Expresión de los genes MIH y CHH del camarón blanco Litopenaeus vannamei expuestos a diferentes salinidadesExpression of genes CHH and MIH of white shrimp Litopenaeus vannamei exposed to different salinities

EducaciónISuperior de Ensenada

Expresióhede los Genes GHH¬y MIH del Camarón Blanco

Liwpenaew vamwnwi Expuesta a Diferentes Salinidaúes

TESIS

MAESTRIA EN CIENCIAS

LUZ ANGELICA CASTRO JIMENEZ

I

` .

›

fCehtró de'InvestigaciónCientífica y de R

CENTRO DE rNvEsTrGACróN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR

DE ENSENADA

C IC GSG

PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS

CON ORIENTACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA MARINA

EXPRESION DE LOS GENES CI-IH Y MIH DEL CAMARON BLANCO

Litopenlleus vnnnamei EXPUESTO A DIFERENTES SALINIDADES

TESIS

que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS

Presenta:

Luz Angélica Castro Jiménez

Luz Angélica Castro Jiménez

Y APROBADA PoR EL srourewre commé

Ji (Í 1

I L IA -YIÍU.

Dra; Elizabeth Ponce Rivas Director del Comité

fíššzáa Q/Ze ar Q

I Dra. Lydia Betty Ladah

Miembro del Comité

e

l\'.__{_._}

\ Í /J

á Dr. Feïñando Díaz Herrera

Miembro del Comité

emi c(¿Á;;'

Dr..Facurìdo Joaquín Márquez Rocha

Coordinador del programa de

posgrado en Biotecnología Marina

Dr. Raúl Ramón Castro Escamilla

Director de Estudios de Posgrado

RESUMEN de la tesis de Luz Angélica Castro Jiménez, presentada como requisito parcial para la obtención del grado de MAESTRO EN CIENCIAS en BIOTECNOLOGIA MARINA. Ensenada, Baja California. México. Septiembre de 2005.

EXPRESION DE LOS CENES CHII Y MII-I DEL CAMARON BLANCO

Lílopenneus wumrrmei EXPUESTO A DIFERENTES SA LINIDADES

Resumen aprobado por:

-Z/« É

(J

,I

` “ Dia. Elizabeth Ponce Rivas Director de Tesis

El sistema endocrino de los crustáceos tiene su órgano mas importante en el complejo OX-GS ya que en el se sintetiza la familia de neurohormonas MIH/Gll-l/CHH responsables de la regulación de procesos como la muda, metabolismo de carboliidratos, osmorcgulación y reproducción entre otros. A pesar de los grandes avances en las técnicas moleculares como el RT-PCR y RT-PCR de tiempo real, que han permitido un crecimiento dentro de la cndocrinologia de los crustáceos, aun falta desarrollarse hacia la comprensión y cuantificación de los procesos de la regulación a nivel genético.

El presente trabajo pretende aportar información del efecto de la salinidad en la expresión de los genes mili y clili en muestras de pedúnculos oculares de los camarones, asi como en otros tejidos del camarón. La metodologia de RT-PCR de tiempo real fue montada para analizar la expresión de estos genes en diversos tejidos del camarón. Sin embargo, (lcbido a la presencia de pigmentos en las muestras de pedúnculo ocular y su interferencia con la unión del colorante fluorescente, las muestras de, camarones expuestos a diferentes salinidades fueron analizadas mediante RT-PCR convencional. Los resultados mostraron diferencias en la expresión de mi/1 y ch/1 en las salinidades analizadas. La expresión de mili fue mayor que la de C/iii en todas las condiciones. Dado que la mayor expresión de mi/i se obtuvo en la condición de 26 %i› que cs la salinidad óptima para el crecimiento de L. vmmzmiei, sc sugiere que mi/i pudiera tener una función alternativa a la de inliibìdora de la muda como se sugerido en otras especies de camarón.

to obtain a grade as MASTER IN SCIENCES in MARINE BIOTECHNOLOGY Ensenada, Baja California. México. September 2005_

EXPRESION OF GENES CHH AND MIH OF WHITE SIIRIMP

Lirapenrleus vunulunef EXPOSED TO DIFFERENT SALINITIES

Abstract approved by:

f~eel;f,.rl_e¿rg¿t“

g

Thesis Director

The endocríne system of crustaceans has its more important organ in the OX-SG complex Which synthesize the neurohormone family of MIH/GIH/CHH responsible to rcgulate processes as molt, carbohydrate metabolism, osmoregulation and reproduction, among

others. Despite the high advances in molec\1lar techniques as RT-PCR and RT-PCR Real

Time, that had allowed a growth in endocrinology of crustaceans, still needs to be developed to understanding and quantification ofrcgulation processes at a genetic level.

The present \vork pretcnds to contribute with information regard the effect of environmental conditions as salinity on the expression of mili and chli genes in samples of the shrimp eyestalks as \vell as in other tissucs. The methodology of RT~PCR Real Time was set up to analyze expression of these genes in several tissues. Howcver, due to the presence of pigments in the eyestalk and its interference with the union of the fluoreseent colorant, the samples from shrimps exposed to different salinitics were analyzed using conventional RT-PCR, Differences in expression of mili and chi: were observed in the salinities analyzed. The expression ofmili was greater than ch/1 in all the conditions. Since the greater expression of mi/1 was obtained in the condition of 26 % that is the optimal salinity [or growth of L. vammmei, it is suggested that mi/1 could have an alternative role to the control of molting, as has been suggested in other shrimp species.

CONTENIDO

I. INTRODUCCIÓN

1.1 . Pe/leidos

1.2. Sistema endocrino I.3_ Neilrolrorlnonas II. ANTECEDENTES III. .IUSTIFICACION IV. OBJETIVOS Objetivo General Objetivos Particulares

v. METODOLOGÍA

VJ. Aclíznatución de organismos

l/.2. Análisis (le secuencias YDise1io de oligonucleotidos V_3. Extracción de ADN c/'omosonml

V.4. Re-exƒmccián de ADN cr'o/nosomnl V.5. Extracción de ARN

V.6. Tratmniento con ADNasas V. 7. Sintesis de ADN corizpleliienta/'io

V,8. Alnplificación de actinu, mili, chlz y gil: de L. vannn/neí

V.9. Pu1'ificacio'n de fragmentos de ADN de gel de ogarosa-Metozlo de fenol congelado

V. 10. Puri/¡cación de fi'ug/nentos de ADN de gel de agnrosa-High Pure Product Pnrificution kit, Roche

V, I I. Secuenciación de los genes

V.l2. Es/tldios (le e.\'1n'esi0'n de clili, mill y nclina en camarones L. vzlnnumeí

de diferentes tejidos

V.12.1. RT PCR Tiempo Ren! V.12,2. Clonacián

V. 12.3. Purificación de ADNplasniidíco

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

V[.I Análisis de secuencias y diseño de oligonztcleótidos V1. 2. Extracción de ADN crolnosolnal

VI. 3. Extracción de ARN

V1. 4. Síntesis de ADN coinplemenlurio VÍ.5. RTPCR Tiempo Ren/

VL6 Análisis de expresión de act, clili y mill por medio de RT-PCR

VIII. OBSERVACIONES Y PERSPECTIVAS

Figura Pagina 1 ~:><›o\1o\v=J>wr\› 10 11 12 13 14 15 16 17 13 19 20 21

LISTA DE FIGURAS

Ciclo de desarrollo de especies de Penaeidae con fase de crecimiento en aguas

costeras.

Regulación de la reproducción en crustáceos. ARN extraido de nn par de pedúriculos dc camarón.

ARN extraido de cada muestra problema.

Amplificación con ADNC de nrnestras, gen aclína. Curva estándar actilm.

Curva estándar míh

Curva de calibracion. Curva de disociación de mili. Curva de disociación de act.

Cuantificación relativa de mill en diferentes tejidos de L. wmnrlmcí.

Muestras amplifieadas por PCR Tiempo Real, corridas en un gel de agarosa y tenidas con bromuro de etidio.

Estudio para detemiinar el número de ciclos optimo para amplificar actínn, uni: y ch/1

Análisis de expresión de mih, ehh y actina. Salinidad: 10°/W. Análisis de expresión de mili, c/111 y aclina. Salinidadt 200%» Análisis de expresión de mi/1, chli y actina. Salinidad: 26%.» Análisis de expresión de mili, chh y actina, Salinidad: 3Z%«.

