Estudio exploratorio de la expresión de alfa
sinucleina en sangre y su relación con el
estreñimiento crónico en población
residente en Bogotá, D.C. con consumo
problemático de alcohol.
Tania Yadira Martínez Rodríguez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de ciencias fisiológicas Bogotá, Colombia
Estudio exploratorio de la expresión de alfa
sinucleina en sangre y su relación con el
estreñimiento crónico en población
residente en Bogotá, D.C. con consumo
problemático de alcohol.
Tania Yadira Martínez Rodríguez
Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Fisiología
Director (a):
M.sc. Mauricio Rey Buitrago
Grupo de Investigación: Genética clínica
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Ciencias Fisiológicas Bogotá, Colombia
Empieza haciendo lo necesario, después lo posible, y de repente te encontrarás haciendo lo imposible.
Agradecimientos
A mi familia por su amor, a mi madre por su sacrificio y por motivarme desde niña a ser excelente en mis proyectos, a mi padre por su apoyo incondicional, a mi hermana por su ejemplo y compañía, a mi cuñado por su cariño y a mi sobrina Gabriella por llegar a iluminar mis días. También agradezco a mis demás familiares por creer en mí, y a los que ya no están, pero me enseñaron siempre a dar lo mejor, mi abuela Cecilia y mi padrino Gabriel. Agradezco a mi director de tesis Mauricio Rey por su dedicación, enseñanzas, paciencia y perseverancia, y a quien le debo mi formación como científica, gracias por el compromiso con este proyecto y sobre todo por ser excelente ser humano.
A los voluntarios que participaron en esta investigación, por su aporte a la ciencia y sin los cuales estos resultados no serían posibles.
A Yolima Parrado, por su colaboración con la toma de muestras a los participantes, agradezco tu profesionalismo y colaboración desinteresada.
A mi colega y amigo Jhonny Vargas, por su amistad, colaboración y las enseñanzas con las que pude completar mi formación como investigadora.
A mis compañeros de laboratorio, mi colega y amigo Julian Murillo a quién espero encontrar en otros ámbitos académicos, a Tatiana Bernal por esas charlas de libros y series con las que pasábamos el tiempo, y a Dolly Pardo a quien admiro y espero que tenga un excelente camino post doctoral. También agradezco a los estudiantes del semillero de investigación Andres Ballesteros, Julian Celis y Lina Peña por su empeño en sacar este proyecto adelante.
A las personas del Instituto de Genética por su cariño, a Mireya Sarmiento, por su amistad y por escucharme siempre en los momentos de felicidad y de tristeza. A Luz Marina, Julián, Claudia, Clarita, Rita y Nohora por el apoyo en diferentes procesos y a los chicos de la maestría en Genética por todos los momentos vividos dentro y fuera del laboratorio. A los amigos que conocí en este camino y que llevaré siempre en mi corazón, a Jorge Álvarez por su cariño, confianza y por todos los momentos compartidos tan especiales, a David Aguillón, Eliana Hurtado, Katherine de la Rosa, Adriana Vergara, Johana Hernández, José Beltrán y David Peña, aprendí mucho de ustedes y compartí momentos inolvidables.
A la profesora Sonia Pertuz por su apoyo incondicional, y a la profesora Olga Cobos por sus enseñanzas en mi inicio en el mundo de la docencia Universitaria. Las admiro y les agradezco por todo.
A la profe Zulma Dueñas, por sus enseñanzas y por permitirme asistir a los clubs de revista; así mismo, a los amigos que conocí en este ambiente académico.
Agradezco a los docentes de la maestría en fisiología por contribuir a mi formación profesional y a Diana por su disposición y gestión con todos los trámites académicos. A mis colegas y amigas de Mederi, quienes siempre me dieron ánimo para continuar a pesar del cansancio. Las admiro por su excelencia profesional y las llevo en mi corazón. También a mis pacientes, aquellos que se recuperaron y los que ya no están, gracias por darme grandes lecciones de vida, iluminar mis días en el hospital con su sonrisa y por motivarme a ser mejor persona.
A mis amigos de pregrado, porque a pesar del tiempo y los caminos separados, sé que puedo contar con ustedes.
Resumen
Objetivo. La presente investigación pretendió determinar la relación entre la expresión de
la alfa sinucleina en sangre y el estreñimiento crónico en población residente en Bogotá, D.C. con consumo problemático de alcohol.
Metodología. La población de estudio estuvo conformada por 62 individuos asignados a
los grupos de acuerdo al puntaje obtenido mediante el cuestionario AUDIT (35 sujetos en el grupo de controles y 27 sujetos en el grupo de casos). Para el diagnóstico de estreñimiento se aplicaron los criterios de Roma IV y aspectos relacionados con la historia clínica. Los participantes tuvieron un periodo de abstinencia ≥ 48 horas, hasta la extracción de sangre periférica. La expresión del gen fue evaluada mediante qPCR y la cuantificación proteica por ELISA. Adicionalmente, se determinó la presencia de SNP’s, así como el estado de metilación en un segmento de la región promotora del gen SNCA, mediante secuenciación.
Resultados. En este estudio se observó un incremento significativo en la expresión génica
de ARNm de SNCA en individuos con problemas de consumo de alcohol, el cual no se relacionó con el diagnóstico positivo de estreñimiento crónico o por la presencia de los SNP’s rs261963 y rs2301134 en la región promotora del gen. Se evidenció un riesgo 4.8 veces mayor de presentar estreñimiento en personas con alto consumo de alcohol. Se encontraron 9 SNP´s en el segmento de la región promotora del gen SNCA, cuya frecuencia fue similar entre grupos de estudio y se identificó un SNP en la posición -2171, que no se encuentra reportado en GenBank para variantes clínicas y cuyo genotipo AT se relacionó con el aumento de ARNm de SNCA.
Conclusión. En sujetos con problemas de consumo de alcohol, se evidenció
sobreexpresión de ARNm de SNCA, lo cual no estuvo relacionado con el diagnóstico de estreñimiento crónico.
Palabras clave: Alfa-Sinucleína, alcoholismo, expresión génica, polimorfismo genético,
Abstract
Objective. The present investigation aimed to determine the relationship between the
expression of alpha synuclein in blood and chronic constipation in a population resident in Bogotá, D.C. with problematic alcohol consumption.
Methodology. The study population consisted of 62 individuals assigned to the groups
according to the score obtained through the AUDIT questionnaire (35 subjects in the control group and 27 subjects in the case group). For the diagnosis of constipation, the criteria of Rome IV and aspects related to the clinical history were applied. The participants had a period of abstinence ≥ 48 hours, until the extraction of peripheral blood. The expression of the gene was evaluated by qPCR and protein quantification by ELISA. Additionally, the presence of SNP's, as well as the methylation status in a segment of the promoter region of the SNCA gene, was determined by sequencing.
Results. In this study, a significant increase in gene expression of SNCA mRNA was
observed in individuals with alcohol consumption problems, which was not influenced by the positive diagnosis of chronic constipation or by the presence of rs261963 y rs2301134 SNPs in the promoter region of the gene. A 4.8 times higher risk of constipation was observed in people with high alcohol consumption. We found 9 SNPs in the segment of the promoter region of the SNCA gene, whose frequency was similar between study groups and a SNP was identified in position -2171, which is not reported in GenBank for clinical variants, and whose AT genotype was related to the increase of SNCA mRNA.
Conclusion. In subjects with problems of alcohol consumption, overexpression of SNCA
mRNA was evidenced, which was not related to the diagnosis of chronic constipation.
