MARTEILIOSIS (INFECCIÓN POR MARTEILIA REFRINGENS)

C A P Í T U L O 2 . 2 . 4 .

M A R T E I L I O S I S

( I N F E C C I Ó N P O R M A R T E I L I A R E F R I N G E N S )

1. D

A efectos de este capítulo, la infección la marteiliosis es una infección por Marteilia refringens, tal como la definen Le Roux et al. (21). En esa definición se excluye la infección por Marteilia sydneyi (30), M. lenghei (13) y M. christenseni (14). Las Marteilia spp. que no están identificadas a nivel de especie (10, 15, 25–27) deben comunicarse al laboratorio de referencia de la OIE.

2. I

a) Factores del agente

• Agente etiológico y cepas del agente: Marteilia refringens (16, 18) según se las define en Le Roux et al. (21).

• Supervivencia fuera del hospedador: según las condiciones medioambientales, desde varios días a 2-3 semanas (17).

• Estabilidad del agente: no existen datos.

• Ciclo de vida: indirecto – incluye a Paracartia grani (2–4). No se han descrito que haya otras especies implicadas en el ciclo de vida (para información detallada, véase el cuadro 1 en Ref. 2). b) Factores del hospedador

• Especies hospedadoras susceptibles: la especie Ostrea incluyendo O. edulis (18), O. chilensis (17, 19), O. puelchana (28), O. angasi (17) y la especie Mytilus que a su vez incluye M. edulis (5, 21) y M. galloprovincialis (23, 28, 32, 37, 38).

• Fases del hospedador susceptibles: juveniles y fases de vida de mayor edad (17).

• Especies y subpoblaciones predilectas (probabilidad de detección): normalmente, causa infección clínica en Ostrea edulis (5, 18) y Ostrea spp. (10, 17, y 19). En poblaciones silvestres, los moluscos de más de dos años de edad, por lo general, tienen mayores niveles de infección (2).

• Órganos diana y tejidos infectados: el tracto digestivo. Los plasmodios jóvenes se encuentran sobre todo en el epitelio de los palpos labiales y en el estómago (18). La esporulación tiene lugar en los túbulos y conductos de la glándula digestiva. Los propágulos se liberan dentro del lumen del tracto digestivo y se esparcen por el entorno en las heces (3, 9, 10).

• Infección persistente en portadores asintomáticos: la marteiliosis es una enfermedad letal de las ostras (1, 3, 9, 18). Tras la infección inicial, la muerte sobreviene durante el segundo año (1, 6, 9, 17). Por tanto, la infección puede persistir más de un año y puede durar toda la vida (6). Normalmente, los mejillones no se ven desfavorablemente afectados por M. refringens (7, 10), pero se desconoce si se produce esporulación o si los mejillones pueden ser portadores de M. refringens (10, 21).

c) Patrón de la enfermedad

• Mecanismo de transmisión: hospedador intermediario (3, 9). No se ha demostrado experimentalmente la transmisión desde P. grani a O. edulis (3). En las ostras, los estadios tempranos de la enfermedad afectan al estómago, los palpos e incluso los epitelios de la branquia. Se cree que la infección inicial se produce por medio de los flujos alimenticios. • Prevalencia: muy variable – hasta el 98%. Se espera una prevalencia más alta de acuerdo con las

prácticas de cría y tras más de 1 año de exposición a la infección (10, 17).

• Distribución geográfica: se ha informado de su existencia en Croacia, Francia, Grecia, Italia, Marruecos, Portugal y España.

• Mortalidad y morbilidad: la infección es letal para las ostras – la muerte sobreviene normalmente durante el verano y el otoño, y se asocia con la esporulación del parásito (9, 17, 18). De forma similar, la morbilidad es mayor durante los periodos más templados. Los mejillones son menos afectados por la infección (7, 10).

• Impacto económico y/o ecológico de la enfermedad: entre 1980 y 1983 en Francia la marteiliosis originó graves pérdidas estimadas en 440 millones de euros (17).