Análisis de expresión de mi/1, ehh y actína. Salinidad: 40%s.

Análisis de expresión de mili, chh y actina a salinidades de l0%o, 20%» y 26%» Análisis de expresión de mi/1, c/¡li y actina a salínidades de 32%@ y 40%«› Gel comparativo entre las cinco salinidades con dos muestras de organismos

Tabla I

Il III IV

Numero de organismos por condición ablacionados para este trabajo.

Numero de organismos utilizados por condición de salinidad, Las condiciones para PCR de tiempo real para ac/ y mili. Cuantificación relativa de MIH.

Página 17

l

I. INTRODUCCIÓN

1.1 Peneidos

Los crustáceos son, en opinión de algunos autores, los invertebrados más interesantes ya

que exhiben una increíble diversidad de formas y hábitat, variando en tamaño desde formas

pequeñas intersticiales y planctónicas a cangrejos gigantes que son encontrados en todas

las profundidades de los ambientes marinos, salobres y de agua dulce conocidos. El subfllo

Crustacea agrupa a la clase Malacrostaca que incluye al orden Decapoda, que a su vez

agrupa a la familia Penaeidae a la que pertenecen los camarones peneidos de importancia

comercial que actualmente son reproducidos en cautiverio (Sweeney, James, 1991).

Si bien muchas especies de camarón son cultivadas comercialmente alrededor del mundo,

Limpeimeus vzmltamei es una de las especies en la cual se han enfocado numerosos

esfuerzos en investigación y desarrollo para su mejoramiento y producción. Esto es debido

a la preferencia del mercado (sobre todo de los Estados Unidos) por este peneido, el cual

cs más resistente a enfermedades que cualquier otro camarón blanco, además de crecer

rápidamente en cultivo y tolerar diversas condiciones ambientales (Baley-Brock & Moss,

1992; Vandeberglte, 1999).

L. wumumei se distribuye en las costas del Pacifico de México, Centro y Sur América, un

área donde el agua del océano generalmente se mantiene a temperaturas de mas de 20°C

durante todo el año, La tasa de crecimiento en camarón, como en todos los artrópodos,

depende de dos factores: la frecuencia de la muda y el incremento de crecimiento. Los

peneidos son carnívoros y se alimentan de pequeños crustáceos, anfipodos y poliquetos.

Los juveniles de L. vn¡i/ru/ner' requieren una dieta con un contenido proteico del 35%,

En su hábitat nativo, los camarones maduran, se aparean y desovan en la columna de agua

cercano a la costa, en agua de mar a temperaturas de 26-28 °C con una salinidad de

aproximadamente 35 ppt. Sus huevos se incuban y las larvas se desarrollan en este

ambiente costero como parte del zooplancton. Las larvas de L. vmmzmzeí se adentran en la

zona costera y se establecen en el fondo de los sistemas lagunares estuarinos poco

profundos ricos en nutrientes, donde la salinidad y la temperatura son mucho mas viables

que en mar abierto. Despues de algunos meses en los sistemas lagunares estuarinos, el

camarón preadulto regresa al ambiente marino fuera de la costa, donde ocurre su

maduración sexual, apareamiento y desove (Figura 1) (Sweeney, 1991).

(7\f

_.`_w Vi

›¬, _ __, ¬ :-.†_-,

2;:

\_/K

ã»J

/ã

\

_\,

_{,¬`_,..(«ff\_}

.

_{faz, › V}

,

f

_{te _--,Wa}

_§

\"\'¬;_\J;j,',"._”†_{4_;.;;1}->;.i§ë§-} 2' fl |._t:1 ¿Él_.ar ãt _~ `\-.__{~ 4--sw}

_”.-›“-ri

F

'

"`~-~~~”"'"'f 51 ï;¿›.,"

Y/*' 'L <ï A.---¬ .1"'¬, !¬=*›<'.{> ,_ K

*-_,› ¿fm Jj; ~ ¬,.A,_› /t 4*

posuawas 4-"____›_ __,__/ ___.¿_^_ - ¡_ l

«_¿_

x f}¿I_f›__

sf;

4%

.'¿ƒ/

'Í/H 2

v ESTADIOS /Í Í _V_a<:uu¬›s

<

Í. fifå

'sf' ' ~

`

,j-¿É LARv/mios i_;_ Í' l." * ' ,

«

_;f¿«°

_{,_ 4,}

fs e~fa¢¬~r

_'

_lr'

mw; ' \\\ ¬`

€¿«,-;1;±¿l--y- " Q- num-1°"

os HUEVOS ÍÍDIQS

nmtoweas "WP"

3

Independientemente de la creciente importancia del camarón en la acuicultura en el

contexto mundial, el estudio especifico de la endocrinologia de camarón está siendo

fortalecido tras el esfuerzo hecho por entender la cndocrinologia de los crustáceos

(Fingerman, 1997).

La endocrinologia es un área de investigación relativamente nueva, y la errdocrinologia de

crustáceos aun más. Esta última ha progresado desde las técnicas de la endocrinología

clásica hasta el uso de las técnicas de la biología molecular, como la PCR (por sus siglas

err ingles, Polymerase Chain Reaction), para elucidar las estructuras de los genes de

muchas de las hormonas, Según Carlisle y Knowles (1959) el estudio de la erulocrinología

de los crustáceos inicio en 1928, cuando se estableció que los cambios de color en estos

animales eran “controlados” por sustancias químicas que circulaban en la hemolirrfa. De

hecho esos primeros estudios fueron realmente la primera prueba de la existencia de

hormonas en los crustáceos, El primer indicio de la existencia de un mecanismo endocrino

en los crustáceos no fue con las células de pigmentación; sino con la reproducción,

1.2 Sistema endocrino

Los crustáceos decápodos han desarrollado un ciclo de vida ampliamente adaptable y por

ello es que su sistema ueuroendocrino esta dotado con elementos de regulación a corto,

mediano y largo plazo. El metabolismo de carbohidratos, por ejemplo, es rrrr proceso a

mediano plazo. Los componentes del sistema ncuroendocrino de los crustáceos se

encuentran distribuidos á través de todo el sistema nervioso central; sin embargo el

ncuroregulación mas importante. La glándula del seno (GS) fue la primera estructura

descubierta de un crustáceo que mostró tener un papel endocrino. Hanström (1933)

descubrió la glándula err el pedúnculo ocular de crustáceos superiores y este hallazgo guió

los estudios para la identificación de la estructura endocrina responsable. El nombre de

glándula del seno se refiere a su localización en el pedtinculo, la cual se encuentrajunto al

seno mayor de la hemolinfa de la gran mayoria de los decapodos crustáceos (Fingerman,

1992).

Uno de los ganglios de los pedúnculos oculares de crustáceos superiores es la “medula

terrninalis”. Esta contiene un aglomerado de cuerpos celulares denominados

ncurosecretores porque, además de retener las propiedades de una neurona, ellos producen

productos secretados que modulan numerosos procesos fisiológicos, conocidos como la

medula terminal-órgano X (OX), y cuyos axones se extienden distalmente al final de las

terminales protubcrantes que fomran la GS. Se estima que el 90% dc las terminales

axónicas que componen la glándula del seno pertenecen a las neuronas cuyos cuerpos

celulares se encuentran en la medula terminalis-órgano X (Cook y Sullivan, 1982). La GS

mostró ser en realidad un grupo de terminales nerviosas, con los axones salientes sirviendo

como conductos para las neurohomtonas producidas en los cuerpos celulares donde estos

axorrcs se originan. La GS es un centro dc almacenamiento y liberacion de lrormonas

producidas y transportadas ahi para alrnacenarlas y ñnalmente liberarlas. El complejo

GS-OX es de vital importancia debido al gran numero de neuropéptidos que sintetiza y a los

procesos en los que estos intervienen; sin embargo a pesar de ser uno de los órganos

5

estructuras endocrinas que, como el GS-OX, consisten en terminales de axones que

almacenan y liberan neurohonnouas. Entre estos están el órgano postcomisural, el organo

pericardio, el órgano Y, el órgano mandibular, la glándula androgenica en machos y los

ovarios en las hembras (Fingerman; 1997).

