PGD EN ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
Dra. Mª Dolores Lozano Arana
UGC de Genética, Reproducción y Medicina Fetal Hospital Universitario Virgen del Rocío
Sevilla
X CONGRESO NACIONAL DE LABORATORIO CLÍNICO
PGD EN EL SIGLO XXI
PGD EN ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
RESUMEN:
- Definición de enfermedades monogénicas - Definición de PGD: tipos
- Programa de PGD para enferm. monogénicas: evolución desde finales del S.XX hasta la actualidad
- Futuro
X CONGRESO NACIONAL DE LABORATORIO CLÍNICO
PGD EN EL SIGLO XXI
NONE Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
ENFERMEDADES RARAS
ENFERMEDADES RARAS
- Prevalencia de 5/10.000
- Existen entre 6.000-8.000 enfermedades raras
- En su conjunto agrupan a un 5% de la población de países desarrollados
ENFERMEDAD RARA
Características:
- Enfermedades hereditarias de inicio temprano - Carácter crónico, elevada morbimortalidad y
discapacidad
- Complejidad etiológica, diagnóstica y evolutiva
- El 80% tiene un origen genético identificado (OMIM: Online Mendelian Inheritance in Men)
ENFERMEDAD RARA
Problemas:
- Elevado coste social y familiar
- 8% estancias hospitalarias - 70% niños en UCI
- 20% mortalidad infantil - Ausencia de terapias
ENFERMEDAD RARA
ENFERMEDADES GENÉTICAS
Enfermedades monogénicas Anomalías cromosómicas
Enfermedades multifactoriales (genéticos+ambientales) Enfermedades de herencia citoplásmica (mitocondriales)
Atrofia Muscular Espinal DM Duchenne DM Steinert Fibrosis Quística Talasemias Síndrome de Opitz Hemofilia Enfermedad de Huntington Síndrome de X frágil Síndrome de Duncan Síndrome de Lowe
Poliposis Adenomatosa Familiar
Síndrome de Marfan
Pelizaeus Merzbacher
Enfermedad de Machado Joseph Distrofia Muscular de Becker
Síndrome de Lowe Enfermedad de Menkes Síndrome de Morris Hidrocefalia ligada a X Síndrome de Alport ENFERMEDAD RARA ≈ Enfermedades monogénicas
Alteraciones causadas por cambios específicos en la secuencia de ADN, alterando la función de un único gen, siendo la causa directa de la enfermedad
Enfermedades monogénicas
Alteraciones causadas por cambios específicos en la secuencia de ADN, alterando la función de un único gen, siendo la causa directa de la enfermedad
Patrón de herencia definido (mendeliano):
Enfermedades monogénicas Incidencia Riesgo Autosómicas dominantes 1% 50% Autosómicas recesivas 0.2% 25% Ligadas a X 0.2% AR: 50% V AD: 50% (
Alteraciones causadas por cambios específicos en la secuencia de ADN, alterando la función de un único gen, siendo la causa directa de la enfermedad
Enfermedades monogénicas
Ligadas a X A. dominantes
Hemofilias (R) Enf. de Huntington
DM Duchenne (R) DM Steinert
Síndrome X frágil (D)
A. recesivas
Fibrosis quística
Atrofia muscular espinal (
OBJETIVO = PREVENCIÓN
Consejo genético
Opciones reproductivas en parejas con enfermedades monogénicas
No tener hijos
TRA con donación de gametos Adopción
Diagnóstico Prenatal (DP)
PGD
(Handyside et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification.
Nature1990;344:768-70)
Diagnóstico Genético Preimplantatorio
Análisis genético de los preembriones obtenidos por técnicas de FIV antes de ser transferidos al útero. Transferimos los no afectos para la enfermedad de riesgo.
Diagnóstico Genético Preimplantatorio
Diagnóstico Genético Preimplantatorio (PGD)
PGD es una forma precoz de DP Evitar IVE
Diagnóstico Prenatal (DP) Opción reproductiva para parejas con alto riesgo de trasmitir una enfermedad de base genética a su descendencia
Opción reproductiva para parejas con alto riesgo de trasmitir una enfermedad de base genética a su descendencia
Diagnóstico Genético Preimplantatorio
INDICACIONES:
- Enfermedades monogénicas - Anomalías cromosómicas
PGD de alto riesgo: PGD
PGD de bajo riesgo: PGS o PGD-AS
screening de aneuploidias TIPOS PGD MAYOR EFICACIA EN FIV RIESGO GENÉTICO AUMENTADO
LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida
En España el PGD
está contemplado en la Legislación vigente
Artículo 12.
