanol en un gel de 0.75 mm de espes or. Se c orr ió a 120 v oltios durante 155 minutos, con buffer de corr ido de pH 8.3 después se pus o en c olor ación de coomasie durante 24 horas par a luego decolor arlo durante 30 minutos en solución de ac ido ac ético glac ia l, metanol y agua; las bandas se observar on en un tr ansiluminador.. Tratamiento de l as muestras. Para s embrar las muestras se les agr ego buffer de c arga ( Laemli) 6X con dodesil sulfato de sodio al 10% (SDS) buffer tris HCl con pH 6.8, 2mercaptoetanol al 2%, az ul de br omof enol al 2% y glic erol; para as í denaturar las y lograr una mejor r esolución en el gel..

(21) Re sul tados A continuación s e pres entan los r esultados obtenidos en las dif er entes pruebas realiz adas. En la gráfica 1 se puede v er la correlac ión pos itiva de la abs orv ancia (nm) contra la c oncentrac ión (mg/dl) de pr oteína en la albúmina cérica bov ina (r2 = 0.9958, F=1748.003, p ≤ 0,001). Esta gráfica se hiz o con los valores de la tabla 2 y per mite extr apolar la concentr ación de pr oteína en el veneno. Tabla 2. V alor es de abs orbancia y conc entración de la curva de calibrac ión. concentr ación ( mg/dl). Absorbanc ia ( nm). 25. 0.157. 50. 0.360. 100. 0.617. 200. 0.998. 400. 1.937. 450. 2.17.

(22) Determinación de concentr ación por el método de Foli n-Lowry 500 450. Concentraci on (mg/dl). 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0. 0,2. 0,4. 0,6. 0,8. 1. 1,2. 1,4. 1,6. 1,8. 2. 2,2. Absorbanci a (nm). Gr afico 1. Deter minac ión de la conc entrac ión de proteína en la soluc ión de veneno el método de foli n low ry (r2 = 0.9958, F=1748.003, p ≤ 0,001) . La concentración fue calculada, además de por extr apolación, por el método del factor, el cual se encuentra div idiendo la sumator ia de la concentración en la s umator ia de la abs orbanc ia. Luego de hallado el factor este fue multiplic ado por el promedio de las absor banc ias de las muestras de v eneno. Σ de concentraciones: 1225 mg/dl Σ de absorbancias: 6.239 nm FACTOR = 196.34 Tabla 3. Valores de concentr ación obtenidos al multiplic ar la absor bancia de las muestr as por el factor (196.34) Muestra. Absor bancia (nm). Conc entrac ión (mg/dl). 1. 2.09. 410.35. 2. 2.15. 422.13. 3. 2.08. 408.38. 4. 2.20. 431.94. 2,4.

(23) La concentración ( mg/dl) de las muestr as s e obtuvo al multiplicar la abs or banc ia por el factor. Con esto se obtuv o el promedio de las concentraciones de veneno ( mg/dl), dando un r es ultado de 418.2 ± 10.98 mg/dl.. Ele ctrofore si s (SDS-PAGE). Se realiz aron var ias electrofor esis para lograr la c onc entr ación que proporcionar a el bandeo mas claro. En las figur as 2 y 3 vemos los dos mejor es bandeos en las diluciones 1/10,1/8 y 1/5. Además de esto también es neces ar io aclar ar la banda del c arr il 6 en las dos figur as, Esta banda (albúmina céric a bovina 66.000 Da), s e coloc o para detec tar los demás pesos moleculares del patrón de pes o molecular.. PM. 1/10. ( mg/dl). 41. 035. 1/8 51.293. 1/5 82.07. alb1/10. 1/3. 20.0. 136. 783. 1/1 205.175. Figur a 2. Electr oforesis en poliacr ilamida ( SDS-PA GE): Pozo 1: patrón de pes o molecular. Poz o 2: vacío. Poz o 3: veneno 1/10 (41.03 mg/dl). Pozo 4: v eneno 1/8 (51.29 mg/dl). Pozo 5: veneno 1/5 (82.07). Poz o 6: albumina 1/10 (20.0 mg/dl). Poz o 7: v ac ío. Poz o 8: veneno 1/3 ( 136.78 mg/dl). Pozo9: veneno 1/1 ( 205.17 mg/dl). Pozo 10: vacio.