• Los factores ambientales (ej. la temperatura, salinidad, estación, etc.): una temperatura de 17°C se considera como umbral para la esporulación y transmisión del parásito, frecuente en los estuarios en los que la prevalencia es normalmente mayor en las partes más elevadas (2, 4, 10, 17).

d) Control y prevención • Vacuna: ninguna. • Quimioterapia: ninguna. • Inmunoestimulación: ninguna. • Producción de resistentes: ninguna.

• Reposición con especies resistentes: ninguna. En Europa se ha intentado con diferentes especies del género Ostrea, pero todas han demostrado ser susceptibles (17, 19, 29). Las existencias no contaminadas de Ostrea edulis y Mytilus edulis son muy susceptibles a la infección. • Agentes bloqueadores: ninguno.

• Prácticas generales de manejo: Se ha descrito que son efectivas las repoblaciones de baja densidad o en conjunción con especies de moluscos resistentes, como la Crassostrea gigas (11).

3. M

a) Métodos de diagnóstico de campo

• Síntomas clínicos: ostras muertas o boqueantes; animales débiles especialmente susceptibles a cualquier estrés adicional (17, 18). Estos síntomas clínicos no son específicos de la infección por M. refringens.

b) Métodos clínicos

• Síntomas generales: palidez de la glándula digestiva, carne fina y acuosa, retracción del manto y ralentización del crecimiento (10, 17, 18). Estos síntomas no son específicos de la infección por M. refringens.

• Bioquímica clínica: ninguna. • Análisis microscópico:

• Preparaciones montadas: ninguna. • Frotis: ninguno.

• Histología: la glándula digestiva, en la que se instalan M. refringens y otras especies Marteilia, es un lugar de digestión alimenticia intracelular y uno de los principales lugares de almacenamiento de reservas metabólicas (10). En infecciones graves, M. refringens reduce considerablemente la absorción de materia orgánica (12, 34). Las infecciones graves también pueden causar pérdida del estado de forma como consecuencia de un consumo limitado de energía. Es más, el parásito puede interferir de forma directa en la alimentación y absorción del hospedador por el mero hecho de su presencia física. Se ha mostrado que el desarrollo de células de almacenamiento adipo-granular en el manto de Mytilus galloprovincialis se inhibe en presencia de M. refringens (36). Parece ser que M. refringens también interfiere con el almacenamiento deglucógeno en la Ostrea edulis (31).

• Microscopía electrónica/citopatología: ninguna. c) Métodos de detección e identificación del agente

• Métodos de detección directa i) Métodos microscópicos

• Improntas: en casos de infección avanzada.

Muestras a tomar: ostras boqueantes u ostras recién muertas.

Procedimiento técnico: se aplasta un trozo de glándula digestiva o heces en un porta de vidrio; las observaciones realizadas a 400 aumentos pueden mostrar gránulos refringentes en los esporangios.

Controles positivos/negativos: no. Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: desconocidos, aunque presumiblemente bajos; • Método de referencia: sin validación comparable a la de histología.

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo consiste en la presencia de cuerpos esféricos grandes (20– 30 µm) con paredes de estructura recia;

• Para especies susceptibles con infección por M. refringens cuya distribución geográfica se conoce, un resultado positivo es indicador de infección por M. refringens;

• Para otras especies, o fuera de la distribución geográfica de la infección por M. refringens, un resultado positivo es indicativo de una infección por la especie Marteilia que debe ser confirmada.

Pruebas disponibles: no existen kits en el mercado.

• Frotis: para infección avanzada, improntas de la glándula digestiva. Muestras a tomar: ostras boqueantes o recién muertas.

Procedimiento técnico: se transfiere un trozo de glándula digestiva a un porta de vidrio; se hacen observaciones a ×400 después de teñir con Giemsa.

Controles positivos/negativos: recomendados. Se pueden solicitar controles positivos y negativos al laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad desconocidas; presumiblemente bajas; • Método de referencia: sin validación frente a histología.