El metabolismo de un organismo es determinado predominantemente por las condiciones

ambientales, la capacidad de los peneidos de adaptarse a los cambios de temperatura y

salinidad son los principales factores para su supervivencia y crecimiento (Ferraris, 1986,

1994). Por otra parte, un incremento en la salinidad modifica el balance iónico y osmótico

de los camarones, causando un incremento en la demanda de energía metabólica, dando

como resultado que el organismo sea capaz de dirigir menos energía a los procesos de

crecimiento y reproducción.

En general, cada especie usa distintas señales ambientales para programar su reproducción,

tiene una amplia gama de estructuras neuronales para la percepción de señales, y utiliza su

complejo sistema neuroendocrino para la transducción de señales a los órganos endocrinos,

los cuales producen por sí mismos factores que regulan la actividad de los órganos

involucrados en la reproducción. El éxito depende del cumplimiento de cada etapa del

ciclo reproductivo del animal, pero es evidente que los factores externos como fotoperiodo,

temperatura, nutrición y estrés, y la organización interna del animal influyen en las

I.3 Neuroltormnnas

Entre las neuroltormonas secretadas por el complejo GS-OX existen algunas involucradas

en procesos como la reproducción, la muda y el control de los niveles de glucosa. Dentro

de este grupo se encuentran péptidos que muestran tener en común su composición de

amino ácidos y organización (Keller, 1992; Sun, 1994; Chang, 1997). Este grupo de

neuropéptidos similares es conocido como la familia CHH/MIH/GIH, y sus miembros

generalmente tiene pesos moleculares de 7-9 kDa y contienen aproximadamente 70

aminoácidos. Esta familia incluye la hormona hiperglucémica de los crustáceos (CHH), la

hormona inhibidora de la muda (MIH), la hormona inhibidora de las gónadas (GIH) y la

hormona inliibidora del órgano mandibular (MOIH).

La hormona hiperglucémica de los crustáceos (CHH) esta involucrada principalmente en la

regulación de los carbohidratos y lípidos, mientras que la hormona inliibidora de la muda

(MLH) juega un papel central en el proceso de muda como la responsable de la inliibicio'n

de la sintesis de ecdiesteroides en el órgano Y. En crustáceos hembras, la fase final de la

maduración gonadal a su forma madura se llama vitelogenesis (Adiyodi, 1985). Este

proceso compromete la sintesis o depósito, o ambos, de yema o vitelo. El componente

mayor de este material nutritivo es la lipoproteína vitelina, derivada del precursor llamado

vitelogenina que puede ser sintetizado en tejidos extraováricos o cn los ovarios.

Debido a que en las hembras GIH inhibe la sintesis de vitelo, esta hormona es llamada

también la liotmona inliibidora de la vitelogénesis (VIH). Tanto GIH como GSH (lionnona

estimuladora de las gónadas) actúan directamente en los ovarios de las hembras, donde

7

indirectamente sobre los testículos através de la glándula androgénica (Adiyodi y Adiyodi,

1970).

GSH fue reportada por Yano (1993) como un péptido. Es requerida para activar las

glándulas androgénicas en los machos con el propósito de que ocurra la cspennatogénesis,

un proceso referido como control positivo de las glándulas androgénicas por una

ncurohormona (Payen, 1982). Tensen et al (1989) en los extractos de las glándulas del

seno de la langosta Homurus americanzls usando HPLC, encontró que la actividad de GSH

está presente en la misma fracción que CHH y existe la posibilidad de que CHH tenga una

actividad estimuladora del sistema reproductivo, además de su actividad hiperglucémica,

Desde hace unos 50 años se conoce que el sistema reproductivo de los crustáceos está bajo

control hormonal. El primer investigador cn proveer una prueba directa de su papel en la

reproducción fue Panaousc (1943). El mostró que la ablación de los pedúnculos oculares

de Puleumon ser/mus provoca una maduración rápida de los ovarios, Después mostro' que

este efecto era debido al hecho de que la glándula del seno contenía una hormona

inhibidora de las gónadas (GIH). Los altos niveles de GIH previenen la muda durante las

etapas inmaduras de reproducción, mientras que CHH puede prevenir la muda durante los

I GÍH

Gtúndute del ,

seno-órgano X 0'9°"° V

CHH

Oi" MF

ECD

Organo

-/

MF

i

Gldnd-»tu

`

undrogénico

Figura 2. Regulación de la reproducción en crustáceos

En crustáceos, la ablación unilateral del pedúnculo ocular en hembras es una técnica

nitinaria para estimular su maduración. Sin embargo este método va en contra de la

fisiologta natural del animal, y no es de sorprender que esta manipulación pueda tener un

efecto negativo en la calidad de los huevos, cuyo desove ha sido inducido por esta vía (Van

Herp, 1992),

Las comparaciones entre las prehormonas descritas de la familia de neuropéptidos

CHH/MIH/GIH por diferentes autores (De Kleijn, et al 1994, 1995; Klein, el al 1993;

Weidemann, el al 1989), revelan la presencia de un péptido adicional, el péptido precursor

9

péptido en los precursores de MIH y GIH refleja una separación evolutiva temprana de dos

grupos, posiblemente causada por una mutación en el gen ancestral de CHH/Ml_H/GIH

(De Kleijn et ul, 1994). En base a lo anterior la familia de neuroho11nonas puede ser

subdividida en dos tipos, Iy1I, siendo CHH del tipo 1 mientras que GIH y MTH del tipo 11.

Actualmente existen diferentes tecnicas para la cuantificación de la expresión de ARNm,

sin embargo, dada su sensibilidad las más utilizadas son la técnica de protección de

nucleasa (NPA) y RT›PCR tiempo real. Esta última presenta la ventaja de pennitir

cuantificación de cantidades muy pequeñas de ARNH1, alta sensibilidad, alta precisión,

riesgo de contaminación minimo ya que no necesita manipulación post-amplificación y no

se utilizan sondas marcadas radiactivamente lo que le confiere una mayor aceptación y

confiabilidad. Esta metodologia esta basada en la adición de un colorante que reporta por

fluorescencia en proporción al número de amplicones generados, pennitiendo medir la

concentración de ARNm durante la fase exponencial del PCR (Freeman et ul., 1999;

ll ANTECEDENTES

La tecnología de secuenciación de péptidos ha avarrzado vertiginosamente, las estructuras

de las neurohormonas de crustáceos se han ido revelando (Fingerman, 1997).

El principal papel de CHH es la regulación de glucosa en la hemolinfa sin embargo

también esta involucrada en la regulación de diversos procesos fisiológicos como

regulación de la producción de ecdiesteroides (Yasuda el al., 1994), metabolismo de

lípidos (Santos el ul., 1997), fisiología de los ovarios (Khayat et al., 1998) y

osmorregulación (Charmantier-Daures et ul., 1993; Serrano et al., 2003). CHH ha sido

aislada de diversos crustáceos como en Cnrcinur mae/ms (Kegel el nl, 1989), Cancer

pagurrrs (Cheng et nl., 1998); H. r/merz'cn¡n¡s (Terrsen el ul., 1991); O/'conecfes [imosus

(Kegel et al., 1991); P1'ocm1¡barus banvieri (Huberman el 111,, 1993); Mrrcrobmclrirmr

rose/rbe1'gir` (Sithigomgul et al., 1999); Porcellio zlilatarus (Martin et nl., 1984) y la

secuencia de L. vmmruuei que se encuentra depositada en el banco de datos (Número de

acceso X9973; Sun, 1994; número de acceso AY4340l6; Lago-Lesión, 2001). incluso se

han reportado múltiples isoformas de la misma en H. umericrurus (De Kleijn et ul., 1995),

Jusns lilandii (Marco et ul., 2000) Oreonccles [ímosus (De Kleijn et ul., 1995),

Pracunrbmus clurkii (Yasuda el ul., 1994) y por lo menos cinco péptidos con actividad

hiperglucernica en el camarón Pelzueusjaponicus (Yang et ul., l997)_

Las secuencias de aminoácidos de MIH han sido determinadas para muchas especies de

crustáceos, Ml`l-1 de Hnnrarus zurrericnmls fue secuenciada por Chang et 11/ (1990). La

11

La secuencia de Gil-1 de la langosta I-I, zmrerierznus fue descrita por Soyez el al (1991) y

encontraron que esta neurohormona esta preserrte como dos isoformas con la misma

estructura primaria pero con efectos fisiológicos diferentes y mas tarde fue descrita la

secuencia que codifica para la pre-honnona de la misma (De Kleijn et al, 1994). Aguilar el

a[_ (1992) describieron una caracterización inicial de GIH del acocil mexicano

Procambarrrs borrvierr' y encontraron que este rreuropéptido inhibe la sintesis de

vitelogenina en ovarios cultivados de camarón L. vmrnunrei; sin embargo aún no se

conoce la secuencia de GIH en este organismo. Recientemente la clonación de ADN

eornplementario (ADNc), expresión de GH~I de la langosta Nephrops /rortfegicus (Edomi et

ul, 2001) se logró con una combinación de técnicas rnoleeulares incluyendo RT~PCR

(retrotranscripción-reacción en cadena de la polimerasa). Asimismo se han descrito dos

ADNc reportados que codifican para péptidos relacionados a MIH/VIH (Yang y Rao,

2001).