Keywords: Alpha synuclein, alcoholism, gene expression, genetic polymorphism
Contenido
Planteamiento del problema y justificación ... 3
Objetivos ... 7
1.1 Objetivo general ... 7
1.2 Objetivo especifico ... 7
3. Marco referencial ... 9
3.1. Alfa sinucleina ... 9
3.2.1 Mecanismos fisiológicos y patológicos de SNCA ... 10
3.2 Polimorfismos de ADN ... 11
3.3 Estado de metilación del ADN ... 13
3.4 Alcoholismo ... 14
3.4.1 Epidemiología del alcoholismo ... 14
3.5 Estreñimiento ... 15
3.5.1 Epidemiología e impacto económico ... 16
3.5.2 Fisiopatología del estreñimiento ... 17
3.5.3 Criterios para el diagnóstico clínico del estreñimiento ... 17
3.6 Estado del arte ... 19
3.6.1 Aspectos neurofisiológicos, cognitivos y genéticos relacionados con alcoholismo ... 19
3.6.2 Expresión diferencial de alfa sinucleina en sujetos con alto consumo de alcohol ... 21
3.6.3 Alfa sinucleina en tejidos periféricos ... 23
3.6.3 Polimorfismos y metilación en la región promotora del gen de alfa sinucleina en el consumo de alcohol ... 24
3.6.4 Efectos del alcohol en la fisiología gastrointestinal ... 26
3.6.5 Relación de la motilidad gastrointestinal con la alfa sinucleina: interacción intestino-cerebro... 29
4 Aspectos metodológicos ... 31
4.1 Tipo de estudio, población y muestra ... 31
4.2 Diseño experimental ... 31
4.2.1Criterios de Elegibilidad ... 31
4.2.1 Cuestionarios ... 34
4.2.1.1 Cuestionario AUDIT ... 34
4.2.1.2 Criterios de Roma IV ... 36
4.3 Procedimientos de la fase III del estudio ... 36
4.3.1 Expresión Génica de ARNm ... 37
4.3.2 Expresión proteica ... 43
4.3.3 Estado de metilación de la región promotora del gen ... 44
4.3.4 Determinación de presencia de estreñimiento crónico ... 49
4.4 Procesamiento de datos ... 50
4.4.1 Variables estudiadas en la investigación ... 50
4.4.2 Pruebas estadísticas ... 51
5. Resultados... 53
5.1 Descripción de los sujetos de estudio ... 53
5.2 Expresión de ARNm de SNCA en células mononucleares de sangre ... 55
5.3 Expresión de la proteína SNCA en sangre ... 58
5.4 Frecuencia de SNP’s en la región promotora del gen SNCA ... 60
5.5 Estado de metilación de la región promotora del gen SNCA... 64
5.6 Presencia de estreñimiento crónico en la población seleccionada ... 65
5.8 Asociación entre el nivel de la proteína alfa sinucleina y la prevalencia de estreñimiento crónico ... 67
5.7 Asociación entre la expresión del gen alfa sinucleina en forma de ARNm y la prevalencia de estreñimiento crónico ... 68
5.9 Relación entre la expresión del gen de alfa sinucleina y los polimorfismos de nucleótido simple ... 68 6. Discusión ... 71 7. Conclusiones y recomendaciones ... 79 7.1 Conclusiones ... 79 7.1 Recomendaciones ... 80 A. Anexos electrónicos ... 81
Lista de figuras
Figura 1. Estructura de cinco transcriptos de alfa sinucleina (22). ... 9
Figura 2. Clasificación de los SNP funcionales(64) ... 12
Figura 3. Algoritmo para el diagnóstico y tratamiento en pacientes con estreñimiento crónico(70) ... 18
Figura 4. Gen de alfa sinucleina humana y polimorfismos asociados con fenotipo de alcohol(130) ... 25
Figura 5. SNCA SNPs y resultados de asociación(130) ... 26
Figura 6. Hipótesis propuesta de las inclusiones de SNCA a nivel colorrectal y la interacción con el sistema nervioso(160) ... 30
Figura 7.Fases de la investigación ... 33
Figura 8. Procedimientos de la fase III del estudio ... 37
Figura 9. Procedimiento para el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica ... 38
Figura 10. Esquema de la distribución de muestras en las placas empleadas para la reacción de qPCR ... 42
Figura 11. Diluciones seriadas para elaboración de la curva estándar del ensayo ELISA ... 43
Figura 12. Principio del ensayo de bisulfito utilizado para la determinación de la metilación ... 45
Figura 13. Gramos de alcohol consumidos en un día habitual de consumo ... 54
Figura 14. Comportamiento del Cq los genes SNCA y GADPH en la muestra calibradora ... 55
Figura 15. Comportamiento de los Cq de SNCA y GADPH en los sujetos de estudio .... 56
Figura 16. Nivel de expresión de ARNm del gen SNCA en células mononucleares de sangre periférica ... 56
Figura 17. Productos de qPCR en gel de agarosa ... 57
Figura 18. Expresión génica de SNCA de acuerdo al sexo ... 58
Figura 19. Concentración de la proteína SNCA en plasma sanguíneo ... 59
Figura 20. Concentración de proteína SNCA en plasma de acuerdo al sexo ... 59
Figura 21. Segmento de la secuencia de la región promotora de SNCA obtenida con la identificación de dos SNP's. ... 60
Figura 22. Frecuencias de genotipos de diferentes SNP's de la región promotora del gen SNCA ... 62
Figura 23. Identificación de SNP no reportado en GenBank [T/A] – 2171 en la secuencia de SNCA ... 63
Figura 24. Fragmento del resultado obtenido en secuenciación para el ensayo de metilación de la región promotora SNCA ... 64
Figura 25. Presencia de estreñimiento crónico en los sujetos de investigación ... 66
Figura 26. Nivel de expresión de la proteína SNCA en plasma sanguíneo según el diagnóstico de estreñimiento ... 67
Figura 27. Expresión del gen SNCA de acuerdo al diagnóstico de estreñimiento crónico ... 68 Figura 28. Tasa de expresión de SNCA según el genotipo de tres SNPs ... 69
Lista de ecuaciones
Lista de tablas
.
Tabla 1. Signos de alarma en el estreñimiento(70) ... 18
Tabla 2. Concentración de etanol en el intestino y sangre después de una ingesta de 0.8g/kg(140) ... 27
Tabla 3. Procesos de selección de los sujetos de estudio ... 33
Tabla 4. Criterios del cuestionario AUDIT(163)... 34
Tabla 5. Criterios diagnósticos de Roma IV para estreñimiento funcional(169) ... 36
Tabla 6. Reacción de la transcriptasa reversa ... 40
Tabla 7. Primers diseñados para la qPCR ... 41
Tabla 8. Componentes de la reacción de qPCR ... 42
Tabla 9. Reacción de conversión de bisulfito ... 45
Tabla 10. Ciclos para la conversión del ADN mediante el bisulfito ... 45
Tabla 11. Primers utilizados para la PCR convencional del ensayo de metilación ... 46
Tabla 12. Componentes de la reacción de PCR convencional del ensayo de metilación 46 Tabla 13. Primers utilizados para la PCR de polimorfismos de nucleótido simple ... 48
Tabla 14. Componentes de reacción de PCR de polimorfismos de nucleótido simple .... 48
Tabla 15. Criterios diagnósticos de Roma IV para el síndrome de intestino irritable(169) 49 Tabla 16. Variables de la investigación ... 50
Tabla 17. Pruebas estadísticas utilizadas para el análisis de datos ... 51
Tabla 18. Descripción de las características sociodemográficas de los sujetos de estudio ... 53
Tabla 19. Tipo de bebida de inicio de consumo de alcohol de los sujetos de estudio ... 54
Tabla 20. Frecuencia de genotipos y alelos de diferentes SNP's de la región promotora del gen SNCA ... 61
Tabla 21. Frecuencia de islas CpG metiladas ... 65
Lista de Símbolos y abreviaturas
Símbolo/Abreviatura Término
A
A53T/A30P
Modelos animales transgénicos que sobre expresan SNCA detipo mutante.