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo es la observación de células cuyo tamaño puede alcanzar 30– 40 µm. La tinción del citoplasma es basófila y la del núcleo acidófila. Se observa un halo claro alrededor de gránulos fuertemente teñidos (refringentes) y en células más grandes, y células dispuestas dentro de células (8, 10, 16, 18);

• En especies susceptibles que se ubican dentro de la distribución geográfica de la infección por M. refringens, un resultado positivo es un fuerte indicador de la infección por M. refringens;

• En otras especies o fuera de la distribución geográfica por M. refringens, un resultado positivo es indicativo de infección por la especie Marteilia que necesita confirmarse. Disponibilidad de la prueba: los kits de tinción rápida disponibles en el mercado incluyen Diff-Quick®/ Hemacolor®.

• Fijación de cortes

Muestras a tomar: ostras vivas.

Procedimiento técnico: para histología se deben realizar cortes a través de la glándula digestiva incluyendo la branquia y los palpos. Las observaciones se hacen con una magnificación creciente de hasta 400 aumentos después de la tinción histológica convencional, i.e. H&E (hematoxilina–eosina).

Controles positivos/negativos: recomendados. Hay controles positivos y negativos disponibles bajo petición en el laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: Los valores de especificidad y sensibilidad para histología se estimaron en 1,7 y 0,99, respectivamente (35);

• Método de referencia: la histología constituye el método de referencia; la hibridación in-situ co-validada con la histología.

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo es la observación de células cuyo tamaño está entre 4 y 40 µm. Los plasmodios jóvenes (uninucleados) se encuentran sobre todo en el epitelio de los palpos labiales y del estómago. La esporulación implica las divisiones de las células dentro de otras células y se realiza en los túbulos y conductos. Los gránulos refringentes aparecen en el curso de la esporulación, pero no se observa en las fases tempranas. En las fases más tardías de la infección se observan esporangios libres en el lumen del tracto digestivo. El citoplasma se tiñe basófilo; el núcleo se tiñe eosinófilo; los gránulos pueden variar de naranja profundo a rojo profundo.

• En especies susceptibles que están dentro de la distribución geográfica de la infección por M. refringens, un resultado positivo es concluyente respecto a la infección por M. refringens;

• En otras especies o fuera de la distribución geográfica de infección por M. refringens, un resultado positivo, incluso con la observación de gránulos refringentes, es indicativo de la infección por una especie de Marteilia que requiere confirmación. Disponibilidad de la prueba: no existe ningún kit en el mercado.

ii) Aislamiento e identificación del agente • Cultivo celular/medios artificiales: no disponibles.

• Métodos de detección del antígeno basados en anticuerpos

(IFAT, ELISA, etc.): no disponibles actualmente o utilizados con fines de diagnóstico pero se ha publicado sobre el desarrollo de anticuerpos monoclonales (10).

• Purificación del agente: no se utiliza actualmente con fines de diagnóstico pero se ha publicado sobre la elaboración de protocolos de purificación (24, 33).

• Técnicas moleculares: Se han elaborado pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se ha publicado sobre las mismas (8, 21, 22).

Muestras pertinentes: ostras vivas o recién muertas.

Procedimiento técnico: Para la extracción de ADN, se congelan los animales a –80°C y se pulverizan los tejidos. Se añaden unos 10 volúmenes de tampón de extracción (NaCl [100 mM], ácido etiléndiamino tetracético [EDTA, 25 mM], pH 8, [SDS, 0,5%]) a proteinasa K (100 µg/ml). Después de incubar durante 24 horas a 50°C, se extrae el ADN utilizando un protocolo estándar fenol/cloroformo, y se precipita con etanol. Se realiza la PCR en un volumen de 50 µl. Después de desnaturalizar el AND a 94°C durante 5 minutos, se somete a 30 ciclos de la siguiente forma: 1 minuto de desnaturalización a 94°C, 1 minuto de hibridación a 55°C, y 1 minuto de elongación a 72°C por cada par de kilobases. Se realiza un paso final de elongación de 10 minutos a 72°C. Para la detección de M. refringens, se utiliza PCR con cebadores orientados a la región ITS1 (5’-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3’ y 5’-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3’) (21).

