Péptidos antimicrobianos en la hemolinfa de quilopodos

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(1)PEPTIDOS ANTIM ICROBIANOS EN LA HEM OLINFA DE QUILOPODOS. ELISA CHAPARRO AGUIRRE. UNIV ERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAM ENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ D.C. 2007.

(2) PEPTIDOS ANTIM ICROBIANOS EN LA HEM OLINFA DE QUILOPODOS. ELISA CHAPARRO AGUIRRE.. Trabajo de grado para optar al título de Bióloga.. Director: Pedro Ismael da Silva Junior. Doctor en Biología.. Codirector Em ilio Realpe. Biólogo M . Sc.. UNIV ERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAM ENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ D.C. 2007.

(3) TABLA DE CONTENIDOS. LISTA DE TABLAS .........................................................................................................4 LISTA DE IMÁ GENES ...................................................................................................4 1 INTRO DUCCIÓN ....................................................................................................4 2 SISTEMA INMUNE EN LOS INVERTEBRADOS..............................................7 3 PÉPTIDOS A NTIMICROBIA NOS. .......................................................................9 4 MEDICINA TRADICIONAL CHINA . ...................................................................11 5 OBJETIVOS...........................................................................................................12 5.1 Objetiv o General ...........................................................................................12 5.2 Objetiv os Es pec ífic os ...................................................................................12 6 MA TERIALES Y MÉTODOS ...............................................................................13 6.1 Colecta de Animales .....................................................................................13 6.1.1 Sc olopendra viridicor nis.......................................................................13 6.1.2 O tostigm us sp........................................................................................14 6.2 Estimulac ión de los Animales .....................................................................15 6.3 Extracción de la hemolinfa ..........................................................................15 6.3.1 Sc olopendra viridicor nis.......................................................................16 6.3.2 O tostigm us sp........................................................................................16 6.4 Purific ac ión de la hemolinfa ........................................................................17 Para las muestr as de Otostigmus sp. solo s e alcanzo a la pr epurif ic ac ión de los péptidos y se pr osiguió con los bioensay os. ..................................................17 6.4.1 Plas ma ....................................................................................................17 6.4.2 Hemocitos. .............................................................................................19 6.5 Bioensay os.....................................................................................................21 6.5.1 Microor ganismos ...................................................................................21 6.5.2 Activ idad A ntimicr obiana......................................................................21 6.6 Car acter izac ión de los péptidos..................................................................22 6.6.1 Es pectrometría de masa......................................................................22 7 RESULTA DOS ......................................................................................................23 7.1 Sc olopendra vir idic ornis ...............................................................................23 7.1.1 Resultados de la Actividad contr a M. Luteus, E. Coli y C. tropicalis en los Hemoc itos y en el Plasma en las Concentrac iones ( 5, 40 e 80%). 23 7.1.2 Resultados de ens ay os c on los picos que pres entar on activ idad antibacteriana contr a M. luteus y E. c oli, analizados con c olumna analític a. 24 7.1.3 Masa de las moléc ulas que pres entaron actividad..........................25 7.2 Otostigmus s p................................................................................................26 7.2.1 HPLC de las muestras estimuladas y de las muestr as no estimuladas ............................................................................................................26.

(4) 7.2.2 Resultados de actividad par a E. coli y C. tr opic alis en los hemoc itos, plasma y cuerpo. ..............................................................................27 7.2.3 Masa de las moléc ulas que pres entaron actividad..........................28 8 DIS CUSIÓ N...........................................................................................................28 8.1 Sc olopendra vir idic ornis ...............................................................................30 8.2 Otostigmus s p................................................................................................31 9 CONCL USIONES .................................................................................................32 10 AGRADECIMIENTOS ......................................................................................33 11 BIBLIOG RA FIA ..................................................................................................34 LISTA DE TABLAS Tabla 1 He moc itos pr esentes en el sis tema inmune de los artr ópodos. ...............8 Tabla 2 Características es tructur ales de las princ ipales clas es de péptidos catiónicos........................................................................................................................10 Tabla 3 Actividad antimicrobiana pr esentada por las diferentes fracciones (p) de los difer entes pools de moléc ulas obtenidos en la ex tracci ón ácida del plasm a y de los hemocitos ( 5, 40, 80%). ...................................................................................25 Tabla 4 Actividad antimicr obiana pr esentada por las diferentes fracciones de la extr acción ácida de los hemocitos da la dilución al 40%. ......................................28 LISTA DE IMÁGENES Figur a 1 Sc olopendra viridicornis ...............................................................................14 Figur a 2 Otostigmus s p................................................................................................15 Figur a 3 Ex tracc ión de hemolinfa ...............................................................................16 Figur a 4 Obtenc ió n de la hemolinfa de Otosti gmus sp...........................................17 Figur a 5 Speed Vac, Sav ant Ins truments, Inc. Figur a 6 Centrif ugue 5804R Eppendorf Fuente: Chaparr o, 2006. Instr uments, Inc .............................................................................................................18 Figur a 7 HPLC Shimatzu modelo SCL- 8a .................................................................19 Figur a 8 Matric es más utilizadas para MALDI. ........................................................23 Figur a 9 Es pectro del MS- MS para la fracción PI presente en la c onc entrac ión de 40% del hemoc ito y el perfil de HPLC indic ando la fracc ión analizado..........26 Figur a 10 Perfiles del HPL C de las muestr as de plas ma al 40% inducidas y no inducidas. ( PONI= Plasma, Otostigmus No Inducido; POI= Plas ma Otostigmus Induc ido) .........................................................................................................................27 1. Los. INTRODUCCIÓN. artr ópodos constituyen el gr upo más. div ers o del Reino Animal,. pres entando una distr ibuc ió n muy amplia en todos los ec osis temas y hábitats. Esto nos lleva a c ues tionar nos cuales son los factores que han per mitido tan.