ADN
Ácido desoxirribonucleicoADH2
Alcohol deshidrogenasa 2ADH3
Alcohol deshidrogenasa 3ALDH*2
Aldehído deshidrogenasa 2AP2
Activador de proteína 2ARN
Ácido ribonucleicoAUDIT
Alcohol use disorders Identification testAVAD
Años de vida discapacitantes atribuibles al alcoholAVP
Años de vida perdidos atribuibles al alcoholB
BLAST2
Herramienta básica de alineaciónBPC
Buenas prácticas clínicasC
CAGE
Cuestionario de tamizaje para detectar problemas de alcohol.CaM
CalmodulinacADN
ADN complementarioCIE-10
Clasificación inteARNcional de enfermedades, décima versión.cMyc/Myn
ProtooncogenesCpG
Islas CpGCq
Ciclo umbralCREB
Elemento de respuesta a AMP cíclico.CSF
Fluido cerebro espinalcSNP
Polimorfismos de nucleótido sencillo codificantesCYP2E1
Citocromo P450 2E1D
DTT
DitiotreitolDMS-IV
manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentalesDNMT3A
AND (citosina-5)-metiltransferasa 3ADNMT3B
AND (citosina-5)-metiltransferasa 3BDRD2
Receptor de dopamina D2dNTPs
Desoxirribonucleótidos trifosfatosDownstream
Corriente abajo del extremo 3' del genE
ELISA
Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimasF
FASTA
Formato basado en texto que representa la secuencia de ácidosnucleicos
G
GABA-A
Receptor de ácido γ-aminobutíricoGADPH
Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasaI
IL6r
Receptor de interleucina 6LPS
Lipopolisacárido inflamatorioM
MAPK/ERK
Proteína quinasa activada por mitógenosMAST
Michigan Alcoholism Screening testMBD
Proteína de unión a metil-CpGMBD2b
Proteína 2 con dominio de unión a metil-CpG (MBD2)MeCP
Factor de transcripción.MIF
Factor inhibidor de migración de macrófagosRNAm
Ácido ribonucleico mensajeromRNP
Ribonucleótido proteínas mensajerasN
NAcc
Núcleo accumbensNACP
Non-A4 component of amyloid precursorNFkB
factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de lascélulas B activadas
NMDAr
Receptor de N-metil-D-aspartatoO
OMS
Organización mundial de la saludP
PARK1
Sinónimo de Non-A4 component of amyloid precursorPb
Pares de basesPBS
Tampon fosfato salinoPCR
Reacción en cadena de la polimerasaPKA
Proteína quinasa APKC
Proteína quinasa CPLD
Fosfolipasa DQ
qPCR
PCR cuantitativa o PCR en tiempo realR
RRAI
Reflejo recto anal inhibitoriorSNP
Polimorfismos de nucleótido sencillo reguladoresS
SNARE
Receptores de proteínas de fijación soluble de NSFSNP’s
Polimorfismos de nucleótido sencillosrSNP
Polimorfismos de nucleótido sencillo estructuralesSSiGMOL
Servicio de secuenciación y análisis molecularSYBR
Colorante de cianinaT
TAE
Solución tampón compuesta de Tris, ácido acético y EDTATH
Tirosina hidroxilasaThy-aSYN
Modelo animal transgénico, que sobre expresa 4 veces más losniveles de alfa sinucleina, bajo el promotor Thy-1.
tm
Temperatura de fusiónTNFR1
Receptor 1 del factor de necrosis tumoralU
Upstream
Corriente arriba del extremo 5' del genUTR
Región no traducida del genV
1.Introducción
El alcohol, es una sustancia adictiva que a diferencia de otras sustancias psicoactivas requiere de dosis más altas para conseguir efectos farmacológicos. La propiedad de interactuar con grupos polares y no polares de componentes de la membrana, explica la solubilidad tanto en medio acuoso como lipídico, por lo cual atraviesa libremente la barrera hematoencefálica y se detecta en el cerebro a los pocos minutos de la ingesta (1), siendo este el principal órgano blanco y dando como resultado cambios estructurales en varias regiones del mismo por consumo crónico y/o excesivo (2).
A nivel mundial, cada año se presentan más de 2 millones de muertes atribuidas al consumo de alcohol, y a diferencia de otras sustancias, el alcohol en altas dosis es tóxico, lo que conlleva a que el abuso pueda ser la causa de diferentes patologías (3), incrementando los costos en atención en salud y comprometiendo el desarrollo del individuo, la familia y la comunidad (4)
El cromosoma 4, contiene genes relacionados con los fenotipos de alcoholismo, dentro de los cuales, se destaca el gen que codifica para la proteína alfa sinucleina SNCA (5). Esta proteína ha sido ampliamente estudiada por tener un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad de parkinson, sin embargo, debido a sus diversas funciones en neuronas dopaminérgicas, vinculadas al sistema de recompensa, en el alcoholismo se ha encontrado expresión diferencial tanto en modelos experimentales animales como humanos (6–13).
Por otro lado, el estreñimiento es un problema de alta prevalencia y bajo reporte a nivel clínico, de acuerdo al consenso latinoamericano de estreñimiento crónico, no hay información suficiente sobre el impacto en la región, a excepción del uso excesivo de laxantes estimulantes y suplementos de fibra (14). Incluso se tiene precedente de estudios que estiman que un porcentaje de individuos con estreñimiento crónico mayor al 40%,
consultó al médico por este motivo (15). Por otro lado se debe considerar las circunstancias clínicas que tengan impacto negativo sobre el estreñimiento crónico, como infecciones urinarias, incontinencia fecal, prolapso rectal, hemorroides, cirugías y otros que puedan predisponer la aparición de úlceras rectales, perforaciones y otras consecuencias a futuro (14).
Teniendo en cuenta que existe la hipótesis de la interacción intestino-cerebro, en la cual se postula que los agregados de SNCA pueden pasar a través del epitelio intestinal y llegar hasta el sistema nervioso central (16,17), esta propuesta de investigación, buscó establecer la posible relación entre la expresión génica de ARNm en células mononucleares de sangre y concentración de SNCA en plasma, con la presencia de estreñimiento crónico en sujetos con problemas de consumo de alcohol, partiendo de hallazgos encontrados en modelos animales modificados genéticamente para sobre expresar SNCA como la disminución de la motilidad, aumento del volumen fecal, reducción de pellets y mayor tiempo de expulsión de las heces. En efecto, se hacen necesarios estudios específicos en cada población que respondan a las necesidades concretas de la misma, para no incurrir en la generalización de resultados de investigaciones realizadas en individuos con características genéticas diferentes(18).
Este estudio exploratorio se enmarcó dentro de un proyecto de genes de neuroinflamación, ya que debido a que el alcoholismo es una enfermedad multifactorial, en la que participan diversos mecanismos y componentes genéticos (1), se necesita profundizar en este tema.
2.Planteamiento del problema y justificación
Se conoce que el alcohol etílico (etanol) es la sustancia psicoactiva de consumo legal más consumida en el mundo. De acuerdo a la OMS, se estima que el uso nocivo del alcohol causa anualmente 2.5 millones de muertes y tiene graves repercusiones en la salud pública, ocupando el tercer lugar dentro de los principales factores de riesgo de salud y comprometiendo el desarrollo personal, al igual que el ámbito familiar y social (4).
En Colombia alrededor de 2.5 millones de personas presentan un consumo perjudicial de bebidas alcohólicas, representando el 31% de los consumidores y el 11% de la población entre 12 y 65 años(19). Adicionalmente se conoce que el porcentaje de personas con consumo de riesgo es mayor en estratos socioeconómicos bajos y se ha estimado una edad temprana de inicio de consumo con una mediana de 16 años en hombres y 18 años en mujeres(19), lo que lo constituye como un problema encontrado en el ambiente escolar y universitario, siendo el punto de inicio para el consumo de otras sustancias psicoactivas. Así mismo, aplicando el cuestionario AUDIT en Colombia se identificó que el 1.19% de las personas encuestadas presenta comportamientos indicativos de dependencia de consumo de bebidas alcohólicas (19). Debido a esto, el consumo de alcohol se tiene en cuenta dentro del componente de estilos de vida saludable del plan decenal de salud pública 2012-2021, en donde la meta es mantener por debajo del 12% el consumo nocivo de alcohol (de riesgo y perjudicial en la población) y aumentar la edad promedio de inicio de consumo de alcohol en adolescentes colombianos (20).