Controles positivos/negativos: obligatorios. Los controles positivos son: 1) PCR con cebadores específicos sobre ADN genómico de un hospedador infectado o sobre ADN de un parásito purificado; 2) muestras de amplificación inespecífica (actina, Subunidad pequeña, etc.). Los controles negativos son: 3) ausencia de reacciones en ADN diana; 4) PCR con cebadores específicos sobre ADN de hospedadores sanos. Se pueden obtener controles positivos (22) solicitándolos al laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: valores desconocidos. No ha aparecido reacción cruzada en las muestras ensayadas y la especificidad se considera muy elevada (20, 22). Se espera que con esta PCR se detecte M. refringens. Dado que la infección puede ser focal y también que la infección afecta a diversos tejidos en las fases tempranas y tardías de la enfermedad, la sensibilidad de la detección por PCR puede ser inferior a la que en teoría cabe esperar de las aplicaciones de la PCR;

• Método de referencia: sin validación frente a histología. Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo consiste en la amplificación positiva por PCR hasta alcanzar el tamaño esperado; y en que todos los controles negativos son realmente negativos y todos los controles positivos son realmente positivos;

• Para especies susceptibles que se hallan dentro de una distribución geográfica conocida de la infección por M. refringens, un resultado positivo tras utilizar PCR, asociado a un resultado positivo resultante del uso de histología o frotis, es confirmativo de infección por M. refringens;

• Para otras especies, o fuera de la distribución geográfica conocida de M. refringens, un resultado positivo por aplicación de PCR, asociado a un resultado positivo resultante del uso de histología o de frotis, es un fuerte indicador de infección por M. refringens, pero se necesita una secuenciación del producto mediante PCR antes de emitir un diagnóstico confirmativo.

• Hibridación in-situ (ISH): Se han elaborado protocolos de ISH y se ha publicado sobre los mismos (8, 21).

Muestras pertinentes: ostras vivas u ostras boqueantes.

Procedimiento técnico: Para ISH, se fijan los moluscos en fijador de Davidson durante unas 24 horas y a continuación se incluyen en parafina. Se realizan cortes de 5 µm de espesor y se colocan en portas recubiertos de amino-alquil-silano, que se calientan durante toda la noche en una estufa a 40°C. Se desparafinan los cortes sumergiéndolos en xileno durante 10 minutos. Se repite una vez más ese paso y luego se elimina el disolvente mediante inmersión en dos baños consecutivos de etanol absoluto de 10 minutos de duración cada uno. Luego se rehidratan los cortes mediante su inmersión en una serie de etanoles. Se tratan los cortes con proteinasa K (100 µg/ml) en tampón TE buffer (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), a 37°C durante 30 minutos. Se deshidratan los portas mediante inmersión en una serie de etanoles y luego se secan. Se incuban los cortes con 100 µl de tampón para hibridación (4 × SSC [citrato salino estándar], 50% formamida, 1 × solución de Denhardt, 250 µg/ml de tARN de levadura, 10% de sulfato de dextrano) que contenga 10 ng (1 µl de la reacción de la PCR) de la sonda marcada con digoxigenina. Los cortes se cubren con cubiertas de plástico in-situ y se colocan en un bloque de calentamiento a 95°C durante 5 minutos. A continuación, se enfrían los portas con hielo durante 1 minuto antes de colocarlos en una cámara húmeda para su hibridación durante toda la noche. Se lavan los cortes dos veces durante 5 minutos en 2 × SSC a temperatura ambiente, y una vez más durante 10 minutos en 0,4 × SSC a 42°C. Se llevan a cabo las fases o pasos de detección siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego se enjuagan los portas con agua destilada. Se tiñen los cortes para contraste de fases con marrón Bismark Y, se enjuagan con agua destilada y se aplican cubres utilizando un medio de montaje acuoso.