(5) amplia distr ibuc ión y éx ito a estos or ganis mos. Si tenemos en cuenta que muchos de los ambientes donde se enc uentran, muestran una alta pr esencia de microor ganismos patógenos ; podemos afirmar que parte de s u éxito en la colonizac ió n de dic hos ambientes está en los mecanis mos de defens a y en su sistema inmune. Uno de los pr incipales componentes del s istema inmune tanto en v ertebrados, como en inver tebr ados, son los péptidos c on func iones antimicrobianas, los cuales c ontrolan el cr ecimiento de la invasión de los difer entes patógenos que pueden atac ar al individuo. Por esta raz ón s e hace impor tante su estudio, no solamente par a entender el éx ito de los invertebr ados y sus mecanis mos de defensa, s ino también par a buscar alternativ as en la lucha c ontra las enfer medades infecciosas en el ser humano. Hasta el presente, ha sido pos ible conseguir gr andes avances en este c ampo, princ ipalmente en el estudio de ins ectos ( Boman, 1986; Boman and Hultmar k, 1987) y en algunos grupos de ar ácnidos (Silva Junior 2000; Bulet 1999). A pesar de es o, faltan muchos grupos por s er estudiados, los cuales pueden darnos un may or conocimiento del sistema inmune de los artr ópodos. Este es el cas o de los miriápodos, de los c uales, s on desconocidos sus mecanis mos de defensa. Los mir iápodos son artr ópodos terr estr es, los c uales están div ididos en cuatro clases: Chilopoda, Diplopoda, Pauropoda y. Sy mphyla. Su cuerpo está. articulado en varios segmentos, en los cuales no se observ a una dif erenciac ión clara entr e tórax y abdomen. Nor malmente, de activ idad noc tur na, se encuentran en lugares oscur os y húmedos tales como cav ernas, bajo piedr as, troncos caídos, hojar asc a etc. Los quilópodos se carac ter iz an por tener un par de patas por s egmento y los difer entes órdenes se definen por el número de estos. Este grupo esta s ub-.

(6) dividido. en. cinco. ordenes:. Geophilomor pha,. Scolopendromor pha,. Lithobiomorpha, Scutiger omorpha y Cr ateros tigmo mor pha. Hasta el mo mento se han descr ito apr oximadamente 1200 es pecies de quilópodos, per o se calcula que este número puede llegar a 2500 espec ies . En Br as il han s ido descr itas aprox imadamente 150 espec ies . El or den Sc olopendr omor pha se encuentra más frecuentemente en regiones tropic ales y subtr opic ales . De este orden se han descr ito 350 es pec ies par a la región Neotropical de las cuales 19 es pec ies son br asileras y 8 han s ido encontr adas en el estado de São Paulo (Chagas Júnior 2003). En este or den encontr amos las escolopendr as, las cuales viv en en ambientes donde la pr esencia de bacterias, hongos y agentes patógenos es muy alta. Xy la nder y Never mann ( 1990) tr abajaron c on este grupo, en el cual detectaron la pr esencia de s ubs tanc ias con ac tiv idad antib acter ia na en la hemolinfa, mas no llegar on a pur ificar ni a car acterizar estas moléculas. Guang et al. (2006) hicieron un tr abajo de pur ific ación y carac ter izaron la esc olopendr ina (un péptido antimicrobiano presente en el v eneno de las esc olopendr as). En la medic ina tradic ional china, el extr acto del c uer po de las escolopendras es conoc id o por la pr opiedad de disminuir los s íntomas del deterior o del s istema nerv ioso c entral. Ex isten v arios estudios s obr e como us ar el cuerpo de la escolopendr a Scol opendr a s ubspinipes m utilans para tratar los síntomas del mal de A lzheimer´s (Y uhao Ren,et al. 2006; Pei- Gen Xiao, et al. 2005) . Es. por. esto. que. la purificac ión y. c aracterizac ión. de. los. péptidos. antimicr obianos y el c onocimiento del func ionamiento de su s istema inmune se tor nan muy inter es antes y potenc ialmente útiles en el tr atamiento de enfer medades espec íficas..

(7) 2. SISTEM A INM UNE EN LOS INVERTEBRADOS.. En los artrópodos la capacidad de reconoc er entr e los tejidos propios y los ajenos por parte del sistema inmune, es coordinada por la acción combinada de v arias células sanguíneas y div ers os factores humorales.. En es tos. organismos las func iones inmunológicas mas importantes (fagoc itos is y encapsulación), s on dir igidas por dos tipos de c élulas pr incipalmente: Los granuloc itos y los plas matocitos, que a s u vez son apoyados por otros hemocitos difer entes (Tabla 1). Cuentan, entonces, con una gran v ar iedad de moléculas, capac es de lisar los microor ganismos, unirse a las paredes c elulares de los microor ganis mos aglutinándolos y fav or ecer la fagoc itosis por medio moléculas líticas y antimicr obianas (A BBAS & ANDREWS, 2005). Es tos animales no presentan memoria in munológic a ni linfocitos específicos para antígenos .. INM UNOCITO. ABREVIATURA. CARACTERISTICAS. Pr ohemocitos. PRs. Células ger minales se cree que son. la. fuente. multiplicación. de. par a. la. hemoc itos. pos tembr ionales Plasmatoc it os. PLs. Gr an pres encia en la hemolinfa.