El consumo crónico de bebidas alcohólicas, puede causar neurotoxicidad que conduce a neuroadaptaciones (9,21–24), activación de factores que inducen citoquinas pro inflamatorias y otros mediadores que inducen daño cerebral y contribuyen a la progresión de la patogénesis(25,26), cuya manifestación incluye síntomas psiquiátricos, produciendo consecuencias para el individuo y la sociedad, disminuyendo la productividad y
aumentando en gastos relacionados con salud, constituyéndose a nivel mundial como un problema de salud pública (4).
La alfa sinucleina (SNCA), constituye uno de los principales factores moleculares que hacen parte del entramado fisiopatológico del alcoholismo, esta proteína se expresa en señales apoptóticas y oxidativas, se encuentra implicada en la sinapsis, plasticidad neuronal y mecanismos relacionados con la dopamina, neurotransmisor implicado en el circuito de recompensa cerebral, que en el alcoholismo se ve alterado debido a la intensidad de los efectos reforzadores que aumentan la necesidad y el deseo de experimentarlos de nuevo (21), causando mayor consumo y otras dificultades relacionadas con alteración en el comportamiento, cognición, actividad motora, aprendizaje y trastornos de sueño.
En humanos, se ha evidenciado disminución de la expresión génica de alfa sinucleina en la corteza prefrontal dorso lateral, un área clave para las funciones ejecutivas que son interrumpidas en alcoholismo severo(7,27), por otro lado, se demostró que la alfa sinucleina aumenta la apoptosis inducida por dopamina a través de su unión y acoplamiento a su transportador, por lo que cambios en la expresión de la alfa sinucleina podrían afectar la recaptación de dopamina, y posiblemente altera la señalización neuronal(7,9).
Se ha demostrado la existencia de flujo de alfa sinucleina en dirección cerebro-sangre y sangre-cerebro, para la regulación de los niveles cerebrales de la proteína través de la barrera hemato encefálica (28) y que permite la detección en fluidos humanos(29–36), además, se conoce que el ARNm de alfa sinucleina, es altamente expresado en componentes sanguíneos, incluyendo eritrocitos y células mononucleares, plaquetas y plasma(33,34,37,38). Los estudios realizados en sangre en pacientes alcohólicos reportan sobre expresión del gen que codifica para dicha proteína, asociada con la búsqueda y deseo compulsivo de alcohol ‘’craving’’ (11), así mismo, estudios en ratas y primates no humanos indican claramente que la sobre expresión de alfa sinucleina en sangre resulta del consumo prolongado de alcohol(8,10) concluyendo que la elevación de niveles de ARNm en sangre es común en humanos, roedores y primates y que la alfa sinucleina es útil como marcador periférico de alcoholismo crónico(8,10,11).
Por otra parte, el estreñimiento es un problema crónico con pronóstico favorable, con sub reporte a nivel poblacional, debido a que no se le presta la suficiente atención en términos
de salud (39) y condiciona que los costos directos (uso de medicamentos, consultas médicas y procedimientos diagnósticos) o indirectos (absentismo laboral) sean muy elevados. Existen hipótesis sobre una posible relación intestino-cerebro, postulando que la acumulación de alfa sinucleina se inicia en el intestino y se propaga a través del sistema nervioso entérico hasta el sistema nervioso central (16,17), En modelos animales, modificados genéticamente para sobre expresar la alfa sinucleina se observan déficits progresivos en la función motora fina y gruesa, acompañado de disminución en la motilidad gastrointestinal y estreñimiento(40–46), así mismo, el consumo crónico de alcohol podría prolongar el tiempo de tránsito intestinal. Respecto a este último aspecto, es posible pensar que, en individuos humanos con problemas de consumo de alcohol, cuya expresión de alfa sinucleina es diferencial, podría darse una disminución temprana en la motilidad intestinal,
que a largo plazo podría conducir a un problema de estreñimiento crónico.
La investigación sobre el consumo de alcohol en Colombia ha tenido un enfoque epidemiológico que busca caracterizar y establecer prevalencias en diferentes grupos poblacionales; por lo tanto, desde el punto de vista científico, existe un vacío en el conocimiento sobre los mecanismos moleculares y fisiológicos implicados en cambios a nivel neurológico en personas con problemas de consumo de alcohol, y se hace necesario un primer acercamiento que pueda determinar la relación entre la alfa sinucleina (como proteína y gen) y los posibles cambios en la motilidad gástrica, teniendo en cuenta la hipótesis de una posible relación entre el intestino-cerebro.
Objetivos
1.1 Objetivo general
Determinar la relación entre la expresión de alfa sinucleina en sangre y el estreñimiento crónico en población residente en Bogotá, D.C con consumo problemático de alcohol.
1.2 Objetivo especifico
A. Determinar la prevalencia de estreñimiento crónico en la población seleccionada. B. Cuantificar la expresión de la proteína de alfa sinucleina en sangre.
C. Cuantificar la expresión del ARNm de alfa sinucleina en sangre. D. Determinar SNP’s de la región promotora del gen de alfa sinucleina.
E. Describir el estado de metilación de la región promotora del gen de alfa sinucleina. F. Establecer la asociación entre la expresión de alfa sinucleina y la prevalencia de
3.
Marco referencial
3.1. Alfa sinucleina
La alfa sinucleina es una proteína neuronal abundante y representa el 1% de las proteínas solubles en citosol a nivel cerebral (2). Se expresa principalmente en las terminales nerviosas pre sinápticas del cerebro, y en bajas concentraciones en todos los tejidos, excepto hígado (47). Según lo reportado en GenBank, la localización del gen de alfa sinucleina (SNCA) se encuentra en 4q22.1 y se organizan en 10 exones (48), el tamaño oscila entre 42 y 1110 pares de bases (2) y tiene 117kb de longitud aproximadamente (48). La alfa sinucleina humana se encuentra en al menos 4 variantes de empalme diferentes para la síntesis de polipéptidos funcionales (22) (figura 1), La forma predominante en humanos está compuesta de 140 aminoácidos, cuyo gen está compuesto de 6 exones (48), la segunda isoforma de 126 aminoácidos es producida por la deleción del exón 3, la tercera isoforma de 112 aminoácidos, por la deleción del exón 5 y la cuarta isoforma de 98 aminoácidos con deleción del exón 3 y 5. (2,22). Por otro lado, se predice una trascripción alternativa de 115 aminoácidos, que incluye los exones 1-4 y 393 nucleótidos del intron 4 (22).
3.2.1 Mecanismos fisiológicos y patológicos de SNCA
La Función principal de la SNCA se ha relacionado con procesos de sinapsis y plasticidad; la elevada concentración de la proteína en las terminales presinápticas sugiere un papel en el mantenimiento de las vesículas sinápticas, mediante el reciclaje de las mismas(2), y se han atribuido funciones de mediación en la neurotransmisión dopaminérgica(23,47,49), incluyendo síntesis, almacenamiento, liberación y reabsorción del neurotransmisor, por regulación negativa. Aunque las funciones de SNCA no están claramente entendidas, algunas de ellas se relacionan directamente con la neuroprotección:
1. Supresión de la apoptosis en neuronas dopaminérgicas por desactivación del factor nuclear Kb y reducción de la transcripción de la proteína quinasa C (PKC) y su actividad(50).
2. Modulación de la actividad calmodulina, convirtiendo la proteína CaM de inhibidor a activador, lo cual desencadena mecanismos de memoria a corto y largo plazo(50).
3. Actividad chaperona de SNCA en el mantenimiento de la estructura SNARE (proteína de fijación)(50).
4. Participa en la diferenciación celular, interactuando con la quinasa supresora de Ras y activando Ras, lo que desencadena vías ERK/MAPK involucradas en enviar señales de factores de crecimiento, desde los receptores celulares a los factores de nucleares(50).
5. Regulación de la tirosina hidroxilasa (TH), que modula la producción de dopamina y controla sus niveles en la célula. Así, una baja expresión o la agregación de SNCA, lleva a un incremento en la síntesis de dopamina, que conduce a estrés oxidativo(50).
6. Modulación del tráfico de vesículas de las reservas al sitio de liberación de la sinapsis. En exceso, la SNCA induce una disminución en la recaptación de dopamina e inhibe el tráfico de vesicular, resultando en una reserva más pequeña(50).