Controles positivos/negativos: obligatorios. Los controles positivos son: 1) ISH en el hospedador infectado; 2) Aplicación de ISH inespecífica (SSU rADN) a las muestras. Los controles negativos son: 3) ausencia de reacciones en ISH con sondas; 4) Aplicación de ISH a hospedadores sanos. Los controles positivos (21) se pueden obtener previa petición al laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: 0,9 y 0,99 respectivamente para el caso de hibridación in-situ (34). Se espera que con este protocolo de ISH se detecte M. refringens;

• Método de referencia: co-validación mediante histología. Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo se demuestra mediante la marcación negro-púrpura de las células de M. refringens dentro de los tejidos diana conocidos; y, además, todos los controles negativos son realmente negativos y todos los controles positivos son realmente positivos;

• Para especies susceptibles que se hallan dentro de una distribución geográfica conocida de la infección por M. refringens, un resultado positivo por ISH, es confirmativo de infección por M. refringens;

• Para otras especies, o fuera de la distribución geográfica conocida de M. refringens, un resultado positivo por aplicación de ISH también es confirmativo de infección por M. refringens, debería comunicarse ese tipo de casos al laboratorio de referencia de la OIE.

Disponibilidad de la prueba: la sonda puede obtenerse, previa petición, del laboratorio de referencia de la OIE.

• Secuenciación: tal como se dijo más arriba, se recomienda la secuenciación como uno de los últimos pasos de cara al diagnóstico confirmativo. Las regiones diana son SSU

rADN e ITS1. Aunque se dispone de secuencias en los bancos de genes, se recomienda comunicar tales casos al laboratorio de referencia de la OIE.

• Métodos de detección indirecta

• Métodos serológicos: ninguno es aplicable.

4. V

Aquí se entiende la “adecuación al fin” como una combinación de aplicabilidad y de realización.

En los cuadros que ofrecemos a continuación, aparece la lista de métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de infección por M. refringens disponibles en la actualidad.

Los símbolos utilizados en el cuadro indican: A = se trata del método recomendado por razones de disponibilidad, utilidad, así como por la especificidad y sensibilidad del diagnóstico; B = se trata de un método de referencia con buena especificidad y sensibilidad de diagnóstico; C = el método es aplicable en algunas situaciones, pero su aplicación se ve seriamente limitada por razones de coste, precisión y otros factores; y D = el método no se recomienda en la actualidad para ese fin. Estas denominaciones (A, B, C y D) son un tanto subjetivas, puesto que están implicadas cuestiones de fiabilidad, sensibilidad, especificidad y utilidad. Aunque no se han estandarizado ni validado formalmente todas las pruebas de las categorías A y B, su carácter rutinario y el hecho de que se las haya utilizado ampliamente sin producir resultados dudosos, las convierte en aceptables.

Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de Marteilia refringens

Especies susceptibles

de la zona afectada Vigilancia Diagnóstico presuntivo confirmativo Diagnóstico

Métodos de diagnóstico de campo D D D

Métodos clínicos D D D Improntas C B D Frotis B A C Histología A A A PCR B A A ISH C B A Secuencia D D A

Métodos de diagnóstico de campo D D D

Métodos clínicos D D D Improntas D C D Frotis C C D Histología A B D PCR C B B ISH C A B Secuencia D D A

5. C

a) Definición de un caso sospechoso

• Para especies susceptibles que se hallan dentro de una distribución geográfica conocida de la infección por M. refringens, un caso sospechoso de infección por M. refringens es un resultado positivo tras la aplicación de uno de los siguientes métodos: improntas, frotis, o PCR.