Sin embargo, los estudios de expresión bajo diferentes condiciones realizados para la

familia de neurohormonas CHH/M11-1/GIH son limitados. Lago Lestón~Ponce Rivas

(2001) realizaron un estudio cn el cual se determinó la expresión de los genes que

codilican para MIH y CHH err L. vannzrmei es afectada en diferentes condiciones de

salinidad y temperatura; determinando que la mayor expresión de ambos genes se

obtuvieron a salinidades de 28 y 40%n y a temperaturas bajas, principalmente a 20°C. Sin

embargo en este trabajo las determinaciones fueron a nivel poblacional.

La técnica utilizada fue RT-PCR la cual incluye la síntesis de cadena sencilla de ADNc a

los genes de interés comparándolos con un gen control, el cual es un gen constitutivo (lcl

mismo organismo. Esta técnica de mtina ofrece la ventaja de ser muy sencilla y ofrecer

resultados relativamente confiables que pueden ser utilizados como preliminares para un

13

lll. JusT1FlcAc1óN

L. vmmmneí es un peneido de gran importancia coinercial en nuestro país por sus

características de resistencia a ciertas enfermedades causadas por virus y bacterias, por su

adaptabilidad al medio y su rápido crecimiento en comparación con otros camarones. Para

poder responder a factores externos como el fotoperiodo, temperatura, salinidad y nutrición

y estrés los camarones cuentan un complejo sistema neuroendócrino, dentro del cual el

OX-GS es uno de los principales órganos endocrinos. En este órgano se producen las

ncurohcnnonas de la fainilia peptidica CHH/MIH/GIH que por sus características son

vitales para la regulación del metabolismo de carlmhidratos, lípidos, ciclo dc muda,

maduración sexual y osmoregulación. Pese a su impoflancia estas neurohormonas han sido

poco estudiadas en crustáceos a nivel de la expresión de sus genes en diferentes

condiciones ambientales y en el caso de L. wmrlamei solo existe un trabajo previo en

donde sc midieron los niveles dc mi/1 y clzh en muestras obtenidas de pedúnculos de

organismos expuestos a diferentes temperaturas y salinidades, Sin embargo, este trabajo se

llevó a cabo a nivel de población. En este sentido el presente trabajo pretende llevar a cabo

el análisis de la expresión de los genes mill y ch/1 a nivel de individuo en camarones

juveniles expuestos a diferentes salinidades utilizando la metodologia de RT-PCR,

Asimismo pretende montar la metodología de RT PCR de tiempo real para poder realizar

la medición cuantitativa de la expresión de estos genes en diferentes tejidos del camarón.

El estudio de estos genes permitirá tener mayor conocimiento sobre cl control

poder tener un desarrollo óptimo en sistemas de cultivo intensivo y semi intensivo,

evitando la utilización de tecnicas como la ablación de los pcdunculos oculares para la

maduración gonadal en reproductores, ya que esto que tiene efectos secundarios negativos

en los organismos tanto en las larvas como en los reproductores, lo que provoca pérdidas

l5

IV. OBJETIVO GENERAL

Llevar a cabo el análisis de expresión de los genes ch/1 y mili de L. vanna/:tel expuestos

diferentes salinidades.

OBJETIVOS PARTICULARES

l. Realizar un análisis teórico de secuencias de mili y c/1/1 disponibles en bancos de

datos para el diseño de oligonucleótidos especificos.

2. Montar la metodologia de RT-PCR tiempo real para el análisis de expresión de las

hormonas de la familia peptldica en diferentes tejidos del camarón L. va/mamei.

3. Realizar el análisis de expresión de ehh y mili a nivel de individuo por RT-PCR en

V, METODOLOGIA

V.l Aelimatación de los organismos

Los pedúnculos oculares de los camarones, L. ifannzunei, fueron donados por el Dr.

Fernando Diaz y su equipo de trabajo (Departamento de Acuicultura, Biotecnología

Marina, CICESE).

Doscientos camarones fueron aelimatados a 28^'C durante 4 días y a una salinidad de 35%t›.

Manteniendo siempre la inisma temperatura, los organismos fueron luego sometidos a

20%» durante 4 días, después 125 de ellos se aelimataron a 26%@ durante 4 días y los

organismos restantes a 32%n.

También se incluyeron organismos aclimatados a 10%@ y 40 %t› de salinidad durante los

mismos tiempos del ensayo anterior, de otro experimento del Dr, Diaz. Una vez tinali'/.ados

17

Tabla I, Numero de organismos por condición ablacionados para este trabajo.

No de oi ganismos

salinidad

0%t›

20%»

20%@

26%¢

26%«

32%@

32%o

40%«›

Los animales fueron pesados y sus pedúnculos oculares ablacionados, congelados en

nitrógeno líquido y almacenados a -70°C hasta su uso para aislamiento de ARN.

V.2 Análisis de secuencias v diseño de olizonucleótidos

Los oligonucleótidos para las reacciones de RT-PCR de tiempo real fueron diseñados a

partir del análisis de secuencias depositadas en el Banco de Genes del Nacional Center for

Biotechnology Information (NCBI) para iiiili, cli/i y actina.

El programa MacVector 7.1 es la herramienta utilizada para el diseño de los

oligonucleótidos dando como resultado el oligo más apropiado, ya que permite saber si

oligonucleótidos. Este programa también predice teóricamente cuál será el producto de

PCR y su tamaño.

Para la metodologia de RT-PCR se usaron los oligonucleótidos diseñados por Lago-Lcstón

(2001) a partir de las secuencias de mili (Sun, 1996; numero de acceso S73824) y cli/i

(numero de acceso X99731); actiiiu-2 de P. iiionozloli (Boonyawan, número de acceso

AF100987):

M

Sentido 5'- TTGAGAAGCTGCTGTCGTCCT-3'

Antisentido 5'-CTTGTTTCCTCCACATTAGCG-3'

M

Sentido 5*- TCACCAAACGCTCGCTCTTC-3'

Antisentido 5 '- CTTGTTTCCTCCACATTAGCG-3 `

m

Sentido 5'~ TGGTCGGTATGGGTCAGAAG-3'

Antisentido 5'- CGAACAGGTCCTTCCTGATG-3°

V.3 Extracción de ADN eroinosomal

Este ADN fue utilizado como templado en las reacciones de PCR como control, para

determinar si existe diferencia de tamaño entre los fragmentos obtenidos a partir de este

templado y los obtenidos a partir de ADNc. El ADN fue obtenido por medio de protocolo

l 2 3 4 5 6 7 8 19

Homogenizar 500 mg de tejido en 500 uL de buffer de extracción (100 mM de

EDTA, 10 inM de Tris-HCI pH 7.5, 1% SDS y I ug/mL de proteinasa K).

Incubar a 55 “C durante 2 horas.

Extraer con un volumen de fenol: clorofomio: alcohol isoamílico (25:24:l) y

centrifugar a l2000 g durante 10 minutos.

Pasar la fase acuosa a un tubo liinpio y repetir el paso anterior.

Añadir un volumen de cloroformo y centrifugar a 12000 g durante 5 minutos, para

lavar los restos de fenol. Pasar la fase acuosa a un tubo limpio y repetir el lavado.