7. Actividad mitocondrial, afectando la dinámica de membrana(51) y generando cambios en la fisión y fusión mitocondrial (52,53).
8. Regulación de la síntesis ácido fosfatídico inhibiendo la fosfolipasa D (PLD)2, la cual se encuentra incrementada en el cerebro de pacientes con enfermedades neurodegenerativas (2).
En cuanto a la fisiopatología, se ha propuesto un modelo sobre los posibles mecanismos en los que SNCA agregada es tóxica para las neuronas, relacionada con modificaciones postraduccionales, como la fosforilación y la oxidación que influyen en la unión a lípidos de membrana; los monómeros de SNCA forman dimeros que pueden o no propagarse, estos últimos, generan oligómeros que tienen interacción con la membrana citoplasmática formando poros e induciendo un flujo de calcio intracelular de manera anormal. Adicionalmente, la formación de fibrillas amiloides genera la acumulación de inclusiones intracelulares, también conocidos como cuerpos de Lewy, que al ser tóxicos bloquean del tráfico de proteínas del retículo endoplásmico a Golgi, alteran la función mitocondrial, la degradación de proteínas y la trasmisión sináptica, causando acumulación en el citoplasma(54,55). Por el contrario, mecanismos reguladores como la acetilación, inducen mayor afinidad a los lípidos, lo cual facilita la unión a membranas y vesículas(56).
En adición, se conoce que el hierro en su forma Fe3+ de manera directa o secundaria a la
oxidación de Fe2+, tiene gran afinidad a SNCA, dando como resultado radicales libres y
alteración en la estructura de las fibras, promoviendo la agregación de la proteína (57); sin embargo, en presencia de dopamina, la capacidad para formar fibrillas es inhibida, resaltando la dopamina como un factor clave de regulación (58). Estos fenómenos, incrementan la conductancia de las membranas, activan la microglía y resultan en sinapsis disfuncionales, llevando a desordenes conocidos en su conjunto como sinucleopatias (59,60) las cuales incluyen la enfermedad de parkinson, demencias de cuerpos de Lewy y atrofia multisistémica, además, se encuentra presente de forma secundaria en la enfermedad de Alzheimer (55). La liberación pasiva de alfa sinucleina de neuronas dañadas podría ser de relevancia en los procesos neurodegenerativos, ya que se conoce que la propagación de neurona a neurona, es un fenómeno de relevancia en la progresión de las patologías y afecta diferentes áreas y estructuras cerebrales (25,61,62).
3.2
Polimorfismos de ADN
Normalmente el ADN está expuesto a factores endógenos y exógenos que pueden causar alteraciones que pueden ir desde reorganizaciones cromosómicas, duplicaciones, deleciones de fragmentos y modificaciones en uno a varios nucleótidos. Una mutación es
originada por errores en mecanismos involucrados en la replicación, reparación y mantenimiento del ADN e incluso factores del ambiente, que también pueden generar polimorfismos. Un polimorfismo se refiere a una variante que presenta frecuencia mayor al 1% de uno de sus alelos (63).
Hay varios tipos de polimorfismos, sin embargo los más frecuentes son los SNP’s o polimorfismos de nucleótido sencillo, la mayoría de estos tienen dos alelos que se representan por la sustitución de una base por otra(63).
Según la importancia funcional y la localización los SNP funcionales de clasifican en rSNP, srSNP y SNP codificantes (cSNP) (Figura 2). Los SNP con implicaciones funcionales en los niveles de expresión se conocen como SNP reguladores (rSNP) que se encuentran en los promotores de los genes y afectan la expresión génica. Los srSNP están en ARNm primarios y secundarios, incluyendo las regiones no traducidas (5’UTR y 3’UTR), regiones intrónicas y las codificantes, afectando la estructura y la función, incluyendo corte y empalme, regulación de traducción, funcionalidad y otros procesos normales. Los cSNP encontrados en exones se dividen en sinónimos (si el cambio de nucleótido no cambia un aminoácido) y no sinónimos (si el cambio de nucleótido cambia un aminoácido) (64). Los polimorfismos de nucleótido simple, son marcadores genéticos utilizados para determinar la respuesta a un fármaco o el riesgo de presentar una patología, y se caracterizan por estabilidad, simplicidad y alta frecuencia(65).
Figura 2. Clasificación de los SNP funcionales(64)
3.3
Estado de metilación del ADN
En vertebrados ocurre una modificación epigenética y fenómeno fisiológico importante en la regulación de genes, mediante la adición enzimática de un grupo metilo al carbono 5 de la citosina, gran parte de las 5metilcitosinas (5Mc) se encuentra en los dinucleótidos -CpG- y en la cadena complementaria en el dinucleótido 3’-GpC-5’. La metilación en residuos de citosina le da una variación a la estructura de la cromatina, en cuanto a espacio y temporalidad, existiendo una correlación inversa entre los niveles de metilación del ADN y la expresión génica. En el genoma humano existen regiones que tienen una mayor frecuencia de dinucleótidos CpG llamadas “islas CpG”, de estas un 60 a 90% de todas las secuencias CpG se encuentran metiladas. Estas islas se encuentran entre la región central del promotor y el lugar de inicio de la transcripción, por lo cual se observa una disminución en la expresión cuando se encuentran hipermetiladas (66).
La reacción de metilación del ADN es catalizada por ADN metiltransferasas, en donde se lleva a cabo una transferencia del grupo metilo de las adenosil- L- metionina al carbono 5 de la citosina. La acción de estas enzimas ocasiona que el ADN se metile al inicio de la replicación, en este caso solamente la nueva cadena es metilada y por esto la herencia es semiconservativa. También existen ADN metiltransferasas de novo, DNMT3A y DNMT3B, que adiciona un grupo metilo a la citosina del dinucleótido CpG no metilado, creando un nuevo CpG metilado(66).
En cuanto a la desmetilación, los mecanismos aún no son completamente claros y se han postulado algunos procesos posibles. El primero es un mecanismo que resulta de la ausencia de metilación de mantenimiento en varios ciclos de la replicación del ADN, el segundo mecanismo sugiere la presencia de un proceso de desmetilación activo; en este caso se ha reportado una proteína de unión a ADN metilado (MBD2b) con actividad desmetilasa, sin embargo se necesita más investigación al respecto(66).
Por otro lado la metilación del ADN es un marcador epigénetico implicado en la regulación génica, es vital para mantener el silenciamiento génico normal, la impronta genómica y la inactivación del cromosoma X(66).
Adicionalmente, se han postulado mecanismos en los cuales la metilación bloquea la transcripción, la 5mC inhibe la unión de factores de transcripción que reconocen
secuencias CpG, como: E2F, CREB, AP2, cMyc/Myn y NFkB. Otro mecanismo involucra proteínas que se unen a las CpG metilados y bloquean indirectamente la unión de estos factores, limitando el acceso a los elementos reguladores como la proteína MeCP2, MBD, MBD1, MBD2 y MBD3(66).
3.4
Alcoholismo
El término “alcohólico” es aplicado a los sujetos que son psicológicamente dependientes al alcohol (67). Por lo cual es importante aclarar términos relacionados, de acuerdo a los establecido en el manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales DMS-IV(68):
• Dependencia del alcohol: La dependencia fisiológica del alcohol es reconocida por síntomas de abstinencia que aparecen 12 horas después de disminuir la ingesta de grandes cantidades de alcohol tras un consumo prolongado, conduciendo a continuar con el consumo para evitar dichos síntomas.
• Abstinencia de alcohol: se desarrolla tras la reducción o interrupción del consumo de alcohol e incluye síntomas como: sudoración, taquicardia, temblor, insomnio, náuseas o vómito, alucinaciones visuales, táctiles o auditivas transitorias, agitación psicomotora, ansiedad y crisis epilépticas. Los síntomas son aliviados con frecuencia tras administrar alcohol.
• Abuso del alcohol: En este caso el individuo presenta un consumo de alcohol en situaciones que pueden ser peligrosas a pesar de ser conscientes de las consecuencias (conducir, manejar maquinas).
