STR: secuencias de ADN en las que un fragmento se repite de forma consecutiva. La variación en el nº de repeticiones crea diferentes alelos Se buscan STR intragénicos y extragénicos flanqueantes de la región donde se ubica la mutación, con alta heterocigosidad.
F8 Xq28 DSX9901 DSX8087 G16PD STR22 STR213 DSX1108 TEL Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Caso HEMOFILIA
Mujer portadora y tienen un hijo afecto. El hijo habrá heredado la copia X mutada de su madre
Haplotipo distinto
ESTUDIO DE INFORMATIVIDAD: Combinación de marcadores
asociados al alelo mutado Sano, portador o afecto.
X XX
DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD
b) Diseño de primers para PCR múltiples (Primer3)
- Objetivo es amplificar todos los marcadores en una única reacción de PCR
- Rango de tamaños de cada producto no sea solapante - Para discriminar cada marcador marcar los primers con fluorocromos que emitan a diferentes λ
DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD
c) Material utilizado para la puesta a punto
ADN genómico en cantidades decrecientes 100ng/μl 5pg/μl
Posteriormente en célula única: blastómeras d) Lisis celular: alcalina /enzimática
e) PCR múltiple: Qiagen Multiplex PCR KIT
f) Electroforesis capilar: secuenciador ABI Prism 3730 g) Análisis de los alelos (Genemapper)
Experiencia de nuestro Centro en DGP aplicado a Hemofilia A 135 156 174 175 231 306 128/128 158 171 175/177 172/172 229/229 308 311 128 135 156 171 175/177 174/172 229 231 306 311 128 158 172 175 229 308 128 171 177 172 229 311 FATHER MOTHER NON- CARRIER FEMALE EMBRYO AFFECTED MALE EMBRYO NON- AFFECTED MALE EMBRYO DXS1073 STR13 DXS1108 DXS9901 STR22 DXS8087
Marcadores subrayados: combinación específica de marcadores ligados a la enfermedad Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016
Estudio indirecto de hasta 16 marcadores STR
PGD-HLA
PCR múltiple fluorescente
Situaciones donde no es posible el diagnóstico con esta metodología:
- Enferm. AD causada por mutación puntual de novo (PAF)
- Casos complejos: No por
*STR no informativos en la familia Indirecto
*No existencia de STR muy polimórficos en la región (SCA3)
Situaciones mejorables:
Enferm monogénica + HLA: Biopsia de 2 blastómeras
muchos marcadores
Picogramos Microgramos
WGA
(Whole genome amplification)
Generar una nueva muestra igual que no se distingue de la original pero con una alta concentración de ADN
Técnicas:
- PEP (primer extension preamplification). (Zhang et al; 1992)
- DOP – PCR (degenerate oligonucleotide primed PCR) (Telenius et al; 1992)
- Técnica MDA (Multiple displacement amplification) (Dean et al., 2002)
MDA
(Hellani et al., 2005)
- Se consigue una alta cantidad de ADN a partir de una blastómera, con una baja tasa de error
- Se puede aplicar posteriormente una amplia variedad de técnicas (PCRmf, secuenciación, MLPA…)
se favorecen mayor nº de familias
- No compromete los resultados y permite realizar repeticiones diagnóstico fiable
1 blastómera
Tranquilidad
Técnicas de WGA
Mayor cantidad de ADN
Enfermedades Monogénicas Técnicas basadas en PCR Todo el complemento cromosómico aCGH Wells et al., 2008 Fiorentino et al., 2009 1 única célula
Transferir embriones sin la enfermedad y euploides (Obradors et al., 2008, Handyside et al., 2010, Daina et al., 2012)
5.Transferencia y congelación de embriones
12 ovocitos (M II) (J. Harper)
10 fecundados 1 sin resultados
8 biopsiados 4 afectos 1 bloqueado 2 transferidos
5.Transferencia y congelación de embriones
Método de congelación Vitrificación
- En caso de gestación se recomienda DP - TG/cp: 21% (ESHRE)
Enfermedades Autosómicas Dominantes Nº Enfermedades ligadas a X Recesivas Nº
Enfermedad de Steinert 28 Hemofilia A 33
Corea de Huntington 26 Distrofia Muscular de Duchenne 21 Poliposis adenomatosa familiar 11 Distrofia Muscular de Becker 4
Síndrome de Marfan 3 Hemofilia B 4
Enfermedad de Machado Joseph (SCA3) 2 Síndrome de Morris 3 Enfermedades Autosómicas Recesivas Nº Agammaglobulinemia tipo Bruton 3
Fibrosis quística 27 Hidrocefalia ligada a X 1
Atrofia muscular espinal 14 Síndrome de Lowe 1
Enfermedades ligadas a X Dominantes Nº Síndrome de Duncan 1 Síndrome de X-frágil 12 Retinosis Pigmentaria ligada a X 1 Síndrome de Alport ligado a X 4 Inmunodeficiencia Severa Combinada ligada a X 1 Tipaje HLA / PGD + Tipaje HLA Nº Alfa-talasemia ligada a X 1
Beta-talasemia Mayor + HLA 5 Enfermedad de Menkes 1
Tipaje HLA 2 Síndrome de Wiskott Aldrich ligado a X 1 Síndrome de Shwachman-Diamond + HLA 1 Enfermedad de Pelizaeus Merzbacher 1 Inmunodeficiencia por déficit de adenosín-deaminasa
+ HLA 1 Síndrome de Opitz ligado a X 1
Granulomatosis + HLA 1
Tabla R-1: Distribución de nº de pacientes según las distintas enfermedades.
Enfermedad Partos HA y HB 14 DMD y DMB 9 DM Steinert 9 FQ 7 CH 3 AME 3 X- Frágil 3 Sd. Alport lig a X 2 PGD-HLA 2 Sd. de Lowe 1 PAF 1 54 partos y 66 rn 44% partos vaginales 3 DP No discordancias
Resultados neonatales
Tparto/pareja: 25%Enfermedad Partos HA y HB 14 DMD y DMB 9 DM Steinert 9 FQ 7 CH 3 AME 3 X- Frágil 3 Sd. Alport lig a X 2 PGD-HLA 2 Sd. de Lowe 1 PAF 1 54 partos y 66 rn 44% partos vaginales 3 DP No discordancias
Resultados neonatales
Tparto/pareja: 25%Next-generation sequencing (NGS)
Secuenciación masiva
Secuenciación 1º genoma humano
13 años ---100,000,000 dólares NGS en blastómera 3 días----1,000 dólares
Next-generation sequencing (NGS)
Secuenciación masiva
Fiorentino et al., 2014
- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula - Abre el futuro a nuevas posibilidades:
- aumento de defectos genéticos que se pueden diagnosticar (enf monogénicas)
- Mutaciones mitocondriales
- Síndromes microdeleccionales - menor coste y poco tiempo
Next-generation sequencing (NGS)
Secuenciación masiva
Fiorentino et al., 2014
- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula - Abre el futuro a nuevas posibilidades:
- aumento de defectos genéticos que se pueden diagnosticar (enf monogénicas)
- Mutaciones mitocondriales
- Síndromes microdeleccionales - menor coste y poco tiempo