(8) de los artr ópodos Gr anulocitos. GRs. Mas pr imitiv os, pr esentes en todos los artr ópodos. Esfer uloc itos. SPs. Coagulocitos. COs. Adipohemocitos. A Ds. Pueden. c ons iderars e. como. granuloc itos mas desarrollados. Oenoc it oides. OEs. Se cree que son originados de los plasmatoc it os. Tabla 1 Hemocitos pres entes en el s istema inmune de los ar trópodos. Los GRs se encuentr an principalmente en el citoplasma y constituy en más del 30% de los hemoc it os encontr ados en la hemolinfa de los artr ópodos. Es tos son los que contienen los factor es causantes de la coagulac ión. La función de los GRs en los invertebr ados s ería equivalente a la de los linfocitos B y a los T en los v ertebrados. Las otras c élulas de gran importancia en el sistema inmune de los artr ópodos son los PLs, los cuales, en los ver tebr ados, se comparan c on los linfocitos T ases inos . Estas células se enc uentran en grandes cantidades en la hemolinfa en gener al de los artr ópodos. Cuando el sistema inmune de los ar trópodos identifica una inv as ión por microor ganismos, los hemoc itos se organizan for mando caps ulas alr ededor de los or ganis mos invas ores, matándolos por hipox ia o por la acc ión de sus tanc ias tóxicas que son liberadas entre los nódulos ( CERENIUS, 1998). Las s ubstancias antimicr obianas en los ar trópodos pueden estar pr esentes natur almente (s istema c ons titutivo), o aparec er después de recibir un estimulo (sistema induc ido). El sistema inmune de los quelicerados es cons ider ado.

(9) “cons titutivo”, y a que pr esenta un alto número de substancias antimicr obianas sin la necesidad de r ecibir un estimulo pr evio ( Chaparro E. & P.I. Silva Junior 2007), mientr as que en los insectos enc ontramos var ios or ganismos que neces it an de un estimulo previo par a produc ir las s ubstanc ias antimicrobianas. Estas desapar ec en apr oximadamente tr es semanas después de pasar el estimulo y s e formar an de nuev o al rec ib ir un nuev o estimulo (Chadw ick, et al. 1967). 3. Los. PÉPTIDOS ANTIMICRO BIANOS.. péptidos. antimicr obianos. de or igen. animal. pos een c ar acter ísticas. estr ucturales muy diversas, en su mayor ía son péptidos catiónicos, que pueden ser clasific ados en cinco grupos principalmente dependiendo de su estr uctur a primar ia y s ecundar ia (Tabla 2) . Son de naturaleza anfipática, pueden ser linear es o cíc licos y su tamaño no es s uper ior a los 10 kDa ( HWA NG & V OG EL apud SIMONE & SOUZA, 2002).. Clase Lineares con estruct ura β. Estructura. Fuente. 2-3 β o 2-3 enlac es Cys. Plantas, insectos,. (defens inas, thioninas,. crustáceos,. protegr inas,. serpientes , c élulas. polifemusinas) .. de mamíf eros (Neutr ófilos,.

(10) plaquetas, macrófagos, células de Paneth), gar ganta, tr aquea e in testino. Lineares con hélice α. Hélices anfipáticas. Ins ectos, anfibios,. frecuentemente con. crustáceos,. retorcimiento en el medio.. ma míf er os y bac ter ias.. Lineares con hom bros. Hélice de Poli- Pr o Tipo II. Neutr ófilos bovinos e insectos.. Cíclicos con Loops. Estr uctura cíc lica. Neutr ófilos bovinos,. covalente que pueden. bac ter ias y. pres entar uno o mas. serpientes .. enlaces SH. Derivados de grandes. Compleja pres enta. péptidos con función. enlaces SH. Plantas. desconocida Tabla 2 C aracterísticas estructurales de las principales clases de péptidos catiónic os Fuente: Revista Biotecnologia Ciência & D esenvolv imento Nº 24 –Enero - Febrero 2002.. El mec anismo de acción se bas a pr inc ipalmente en la unión del péptido a la me mbr ana c elular del micr oor ganismo, inhibiendo la síntes is de los metabolitos vitales (con dif er entes estrategias), a los organismos inv asor es causando la muerte de los mis mos ( Grafica 1)..

(11) Gráfica 1 Posibles m ec anis mos de acción de los péptidos antimic robianos Fuen te: Rev ista Biot ecnologia Ciência & Des envolvimento - nº 23 - nov em bro/ dezembro 2001.. La acción de los péptid os se puede pres entar en diferentes c ompartimentos celulares y es por esto que estos compuestos pueden ser consider ados fundamentales en los estudios para el des arr ollo de medicamentos contra patógenos r es istentes a los antibióticos que exis ten actualmente.. 4. MEDICINA TRADICIONAL CHINA.. En la medicina tradicional c hina s e cree que var ios quilópodos tienen propiedades c urativas, tales c omo el alivio de s íntomas r elac ionados con enfer medades degenerativas del sistema nervioso central, como por ejemplo, la per dida de la me moria. Yuhao Ren, et al. en el 2005 trabajaron con el efecto de la Sc olopendra s ubspinipes mutilans sobre el Alz heimer obteniendo una mejor a s ignificativ a en los pac ientes, al descubrir un aumento en s u func ión cognitiva..

(12) Por muc hos años estos animales han s id o utiliz ados para cur ar diferentes enfer medades. Según la tr adic ión china, las escolopendras ay udan c on los dolores r eumáticos, c on la gripa, prev ienen el c anc er y son c apac es de calmar las c onvuls iones. Su capacidad de absorción de agua les permite prev enir la tuberculosis mic o bac ter iana y la dermomic osis. En la pr actica popular lo que se hace es hervir la esc olopendra viv a en agua caliente, seguido a esto se pone el c uerpo a sec ar en el s ol y des pués el cuer po es molido (sin la cabez a ni las patas del ult imo segmento) . El polvo obtenido es empleado en el manejo de las enfer medades anterior mente menc ionadas. A pes ar de no c ontar con un soporte científic o hasta ahora, es ta tradición tiene dos cos as a favor . La pr imera es que dados los miles de años de exper imentación y el hec ho de que aun estas pr ácticas sean v igentes, nos lleva a pensar que tienen que funcionar de alguna for ma. La segunda la c ombinac ión de 2 for mas de conoc imiento: el científico y el tradic ional.. 5. 5.1. OBJ ETIVOS. Objetivo General. Deter minar la actividad antimicr obiana de los péptidos pres entes en la hemolinfa de los quil ópodos: Sc olopendra viridicornis y de Otostigmus s p.. 5.2. Objetivos Específicos.