Precipitar con dos voli'imenes de etanol absoluto y 1/10 del volumeii de NaCl 2M y

enfriar a -20 “C durante 30 minutos.

Centrifugar a 12000 g y vaciar el tubo.

Lavar el precipitado con etanol al 70% y centrifugar durante 5 minutos.

V,4 Reextracción de ADN cromosomal

I 2. 3 4 5 6 7 8.

Aforar el ADN piirificado hasta 100 pL con agua estéril.

Agregar l00uL de fenol.

Vórtex.

Agregar 100 |,iL de cloroformo

Centrifiigar 10 min. a 14000 rpm.

Tomar fase acuosa y pasarlo a un tubo limpio.

Agregar l/25 volumen de NaCl SM y 2,5 volúmenes de etanol absoluto.

9

10.

ll.

12.

l3,

Centrifugar IO min. a 14000 rpm.

Descartar sobrenadante.

Lavar con 3 volúmenes de etanol 70% y centrifugar 5 iniii. a 14000 rpin.

Descaitar sobrenadante y secar en centrifiiga de vacio.

Resuspender en 30 uL de agua estéril.

V.5 Extracción de ARN

Se utilizó el reactivo TRI (Sigina) para aislar el ARN de los pedúnculos oculares, el cual

tiene su principio en el inétodo descrito por Chmczynski (1987):

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Homogenizar el par de pedúnculos oculares congelados (50-100 ing) en l mL de

solucion TRI con la ayuda de un pistilo o un Iiomogenizador mecánico.

Centrifugar la muestra a 12 000 g a 4°C durante 10 mimitos.

Transferir la fase acuosa a un tubo liinpio y añadir 0.1 mL de BCP.

Agitar vigorosamente durante 15 seg. y permitir reposo 2-15 minutos a temperatura

ambiente.

Centrifugar la muestra a 12 O00 g a 4°C durante 15 minutos.

Transferir la fase acuosa a un tubo limpio y añadir 0.5 mL de isopropanol.

Mantener 5- l 0 minutos a teinperatura ambiente.

Centrifugar a l2000 g durante 15 minutos a 4 "C y descartar el sobrenadante.

Adicionar l mL de etanol 75%.

10, Dar ligero vórtex.

21

12. Decantar el sobrenadante cuidadosamente y dejar secar el ARN hasta que se

evaporc completamente el etanol. No debe permitirse que se seque cn exceso

porque después será muy dilicil de disolver.

13. Disolver en agua tratada con DEPC y guardarlo a -70 "C,

V.6 Tratamiento con ADNasas

La metodologia de cuantificación de expresión requiere ARN perfectamente limpio por lo

que es necesario degradar completamente el ADN genóinico que pudiera estar presente en

la muestra y su importancia lo convierte en un paso ineludible. Este protocolo es el

recomendado por la casa comercial Proinega para la enzima RQ1 ADNasa I. Digerir la

muestra de ARN con la enzima, estableciendo la siguiente reacción, añadiendo los

componentes según el orden indicadoi

l-2 ug/pL de ARN total disuelto en agua libre dc nucleasas (x pL).

10 uL dc buffer l0X de ADNasa RQ1.

X uL de ADNasa RQ1 libre de ARNasa (IU/ug de ARN).

e.b.p. 100 pL de agua libre de nucleasas.

l. Incubar a 37 “C durante 30 miiiutos,

2. Adicionar 10 uL de Stop Solution e incubar a 65°C durante 10 minutos.

4. Mezclar en vóitex y sediinentar por centrifugación a 12000 g durante lO

minutos a 4“C.

5. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.

6. Realizar una segunda extracción con un volumen de cloroformo.

7. Mezclar con vórtex y centrifugar 10 minutos a 12000 g a 4°C,

8. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.

9. Precipitar el ARN añadiendo 2,5 volúmenes de etanol absoluto.

lO. Mezclar y precipitar a -70 "C durante 15 minutos o a -20°C durante l hr.

minimo.

ll. Centrifugar a 12000 g durante 10 minutos a -4 °C.

12. Lavar el ARN precipitado con I mL de etanol libre de ARNasas al 70%.

l3. Secar a 37 °C hasta que se evapore completamente el etanol. Secar la muestra

en exceso impide una buena disolución en agua.

14. Disolver el ARN en 20-30 pL de agua libre de ARNasas.

V.7 Sintesis de ADN complementario

El ADNc es una molécula de secuencia coinplementaria al templado, que es sintetizada a

partir de ARN mensajero utilizando una enzima reverso-transcriptasa. Esta enzima utiliza

un oligonucleótido de dT (desoxitiminas) para unirse a la cadena de ARNin, añadiendo

timinas en la secuencia donde hay adeniuas (Secuencia Poly A), Esta molécula se sintctizó

a partir de ARN puro, utilizando la retrotranscriptasa de la casa coinercial l_nvitrogen

23

Este cDNA fue utilizado para la amplificación de nctiiia, clili y mili con los oligos de PCR

ticinpo real y de los RT-PCR.

l. Agregar los siguientes componentes a un tubo estéril:

a. l uL de oligo (dT)¡;,

b. IO pg~5 ug de ARN total

c. l uL 10 inM dNTP Mix

d. Agua destilada estéril a 13 pL

2. Calentar la muestra a 65”C durante 5 min. e incubar posteriormente en hielo

durante, por lo menos, un minuto más.

3. Colectar el contenido del tubo por centrifugación y adicionar:

a. 4 pL SX First-Strand Buffer

b, 1;iL 0.1 M DTT

c. l pL inhibidor de micleasa

d. l pL SuperScript Ill RT (200 U/uL)

4, Mezclar por pipeteo.

5. incubar a 55"C de 30-60 min.

6. lnactivar la reacción calentáudola a 70°C durante 15 minutos.

7, Agregar al tubo de reacción 180 uL de agua estéril y agitar en vórtex.

8. Agregar 100 uL de fenol y agitar en vórtex.

9. Adicionar l00 pL de cloroformo y agitar en vórtex.

10. Centrifugar durante 5 minutos a 12000 rpin.

12. Agregar 8 ¡IL de NaCl 5 M y 500 pL de etanol absoluto.

13. Mantener en hielo seco durante l lu^ por lo menos.

14. Centrifugar durante 5 min, a 12000 rpin.

15, Descartar el sobrenadante.

l6, Lavar con l mL de etanol 70% y agitar con vórtex.

I7. Centrifugar durante 5 min. a 12000 ipm.

18, Descartar el sobrenadante.

19. Secar en centrifuga de vacío.

20. Resuspender en 10 uL de agua estéril y guardar a -20°C.

V.8 Antplificación de actina_ clili v iiii`li de L, ifainiaiiiei

Reacción en cadena de polimerasa (PCR)

Es una técnica que permite la ainplificación exponencial de un fragmento de ADN dc cada

gen para lograr una concentración a(lccuada y detectable del inismo. Las condiciones a las

cuales se amplificó este fi^agmento se detenninaron una vez diseñados los oligos,

utilizando como tcinplados ADN genómico y ADNc,

V,9 Purificación de fragmentos de ADN de gel de agarosa~Método de fenol congelado

Una vez que los fragmentos de ADN de interés son amplilicados por PCR, analizados por

electroforesis en gel de agarosa, estos pueden ser recuperados para su uso posterior, Una

técnica para purificar dichos l`ragmentos es la de fenol congelado, que extrae el ácido

25

Esta técnica fue utilizada para purificar los fragmentos de ncliiin, c/:li y mili del gel de

agarosa para su posterior secuenciación, clonación o adición de adaptadores.

1. Cortar la banda de interés del gel de agarosa sobre transluminador y colocarla

en un tubo estéril.

2. Congelar la(s) muestra(s) que contienen el fragmento y homogenizarlas bien

coii la ayuda de tin pistilo.

3. Adicionar 400 o 500 pL de fenol y agitar en vórtex.

4. Congelar en hielo seco durante 5 min.

5. lncubar a 55°C durante 2 min. o hasta que se descongele,

6. Agitar en vórtex.

7. Repetir los pasos del 4 al 6 dos veces más.

8. Centrifugar durante 15 min. a máxima velocidad.

9. Pasar el sobrenadante a un tubo nuevo.

lO. Agregar 400 pL de fenol y agitar en vórtex.

l l. Centrifugar durante 2 min. a máxima velocidad.