(24) D ilución. 1/5. 1/8. 1/10. [ mg/dl]. 82. 07. 51.29. 41.03. alb 1/20. ptr. 10. 1/5. 1/8. 1/10. 82.07. 51.29. 41. 03. Figur a 3. Electr ofores is en poliacr ilamida (SDS- PA GE) : Pozo 1: v acio. Pozo 2: v eneno 1/5 ( 82.07 mg/dl). Pozo 3: 1/8 (51.29 mg/dl). Pozo 4: veneno 1/10 (41.03 mg/dl). Poz o 5: albúmina 1/20 (10 mg/dl) Pozo 6: patrón de peso molec ular. Pozo 7: veneno 1/5 (82.07 mg/dl). Poz o 8: veneno 1/8 ( 51.29 mg/dl). Pozo 9: v eneno 1/10 ( 41.03 mg/dl). Pozo 10: vacio. En la tabla 4 vemos el logaritmo de cada una de las bandas del patrón de pes o molecular. Tabla 4. Logaritmo del patrón de pes o molec ular. Peso molecular ( Da). Logaritmo pes o molecular. 37000 50000 66000 75000 100000 150000 250000. 4,568 4,698 4,819 4,875 5 5,176 5,397.

(25) En el grafico 2 s e puede ver la correlación pos itiva de la dis tanc ia migr ada (cm) c ontr a el logar itmo del pes o molec ular de ( mg/dl) del marcador de pes o molecular (catalog No. 161-0373 prec ision Plus Protein Standar ds). Esto permite encontr ar la ecuación para deter minar los pesos moleculares apr oximados, encontrados en el v eneno (Y= 0,1877X + 4,308 ;r 2 = 0,986,. Dist ancia migrada v s. Log PM 5,05 5 4,95 4,9. Log PM. 4,85 4,8 4,75 4,7 4,65 4,6 4,55 4,5 0. 0,5. 1. 1,5. 2. 2,5. 3. 3,5. Dist ancia migrada (cm). Gráfico 2. Distancia migrada Vs. Logar it mo del pes o molec ular. En la tabla 5 tenemos nos c entímetr os migrados de cada una de las 10 bandas encontradas en la elec trofor esis y el Y obtenido con la regres ión, al enc ontrar este Y se calcula el antilogar itmo para as i tener los pesos molec ular es de las bandas.. 4.

(26) Tabla 5. Identific ación del peso molec ular de las pr oteínas, mediante la dis tanc ia rec orrida en el gel. r 2 = 0,986. Centímetros. Y Obtenido c on la. migr ados. regres ión. 0,8 1,1 1,3 1,7 1,8 2,1 3 3,6 4 4.6. 4,45 4,51 4,55 4,62 4,64 4,70 4,87 4,98 5,05 5,17. antilogaritmo del Y obtenido c on la func ión ( PM calculado en Daltons) 28719,38 32695,71 35647,95 42376,21 44248,03 50374,37 74328,72 96335,87 114518,48 148424.95. Cromatografí a de capa fi na Para las cr omatogr afías de c apa fin a en las figur as 4 y 5 s e utiliz o uno o dos marc ador es de aminoácidos totales que se ven en el carril 1, ademas de este marcador tambien s e utilizaron marcadores de aminoác idos espec ificos c omo phenilalanina, glicina y tir osina. En la figur a 4 tenemos 4 mues tras de veneno en los c arr iles 6, 7, 8 y 9..

(27) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Figur a 4. Cr omatogr afía c apa fina. Carril 1: aminoác idos totales. Carril 2: patrón glisina.. Carril 3: patr ón ac ido glutámico. Carr il 4:. patrón. phenilalanina. Carril 5. patr ón tirosina. Carr iles 6, 7, 8 y 9: muestras de veneno; c onc entr ación 410.35 mg/dl..

