INFECCIÓN POR MIKROCYTOS MACKINI (MICROCITOSIS)

C A P I T U L O 2 . 2 . 5 .

I N F E C C I Ó N P O R M I K R O C Y T O S M A C K I N I

( M I C R O C I T O S I S )

1. D

A efectos de este capítulo, la microcitosis se considera una infección por Mikrocytos mackini.

2. I

• Agente etiológico, cepas del agente: Mikrocytos mackini, no se conocen cepas (13).

• La supervivencia fuera del hospedador (es decir, en el ambiente natural) no se conoce. Sin

embargo, la transmisión directa entre ostras ocurre a través del agua (1, 14, 18).

• La estabilidad del agente es desconocida. No existe evidencia de pared celular y su aparente

dependencia de los orgánulos del hospedador (15) sugiere que este parásito carece de viabilidad cundo está fuera de su hospedador

• Ciclo biológico: directo de hospedador a hospedador. b) Factores del hospedador

• Especies hospedadoras susceptibles: ostras – Crassostrea gigas, C. virginica, Ostrea edulis y

O. conchaphila (=O. lurida) (7); la almeja Panope abrupta es resistente a la infección (4).

• Fases susceptibles del hospedador: todas las fases tras el asentamiento (4). Se desconoce la

susceptibilidad de las larvas.

• Predilección de especie o subploblación (probabilidad de detección): son vulnerables a la

enfermedad todas las especies susceptibles mantenidas por debajo de 10°C durante al menos 3 meses (7, 14). Crassostrea virginica, Ostrea edulis y Ostrea conchaphila parecen ser más susceptibles que Crassostrea gigas a la infección y a la enfermedad (7).

• Órganos diana y tejidos infectados: tejido conjuntivo de todos los órganos, fibras del músculo

abductor y hemocitos (15). Recientemente, se ha observado M. mackini en el epitelio de la glándula digestiva (17).

• Infección persistente con portadores duraderos: la infección puede ser letal en función de las

condiciones ambientales y del hospedador (1, 2, 9). Ocurren infecciones subclínicas pero se desconoce la persistencia de la infección durante varios años y la existencia de portadores (6).

• Vectores: no se requiere ninguno. c) Patrón de la enfermedad

• Mecanismos de transmisión: la transmisión es directa de hospedador a hospedador (14). Se

adquieren probablemente con la alimentación las células viables liberadas a la muerte del hospedador, y posiblemente por sus heces, y también mediante diapédesis a través de las branquias.

• Prevalencia: se han descrito mortalidades de hasta el 40% durante la primavera (Abril y mayo)

en niveles bajos de las mareas entre ejemplares de más de 3 años de C. gigas crecidos sobre el substrato de la playa. Cerca del 10% de las ostras de un lugar con cultivos suspendidos, que

no se recogieron a tiempo, murieron por infecciones fuertes de M. mackini en la primavera siguiente. Hasta el 45% de las ostras de esta población infectada tenían lesiones sintomáticas (pústulas grisáceo-amarillentas). Sin embargo, esta enfermedad no tiene normalmente impacto en las ostras bajo cultivo intensivo (cosechadas dentro de los primeros 3 años). Experimentos de laboratorio sobre los efectos de la exposición indican que la ostra joven es susceptible a la infección y muestra una elevada mortalidad (4). El impacto de M.mackini sobre la ostra joven durante el cultivo comercial no se conoce, pero se supone que es despreciable si la ostra joven se asienta después del final del período de transmisión natural que ocurre en primavera (18).

• Distribución geográfica: costa oeste canadiense, probablemente común por el estrecho de

Georgia y confinado a otras localidades específicas alrededor de la Isla de Vancouver y áreas adyacentes del estado de Washington, EEUU.

• Mortalidad y morbilidad: la infección puede ser letal si la temperatura ambiental es <10°C

durante 3–4 meses (9, 14). Sin embargo, casi la mitad de las ostras expuestas parecen ser resistentes a la infección.