• Para otras especies, o fuera de la distribución geográfica conocida de M. refringens, un caso sospechoso de infección por M. refringens constituye un resultado positivo por histología o PCR.

b) Definición de un caso confirmado

• Para especies susceptibles que se hallan dentro de una distribución geográfica conocida de la infección por M. refringens, un caso confirmado de infección por M. refringens es:

• un resultado positivo por histología o ISH; o

• un caso sospechoso por PCR solamente o combinada con histología o ISH positivas; o • un caso sospechoso por impronta o frotis solos o combinados con PCR positiva

• Para otras especies, o fuera de la distribución geográfica conocida de M. refringens, un caso confirmado de infección por M. refringens:

• un caso sospechoso por PCR combinada con un resultado positivo por histología e ISH; o • un caso sospechoso por histología combinada con un resultado positivo por PCR e ISH. Todos estos casos deben comunicarse de forma inmediata al laboratorio de referencia de la OIE para M. refringens tanto si existen como si no existen síntomas clínicos asociados con cada caso.

6. M

/

Los métodos de vigilancia orientada para declarar la ausencia de infección, tal como se esbozan en el Código de animales acuáticos, y fundamentados en la información provista más arriba, son:

• Histología; o • ISH.

REFERENCIAS

1. ALDERMAN D.J. (1979). Epizootiology of Marteilia refringens in Europe. Mar. Fishery Rev., 41, 67–69.

2. AUDEMARD C.,BARNAUD A.,COLLINS C.M.,LE ROUX F.,SAURIAU P.-G.,COUSTAU C.,BLACHIER P.& BERTHE F.C.J. (2001). Claire ponds as an experimental model for Marteilia refringens life-cycle studies:

new perspectives. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 257, 87–108.

3. AUDEMARD C., LE ROUX F., BARNAUD A. COLLINS C., SAUTOUR B., SAURIAU P.-G., DE

MONTAUDOUIN X., COUSTAU C., COMBES C. & BERTHE F.C.J. (2002). Needle in a haystack: involvement of the copepod Paracartia grani in the life cycle of the oyster pathogen Marteilia refringens. Parasitology, 124 (3), 315–323.

4. AUDEMARD C.,SAJUS M.-C.,BARNAUD A.,SAUTOUR B.,SAURIAU P.-G.&BERTHE F. (2004). Infection

of the paramyxean parasite Marteilia refringens in its hosts, Ostrea edulis and Paracartia grani: dynamics in ponds of Marennes-Oléron bay. Dis. Aquat. Org., 61 (1–2), 103–111.

5. AUFFRET M. &PODER M. (1983). Recherches sur Marteilia maurini, parasite de Mytilus edulis sur les

côtes de Bretagne nord. Rev. Trav. Inst. Pêches Marit., 47, 105–109.

6. BALOUET G. (1979). Marteilia refringens – Considerations of the life cycle and development of Aber

disease in Ostrea edulis. Mar. Fishery Rev., 41, 64–66.

7. BERTHE F.C.J. (2002). Pacem in terris pathogenibus bonae voluntatis. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 22

8. BERTHE F.C.J.,LE ROUX F.,PEYRETAILLADE E.,PEYRET P.,RODRIGUEZ D.,GOUY M.&VIVARÈS

C.P. (2000). The existence of the phylum Paramyxea Desportes and Perkins, 1990 is validated by the phylogenetic analysis of the Marteilia refringens small subunit ribosomal RNA. J. Euk. Microbiol., 47 (3), 288–293.

9. BERTHE F.C.J., PERNAS M., ZERABIB M., HAFFNER P., THÉBAULT A. & FIGUERAS A.J. (1998). Experimental transmission of Marteilia refringens with special considerations for its life cycle. Dis. Aquat. Org., 34, 135–144.

10. BERTHE F.C.J., ROUX F., ADLARD R.D. & FIGUERAS A. (2004). Marteiliosis in molluscs: A review. Aquatic Living Resources, 17, 433–448.

11. BODOY F.,BOUGRIER S.,GEAIRON P.,GARNIER M., BOULO V.&HEURTEBISE S. (1991). Does the

prevalence of Bonamia and Marteilia diseases be reduced on flat oyster (Ostrea edulis) of Atlantic and Mediterranean origin, when they are reared together with Japanese oyster (Crassostrea gigas) in tidal ponds? Note ICES C.M./K: 28, 9pp.