(28) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Figur a 5. Cr omatogr afía c apa fina. Carril 1: aminoác idos totales. Carril 2: patrón glisina. Carr il 3: patrón acido glutámic o. Carr il 4: patr ón tiros ina. Carr il 5: patr ón phenilalanin a. Carr ile 6: aminoácidos totales. Carr il 7: muestra de v eneno filtr ado sin diluir.. An álisis de resultados Carácterísti ca s fí sicas Las c arac ter ístc as fís icas del v eneno ( lechos o, de color amarillo y tras nlúcido) indic an la pr esenc ia de L- aminoac ido oxidasa.. Ele ctrofore si s Des pués de r ealizar varias elec trofores is con diferentes diluc iones de la solución madre s e enc ontró que las concentraciones. que mejor. funcionaban fuer on 1/10 ( 41.03 mg/dl), 1/8 (51.29 mg/dl) , 1/5 (82.07 mg/dl) . Estas concentr aciones permitier on una c lara visualizac ión de las difer entes bandas ..

(29) Se. hallar on. alt as. concentr aciones. de. las. proteínas. que. se. enc ontr aban entre 42.376 y 50.374 Da que corr es ponden al peso molec ular de las endopentidasas (tabla 6), encar gadas de hidrolizar los enlaces peptídic os. En algunos venenos como son los de Cr otalus atrox y Bitis ari etans se han encontrado tres tipos de endopeptidas as, pr oteinasa a, b y c (Iw anaga y Suzuki.1979). Tabla 6.. Posibles enzimas pr esentes en el veneno, encontr adas de. acuer do a los pesos moleculares calc ulados a partir de la electr ofor esis . Pes o Mol ecular (Da ). 28,719,38 32,695,71 35,647,95 42,376,21 44,248,03 50,374,37 74,328,72 96,335,87 114,518,48 148,424,95. Nombre trivial Fosfo lipa sa A2 L-a mino á cido oxida sa Fosfo dieste rasa 5´-nu cleotidasa Fosfo monoe stera sa Deoxiribonu clea sa Ribonu clea sa Hya luronida sa NAD-nucleosida sa Aryla mida sa Endopeptida sa Arg in ina e ster hydro lasa Kinin ogena sa Enzima tip o tro mb ni Activador de l fa ctor X Activador protro mbin Activador de l fa ctor V Fosfo lipa sa B Fosfa tasa alca lina. X X. X. X. X. X. X. X. X. X X. X X X. X. Tabla 7. Efec to de las posibles enzimas enc ontradas en el v eneno ( BORN G. V. R. 1979). Enzima L-am ino oxidasa Kininogenasa Enzim a tipo trom bin Fo sf odie stera sa Activado r del factor X Fo sf atasa alcalina Argenina este r hidrolasa. Efect o Anticoagulante Inhibe la contracción mu scular Anticoagulante Baja notablem ente la pre sión sanguínea Anticoagulante dif ución del v eneno y participa en la necrosis. Hem orrágico.

(30) Cromatografía de capa fi na El res ultado de la cr omatogr afía de capa fina, indica la pr esencia de los siguie ntes. aninoácios. libres:. cistina,. histidina,. glic ina,. alginina,. hidr oxiprolina, treonina, ácido glutámico, alanita, pr olina, acido alfa animobutanóico y tirosina. Sin embar go no s e puede decir c ual se enc ontr aba en mayor conc entrac ión. El contenido de aminoácidos var ía de ac uerdo con el veneno, en algunos se tienen 7, en otros 11 y en otr os hasta 13 ( Quev edo, 1999). En gener al se enc uentr an glic ina, ser ina, c isteína, lis ina tirosina, ácido aspártic o y leuc in a (Quev edo.1999).. Conclusiones. Los res ultados de la elec trofor es is, indican la pr esencia de 10 pr oteínas de diferente pes o molecular . Sin embargo, par a poder deter minar con certeza la pr esenc ia de dichas proteínas y s u res pec tivo efecto en el veneno, es neces ar ia la utilización de otr as pruebas que utilicen sustratos espec íficos para cada una de las enz imas que s e puedan enc ontrar . La cr omatogr afía de c apa fina dio como res ultado la presencia de 11 aminoácidos , per o la concentrac ión de estos en el v eneno no er a lo suficientemente alt a par a s er detectada c on esta técnica. Para obtener mayor infor mación s obre el veneno de Bothroc ophias microphtalmus ser ía importante realizar pr uebas de dos is letal 50, dosis espec ífica, y dos is específ ica 50, para así calc ular su letalidad y per mitir un adecuado tratamiento de la mordedura. La caracteriz ación fue hec ha a partir de un sólo espécimen. Por lo tanto es importante la r ecolección de más individuos par a determinar si los result ados son gener ales a toda la es pecie..

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