• Intoxicación por alcohol: Se caracteriza por cambios psicológicos o comportamentales no adaptativos clínicamente significativo (comportamiento agresivo, labilidad emocional, deterioro de la capacidad de juicio y deterioro de la actividad laboral) que aparece durante la ingesta de alcohol o posteriormente. Generalmente se acompaña de lenguaje farfullante, falta de coordinación, marcha inestable, nistagmo, deterioro de la atención o memoria, estupor o coma.
3.4.1 Epidemiología del alcoholismo
De acuerdo a la OMS, el alcohol es una sustancia psicoactiva que ha sido usada legalmente en muchas culturas (3). Se estima que cada año se presentan más de 2 millones de defunciones a nivel mundial atribuidas al consumo de alcohol (3); también, el
uso nocivo del alcohol es un factor causal de más de 200 enfermedades (3) y tiene graves repercusiones en la salud pública, lo cual compromete el desarrollo del individuo, la familia y comunidad (4).
Según el informe de la situación global de consumo de alcohol de 2015 publicado por la OMS (69), en América se consume más alcohol que en el resto de continentes, con una tasa de 13.0% y causando para el año 2012 una muerte cada 100 segundos. Adicionalmente, el alcohol es el factor principal de riesgo de muerte y discapacidad en personas en un rango etario entre 15-49 años, causando pérdida salarial en millones de dólares anualmente. En Colombia, se registra una tasa de defunciones para mujeres de 5.2 por cada 100000 habitantes y para hombres de 29.7 por cada 100000 habitantes (69), además, se estima una media de años de vida perdidos atribuibles al alcohol de 5.2 para mujeres y 14.0 para hombres (69).
Adicionalmente, el consumo total de alcohol per cápita para la población adulta en litros de alcohol puro para los años 2008-2010, mostró un consumo para el país, de 3.5 y 9.1 litros de alcohol puro para mujeres y hombres respectivamente, con una prevalencia de 0.6 episodios de consumo excesivo de alcohol para mujeres y 13.8 para hombres (69). Así mismo, el estudio de consumo de sustancias psicoactivas en Colombia 2013, muestra que al alrededor de 2.5 millones de personas presentan un consumo perjudicial de bebidas alcohólicas, representando el 31% de los consumidores. Se sabe, que al igual que lo evidenciado por la OMS, el mayor riesgo se encuentra en estratos socioeconómicos bajos (19).
También se debe tener en cuenta, que los costos derivados de las consecuencias del consumo excesivo de alcohol sobrepasan los beneficios económicos, ya que este presenta efectos nocivos para la salud del sujeto, pérdida de productividad y perjuicio para la sociedad (69).
3.5 Estreñimiento
Se define el estreñimiento funcional como un trastorno que se caracteriza por dificultad persistente para defecar o sensación de defecación incompleta y movimientos intestinales
infrecuentes (cada 3-4 días o con menor frecuencia) en ausencia de síntomas de alarma o causas secundarias (70).
Se clasifica en dos categorías (71):
• Estreñimiento primario, se debe a causas desconocida, a defectos intrínsecos de la función del colon y zona ano rectal.
• Estreñimiento secundario, como consecuencia de enfermedades sistémicas y fármacos.
3.5.1 Epidemiología e impacto económico
Para el estreñimiento se estima una prevalencia a nivel mundial de aproximadamente el 15% (39). A nivel general y aunque existen pocos estudios en Latinoamérica, se encontró una frecuencia del 5-21%, con una relación mujeres-hombres de 3:1 y edad promedio de 38±16 años (72–74). Se dispone de datos epidemiológicos de México donde según los criterios de Roma II se presenta una frecuencia de 7.4% y del 18.8% (14), en Nicaragua la frecuencia fue de 21.1% (74). En Colombia no se cuenta con datos epidemiológicos disponibles acerca de la patología.
No hay información suficiente sobre el impacto en la región, a excepción del uso excesivo de laxantes estimulantes y suplementos de fibra (14). Se estima que aproximadamente el 30% de los sujetos que presentan la patología buscan ayuda médica (75,76).
Los estudios de participación del mercado en unidades vendidas en países como Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Ecuador, México, Perú, Venezuela y otros Latinoamericanos determinaron que hasta un 75% de las personas que padecen estreñimiento crónico toman algún producto para alivio de los Síntomas (14), de los cuales el 75% de personas tomaba algún producto, 59% laxantes, 38% fibra, 1% antiespasmódicos y el 0.18% otros pro cinéticos; sin embargo el 53% eran remedios caseros y el 27% auto medicación, sólo el 20% de estos eran con prescripción médica (14). También, se observa consumo oculto de laxantes en infusiones (14).
El ausentismo laboral o escolar por la presencia de estreñimiento crónico es de aproximadamente 2.4 días por mes (77), estos datos no se han caracterizado en la región
Latinoamericana, debido a que se encuentra mayor cantidad de empleo informal, lo cual dificulta el proceso.
3.5.2 Fisiopatología del estreñimiento
El proceso normal de defecación, depende de la adecuada función motora del colon, que prepara el contenido fecal y lo mueve hacia el recto y de la función sensitivo-motora recto anal, para la expulsión de las heces, por lo tanto, el estreñimiento puede producirse por alteración de la función motora del colon, por anomalía en la fase de evacuación o por ambas causas(71).
3.5.2.1 Alteración de la motilidad del colon:
Los individuos presentan un tránsito lento, especialmente en colón derecho, transverso y descendente, en algunos estudios se ha observado reducción en la frecuencia y duración de las contracciones (71). Al ser poco conocidos los mecanismos fisiopatológicos, se proponen dos teorías: en la primera, hay pérdida de células intersticiales de Cajal que lleva a una reducción de ganglios mesentéricos y disminución de las neuronas que secretan péptido intestinal vasoactivo; en segundo lugar, hay evidencia creciente de que puede producirse por disbiosis intestinal microbiana (71).
3.5.2.2 Disfunción de la defecación
La obstrucción funcional de la salida se debe a la contracción del esfínter anal externo y la musculatura del suelo pélvico, llevando a que ante un intento de defecación se cierre el canal anal y dificulte el paso; en otros casos, puede deberse a una anomalía en el reflejo recto anal inhibitorio (RRAI). También, se puede presentar disminución en la percepción rectal y se ha observado distensibilidad rectal y mega recto, generalmente se trata de pacientes que por condiciones personales o sociales han inhibido el deseo defecatorio (71).
3.5.3 Criterios para el diagnóstico clínico del estreñimiento
De acuerdo a la Guía basada en la evidencia para Colombia, el algoritmo para el diagnóstico y tratamiento con estreñimiento crónico (Figura 3), se aplican los criterios de Roma, que actualmente se encuentran en la versión IV, adicionalmente se indaga sobre la
historia clínica y se realiza un examen físico, si hay presencia de signos de alarma (70)(Tabla 1), se realizan paraclínicos específicos como imágenes diagnósticas y si no hay presencia de dichos signos, se realizan modificaciones en el estilo de vida; en caso de no presentar respuesta, el tratamiento continua con el uso de laxantes (78).
Figura 3. Algoritmo para el diagnóstico y tratamiento en pacientes con estreñimiento crónico(70)
Tabla 1. Signos de alarma en el estreñimiento(70)
Síntomas de alarma en el estreñimiento
Cambios en el calibre de las heces Heces hem positivas
Anemia ferropénica Síntomas obstructivos
Pacientes mayores de 50 años no sometidos a tamizaje previo para cáncer de colon Estreñimiento de reciente instalación
Sangrado rectal Prolapso rectal Pérdida de peso
3.6 Estado del arte
3.6.1 Aspectos neurofisiológicos, cognitivos y genéticos
relacionados con alcoholismo
El cerebro es uno de los principales órganos diana de las acciones del alcohol, la exposición crónica al alcohol produce alteraciones en la estructura, sus funciones e incluso neurodegeneración (79). Algunas áreas cerebrales más vulnerables a los efectos del alcohol como la corteza prefrontal, hipocampo, cerebelo, materia blanca y células gliales. Por su parte, el alcohol actúa sobre proteínas de membrana específicas como receptores de neurotransmisores como NMDAR y GABA-Ar, canales iónicos y vías de señalización como PKA y PKC, además adaptaciones en el sistema mesolímbico dopaminérgico, relacionado con el sistema de recompensa (80). El fenotipo resulta en perdida de la memoria, deterioro conceptual, procesamiento de material complejo, planeación y pensamiento abstracto (22).