(13) Pr obar la ac tiv idad antimicrobiana de los péptidos pres entes en la hemolinfa de los quil ópodos objeto del pr esente estudio. Caracter izar los péptidos que pr esentan ac tiv idad antimicrobiana, utilizando espectr ofotometría de masa ( MALDI-TOF/ Pro) Identific ar el mec anismo de defensa que utiliz an los quilópodos para defenderse contr a los patógenos a los que se enc uentran constantemente expuestos.. 6. 6.1. MATERIALES Y M ÉTODOS. Colecta de Animales. 6.1.1 Scolopendra viridicornis Los animales de la pr imera especie con la c ual se tr abajó (Scol opendra viridicor nis –Ver figura 1-), fuer on colectados de s u ambiente natur al. La colecta s e realizó en el estado de Toc antins ( 9° 24’ 06.49’’S; 48° 10’ 55.88’’ O; 325 msnm) en Br asil. Se colectaron 2 animales..

(14) Figura 1 Sc olopendra viridic ornis Fuente: htt p://goldenphoenix exotic a.com/cent.html. 6.1.2 O tostigmus sp.. Los animales de la segunda es pec ie con la cual s e trabajo (Otosti gmus s p. – Ver figura 2-) fuer on tomados de su ambiente natural. La colecta se realiz ó en los alrededores del Instituto Butantan ( 23° 34’ 08.00’’ S; 46° 43’ 10.77’’ O; 744 msnm), en São Paulo, SP, Brasil. Se colectaron siete animales, los cuales fueron s eparados en dos gr upos, dejando un gr upo c ontrol y el otro estimulando con micr oorganismos..

(15) Figura 2 Ot ostigmus s p. Fuente: Silv a Junior 2007. Para el grupo c ontrol se utilizo una hembr a y dos machos. Mientras que en el grupo estimulado, se utilizar on tr es mac hos (un juvenil) y una hembra.. 6.2. Estimulación de los Animales. 5 Para la inmuniz ación experimental, fuer on empleados 500 uL de Echerichi a coli (Bacteria Gr am Negativa) y 500 uL de Micr ococc us luteus. ( Bacteria Gram. Positiva). Estos fueron c entr ifugados y el pellet fue iny ectado en la región del vaso dorsal en la me mbrana articular entre el VII y el V III s egmento del cuerpo de los c uatro animales utilizando una jer inga de insulina esterilizada. La hemolinfa de estas escolopendras se colectó al pas ar tres días después de la inoc ulac ión y los hemoc itos fueron aislados del plas ma, como será descrito mas adelante.. 6.3. Extracción de la hemolinfa.

(16) 6.3.1 Scolopendra viridicornis. Los animales fueron anestes iados con CO2 prov eniente de hielo s eco y posterior mente fijados en una s uperfície plana para la extr acción de la hemolinfa. Esta fue r ealizada por punción del vas o dorsal en la me mbr ana articular entre el VII y el VIII segmento del cuer po (f igur a 3). Para esta oper ación, se empleó una jer inga de ins ulina esterilizada y soluc ión antic oagulante (tampón- citr ato). De esta es pec ie se extrajeron 2 mL de cada animal.. Figura 3 Extracción de hem olinf a. 6.3.2 O tostigmus sp.. Debido al tamaño de esta especie fue necesar io desangrar a los animales. Para lo cual cada uno de los indiv iduos ex per imentales fue anestesiado con CO2 ,. prov eniente de hielo seco, des pués de esto fueron dec apitados y. fragmentados. Los segmentos obtenidos fueron centr ifugados dur ante 30 minutos para extraer la hemolinfa usando un medio filtrante. Para lo c ual se utiliz ó s oluc ión anticoagulante y un colador adaptado a un falcon, el cual a su vez había sido esterilizado anterior mente. inmuniz ado) se colectaron 150 uL.. De cada grupo (contr ol e.

(17) Figura 4 Obtención de la hem olinf a de Ot ostig mus sp.. 6.4. Purificación de la hemolinfa. Para las muestr as de Otosti gmus s p. solo se alcanz o a la prepur ificac ión de los péptidos y s e pros iguió c on los bioensayos.. 6.4.1 Plasma. El plasma de las escolopendras no inmunizadas e inmuniz adas después de ser conc entr ado en una centr ifuga al v acío ( Speed V ac, Savant Instr uments, Inc Ver Figur a 5- ), fue r esus pendido en agua Milli-Q ac idificada c on Ac ido trifluoroacético ( TFA) 0,05%. La soluc ión s e mantuv o en baño de hielo dur ante 30 minutos, con agitac ión constante..