12. Repetir los pasos del 9 al ll.

13. Pasar el sobrenadante a un tubo nuevo.

14. Adicionar NaCl 5 M ( IS pL por cada 100 uL de sobrenadante)

15. Invertir repetidas veces.

16. Congelar en hielo seco.

17. Centrifugar durante 5 min. a máxima velocidad.

19. Agitar en vórtex y centrifugar durante 5 min. a velocidad máxima.

20. Decantar y secar remanente de alcohol en centrífuga de vacío 0 en baño de

agua.

21. Resuspender en 30 uL de agua estéril.

V.l0 Purificación de fragmentos de ADN dc gel dc agarosa-Hizh Pure Product Purification

Kit Roche

1. Cortar la banda de interés del gel de agarosa sobre transluminador y colocarla

en un tubo estéril de l.5 mL,

2. Determinar el peso del gel,

3. Añadir 300 ¡,tL de Binding Buffer por cada 100 mg de agarosa.

4. Agitar por vórtex de 15-30 segundo para resuspender el gel en el buffer.

5, Incubar a 56°C durante 10 min. Agitar la muestra en vórtex esporádicamente

durante incubación.

6. Una vez disuelto totalmente el gel, adicionar 150 uL de isopropanol absoluto

por cada 100 mg de agarosa. Agitar en vórtex.

7. Insertar un filtro en un tubo nuevo.

8. Pipetear todo el contenido del tubo muestra dentro del compartimiento superior

del filtro. NOTA: No exceder más de un volumen total de 700 uL.

9. Centrifugar durante 60 segundos a 12000 xg y descartar sobrenadante.

lO. Reconectar el filtro al mismo tubo de colección y adicionar 500 pL de Wash

27

ll. Centrifugar durante 1 iniii. a 12000 xg y descartar el sobrenadante,

12. Repetir los pasos l0 y ll,

13. Adicionar 200 ¡JL de Wash Buffer y centrifugar durante l min, a 12000 xg.

14. Descartar el sobrenadante y el tubo de colección.

15. Reconectar el filtro a un tubo limpio de 1.5 mL y adicionar 50 uL de buffer de

elución.

16. Centrifugar diirante l minuto a 12000 Xg.

17, La solución que se obtenga contiene el ADN de interés.

V,ll Secuenciación de los genes

Los plásmidos con los genes de interés fueron enviados a secueiiciar a Keck Biotechnology

Resource Laboratory, Yale University. La secuenciación de los genes clonados permitió

corroborar la secuencia de los genes c/i/1, mili y actiiia.

V.l2 Estudios de expresión de ch/1. mi/i v uclimi en camarones L. ifaniimiieí de diferentes

teiidi

Con el objeto de llevar a cabo el estudio de expresión utilizando la técnica de RT-PCR de

Tiempo Real, se llevó a cabo la clonación de los genes en el plásmido TOPO-TA. Estos

plásmidos se transforman en células coinpeteiites de E. coli, se purifica dicho plásinido y

después llevan a cabo las diluciones correspondientes a las concentraciones conocidas

las curvas qiie sen/irán coino estándares de concentraciones conocidas para utilizarlas eii la

cuaiitificación de las muestras problema.

V.12.I RT-PCR tiempo real

El protocolo que se siguió fue el recomendado por la casa comercial Applied Biosystems

para su terinociclador GeneAmp S700 y se utilizó el colorante SYBR Greeii. Este colorante

fluórese al unirse al ADN de doble cadena por lo que no se requiere utilizar

oligonucleótidos marcados coii colorantes diferentes o iina tercera sonda marcada. Para

evitar obtener señales de fluorescencia de fraginentos inespecíficos ya que se une a

cualquier fragmento de ADN de doble cadena, se realizaron curvas dc fusión del amplicón

relacionando gráficaiuente la fluorescencia en función de la temperatura. Esto se logró

incrementando lentamente la temperatura, con cambios de 0.2 °C, por arriba de la

temperatura de alineamiento de los oligonucleótidos (Tm) hasta alcanzar los 95°C y

midiendo la tluorescencia cada fracción de segundo.

Para las muestras problema se requirió purificar el ARN de los diferentes tejidos del

camarón (músculo, pedúnculo ocular con y sin la membrana ocular, branquia,

liepatopancreas y pleópodos). Con ellos se realizaron reacciones de tratamiento coii

ADNasas y sintesis de ADNc como se indicó en los protocolos anteriores. Las reacciones

dc PCR de tiempo real para la realización de las curvas estándar se llevaron a cabo

utilizando diferentes concentraciones del templado para cada par de oligomicleótidos

correspondientes a los genes de interés: actiiia, clili y mili y con las condiciones requeridas

para cada uno. Al finalizar la reacción de PCR, los datos fueron analizados por inedio del

29

la línea base (BL) y se refieren al no. de ciclos en los cuales no ocurre ningún cainbio de

intensidad de la fluorescencia y por arriba de 10 desviaciones estándar de esta BL el

sofiware detecta los incrementos de fluorescencia; este nivel de fluorescencia es llamado

iiinbral (Th) y al número exacto de ciclos cuando aparece en la reacción un incremento de

la fluorescencia es llamado ciclo del iimbral (Ct). Posteriormente los valores de Ct de las

diferentes diluciones de cada gen fueron graficados contra la concentración del templado

utilizada en térininos de logaritmo (Logia) para asi' obtener la curva de calibración o

estándar. La pendiente de la línea resultante esta en función de la eficiencia del PCR. Los

valores de Ct obtenidos para las miiestras problema fueron interpolados eii la cuiva

estándar y las concentraciones obtenidas, Los datos fueron normalizados en relación al gen

de actina.

V. 12.2 Clonación

El kit TOPO TA de Invitrogen fue utilizado para clonar los fragmentos amplificados de los

genes de uctína, chh y mili. Este kit contiene las céliilas competentes TOPIOF dc E. coli

para la clonación del plásmido pCR Z. l. La metodología es sumamente rápida y coiista de

dos partes:

Paite 1. Reacción de clonación

l. Agregar los sigiiientcs componentes a un tubo estéril:

Producto de PCR 0.5-4 pL

Solución salina 1 iiL

TOPO vector l pL

Volumen reacción total 6 pL

2. Mezclar la reacción lentamente.

3. Incubai' a temperatura ambiente durante 5 minutos.

4. Colocar la reacción en liielo y proceder con la transformación.

Parte 2. Transformación de células competentes

1. Para cada transfoiinación utilizar un vial de células competentes y dos platos

selectivos.

2. Previamente a iniciar el procedimiento, asegúrese de contar con lo siguiente:

a. Baño de agua a 42°C

b. Ambientar el vial de medio SOC

c. Ambientar los platos selectivos a 37°C durante 30 minutos.

d. Descongelar en liiclo un vial de células.

3. Adicionar lO pL de reacción de clonación al vial de células competentes y

mezclar cuidadosamente.

4. lncubar en hielo 30 minutos.

5. Choque térmico a las células por 30 segundos a 42°C sin agitar.

6. Transferir irimediatainente los tubos al hielo.

7. Adicionarle 250 uL de medio SOC.

8. Ceirai' el tubo perfectamente e incubar en agitador orbital a 37“C, 200 rpm

durante 2 horas.

31

10. Incubar ON a 37°C.

ll. Picar ~l0 colonias blancas o azules y analizarlas,

V.l2.3 Purificación de ADN plasmidico

Uiia vez que se han obtenido clonas de E. coli' con el fragmento de interés es pertinente

crecer esta bacteria y producir la cantidad suficiente de ADN de plásinido que

posteriormente será recuperado para su uso en PCR TR.

l. Crecer E. coli en 3 mL de medio de cultivo LB por 12 hrs.

2, Transferir a tubos de 1.5 mL y centrifugar a. 14000 ipm durante 1 min,

3. Resuspender en l mL de buffer SET y agitar en voitex ~l min.

4. Centrifugar a l4000 rpm durante 1.5 min,

5. Resuspender en 150 |,iL de SET y agitar en vórtex,

6. Adicionar 5 pL de buffer de ARNasa.

7, Agregar 350 ¡IL de inezcla litica e invertir los tubos.