El sistema dopaminérgico mesolímbico contribuye a la conducta de búsqueda(81)(82), este sistema se origina en el área tegmental ventral (VTA) y se proyecta al núcleo accumbens (NAcc), en donde se ha demostrado que un alto nivel de dopamina influye en los efectos de recompensa en casos de abuso de droga (83). También, ha sido demostrada la relación del sistema dopaminérgico mesolímbico con diversas estructuras involucradas en acciones motoras y procesamiento cognitivo(84), se cree que zonas como el hipocampo y la amígdala responden a estímulos relacionados con el consumo al establecer conexiones con NAcc. La liberación de dopamina se ve reducida durante la abstinencia del alcohol; las adaptaciones moleculares disminuyen la sensibilidad a los efectos de recompensa, por lo cual al descontinuar el uso de la droga, el individuo presenta síntomas depresivos(82). En Colombia, se evaluó la existencia de relación entre polimorfismos de genes involucrados en vías dopaminérgicas, encontrando que en pacientes con puntajes AUDIT correspondientes a dependencia, la frecuencia del alelo 141C Ins del gen del receptor de dopamina DRD2 obtuvo diferencias significativas comparado con el grupo control(85).
La supresión de SNCA disminuye la superficie de expresión y captación de dopamina, por consiguiente se altera la vía de recompensa, responsable del consumo crónico de
alcohol(22,65). En ratas con consumo crónico de alcohol en diferentes niveles, se evidenció que los animales con un alto consumo (10,4 ± 0.79g/kg) presentaron disminución de expresión de alfa sinucleina a nivel del mesencéfalo (45%) e hipotálamo (42%) en comparación con animales con bajo consumo (3.6 ± 0.46g/kg), estos cambios pertenecen a las áreas del cerebro donde prevalecen las vías dopaminérgicas(86). Los receptores GABA-A, tienen un papel importante en el reforzamiento psicológico del alcohol, los agonistas aumentan la autoadministración en ratas mientras que los antagonistas la disminuyen (87) y el estímulo en receptores NMDA, inhibe el reforzamiento (88–90). En estudios con humanos la pérdida neuronal se ha observado en áreas como corteza frontal, hipotálamo, cerebelo y en menor proporción en hipocampo, amígdala y locus coerulus (46), se ha evidenciado la existencia de un déficit en la memoria de corto plazo y preservación de la memoria procedimental; en cuanto a las funciones ejecutivas, la mayoría de estudios ponen en manifiesto afectación en funciones de planificación, organización, resolución de problemas flexibilidad mental, generación de conceptos, abstracción entre otras (91–95). También, se ha evidenciado que el deterioro cognitivo, puede llevar a demencia con un progreso gradual (96). Adicionalmente, un meta análisis examinó la cognición en el abuso/dependencia de alcohol y la duración de la abstinencia necesaria para recuperación cognitiva, encontrando deterioro moderado en 11 dominios durante la abstinencia a término moderado y persistencia durante el primer año posterior a la desintoxicación de alcohol (97).
En cuanto a los aspectos genéticos, estudios de familia, adopción y gemelos concluyeron que el alcoholismo tiene una heredabilidad del 50% (98,99) y que en población Colombiana, existe una asociación positiva entre antecedentes familiares de alcoholismo y el fenotipo alcohólico (100). Se ha apoyado la idea que los polimorfismos en genes que codifican enzimas para el metabolismo del alcohol puede influir en la dependencia, como es el caso de la conversión de etanol a acetaldehído por la alcohol deshidrogenasa (ADH) y de este a acetato por la aldehído deshidrogenasa (ALDH) (65), y se sabe que en población Colombiana, diferentes genotipos ADH2*2, CYP2E1*1 combinado con genotipo homocigótico ALDH2*1, pueden predisponer un riesgo potencial al alcoholismo debido a altas tasas de oxidación, aumento de las tasas de eliminación de alcohol y acetaldehído, lo que resulta en mayor tolerancia y consumo de grandes cantidades de alcohol(100). Adicionalmente una investigación en población colombiana que analizó varios genes,
incluyendo el DRD2 (TaqI B and -141C Ins/Del) en personas alcohol dependientes, no encontró asociación entre el polimorfismo de este gen y el consumo de alcohol(85). Otros estudios han identificado genes que se expresan diferencialmente en distintas áreas del cerebro en respuesta al consumo prolongado de alcohol, observando pérdida de volumen en la sustancia blanca y perdida neuronal en la materia gris (101), acompañado de déficit en la memoria y reducción en el volumen del hipocampo (102,103), además, se han observado niveles alterados de expresión en genes implicados en apoptosis, mielinización, ubiquitinación y en enfermedades neurodegenerativas, como la presenilina 1 y transferrina, lo que sugiere una posible relación entre alcoholismo y estas patologías. Contrariamente a los efectos negativos, el resultado de algunas investigaciones postula que la ingesta moderada de alcohol reduce el riesgo de deterioro cognitivo (104,105). En estudios a nivel mundial, se evidenció que el consumo de vino mostraba protección contra el deterioro cognitivo (106–111). Un meta-análisis que analizó 23 estudios que asociaban el alcohol y el deterioro cognitivo (112) concluyó que pequeñas cantidades de alcohol protegen contra la demencia (RR: 0.63) y la enfermedad de alzheimer (RR:0.57). Estos resultados parecen ser consistentes con otros modelos de experimentación como cultivos de células cerebrales con exposición a alcohol en cantidades no neurotóxicas, en donde se observó protección celular contra la neurodegeneración mediada por receptores de NMDA (113,114) y en ratas donde el consumo de 15% etanol/agua confería protección contra la apoptosis causada por inyección de lipopolisacarido inflamatorio (LPS) (115). Por último, el estudio de Framingham probo que el consumo de alcohol moderado puede asociarse con menor reducción de volumen cerebral en comparación con presentar un consumo nulo o excesivo (116).
3.6.2 Expresión diferencial de alfa sinucleina en sujetos con alto
consumo de alcohol
La expresión génica de SNCA ha sido objeto de estudio en diferentes modelos. En ratones, se ha evaluado, los posibles cambios en la expresión después de periodos cortos de abstinencia; inicialmente, los ratones tuvieron acceso constante a una solución de alcohol al 8% durante 32 días, y posteriormente se utilizaron técnicas para cuantificar los niveles del gen y la proteína en cerebro y sangre. A nivel cerebral, los resultados no mostraron
cambios en el ARNm en ninguna de las áreas del cerebro estudiadas, pero el nivel de la proteína sufrió modificaciones, mediante un incremento en la amígdala, después de 24h de abstinencia, que no corresponde al nivel de transcripción de ARNm, y se postula una posible acumulación en botones sinápticos, por alteraciones en trasporte o degradación. Por su parte, en sangre, se observó un incremento en la expresión génica a las 48h de abstinencia, que en este caso no se relaciona con la expresión a nivel cerebral(8).
En la corteza prefrontal de alcohólicos humanos con la variante más común SNCA-140, se ha evidenciado una importante reducción de la expresión (6,7,9). Por el contrario, en modelos animales, en regiones del cerebro como el hipocampo y el caudado, la expresión de SNCA se incrementó y en estriado presentó reducción(9).
Por su parte, en primates no humanos con autoadministración de alcohol por 18 meses y con diagnóstico de alcoholismo, se observó un incremento 3.21 veces mayor de los niveles del gen en sangre periférica(10). En humanos, se ha evaluado la expresión génica en sangre total en sujetos con un periodo de abstinencia de 24-72 horas, mostrando que en pacientes alcohólicos la expresión es significativamente más alta en comparación con los sujetos control(11). Por su parte, el nivel de expresión de la proteína en plasma, también fue significativamente más alto, comparado con el grupo control(117).