(18) El sobrenadante, obtenido por c entr ifugac ión a 16.000 x g durante 30 minutos a 4°C ( Centr ifugue 5804R Eppendorf Instr uments, Inc - ver figur a 6- ) , fue aplicado en tres columnas Sep- Pak C18 (Water Assoc iates) unidas en s erie, equilibradas. con. agua. acidific ada.. Tres. diluciones. fueron. realizadas. utiliz ándose diferentes c onc entr aciones de acetonitr ila (5, 40 y 80%) en agua acidificada.. Figura 5 Speed Vac, Sav ant Instruments, Inc.. Figura 6 Centrif ugue 5804R Eppendorf. Fuente: C haparro, 2006.. Instrum ents, Inc. Fuente: Chaparro, 2006.. Después de las diluciones, se obtuv ieron tr es fracciones al 5%, 40% y 80% con difer entes tipos de moléculas. Estas fracciones fuer on conc entradas en centrifuga al v acío, resus pendidas en agua Milli-Q ac idific ada ( TFA 0,05%) y sometidas a cr omatogr afía liquida de alta r esolución (HPLC). La purificac ión fue realizada utilizando el sis tema de HPLC Shimadzu modelo SCL- 8ª ( ver figura 7), con columna de fase rev ersa s emi- pr epar ativa del tipo JUPITER C18 (250 mm x 10 mm, Phenomenex™), y con un gradiente de c onc entr ación de 0 a 20% para 5%, de 2 a 60% para 40% y de 20 a 80% par a 80% de acetonitrila acidificada (ACN/TFA) dur ante 85 minutos . El flujo del HPLC fue de 1,5mL/min y la. abs or banc ia del efluente fue. monitor eada a 225 nm. Las fracciones de los picos fueron c olectados.

(19) manualmente, concentrados en centr ifuga al vacío y r es uspendidas en agua Milli- Q.. Figura 7 H PLC Shimat zu modelo SCL-8a Fuente: C haparro, 2006.. La pr esenc ia de activ idad antibac teriana en estas fracciones fue deter minada por medio del ens ayo de inhibición de crec imiento en medio líquido. Los. pic os que presentaron actividad antibacteriana en las. diferentes. conc entr aciones, pas aron por una etapa de purificac ió n por HPL C utiliz ándose una columna de fase rev ersa analític a del tipo JUPITER C18 (250 mm x 4.60 mm, Phenomenex™) , con un flujo c ons tante de 1 mL/min y con un gr adiente de conc entr ación calc ulado a partir da concentración y del tiempo donde se pres entaron en la colecta inicial.. 6.4.2 Hemocit os.. Los hemoc itos de las esc olopendr as después de ser conc entrados por medio de centr ifugac ión al v ac ío, f uer on res us pendidos en Acido acétic o 2 M. La soluc ión fue mantenida en un baño de hielo dur ante 30 minutos , con agitac ión cons tante. El sobr enadante, obtenido por c entr ifugación a 16.000 x g por 30 minutos a 4°C, fue aplicado en tres columnas Sep- Pak C18 (Water Ass ociates).

(20) unidas en ser ie y equilibradas con agua ac idificada c on el objetivo de prepurific ar los péptidos antimicr obianos. Tr es diluciones fuer on realiz adas utilizándos e dif er entes concentr aciones de acetonitr ila ( 5, 40 y 80%) en agua acidificada. Después de la dilución, se obtuvieron tr es fracciones 5%, 40% y 80% con un difer ente pool de moléculas. Estas fracciones fueron conc entradas en centrifuga al vacío, resus pendidas en agua Milli- Q acidif icada ( TFA 0,05%), y sometidas a cr omatogr afía liquida de alta res oluc ión (HPLC). La purificac ión fue r ealizada util iz ando una columna de fas e r ev ersa s emipreparativa del tipo JUPITER C18 ( 250 mm x 10 mm, Phenomenex™) con un gradiente de c oncentr ac ión del 0 al 20%, para 5%; del 2 al 60%, para 40%; y del 20 al 80%, para el 80% de acetonitr ila acidificada (A CN/TFA) dur ante 85 minutos. El flujo del HPLC fue de 1,5mL/min y la absor banc ia del efluente fue monitor eada a 225 nm. Las fracciones fuer on colectados manualmente, conc entr ados en centr if uga al v ac ío (Sav ant Ins truments, Inc) y rec ons tituidas en agua Milli- Q. La pr es enc ia de actividad antibacter iana en estas fracciones fue deter minada por ens ayo de inhibic ión de crec imiento en medio líquido. Los. pic os que presentaron actividad antibacteriana en las. diferentes. conc entr aciones pasar on por una etapa de purificac ió n por HPLC utiliz ándose una columna de fase rev ersa analític a del tipo JUPITER C18 (250 mm x 4.60 mm, Phenomenex™), con un flujo c onstante de 1 mL/min. La absor bancia del efluente fue monitor eada a 225 nm, y con un gr adiente de concentrac ión calculado a par tir de la c onc entr ación y del tiempo donde s e pr esentaron en la colecta inic ial..

(21) 6.5. Bioensayos. 6.5.1 M icroorganismos. Los organis mos utilizados en los ensay os fuer on: Microc occus luteus A 270 (bac teria Gram Positiv a), Ec herichia coli SBS 363 (bacteria Gr am negativ a) y la levadur a Candida tropicalis.. 6.5.2 Actividad Ant imicrobiana. Para deter minar la actividad del péptido fue utilizado el ens ayo de inhib ic ió n de crecimiento de las bac ter ias y de la lev adur a en medio líquido descrito por Bulet et al., (1993). La medida de la abs orbancia de los cultivos c elulares, después del tiempo de incubac ión, fue r ealizada en el lector de placas IEMS (LABSY STEM™). En un primer momento todas las fracciones de las conc entrac iones iniciales (5%, 40% y 80%) fuer on sometidas al ens ay o de inhibición. Las fracciones que pres entaron activ idad en el pr imer análisis fueron purificadas y sometidas nuev amente a ensayos de inhibición de cr ecimiento.. 6.5.2.1 Ens ayo de Inhibición de Crecim iento en medio liquido. A 20 uL de la fracción a s er probada o de agua (control), aplic ados en pozos de una micr o plac a de ELISA , fuer on adicionados 80 uL de medio de cultur a pobre en nutr ientes ( PB = Bac to - Peptona 1%; NaCl 0,5% ( m:v); pH 7,4) , el c ual contenía una sus pensión de un c ultiv o de bacter ias en cr ecimiento. El crecimiento bacter ia no fue analiz ado midiendo la absorbanc ia del cultivo.