8. Incubar en hielo durante 10 min.

9. Adicionar 250 pL de acetato de sodio 3 M, pH 4.8

10. Invertir los tubos e incubar en hielo durante 20 min.

1 l. Centrifugar a 14000 rpm durante 5 min.

12. Pasar el sobrenadante a un tiibo limpio y adicionar un voliunen idéntico de

isopropanol.

14. Decantar el sobrenadante y lavar con 1 mL de etanol 70%. Centrifugar a 14000 rpm

durante 5 min.

15. Descartar el sobrenadante y secar eii ceiitrifuga de vacío.

16. Resiispender en 50 pL de agua o buffer TE.

Electroforesis de poliacrilamida y tinción de plata

Para un resultado más sensible de los productos de PCR esta técnica de electroforesis y

tinción es la recomendable.

Gel de poliacrilamida 8%

l. 2.5 n1L archilamida/bis-acrilamida 29:1

2. 2.56 mL TBE IOX

3. 4.84 mL H2O

4. 100 pL APS 10%

5. s »L TEMED

Tincióii de plata

Sol. A:

5 mL etanol

250 pg acido acético

33

Cubrir el gel coii 25 mL de Sol. A, agitación constante durante 3 minutos,

Descartar solución e incubar durante 5 minutos con el remanente de la misma.

Descartar la solución y enjuzigar coii agua destilada por 10 min.

Preparar solución B (2.5 mL AgNO; 1% + 22.5 mL ddH2O), verter sobre el gel

e iiiciibar por 10 iniiiutos coii agitación. Descaitar solución y enjuagar

continuamente eii cuatro ocasiones (5 seg c/ii) con agua destilada.

Preparar Sol. C (15 mL NaOH 3% + 15 mL formaldehído 0.3%). Vaciar la

solución opiiestamente al gel para no cubrirlo directamente y agitar

constantemente para lioniogenizar. Incubar 20 iniiiutos coli agitación constaiite.

Descartar solución y enjuagar con agua destilada,

Preparar sol. D (2.5 mL NaCD; 7.5% + 22.5 mL HZO dest) e incubar coii ella el

gel durante 20 minutos agitando constantemente. Descartar solución y ciijuagar

coii agua destilada,

Finalmente, iiicubar el gel toda la noche eii iina solución de gliccrol 5% y

VI. RESULTADOS

VI. IAnálisis de secuencias v diseño de oligonucleótidos

Se diseñaroii un par de oligonucleótidos para cada uno de los genes de iiiterés clili y mili a

paitir de las secuencias de estos genes depositadas en el NCBI (Lago Lestóii-Poiice Rivas,

2003) para la cuantificación de la expresióii por medio cle la inetodología de

Retro-transcripción-PCR de tiempo real.

clili 1149 pb

Sentido 5”›'I`CGGGAAATAGATTCACGG-3” Aiitiseiitido 5 '-CACCATTGGAAACCATTCG-3 '

mili 1l30¡;b

Sentido 5'-CCAACTTCGTATTCAAGCAGTG~3'

Antisentido 5'-TGTTTCCTCCACATTAGCGTC -3'

Como control, se diseñaron oligonucleótidos de actina a partir de la secuencia de L.

vruinamei` (AF 300705, NCBI):

act 141 pb

Sentido 5 '-TCCACGAGACCACCTACAACTC-3 `

35

VI.2 Extracción de ADN croniosomal

Con la técnica estandarizada se obtuvo una cantidad considerable de ADN croniosomal de

pleópodos de camarón. Este ADN fue re-extraido posteriormente y diluido 11100 para su

uso en PCR coino coiitrol y para la estaiidarización de las diferentes reacciones de PCR

conio por ejemplo eii los gradientes de temperatura.

También se obtuvo ADN croiiiosomal viable de pedúnculos oculares de organismos

juveiiiles con el inismo procedimiento, Estas muestras de ADN permitieroii observar las

dificiiltades de este tejido para aislar cualquier ácido niicleico ya que el protocolo origiiial

de aislamiento de ADN tuvo que ser ligeramente modificado para obtener un producto no

degradado y fiuicional, Además durante este proceso se observó que no se lograba eliniiiiar

cl pigmento púrpura de los pedúnculos, que al resuspender en agua y guardarlos a -15°C

durante el proceso de congelamiento el pigmento precipitaba. Con este ADN también se

hicieroii algunas reacciones de PCR. Las diluciones con las qiie se logró iina biiena

ampli ficacióii fiieroii: l:l00, l:l000 y 115000.

Vl.3 Extracción de ARN

Las primeras extracciones de ARN de prueba se hicieron siguiendo el método largo de

Climczyiiski ( 1987); pero debido al tienipo que se consume eii él, la cantidad de miiestras

qiie liabía qiie procesar y al lieclio de que los pedúnculos fiieron procesados por organismo,

(por lo qiie uiia miiestra constaba de ambos pedúiiciilos oculares), se buscó uiia alteriiativa

que permitiera obtener iguales o mejores resultados que coii esta técnica; pero con mayor

casa comercial Sigma el cual tiene su principio en el descrito por Chmczynski y Sacchi;

pero es de uso fácil y se puede aislar el ARN deseado en una tercera pane del tiempo que

se toma haciéndolo por el método largo. El uso de este reactivo se estandarizó haciendo

algunas variaciones al procedimiento propuesto por la casa comercial, por ejemplo el uso

del reactivo BCP en lugar de cloroformo, para obtener los resultados deseados. El ARN

aislado fue después tratado con ADNasas para asegurar que se tenía puro de contaminación

por ADN y re-extraído para eliminar trazas de enzima y sales.

Con la estandarización de estas metodologías se logró mantener la integridad del ARN a

pesar de los tratamientos a los que fue sometido.

Figura 3. ARN extraído de pedúnculos de camarón.

La metodología de extracción de ARN se llevó a cabo tanto para obtener ARN a panir de

37

ensayos de expresión por PCR de tiempo real de muestras de diferentes tejidos del

camarón, como para la obtención del ADNc de los pedúnciilos oculares de los camarones

expuestos a diferentes salinidades y posterior medición de la expresión por

Retrotranscripción-PCR (RT-PCR).

Siii embargo, desde el periodo de estandarización de la técnica se observó qiie a pesar de

los diferentes procesos a los que se sometia el ARN para elimiiiar sales o ADN, la

coloración ligera o considerablemente púipura permanecía, por lo que sc asume qiie este

pi gineiito tiene uiia gran afinidad por este ácido nucléico,

Una vez concluida la fase de estandarización de métodos que también incluyó la

purificación de ARN a partir de muestras congeladas a -70°C para emular las coiidicioiies

eii las qiie se encontraban las miiestras problema, se procedió a procesar todas las niuestras

de los pedúnculos de los camarones expuestos a diferentes salinidades. Las muestras

procesadas teníaii un peso promedio entre 50-100 mg por lo qiie se adaptaroii materiales

coino pistilos y tubos de plástico de 1.5 mL para la extracción eii lugar de honiogenizador

mecánico o vidrio. Siii excepción, el ARN aislado de cada miiestra se obtuvo sin degradar,

de buena calidad y libre de ADN,

El paquete de este ARN se conservo a -70°C sin resiispender una vez eliminada la posible

Figura 4. ARN extraído de cada muestra problema.

VI.4 Sintesis de ADNc

Las muestras de ARN total requirieron una doble extracción con fenol-cloroformo previo a

la síntesis de ADNc. La selección de la enzima fue muy importante debido a que el

pigmento puede interferir con la acción de algunas enzimas como la retro-transciiptasa, por

ello después de probar varias retro-transcriptasas seleccionamos a la enzima SuperScript

III de la casa comercial Invitrogen. Para llevar a cabo la síntesis de ADNc se usaron 4 pg

de ARN total para cada muestra. Posteriormente las muestras fueron re-extraídas para

eliminar sales y a la enzima. Sin embargo, aun con la re-extracción algunas muestras de

ADNc tenían una coloración ligeramente rosa y en otras con tonalidad púrpura, incluso al

ser diluidas. Por ello, a pesar de liaber aislado el ARN total de todos los pares de

pedúnculos de las muestras se seleccionó solo cierto número de ellos para obtener los

perfiles transcripcionales de las muestras provenientes de los organismos expuestos a

diferentes salinidades (Tabla ll). De las observaciones de las muestras es posible asumir

que el pigmento posee gran afinidad no solo por el ARN sino que también por el ADN

39

ADNc de un gen constitutivo como actina tanto de muestras de ADN cromosomal

obtenidas dc un tejido libre de pigmentos como con una muestra con pigmentos, ambas

con concentraciones similares a las usadas con ARN 0 menores, Cuando se utilizó las

muestras de ADNc concentradas no se observó la amplificación de actina (Fig. 5 carriles

1-8). Sin embargo se logró la amplificación cuando las muestras fueron re-extraídas y

diluidas 1:10, lo que se sugiere que la inhibición de la reacción en muestras concentradas

fue debida a una elevada concentración de pigmento en algunas de ellas.