12. CAMACHO A.P.,VILLALBA A.,BEIRAS R.&LABARTA U. (1997). Absorption efficiency and condition of

cultured mussels (Mytilus edulis galloprovincialis Linnaeus) of Galicia (NW Spain) infected by parasites Marteilia refringens Grizel et al. and Mytilicola intestinalis Steuer. J. Shellfish Res., 16 (11), 77–82.

13. COMPS M. (1976). Marteilia lengehi n. sp., parasite de l’huître Crassostrea cucullata Born.Rev. Trav. Inst. Pêches Marit., 40, 347–349.

14. COMPS M. (1983). Etude morphologique de Marteilia christenseni sp. n. parasite du lavignon Scrobicularia piperata P. (mollusque pélécypode). Rev. Trav. Inst. Pêches Marit., 47, 99–104.

15. COMPS M.,GRIZEL H.,TIGÉ G.,&DUTHOIT J.L. (1975). Parasites nouveaux de la glande digestive des

mollusques marins Mytilus edulis L. et Cardium edule. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences de Paris, 281, 179–181.

16. COMPS M.,PICHOT,Y.&PAPAYIANNI P.(1982). Recherche sur Marteilia maurini n. sp. parasite de la moule Mytilus galloprovincialis Lmk. Rev. Trav. Inst. Pêches Marit., 45, 211–214.

17. GRIZEL H. (1985). Etude des récentes épizooties de l’huître plate (Ostrea edulis Linné) et leur impact sur l’ostréiculture bretonne. Thèse Doctorat es Sciences, Université des Sciences et Techniques du Languedoc, Montpellier, France, 145 p.

18. GRIZEL H., COMPS M., BONAMI J.R., COUSSERANS F., DUTHOIT J.L., & LE PENNEC M.A. (1974). Recherche sur l’agent de la maladie de la glande digestive de Ostrea edulis Linne. Sci. Pêche. Bull. Inst. Pêches marit., 240, 7–29.

19. GRIZEL H.,COMPS M.,RAGUENES D.,LEBORGNE Y.,TIGÉ G.&MARTIN A.G. (1983). Bilan des essais

d’Accimatation d’Ostrea chilensis sur les côtes de Bretagne. Rev. Trav. Inst. Pêches marit., 46, 209–225.

20. KLEEMAN S.N., LE ROUX F., BERTHE F. & ADLARD R.D. (2002). Specificity of PCR and in situ

hybridisation assays designed for detection of Marteilia sydneyi and M. refringens. Parasitology 125, 131– 141.

21. LE ROUX F.,LORENZO G.,PEYRET P.,AUDEMARD C.,FIGUERAS A.,VIVARÈS C.,GOUY M.&BERTHE

F.C.J. (2001). Molecular evidence for the existence of two species of Marteilia in Europe. J. Euk. Microbiol., 48 (4), 449–454.

22. LE ROUX F.,AUDEMARD C.,BARNAUD A.&BERTHE F.C.J. (1999). DNA probes as potential tools for

the detection of Marteilia refringens. Mar. Biotechnol., 1(6), 588–597.

23. LOPEZ-FLORES I., DE LA HERRAN R., GARRIDO-RAMOS,M.A., NAVAS J.I., RUIZ-REJON C., RUIZ -REJON M. (2004). The molecular diagnosis of Marteilia refringens and differentiation between Marteilia

strains infecting oysters and mussels based on the rDNA IGS sequence. Parasitology, 129, 411–419 24. MIAHLE E., BACHERE E., LE BEC C. & GRIZEL H. (1985). Isolement et purification de Marteilia

(Protozoa: Ascetospora) parasites de bivalves marins. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences de Paris 301, Serie III, no 4, 137–142.

25. MOYER M.A.& BLAKE N.J. (1991). Mass mortality in the calico scallop, Agropecten gibbus, caused by Marteilia sp. 8th International Pectinid Workshop, Cherbourg, France. Fisheries Section.