(22) (Materiales y Métodos 5.5.2) después de 12 a 18 horas de inc ubac ión a 37° C y a agitación constante.. 6.5.2.2 Ens ayo de Inhibición Ant imicótico La levadura C. tropicalis (concentración final: 104 células/mL) fue resus pendida en un medio de crecimiento que c ontenía dextr os a de papa 1,2% ( m:v) [POTATO DEXTROS E BRO TH]. 80 uL de es a s uspensión fue aplicada en pozos de micr o placas de ELISA las c uales c ontenían 20 uL de agua (control) o de la fracción a ser analiz ada. La plac a con el medio de c ult ivo fue s ometida a agit ac ió n c onstante a temper atura de 37° C. La primera av aluac ión del crecimiento de la lev adur a fue por la pres encia o la ausencia de la for mac ión del levaduras en el pozo. Después de 24 a 48 hor as el crec imiento del hongo fue analizado midiendo la absor bancia del cultivo. 6.6. Caracterización de los péptidos. 6.6.1 Espectrometría de m asa. Se utilizo es pectr ometría de masa par a analiz ar la mas a de las moléculas que pres entaron ac tiv idad antimicr obiana. Los equipos utilizados par a es tas medidas fueron: Ettan M ALDI-TOF/Pro (Amershan Bioscience) equipado c on láser de nitrógeno. Las mues tras fueron aplic adas junto con una s olución satur ada de la matr iz en acetonitr ila: agua (50:50) con 0,1% de ác ido tr ifluor oacétic o (Ver Figur a 8). Los espectr os fueron obtenidos en el modo positivo con un voltaje de acelerac ión de 20kV. Cada espectr o es la sumatoria de 200 pulsos del láser..

(23) Como r esultado tenemos un perfil de raz ones mas a/c arga ( m/z). Se hizo un anális is de péptidos utiliz ando el equipo en el modo reflectron y un análisis de proteínas de tipo linear.. Figura 8 Matrices más utilizadas para MALDI. Fuente: htt p://www.chemistry.wustl.edu/ ~msf/damon/m aldi_matrices.html. Equipo Micromass Q-TOF Ultima API (M anchester, Inglaterra). Las mues tras fueron aplic adas por medio de infus ión por bomba de jeringa en flujo de 1uL/min e ionizadas en la fuente nanoflow . Las condiciones del equipo fueron: potencial del capil ar de 3.1 kV, temper atura de la fuente de 80oC, voltaje del cono 75V y ener gía de c olis ión de 15- 40 eV.. En la disociac ión. inducida por c olis ión ( CID) para los experimentos de MS/ MS s e utilizo ar gón como gas de c olis ión.. 7. 7.1. RESULTADOS. Scolopendra viridicornis. 7.1.1 Resultados de la Actividad contra M . Luteus, E. Coli y C. tropicalis en los Hem ocitos y en el Plasma en las Concentraciones (5, 40 e 80%)..

(24) Utiliz ando ens ayos de inhibic ión de cr ecimiento fue detectada la actividad antibacteriana y antimicótica en el extr acto ác ido del plasma y de los hemocitos de las escolopendras en las dif er entes concentr aciones [5%, 40%, 80%]. El extracto ácido del plasma en la c oncentrac ión al 5% pr es entó actividad contra la bacteria Gram Negativ a E. c oli y contr a la lev adura C. tropicalis. Las conc entr aciones de 40 y 80%, presentaron actividad contra la bacteria Gram Positiva M. luteus y nuevamente se detec tó ac tiv idad contr a C. tr opic alis. En el extr acto ácido de los hemocitos se enc ontr ó actividad antibacteriana contra las bacterias Gram Pos itivas y las Gram negativas en la concentrac ión de. 40%.. Mientr as. la. de. 80%. presentó. actividad c ontr a todos. los. microor ganismos con los que se pr obo (M. luteus, E. coli y C. tropicalis).. 7.1.2 Resultados de ensayos con los picos que presentaron actividad antibacteriana contra M . luteus y E. coli, analizados con columna analít ica.. Para r ealizar la segunda purific ación se trabajo con las fracc iones que pres entaron. activ idad. antibacteriana. total. de. las. primeras. fracciones. analiz adas. Con tal pr opós ito se abrió el gradiente de c ada uno de las fracciones en el HPLC y después de esto se observ o nuev amente la actividad de las fracciones colectadas. Las fracciones que confir maron actividad se mues tran en la Tabla 3..

(25) CARACTERISTICAS DILUCIÓN. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA. MUESTRA. FRACCIÓN. PLA SMA. 6. M. luteus. E. coli PI, P1, P7,. 5%. P9 PLA SMA. 11. P2. PLA SMA. 1. P6, P18. PLA SMA. 13. P3, P4,PI,. 40 %. 80%. C. tropicalis. P4, P10. F1 HEMÓCITOS. PI. X. X. HEMÓCITOS. P1. X. X. PLA SMA. 15. P21. PLA SMA. 11. HEMOCITOS. 6. P2. HEMOCITOS. 10. P6, P10,. P20 P10. P12, P13 HEMOCITOS. 1. PI, P1, P5, P6, P7. HEMOCITOS. 18. HEMOCITOS. 5. PLA SMA. 10. PI. P8 P3. P7. Tabla 3 Actividad antimicrobiana pres ent ada por las diferentes fracciones (p) de los diferent es pools de moléc ulas obtenidos en la extracción ácida del plasma y de los hemoc itos (5, 40, 80%).. 7.1.3 M asa de las m oléculas que presentaron act ividad. Las diferentes fracciones que presentaron activ idad total antimic ótic a y antibacteriana, fueron analizados por espectrometr ía de masa para determinar la mas a de las moléculas. De las moléculas analiz adas, el PI de la.