12.1a- Detectar enfermedad hereditaria grave, de
aparición precoz y no susceptible de tratamiento postnatal…..
12.1b- Detectar alteraciones que puedan comprometer la viabilidad del embrión
Comunicarlos a las autoridades sanitarias
12.2. Aplicación del PGD para cualquier otra finalidad no comprendida en el apartado anterior.…. (PGD-HLA, mutaciones con penetrancia incompleta….)
Pedir autorización caso a caso
LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida
En España el PGD
está contemplado en la Legislación vigente
…….por el que se regula el Diagnóstico Genético Preimplantatorio en el
Sistema Sanitario Público de Andalucía, se crea la Comisión Andaluza de Genética y Reproducción y se designa a la UGCGRMF del Hospital Virgen del Rocío de Sevilla como centro de referencia.
SSPA DECRETO 156/2005 de 28 de junio
El PGD está incluido en la cartera básica de servicios del SNS El PGS no
Programa de PGD Genética Reproducción Genetistas Ginecólogos Embriólogos
Programa de PGD para enfermedades monogénicas Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
1. Consulta Conjunta de Genética y Reproducción
- Los pacientes conocen muy bien la enfermedad
para la que consultan (AD, AR, Lig X)
- Se asesora e informa sobre opciones reproductivas
No tener hijos Donación gametos Adopción DP PGD
1. Consulta Conjunta de Genética y Reproducción
Informe de Consejo Genético donde se especifique: - Estatus de la pareja/familia consultante
- Identificación del gen implicado - Mutación responsable
- Certeza de relación fenotipo/genotipo
Estudios genéticos previos (puesta a punto para cada familia y enfermedad)
Estudio Básico Esterilidad
Día + 1
Día + 2
Día +0 Día +0
Mayor respuesta e ICSI
Día + 3
3.-Biopsia embrionaria Tipos:
- Corpúsculo polar información materna - Blastómeras Habitual - Blastocisto Más células Poco tiempo Día+3
4- Diagnóstico genético
Sexado mediante PCR, amplificando una región Y
Ausencia de banda: - Ausencia de núcleo
- Fallo en la entubación
- Fallo en la amplificación
- Fenómeno ADO
Año 1990
HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE (FISH) Griffin et al; 1992 Fijación núcleo citoplasma núcleo FISH Verde - Cromosoma X Acqua - Cromosoma 18 Verde – Cromosoma 13 Rojo – Cromosoma 21
LIMITACIONES DE FISH
- Fijación de un núcleo en un porta - Fallo de hibridación
- Solapamiento de señales
- 10% de embriones no informativos
- No se pueden estudiar todos los cromosomas Enf. Ligadas a X
50% de los XY son sanos, y se descartan
SECUENCIA COMPLETA DEL GENOMA HUMANO (2000)
PCR MULTIPLE FLUORESCENTE (GOLD STANDARD (Thornill et al., 2005))
ESTRATEGIAS METODOLÓGICAS Limitaciones: Escasez de ADN Escasez de tiempo 6 pg
PCR múltiple fluorescente
Co-amplificación de diferentes loci en una reacción de PCR única.
Permite realizar el análisis molecular indirecto y en ocasiones el directo:
- Estudio indirecto de la enfermedad STR - Diferenciar los portadores, enfermos y sanos
- Detectar contaminaciones y fenómenos de ADO
- Estudio directo de la mutación
cuando las mutaciones son dinámicas, ya que
afectan al tamaño del producto de la PCR, siendo por tanto objetivable
DISEÑO DE LOS PROTOCOLOS BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD
a) Búsqueda de marcadores STR para estudio indirecto
Herramienta bioinformática: Genome Browser
HEMOFILIA A Amplia variedad de mutaciones en el gen F8
TEST INFORMATIVOS (Estudios de informatividad)
Se eligen los marcadores en función de: - localización en la región (locus)
- Alta heterocigosidad Informativos para cada familia - Eficiencia de la amplificación
ESTUDIO INDIRECTO
STR: secuencias de ADN en las que un fragmento se repite de forma consecutiva. La variación en el nº de repeticiones crea diferentes alelos Se buscan STR intragénicos y extragénicos flanqueantes de la región donde se ubica la mutación, con alta heterocigosidad.