• Impacto económico y/o productivo de la enfermedad: se pueden emplear en la industria de la

acuicultura técnicas de gestión para evitar el impacto de M.mackini (1). Las especies susceptibles, excepto Ostrea conchaphila, no son nativas de las áreas donde se sabe que existe M.mackini. Las poblaciones de O.conchaphila son escasas y esta especie se ha identificado como una especie de especial preocupación por el Comité sobre el Estado de la Vida Salvaje en Extinción en Canadá (12). El impacto de M.mackini sobre las poblaciones de O.conchaphila resulta desconocido.

d) Control y prevención • Vacunación: ninguna

• Quimioterapia: ninguna

• Inmunoestimulación: ninguna

• Producción de resistentes: ninguna

• Repoblación con especies resistentes: ninguna • Agentes bloqueadores: ninguno

• Prácticas generales de manejo: se recogen las ostras de tamaño de mercado en los 3 primeros

años de plantación y antes del mes de febrero del tercer año de crecimiento. La ostra de siembra no debe ser asentada antes del mes de junio en niveles bajos de las mareas ni adyacente a producciones infectadas en cultivos suspendidos (1, 18).

3. M

a) Métodos de diagnóstico de campo

• Síntomas clínicos: ostras muertas o vacías durante la primavera. Se observan pústulas focales

grisáceo-amarillentas de hasta 5 mm de diámetro en los tejidos blandos y con frecuencia una cicatriz marrón en la concha, adyacente al absceso sobre la superficie del manto. Aparte de las pústulas, las ostras infectadas están por lo general en buenas condiciones hasta el momento de la muerte. Estos síntomas clínicos no son específicos de infección por M. mackini.

b) Métodos clínicos

• Lesiones macroscópicas: pústulas focales grisáceo-amarillentas de hasta 5 mm de diámetro, en

la pared del cuerpo, en el músculo abductor o en la superficie de los palpos labiales o del manto (3). Estas lesiones no son específicas de la infección por M. mackini.

• Examen microscópico

• Preparaciones con montaje en húmedo: ninguna • Frotis de tejidos: ver descripción más adelante

• Cortes fijados: focos de infiltración de hemocitos en el manto, en los palpos labiales y en el

músculo abductor. Puede haber necrosis tisular en el centro de la lesión (8). En infecciones muy fuertes inducidas en laboratorio, la infiltración por hepatocitos puede estar ausente.

• Microscopía electrónica/citopatología: ver descripción más adelante. c) Métodos detección e identificación del agente

• Métodos directos de detección i) Métodos microscópicos

• Frotis de tejidos: solo en infecciones avanzadas. Muestras tomadas: hospedadores vivos con pústulas.

Procedimiento técnico: se aísla la pústula y se corta por la mitad con un escalpelo. Se transfiere la pústula por el lado del tejido sobre un papel absorbente para eliminar el exceso de líquido. Se toca con el tejido en varias áreas de un porta de vidrio limpio y se deja secar al aire. Las observaciones se realizan a ×1000 (con aceite de inmersión) después de la tinción con colorantes de Wright–Giemsa (Romanowsky) o con un kit comercial de colorantes para células sanguíneas siguiendo las instrucciones del fabricante.

Controles positivos/negativos: no. Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: muy baja especificidad porque M.mackini se parece a

otras microcélulas en frotis de tejidos; la sensibilidad es mejor que la histología rutinaria, pero sólo cuando se presentan pústulas (14).

Interpretación de los resultados:

• Presencia de microcélulas (que pueden estar distorsionadas hasta alrededor de 4 µm

de diámetro) que por lo general están fuera de las células hospedadoras. El parásito, normalmente con un diámetro de 2–3 µm, tiene un citoplasma azul (basófilo) y un pequeño núcleo rojo (eosinófilo) (los colorantes pueden variar con la tinción utilizada). Esta técnica no es específica de especie.

Disponibilidad de pruebas: existen kits de tinción rápida comercializados (por ejemplo, Hemacolor®, Merck; Diff-QuiK®, Baxter).

• Histología:

Muestras a tomar: ostras vivas o recién muertas.

Procedimiento técnico: Se deben fijar durante 24 horas cortes de tejido que incluyan las pústulas y cortes del músculo abductor en solución de Davidson o en 10% de formalina tamponada; después se sigue un procesamiento histológico normal en parafina y tinción con hematoxilina y eosina como colorantes. Se observa a aumentos crecientes hasta ×1000.