(26) conc entr ación de 40% de los hemoc itos presentó un peso molecular de de 4306,74 Da ( Figura 9). De los otros picos que pres entaron ac tiv idad antimicr obiana analiz ados en el MALDI y en el MS- MS, no fue posible determinar su pes o molecular.. Figura 9 Es pect ro del MS-MS para la f racción PI presente en la concentrac ión de 40% del hem ocit o y el perf il de H PLC indic ando la fracción analizado.. 7.2. Otostigmus sp.. 7.2.1 HPLC de las m uestras estimuladas y de las m uestras no estim uladas.

(27) En los perfiles observados des pués del análisis de las difer entes fracciones obtenidas del grupo induc ido y no induc ido de O tostigmus s p., no se observaron diferencias significativas. Sin embar go los perfiles observados del plas ma en la fracción de 40% muestr an una dif er encia impor tante entre los dos grupos.. Figura 10 Perf iles del HPLC de las muestras de plasma al 40% inducidas y no inducidas. (PONI = Plasm a, Otostigm us No I nducido; POI = Plasm a Ot ostigmus Induc ido).. 7.2.2 Resultados de actividad para E. coli y C. tropicalis en los hemocitos, plasm a y cuerpo.. Utiliz ando ens ayos de inhibic ión de cr ecimiento fue detectada la actividad antibacteriana y antimicotica en el extr acto ác ido del plas ma, de los hemocitos y del cuerpo de las escolopendr as en las difer entes fracciones. En la conc entrac ión de 40% del plasma que fue estimulada, s e obs ervo actividad total c ontra E. coli y des pués de la purificac ión en el HPLC, var ias fracciones pres entaron activ idad antibacteriana y antimic otica. (Ver Tabla 4) ..

(28) CARACTERÍSTICAS. ATIV IDADE ANTIBACTERIANA. DILUCIÓN MUESTRA FRACCIÓN. E. coli.. C. tropicales. PLA SMA. X. X. 4. NO INDUCIDO 40%. X 2 11. X. X. 25. X. X. PLA SMA. 7. X. INDUCIDO. 20. X. 33. X. Tabla 4 Actividad antimicrobiana presentada por las dif erentes f racciones de la extracción ácida de los hemocit os da la dilución al 40%.. En las. mues tras del cuerpo, s e obs erv o activ idad antimic ótic a en las. conc entr aciones del 5 y el 40%. Esta actividad no fue observada en las mues tras no estimuladas antes de s er s ometidas a los análisis. 7.2.3 M asa de las m oléculas que presentaron act ividad. Hasta el momento no fue posible analizar las mas as de ningunas de las moléc ulas que pres entar on actividad.. 8. DISCUSIÓN. En inver tebrados, los péptidos antimicr obianos pueden ser pr oduc idos de manera dif er ente, dependiendo de las especies. En los insectos holometabolos,.

(29) estos péptidos son producidos principalmente en el cuerpo gr aso y su s íntesis es. inducida des pués. de unas. horas. de recibida la infecc ión, para. posterior mente ser liberados en la hemolinfa ( Lamberty M, et al. 2000) . En contr aste, en los ins ectos hemi metábolos , los péptidos antimicr obianos están pr esentes de manera constitutiv a en los hemocitos granulares (Lamberty M, et al. 2000). En otr os invertebr ados como los moluscos y los cangr ejos cacer ola los péptidos antimicr obianos es tán almac enados en los hemocitos granular es y s on li berados en la hemolinfa ( Des toumieux D, et al. 2000; Shigenaga T, 1990). En estos c asos s e afirma que estas especies cuentan con una inmunidad innata. Para entender la importanc ia de es tas moléculas en el sis tema inmune de los insectos y el pos ible impacto que podr ía c aus ar el empleo de los péptidos antimicr obianos pres entes en los invertebrados Hoffman JA, et al. en 1993 y posterior mente Bulet P. en 1999 trabajando c on Dr os ophila melanogaster, encontr aron que un solo insec to es capaz de pr oduc ir de 10 a 15 péptidos antimicr obianos, ex hibiendo cada uno un espectr o de actividad c ompletamente difer ente y con una c apacidad antibacteriana mucho mas potentes que la que encontr amos en la s angr e de los ma míf er os poster ior a r ecibir un estimulo infecc ioso. De ac uer do con los es tudios pr evios y el pres ente, sobr e el sis tema inmune de los insectos y de los arác nidos, y las c ada vez mas numer osas investigaciones sobr e el funcionamiento del sis tema inmune de es tos animales , encontramos una gran v ariedad de mec anis mos de defens a, en los cuales los péptidos antimicr obianos pr esentes en la hemolinfa y en el v eneno de los inv ertebrados, juegan un papel muy importante..