F8 Xq28 DSX9901 DSX8087 G16PD STR22 STR213 DSX1108 TEL Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Caso HEMOFILIA
Mujer portadora y tienen un hijo afecto. El hijo habrá heredado la copia X mutada de su madre
Haplotipo distinto
ESTUDIO DE INFORMATIVIDAD: Combinación de marcadores
asociados al alelo mutado Sano, portador o afecto.
X XX
DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD
b) Diseño de primers para PCR múltiples (Primer3)
- Objetivo es amplificar todos los marcadores en una única reacción de PCR
- Rango de tamaños de cada producto no sea solapante - Para discriminar cada marcador marcar los primers con fluorocromos que emitan a diferentes λ
DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD
c) Material utilizado para la puesta a punto
ADN genómico en cantidades decrecientes 100ng/μl 5pg/μl
Posteriormente en célula única: blastómeras d) Lisis celular: alcalina /enzimática
e) PCR múltiple: Qiagen Multiplex PCR KIT
f) Electroforesis capilar: secuenciador ABI Prism 3730 g) Análisis de los alelos (Genemapper)
Experiencia de nuestro Centro en DGP aplicado a Hemofilia A 135 156 174 175 231 306 128/128 158 171 175/177 172/172 229/229 308 311 128 135 156 171 175/177 174/172 229 231 306 311 128 158 172 175 229 308 128 171 177 172 229 311 FATHER MOTHER NON-CARRIER FEMALE EMBRYO AFFECTED MALE EMBRYO NON-AFFECTED MALE EMBRYO DXS1073 STR13 DXS1108 DXS9901 STR22 DXS8087
Marcadores subrayados: combinación específica de marcadores ligados a la enfermedad Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Estudio indirecto de hasta 16 marcadores STR
PGD-HLA
PCR múltiple fluorescente
Situaciones donde no es posible el diagnóstico con esta metodología:
- Enferm. AD causada por mutación puntual de novo (PAF)
- Casos complejos: No por
*STR no informativos en la familia Indirecto
*No existencia de STR muy polimórficos en la región (SCA3)
Situaciones mejorables:
Enferm monogénica + HLA: Biopsia de 2 blastómeras
muchos marcadores
Picogramos Microgramos
WGA
(Whole genome amplification)
Generar una nueva muestra igual que no se distingue de la original pero con una alta concentración de ADN
Técnicas:
- PEP (primer extension preamplification). (Zhang et al; 1992)
- DOP – PCR (degenerate oligonucleotide primed PCR) (Telenius et al; 1992)
- Técnica MDA (Multiple displacement amplification) (Dean et al., 2002)
MDA
(Hellani et al., 2005)
- Se consigue una alta cantidad de ADN a partir de una blastómera, con una baja tasa de error
- Se puede aplicar posteriormente una amplia variedad de técnicas (PCRmf, secuenciación, MLPA…)
se favorecen mayor nº de familias
- No compromete los resultados y permite realizar repeticiones diagnóstico fiable
1 blastómera
Tranquilidad
Técnicas de WGA
Mayor cantidad de ADN
Enfermedades Monogénicas Técnicas basadas en PCR Todo el complemento cromosómico aCGH Wells et al., 2008 Fiorentino et al., 2009 1 única célula
Transferir embriones sin la enfermedad y euploides (Obradors et al., 2008, Handyside et al., 2010, Daina et al., 2012)
5.Transferencia y congelación de embriones
12 ovocitos (M II) (J. Harper)
10 fecundados 1 sin resultados
8 biopsiados 4 afectos 1 bloqueado 2 transferidos
5.Transferencia y congelación de embriones
Método de congelación Vitrificación
- En caso de gestación se recomienda DP - TG/cp: 21% (ESHRE)
Enfermedades Autosómicas Dominantes Nº Enfermedades ligadas a X Recesivas Nº
Enfermedad de Steinert 28 Hemofilia A 33
Corea de Huntington 26 Distrofia Muscular de Duchenne 21 Poliposis adenomatosa familiar 11 Distrofia Muscular de Becker 4
Síndrome de Marfan 3 Hemofilia B 4
Enfermedad de Machado Joseph (SCA3) 2 Síndrome de Morris 3 Enfermedades Autosómicas Recesivas Nº Agammaglobulinemia tipo Bruton 3
Fibrosis quística 27 Hidrocefalia ligada a X 1
Atrofia muscular espinal 14 Síndrome de Lowe 1
Enfermedades ligadas a X Dominantes Nº Síndrome de Duncan 1 Síndrome de X-frágil 12 Retinosis Pigmentaria ligada a X 1 Síndrome de Alport ligado a X 4 Inmunodeficiencia Severa Combinada ligada a X 1 Tipaje HLA / PGD + Tipaje HLA Nº Alfa-talasemia ligada a X 1
Beta-talasemia Mayor + HLA 5 Enfermedad de Menkes 1
Tipaje HLA 2 Síndrome de Wiskott Aldrich ligado a X 1 Síndrome de Shwachman-Diamond + HLA 1 Enfermedad de Pelizaeus Merzbacher 1 Inmunodeficiencia por déficit de adenosín-deaminasa
+ HLA 1 Síndrome de Opitz ligado a X 1
Granulomatosis + HLA 1
Tabla R-1: Distribución de nº de pacientes según las distintas enfermedades.