Controles positivos: se recomiendan, y están disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: la especificidad de especie es muy baja para microcélulas observadas en los hemocitos pero alta cuando las microcélulas se encuentran en el citoplasma de las células del tejido conectivo vesicular; la sensibilidad es buena en infecciones de intensidad moderada a alta, en especial cuando se examina el tejido

conectivo adyacente a las pústulas, pero es baja en tejidos distantes de las pústulas y para infecciones de baja intensidad.

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo es la presencia de microcélulas esféricas de 2–3 µm de

diámetro en el citoplasma de células del tejido conectivo vesicular y/o miocitos, normalmente intracelulares en las células del hospedador que están inmediatamente adyacentes a la infiltración focal intensa por hemocitos.

• En especies de hospedadores susceptibles dentro del espectro conocido para

M. mackini, un resultado positivo es la evidencia presumible de infección por M. mackini. Fuera de ese espectro, un resultado positivo debe confirmarse por secuenciación del ADN de la región del ARN ribosómico de la subunidad pequeña (SSU rADN) y por comparación de la secuencia con el fragmento de 1457 pb de M. mackini publicado en GenBank (número de acceso AF477623, y URL:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=30515676). Disponibilidad de pruebas: no existen pruebas en el mercado.

• Microscopía electrónica de transmisión

Muestras tomadas: ostras vivas o recién muertas.

Procedimiento técnico: descrito en el capítulo I.2 de este Manual de animales acuáticos. Controles positivos: no.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: mejor especificidad que la histología. La microscopía

electrónica de transmisión puede emplearse para diferenciar M. mackini de otras microcélulas como todas las especies de Bonamia. La sensibilidad es muy baja.

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo es la presencia de parásitos en las células del tejido conectivo

vesicular, los miocitos y los hemocitos. Se han descrito tres formas morfológicas (15). Las células quiescentes (QC) tienen un núcleo central redondo u ovoide, menos de siete cisternas del aparato de Golgi inactivo unido a la membrana nuclear, y pocas vesículas y cuerpos parecidos a lisosomas. Se presentan en las células del tejido conectivo vesicular, en los hemocitos (hialinocitos), los miocitos del abductor y del corazón, y extracelularmente. Las células vesiculares (VC) contienen muchas vesículas pequeñas recubiertas o no, carecen de membranas de tipo Golgi y la membrana nuclear se dilata a veces hasta formar una cámara o cisterna. Raramente son extracelulares y por lo general están en los miocitos del abductor y del corazón, cerca de las mitocondrias de las células del hospedador. Las células endosómicas (EC) tienen una envoltura nuclear dilatada, un retículo endoplásmico con anastomosis que está bien desarrollado y que conecta la membrana nuclear con la membrana plasmática, y con endosomas presentes en el citoplasma. Aparecen en las células del tejido conectivo vesicular, en los hemocitos (hialinocitos), y también extracelularmente.

• A diferencia del resto de microcélulas, M. mackini no tiene mitocondrias o sus

equivalentes, presenta pocos orgánulos citoplásmicos y su nucleolo se localiza hacia el centro del núcleo. Los escasos orgánulos en todas las formas de M. mackini pueden deberse a un parasitismo obligado y al uso de los orgánulos del hospedador, lo que reduce la necesidad de orgánulos para el parásito (15).

Disponibilidad de pruebas: no hay disponibles pruebas comercializadas.

ii) Aislamiento e identificación del agente • Medios de cultivo celular artificial: ninguno.

• Métodos de detección de antígenos basados en anticuerpos: se han desarrollado anticuerpos

monoclonales y policlonales contra M. mackini, (14), pero no se ha determinado por completo su especificidad y sensibilidad.

• Técnicas moleculares: reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Muestras tomadas: moluscos vivos o recién muertos.

Procedimiento técnico: las muestras de tejido se colocan en 95% de etanol hasta la extracción del ADN usando un sistema comercializado disponible (por ejemplo, DNeasy Kit; QIAGEN).