(30) 8.1. Scolopendra viridicornis. La hemolinfa de la Sc olopendra viridicornis pres ento indicios de la pr esencia de moléc ulas que poseen actividad antimicr obiana. Como y a s e dij o, es tas moléc ulas fuer on pur ificadas par a las muestras de plas ma y de hemocitos . La actividad fue analizada en cada etapa de pur ificación, probando contra los mismos microorganis mos con los que en un primer momento se había observado actividad. De esta maner a lo que s e busc o fue confir mar la respuesta inhibitor ia de estas moléc ulas. La fracc ión (PI) encontr ada en la diluc ión al 40% de los hemocitos y que pres entó activ idad contr a las bacterias M . luteus y E. coli presenta una masa molec ular de 4306,74 Da. De las otras mues tras que fueron analiz adas por espectr ometr ía de mas a no fue pos ible conseguir el pes o molecular. Se asume que esto fue debid o a una baja c oncentración de la muestr a al momento de hac er la prueba. La producción de los péptidos antimicr obianos. puede ser constitutiva. (Quelicerados y los Crustác eos) o puede s er inducida por algún tipo de de estimulo infecc ios o como en el caso de los ins ectos. ( Rober t E. W. Hanc ock. 2006). Teniendo en cuenta lo anter ior, se puede c oncluir que es pos ible que los quilópodos no pres enten una producción constitutiva de péptidos necesitando un es timulo pr evio. Esto explicaría la baja concentrac ió n de moléculas antimicrobianas en las difer entes fracciones, tanto de hemoc itos como de plas ma. Sin embargo, la baja concentr ación no implicó que las muestr as no pr esentaran actividad antimicr obiana, por lo que s e as ume que en el momento de hacer la ex tracc ión de la hemolinfa, s e presentó algún tipo de estímulo bas al..

(31) 8.2. Otostigmus sp. En los perfiles obs ervados del HPL C s e obs erv a una gran difer enc ia entr e las fracciones del grupo control y del grupo c on estimulo. Esta diferencia se confir ma c on los r es ultados de las actividades donde también se observan difer encias importantes, como la alta activ idad antimicr obiana en las fracciones que r ec ibieron un estimulo prev io c on respecto a las no inducidas . Con r elación a los res ultados anter iores obtenid os c on Sc olopendra viridicor nis en este estudio se observo un alto indic io de que el sistema inmunológico de estos animales no es constitutiv o, siendo neces ario un estimulo prev io par a la producción de los péptid os antimicrobianos. Esta hipótesis se ve soportada por estudios realiz ados prev iamente c on Miriápodos, donde s e obs erva un efecto importante en la estimulac ión previa a la extr acción de la hemolinfa de los organismos (Xy lander y Nevermann, 1990). La hemolinfa de Otostigm us sp. pr es enta ev idenc ia de la pr esencia de moléc ulas que pos een ac tiv idad antibacteriana. Después de la primera purific ación de la c onc entr ación del 40% del plas ma es timulado, fue c onfirmada la r espuesta inhibitor ia de estas moléculas. Sin embargo estos r esultados prec is an s er r atificados con nuev os anális is antimicr obianos en etapas de purific ación más avanz adas. De las muestr as que fueron analiz adas por es pec trometr ía de masa no fue posible hallar el peso molec ular de los péptidos detectados, s e as ume que esto se debe a una baja c onc entración de la muestr a en el momento de hac er el anális is. La baja concentr ac ión puede ser consec uencia de la poc a cantidad de mues tra c on la que se tr abajó (150 uL tanto para plas ma c omo para hemocitos)..

(32) Los res ultados presentados res pec to a O tostigmus sp. s on preliminares y se esper a en pr óximos es tudios realiz ar pruebas de ac tividad en las otras fracciones que todavía no han sido analizadas, para continuar con la carac ter ización de las moléc ulas que presentan actividad tanto en la hemolinfa como en el c uer po de es tos organis mos.. 9. CONCLUSIONES. La hemolinfa de la Sc olopendra viridicornis y de O tosti gmus sp. pr es entó moléc ulas que pos een activ idad antimicrobiana. Hay evidenc ia que los quilópodos tienen un sistema inmune induc ido. La c arac ter ización de los péptidos usando es pectrometr ía de masa se vio afectada por la baja conc entrac ión de las moléculas en las muestras obtenidas. Es importante c ontinuar la purificac ión y la c arac ter ización de los péptidos que pres entaron actividad antimicrobiana. Para respaldar los res ultados obtenidos en este estudio se consider a neces ar io realizar más ex perimentos para v erific ar si el sistema inmune de las escolopendr as es inducido o constitutivo..

(33) 10 AGRADECIMIENTOS Cada v ez que se llega al c ulmen de una etapa importante en la v ida, es importante mir ar hacia atrás y rec ordar y agr adecer a las personas que te acompañar on en el v iaje. Este doc umento es entonces el res ultado de 6 años en la univ ers idad, en la que desc ubr í c osas que c onocía de oídas per o que no había experimentado antes . Desc ubr í, la Biología y gracias a profesores como Emilio Realpe, A driana Bernal y al pr ofesor Marinkelle; pude ver lo marav illoso, mister ioso y encantador que puede llegar a ser este. A es tos pr ofes or es, GRACIAS, de no s er por sus enseñanz as no habría llegado hoy has ta aquí sintiendo la pasión que s ie nto por lo que hago. Desc ubr í que la vida es luc ha y que muc has v eces esta ac ompañada por sufrimiento pero que la recompensa que te da siempr e es dulce y te hace olvidar todo lo que habías pasado. También redescubr í las amistades duraderas , encontr é amigos que sé que me v an a acompañar toda mi v ida. A migos, que aunque pocos ( los puedo contar c on los dedos de una sola mano), siempre estuvier on a mi lado y no me dejaron renunciar cuando y o creía que ya no tenia mas fuerz as. Sonia, Mara, gr ac ias por ser mis c ompañer as de luchas, mis her manas ; Manuel, grac ias por toda la ay uda, c ompañía y apoy o. Chelo, May ita, Ber ni y todos los demás, gracias por hacer de este r ecorrido mas ameno. Finalmente, entendí la impor tancia de la familia. Ya que si no hubier a s ido por el apoy o de mis papas y hermanos en toda mi carr er a, en mi v ida, me habr ía perdido hace muc ho. Ustedes s on el espejo en el que me miro, son mi país de las marav illas, mi desc anso, mi gota de agua en el desierto. Gr ac ias . A todos los demás muchas grac ias y hasta luego y esper o que ustedes se hayan divertido tanto como y o..

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