26. MOYER M.A.,BLAKE N.J.&ARNOLD W.S. (1993). An ascetosporan disease causing mass mortality in the

Atlantic calico scallop, Agropecten gibbus (Linnaeus, 1758). J. Shellfish Res., 12 (2), 305–310.

27. NORTON J.H., PERKINS F.P. & LEDUA E. (1993). Marteilia-like infection in a giant clam, Tridacna maxima, in Fiji. J. Invertebr. Pathol., 61, 328–330.

28. NOVOA B.,POSADA D.&FIGUERAS A. (2005). Polymorphisms in the sequences of Marteilia internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA genes (ITS-1) in Spain: genetic types are not related with bivalve hosts. J. Fish Dis., 28 (6), 331-338.

29. PASCUAL M.,MARTIN A.G.,ZAMPATTI E.,COATANEA D.,DEFOSSEZ J.&ROBERT R. (1991). Testing of

the Argentina oyster, Ostrea puelchana in several French oyster farming sites. ICES Council Meeting Papers. ICES CM 1991/K:30 (ICESCM1991K30), Copenhagen, Denmark. 17 pp.

30. PERKINS F.O.&WOLF P.H. (1976). Fine structure of Marteilia sydneyi sp. n. – Haplosporidian pathogen of Australian oysters. J. Parasitol., 62, 528–538.

31. ROBERT R.,BOREL M.,PICHOT Y.&TRUT G. (1991). Growth and mortality of the european oyster Ostrea edulis in the Bay of Arcachon (France). Aquatic Living Resource, 4, 265–274.

32. ROBLEDO J.A.F.,CACERES-MARTINEZ J.&FIGUERAS A. (1994). Marteilia refringens in mussel (Mytilus galloprovincialis Lmk) beds in Spain. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 14, 61–63.

33. ROBLEDO J.A.F., MIAHLE E. & FIGUERAS A. (1995). Purification of several phases of the parasite Marteilia (Protozoa: Ascetospora) from mussels (Mytilus galloprovincialis). In: Techniques in Fish Immunology – 4. Immunology and pathology of aquatic invertebrates, Stolen J.C., Fletcher T.C., Smith S.A., Zelikoff J.T., Kaattari S.L., Anderson R.S., Soderhall K. & Weeks-Perkins B.A., eds. SOS Publications, Fair Haven, NJ, USA, 117–121.

34. ROBLEDO J.A.F.,SANTAREM M.M., GONZALEZ P.&FIGUERAS A. (1995). Seasonal variations in the biochemical composition of the serum of Mytilus galloprovincialis Lmk. and its relationship to the reproductive cycle and parasitic loads. Aquaculture, 133, 311–322.

35. THÉBAULT A.,BERGMANN S.,POUILLOT S.,LE ROUX F.&BERTHE F.C.J. (2004). Validation of in situ

hybridization and histology assays for the detection of the oyster parasite Marteilia refringens. Dis. Aquat. Org., 65 (1), 9–16.

36. VILLALBA A., MOURELLE S.G., CARBALLAL M.J.& LOPEZ M.C. (1993). Effects of infection by the

protistan parasite Marteilia refringens on the reproduction of cultured mussels Mytilus galloprovincialis in Galicia (NW Spain). Dis. Aquat. Org., 17, 205–213

37. VILLALBA A., MOURELLE S.G., LOPEZ M.C., CARBALLAL M.J. & AZEVEDO C. (1993). Marteiliasis affecting cultured mussels Mytilus galloprovincialis of Galicia (NW. Spain). I. Etiology, phases of the infection, and temporal and spatial variability in prevalence. Dis. Aquat. Org., 16, 61–72.

38. ZRNCIC S.,LE ROUX F.,ORAIC D.&F.BERTHE (2001). First record of Marteilia sp. in mussels, Mytilus galloprovincialis in Croatia. Dis. Aquat. Org., 44, 143–148.

* * *

NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE especializado en Martelia refringens (véase el cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE: www.oie.int).