Prueba para la región SSU rADN (5, 11): se han desarrollado pares de cebadores dirigidos a la región SSU de M. mackini. Los cebadores son 5’-AGA-TGG-TTA-ATG-AGC-CTC-C-3’ y 5’-GCG-AGG-TGC-CAC-AAG-GC-3’ y amplifican un producto de 546 pb (11). Las muestras deben diluirse antes de la prueba a una concentración entre 10 y 40 ng/µl con agua estéril doblemente destilada o con tampón estéril Tris/EDTA (TE) (pH 7,0–7,2). La mezcla de reacción de la PCR contiene los siguientes ingredientes a las concentraciones finales que se indican: 20 mM de Tris/HCl (pH 8,4), 50 mM de KCl, 1,25 mM de MgCl2, 200 µM de cada uno de los nucleótidos dATP, dCTP, dGTP,

y dTTP, 0,05 µM de cada uno de los cebadores y 0,05 unidades/µl y 1,5 µl de ADN molde en un volumen total de 15 µl. Los parámetros cíclicos comienzan con una desnaturalización inicial a 94°C durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos a 94°C durante 1 minuto, 60,5°C durante 1 minuto, y 72°C durante 1 minute, terminando con una extensión final a 72°C durante 10 minutos. Los productos se pueden someter a electroforesis en geles de agarosa al 1,5% que contengan 2,0 µl de 5000X SybrGreen o 0,1 µg/ml de bromuro de etidio y se visualizan por exposición a luz UV.

Controles positivos/negativos: son obligados y están disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE. Los controles positivos son ADN genómicos de hospedadores con infección fuerte. Los controles negativos son ADN que no sirven como molde. Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: la especificidad de esta prueba de PCR no se ha

determinado por completo. Sin embargo, detectó tres o cuatro veces más infecciones por M. mackini que la histopatología estándar en 1.056 ostras silvestres de la isla Denman, en British Columbia. La prevalencia de Mikrocytos mackini basada en los dos métodos aumentó (PCR de 4.4 a 7.4%, histopatología de 1.2 a 2.1%) cuando se procesaron lesiones grandes además de muestras estándar (es decir, cortes transversales para histopatología, y ADN del palpo externo izquierdo para PCR). El uso de la histopatología y de frotis de tejidos más la PCR, y de muestras estándar más las lesiones grandes observadas, representó una evidencia total para la diagnosis de M. mackini que supuso la estimación más realista que pudo obtenerse de modo práctico sobre la prevalencia de M. mackini en una muestra de ostras (11).

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo es un amplicón por PCR del tamaño adecuado, siendo

negativos todos los controles negativos y positivos todos los controles positivos. Disponibilidad de pruebas: no disponibles comercialmente.

• Técnicas moleculares: hibridación in-situ (ISH).

Muestras tomadas: moluscos vivos o recién muertos.

Procedimiento técnico: se deben fijar durante 24 horas en líquido de Davidson cortes de tejidos que incluyan pústulas y el músculo abductor, seguido por un procedimiento histológico normal con inclusión en parafina e hibridación con sondas de oligonucleótidos marcados. Las sondas marcadas en 5’ con verde Oregón hibridan fuertemente con M. mackini (11) aunque resulta difícil la orientación del tejido del hospedador. La hibridación con la sonda MACKINI-1 (5’-AGC-CCA-CAG-CCT-TCA-C-3’) con un marcaje con digoxigenina en el extremo 3´ (QIAGEN Inc., Canadá) y una

tinción de contraste con 0,5% de marrón Bismark Y en 30% de etanol (17) permiten la localización del parásito dentro de los tejidos del hospedador.

Controles positivos: recomendados y disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: la sonda MACKINI-1 hibridó fuertemente con M. mackini, pero no hibridó con tejidos de ostras o con otros parásitos de moluscos y una bacteria probada: Bonamia ostreae en O. edulis; Perkinsus qugwadi en Patinopectin yessoensis; Trichodina sp. en C. gigas; un protisto semejante a una ameba en Protothaca staminea; Hematodinium sp en Chionoecetes tanneri; SPP (un protisto parásito de afiliación taxonómica incierta (10) en Pandalus platyceros; y Nocardia crassostreae. en C. gigas (17). Esta sonda con un marcaje de digoxigenina fue mucho más sensible para detectar infecciones que los cortes histológicos estándar teñidos con hematoxilina y eosina. La infección se puede detectar a menos aumentos (×100 en comparación con ×1000) y en tejidos con tinción basófila como la glándula digestiva, el epitelio intestinal y las gónadas (17).

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo es una reacción tntorial de tamaño apropiado, siendo

negativos todos los controles negativos y positivos todos los controles positivos. Disponibilidad de pruebas: no disponibles comercialmente.