Enfermedad Partos HA y HB 14 DMD y DMB 9 DM Steinert 9 FQ 7 CH 3 AME 3 X- Frágil 3 Sd. Alport lig a X 2 PGD-HLA 2 Sd. de Lowe 1 PAF 1 54 partos y 66 rn 44% partos vaginales 3 DP No discordancias
Resultados neonatales
Tparto/pareja: 25%Enfermedad Partos HA y HB 14 DMD y DMB 9 DM Steinert 9 FQ 7 CH 3 AME 3 X- Frágil 3 Sd. Alport lig a X 2 PGD-HLA 2 Sd. de Lowe 1 PAF 1 54 partos y 66 rn 44% partos vaginales 3 DP No discordancias
Resultados neonatales
Tparto/pareja: 25%Next-generation sequencing (NGS)
Secuenciación masiva
Secuenciación 1º genoma humano
13 años ---100,000,000 dólares NGS en blastómera 3 días----1,000 dólares
Next-generation sequencing (NGS)
Secuenciación masiva
Fiorentino et al., 2014
- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula - Abre el futuro a nuevas posibilidades:
- aumento de defectos genéticos que se pueden diagnosticar (enf monogénicas)
- Mutaciones mitocondriales
- Síndromes microdeleccionales - menor coste y poco tiempo
Next-generation sequencing (NGS)
Secuenciación masiva
Fiorentino et al., 2014
- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula - Abre el futuro a nuevas posibilidades:
- aumento de defectos genéticos que se pueden diagnosticar (enf monogénicas)
- Mutaciones mitocondriales
- Síndromes microdeleccionales - menor coste y poco tiempo
UN MÉTODO PARA TODO
TEST de COMPATIBILIDAD GENÉTICA
(Programas de donación de gametos)
Donante y receptor (enfermedades AR) Compatibles No compatibles cambio de donante Matching genético
Métodos de diagnóstico genético al alcance de la población general
Dirigidos a conocer nuestro estado de portador
Prevención enfermedades monogénicas
Queremos saber si somos portadores de…………
PGD Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
ADN nuclear libre 0.01ml PGD / PGS
Nuevas fuentes de ADN
- Medios de cultivo (Assou et al,. 2014; Wu et al., 2015)
- Blastocele (Palini et al.,2014, Gianaroli et al.,2014, Tobler et al., 2015, Magli et al., 2016)
TECNICAS NO INVASIVAS
Blastocentesis
Tecnología CRISPR/Cas9
E. Charpentier y J. Doudna
Técnica de edición genética
Avance científico del año 2015 – Science
Tecnología CRISPR/Cas9
E. Charpentier y J. Doudna
Técnica de edición genética
Avance científico del año 2015 – Science
Bolotin et al., 2005 Mojica et al., 2005 Pourcel et al., 2005
J. Doudna
Terapia génica
Vassena et al., 2016
J. Doudna
Tecnología CRISPR/Cas9
E. Charpentier y J. Doudna
J. Doudna
Tecnología CRISPR/Cas9
E. Charpentier y J. Doudna