En general, el aumento de los niveles de ARNm en sangre es común en humanos, roedores y primates, sin embargo, la expresión también está vinculada a la presencia de polimorfismos y de miARNs. Los miARNs, otro mecanismo de regulación epigenética, son oligonucleótidos no codificantes, que tiene un importante papel en la regulación postranscripcional de la expresión del gen y la degradación del ARNm. En el cerebro se encuentran de manera amplia, afectando su desarrollo, diferenciación neuronal, sinapsis y neurogénesis (118). Los miARNs intervienen en las adaptaciones tras la exposición al alcohol en modelos celulares, animales y humanos(22); se sabe que en alcohólicos humanos se presenta regulación de alrededor de 35 miARNs, sugiriendo que la expresión reducida de genes en los casos de alcoholismo puede ser consecuencia del aumento de miARNs(118).
Normalmente, el microARN-7 expresado en neuronas, reprime la expresión de SNCA a través de la región 3’ no traducida (UTR) del ARNm de la SNCA, e inhibe la muerte celular mediada por SNCA. En ratones con neurotoxicidad dopaminérgica con inyecciones de MPTP(neurotoxina,1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) y en células que fueron
transfectadas con constructos que expresan SNCA en ausencia o presencia de miARN-7 y exposición a peróxido de hidrogeno, se observó que la disminución en la expresión de miR-7, aumenta la expresión de SNCA(119). Así mismo, lo confirman estudios recientes en ratones inyectados con un vector lentiviral que media la expresión de miARN-7 en sitios de unión complementaria para inducir la pérdida de la función de miARN-7, en donde se produjo un aumento de la expresión de SNCA in vitro e in vivo, muerte neuronal dopaminérgica y reducción de dopamina estriatal(120).
Tras la exposición de precursores neuronales corticales cerebrales de feto de ratón a dosis de alcohol equivalentes a las consumidas por alcohólicos, se observó supresión en la expresión de cuatro miARNs, miR-21, 335, 9 y 153(121). El miARN-153, actúa degradando el ARNm y se sabe que al sobre expresarse junto con el miARN-7, se reduce significativamente la expresión de SNCA y su inhibición la aumenta(13).
3.6.3 Alfa sinucleina en tejidos periféricos
El Flujo de alfa sinucleina entre el cerebro y los tejidos periféricos podría tener implicaciones fisiopatológicas importantes y se sabe que cuando la proteína es marcada radioactivamente cruza la barrera hemato encefálica en dirección cerebro-sangre y viceversa, mecanismo por el cual se regulan los niveles cerebrales, en caso de un flujo alterado de sangre se observa acumulo a nivel cerebral; a su vez, los procesos inflamatorios conducen a mayor neurotoxicidad ya que interrumpen la barrera hemato encefálica (28).
Se sabe que los valores de alfa sinucleina total en células sanguíneas y saliva se determinan mediante ELISA adaptada para máxima detección (29,122). La alfa sinucleina es accesible en fluidos humanos (29,30) como sangre (31,32), eritrocitos(33,34), saliva(35) y fluido cerebroespinal. En cuanto a la expresión en eritrocitos que son células que carecen de núcleo, esta se regula por el mecanismo post traduccional, como la degradación y liberación de alfa sinucleina; además, se asocia con la membrana plasmática de estas células y esta forma de unión es más propensa para agregación de células neuronales(33) también se sugiere que la alfa sinucleina encontrada en eritrocitos se asocia con enfermedad de parkinson(34,36).
En este contexto, la detección de alfa sinucleina extracelular, específicamente en plasma humano, es un marcador confiable(123), ya que la proteína neuronal se secreta en el
entorno cerebral circulando al fluido cerebroespinal (CSF) y posteriormente a la sangre (31), además, se han realizado estudios en pacientes alcohólicos sobre la expresión de alfa sinucleina en sangre concluyendo que la elevación de niveles de RNAm en sangre es común en humanos, roedores y primates y que la alfa sinucleina es útil como marcador periférico de alcoholismo crónico (8,10,11).
3.6.3 Polimorfismos y metilación en la región promotora del gen
de alfa sinucleina en el consumo de alcohol
La evidencia encontrada en la identificación de polimorfismos en la región promotora de alfa sinucleina ha sido profunda en la enfermedad de Parkinson y alzheimer, por lo tanto, investigaciones en Alemania, Rusia, Singapur y otros países, han identificado diferentes polimorfismos(124–127). Dentro de los resultados más destacados, se encontró un polimorfismo (rs2736990), asociado con el riesgo de enfermedad de parkinson en la población rusa, adicionalmente se probaron los siguientes SNPs de la región promotora (rs2583988, rs2619363, rs2736990 y rs2619364) y no se encontró asociación entre los genotipos y las alteraciones en los niveles de expresión de SNCA (125).
Se ha relacionado la dependencia del alcohol con una región del cromosoma 4 que contiene genes de alcohol deshidrogenasa y alfa sinucleina (SNCA)(128,129). El gen SNCA es altamente polimórfico y se han relacionado variantes en la región promotora con el abuso de alcohol. Polimorfismos en SNCA-Rep1 se encuentran asociados con fenotipos de uso, abuso, dependencia y búsqueda de alcohol (12). Adicionalmente, en un estudio llevado a cabo en tejido cerebral, el alelo de SNCA-Rep 1 difería entre los casos y controles, encontrando que los alcohólicos tenían mayor frecuencia del alelo corto, asociado con disminución de la expresión de alfa sinucleina en la corteza prefrontal, sugiriendo que los individuos con alelo de 267pb pueden tener mayor riesgo de desarrollar alcoholismo (7).
También se midió la expresión de tres variantes de alfa sinucleina SNCA-140, SNCA-112 Y SNCA-115, en corteza prefrontal de alcohólicos humanos con presencia de cirrosis, como resultado se encontró que en los alcohólicos la expresión de 140 y SNCA-112 fue menor y la expresión de SNCA-115 mayor(7).
También, se ha estudiado el papel del gen SNCA (Figura 4) en distintos fenotipos como la dependencia al alcohol y el deseo compulsivo de alcohol, en una población de 219 familias
de descendencia Europea Americana, encontrando que no hubo asociación entre SNPs de SNCA y dependencia de alcohol; en estos resultados se identificaron 5 polimorfismos en la región promotora del gen “upstream” (rs7678651, rs7687945, rs2736995, rs2619364, rs2301134), de los cuales 2 se encontraban dentro de los 8 SNPs (Figura 5) (rs2736995, rs2619364, rs2583985, rs2737006, rs3561184, rs356183, rs356195, rs3561168) asociados con el fenotipo de deseo (craving) de alcohol (130).
Figura 4. Gen de alfa sinucleina humana y polimorfismos asociados con fenotipo de alcohol(130)
Figura 5. SNCA SNPs y resultados de asociación(130)
Por otro lado, se investigó en un grupo de 84 alcohólicos crónicos y 93 controles, si la metilación del ADN en la región promotora de la alfa sinucleina estaba alterada en células mononucleares de una muestra sanguínea, observando un aumento significativo de la metilación en el promotor de ADN en estos pacientes, lo cual estaba asociado a niveles incrementados de homocisteína(131).
3.6.4 Efectos del alcohol en la fisiología gastrointestinal
El consumo de alcohol tiene un efecto directo en la fisiología gastrointestinal, específicamente en la absorción, metabolismo del alcohol y en el microbioma intestinal(132).
En alcohólicos con un consumo de alcohol de más de 200g/día en los últimos 10 años con polimorfismos genéticos en enzimas importantes del metabolismo del alcohol, como el alcohol deshidrogenasa 3 (ADH3) y el citocromo 450 2E1 (CYP2E1), se estudió, si el genotipo predisponía el desarrollo de síntomas gastrointestinales, no se observó asociación estadísticamente significativa entre los genotipos y los síntomas gastrointestinales adversos, sin embargo el 83% de los sujetos reportaba síntomas