• Purificación del agente: no se han obtenido aislamientos de M. mackini libres de

contaminación con núcleos del hospedador. Sin embargo, se ha descrito una técnica de filtración que concentra este parásito (16).

• Métodos indirectos de detección

• Métodos serológicos: no es aplicable ninguno.

4. V

Los métodos actualmente disponibles para vigilancia, detección y diagnóstico de M. mackini se enumeran en el cuadro 1. Las designaciones usadas en el cuadro indican: A = el método es el método recomendado por motivos de disponibilidad, utilidad, y especificidad y sensibilidad diagnóstica; B = el método es un método estándar con buena sensibilidad y especificidad diagnóstica; C = el método tiene aplicación en algunas situaciones, pero su coste, exactitud y otros factores, limitan notablemente su aplicación; y D =el método no se recomienda actualmente para esta finalidad. Estas indicaciones son algo subjetivas ya que la adecuación implica valoraciones de confianza, sensibilidad, especificidad y utilidad.

Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de Mikrocytos mackini

Método Vigilancia Presuntiva Confirmativa

Síntomas generales* C D D

Frotis de tejidos* C C D

Histología B B B

Microscopía electrónica de transmisión D D A

Reacción en cadena de la polimerasa C C C

Secuenciación D D A

Sonda de ADN – hibridación in-situ C C C

* La técnica no es específica de especie, pero puede usarse durante la primavera en hospedadores y en áreas donde la enfermedad causada por M. mackini es evidente.

5. C

En especies susceptibles conocidas, dentro de un ámbito geográfico conocido de existencia de M. mackini durante la primavera, un caso sospechoso de infección por M. mackini es un resultado positivo en uno de los siguientes métodos: síntomas generales en combinación con frotis de tejidos con pústulas, histología o PCR.

En otras especies, o fuera del ámbito conocido de M. mackini, un caso sospechoso es un resultado positivo por histología, PCR o hibridación in-situ.

b) Definición de un caso confirmado

Un caso confirmado de Mikrocytos es un resultado positivo por frotis de tejidos con pústulas, histología, PCR o hibridación in-situ combinado con un resultado positivo en microscopía electrónica de transmisión. Se recomienda la secuenciación de la región SSU como paso final para un diagnóstico confirmativo de M. mackini.

6. M

/

Los métodos de vigilancia dirigida a declarar la ausencia de infección como se define en el Código de animales acuáticos son: análisis histológico durante la época de la primavera de ostras de 3+ años a bajos niveles de las mareas o en cultivo suspendido.

REFERENCIAS

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5. BOWER S.M.,CARNEGIE R.B.,GOH B.,JONES S.R.M.,LOWE G.J.&MAK M.W.S.(2004). Preferential

PCR amplification of parasitic protistan small subunit rDNA from metazoan tissues. J. Eukaryotic Microbiol., 51, 325–332.

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8. BOWER S.M., McGLADDERY S.E. &PRICE I.M. (1994). Synopsis of infectious diseases and parasites of commercially exploited shellfish. Ann. Rev. Fish Dis., 4, 1–199. For update see URL: http://www.pac.dfo-mpo.gc.ca/sci/shelldis/title_e.htm.

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10. BOWER S.M. & MEYER G.R. (2002). Morphology and ultrastructure of a protistan pathogen in the

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11. CARNEGIE, R.B., MEYER G.R., BLACKBOURN J., COCHENNEC-LAUREAU N., BERTHE F.C.J. &

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14. HERVIO D., BOWER S.M. &MEYER G.R. (1996). Detection, isolation and experimental transmission

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16. JOLY J.-P., BOWER S.M. & MEYER G.R. (2001). A simple technique to concentrate the protozoan Mikrocytos mackini, causative agent of Denman Island disease in oysters. J. Parasitol., 87, 432–434. 17. MEYER G.R., BOWER S.M. & CARNEGIE R.B. (2005). Sensitivity of a digoxigenin-labelled DNA

probe in detecting Mikrocytos mackini, causative agent of Denman Island disease (mikrocytosis) in oysters. J. Invertebr. Pathol. 88, 89–94.

18. QUAYLE D.B. (1982). Denman Island oyster disease 1960–1980. British Columbia Shellfish Mariculture Newsletter, 2, 1–5, (Victoria, Canada).

* * *

NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la microcitosis (véase el cuadro al final de este