Tabla II. Numero de organismos utilizados por condición de salinidad.

No de organismos Salimdad

O_šq_

1

20%o

26%@

32%«

(contas) iz 3 4 5 7 B 9101112131-Hsis

Figura 5. Amplificación con ADNc de muestras, gen de actina. Muestras problema por duplicado, a una dilución de 1:10. Carriles 1-8 muestras sintetizadas sin re-extraer, canìles 9-16 mismas muestras re-extraídas una vez sintetizado el ADNc.

Vl.5 PCR de Tiempo Real

Para llevar a cabo el primer objetivo específico de este trabajo se montó la técnica de PCR

de tiempo real para los genes chh y mih utilizando como gen constitutivo control a la

actina. Para ello se realizó una estancia en el Laboratorio de Inmunología Molecular II de

la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN en donde ya se tiene montada esta

metodologia (Ramos-Payan, R. el ul, 2003). En este laboratorio se trabajo con el

termociclador de tiempo real GeneAmp 5700.

Con el objeto de tener los productos que se utilizarían para hacer la cuwa estándar se llevó

a cabo la clonación de los genes. Para ello los tres genes fueron amplificados exitosamente

a partir del ADNc utilizando los oligonucleótidos diseñados en este trabajo. Para actina se

obtuvo un fragmento de 141 ph, mientras que para mih y chh se obtuvieron fragmentos

esperados de 130 y 149 pb, respectivamente. Tanto el gen de actina como el de mih fueron

clonados en el plásmido TOPO-Ta como se mencionó en materiales y métodos. Sin

41

gcn en forma exitosa no se logró la clonación en el plásmido. Después de varios ensayos

infructuosos por cuestiones de tiempo de la estancia decidimos continuar con los ensayos

de expresión solo para el gen mih utilizando actina como control.

Una vez obtenido el ADN plasmídico para actina y mih se montó la metodologia para la

obtención de las curvas de estándar las cuales permiten obtener los datos requeridos para la

cuantificación de las muestras problema. Para obtener la curva estándar sc realizó la

amplificación para cada gen utilizando cinco diferentes concentraciones de ADNc (104 ~

lO'°). En ambos casos se obtuvieron curvas favorables y los resultados mostraron que no

habia amplificaciones inespecificas (ver figuras 6 y 7). Además se realizaron cun/as de

fusión para cada par de oligonucleótidos, incluyendo los de c/¡Il utilizando ADN genómico

como templado. Los oligonucleótidos no formaron dímcros ni estructuras secundarias que

provocaran la unión del colorante SYBR Green ni se obtuvieron amplificaciones

inespecíficas, lo que indicaba que estaban bien diseñados para las amplificaciones de PCR

tiempo real utilizando este colorante.

Asimismo las curvas de fusión permitieron determinar la temperatura donde sc tenía la

mejor señal de fluorescencia para cada par de oligonucleótidos:

0 mili: 82°C

0 act: 83°C

0 chh= 81°C

95°C iïãxmin. 1 lcicloi -V A

95°C

45 seg.” K

ÉVZÍS “C 30 seg. l 35 ciclos I

72"c

35 seg.

l

72°C I 7 min. l 1 ciclo

1%

l

, 4;,

2

0 5 pL de Sybr Green

0 Reacciones de 50 uL

Con las curvas estándar de actina (Figura 6) y mi/1 (Figura 7) se determinó la linea base y

el umbral (Th), para así calcular el valor del ciclo del umbral (Ct) el cual aparece durante la

fase exponencial del PCR y es inversamente proporcional al número inicial de moléculas

del templado en la muestra. El umbral es el nivel en el cual se observa el primer

incremento de fluorescencia y esta por arriba de la linea base (BL) y fue determinado por

el programa del equipo en 0,7. Estas curvas sirvieron para interpolar los valores de Ct

obtenidos de las amplificaciones de cada tejido en las curvas de calibración (Figura 8)

para determinar asi el nivel de expresión de mi/1 en cada uno ellos normalizando los

FLUORESENC A

14

›bc››o.›cno=É|`$

CURVA ESTANDAR ACTINA

7-›¬¶¬9

m m m' 10¬7

† †7 :z 10¬6

~›t<¬10¬5

¿10¬4

3 ,5_L 9 1ll_13 15_1_7_19 21l_23_25 27_2ì31 33.35 37j9_4_L 43 No. DE CICLO

Figura 6. Curva estándar de actina.

FLUORESENOA 14

<=~›a›=»3

CURVA ESTANDAR MIH

121 '

v-0**-v°^**¢~,.¢4~¢-o-¢

ìiv »›¬¬-ff..-†.¬-r. 1.'

'*°*'\›é>›(b›3>›9f1'J~f1Í*-1`3°'š*fa°"š\›°š°

# CICLO

-Ã_¶›¬9

+.1o¬1

1o¬s

¬<_1o¬4

Figura 7. Curva estándar de mih.

Curva de Calibraclon

30 25 20

ct 1 5

. ct

10 y = ›a.214ax + 36.536 _ mea' (cl)

5 R 2= osass

0

¬ 7 ¬~ a

f 7.

0 2 4 6 8 10

Moléculas (Log)

Figura 8. Curva de calibración

Una vez terminadas las gráficas de calibración se procedió a ampliñcar por PCR de

Tiempo Real las muestras de ADNc sintetizados a panir de ARN total de diferentes tejidos

de camarón: pleópodos, branquias, hepatopáncieas, músculo y pedúnculos. Estos últimos

tanto de muestras con pigmentos como de muestras provenientes de pedúnculos a los que

les fue removida la mayor cantidad posible de pigmentos. Para ello, el ADNc de cada

muestra problema se amplificó por duplicado por PCR de tiempo real tanto para el gen de

actina como para mih obteniéndose las curvas correspondientes (Figuras 9 y 10). Estos

ensayos de expresión de mih utilizando diferentes tejidos del camarón fueron realizados

debido al interés de determinar si mih se estaba expresando en algún otro tejido diferente al

pedúnculo ocular del camarón. En este sentido estudios previos ya habían mostrado la

expresión del gen mih de L. vannameí no solo en el pedúnculo ocular del camarón sino

14 FLuoREsENcA aQ 3 a› foam MUESTRAS ACTINA

J

A

V

7 Í _ i _

/

_

,

¡Y

,

Í 7

_

/. † És

7 7

_

...sé-' si

. . tf, "iii í v||¬-1-v-v¬i|¬r¬'¬|_Y¬|i

3j_L 9J_1_1_3_151]_1_9_Zl23_25_2l29 3fl_33_35 37j9AJJ3 4, ND CICLO

Bamquias, D: Pleopodos, E: Pleópodos, F: Músculo, cDNA8: Pedúnculos con pigmento

14~ MUESTRAS MIH 12 F|.uoREsENcA ON-h GIW 3

/;-~--~~-~

#CICLO

Figura 10. Curva de disociación de actina A: Pedúnculo sin pigmento, B: Hepatopancreas, C: Branquias, D: Pleópodos, E: Pleópodos, F: Músculo, cDNA8: Pedúnculos con pigmento. -o¬A -J~A B +5 -x¬C _ø_C `1'll'I'II'\'IUU -¢_A ~o- B C :: D -¡H E «_ F -0-CDNAB

Figura 9. Curva de disociación de mih. A: Pedunculo sin pigmento, B: Hepatopancreas, C

F 1 cDNA8

A partir de estas curvas se obtuvieron los valores de Ct para cada muestra mismos que se

inlerpolaron en la curva de calibración para obtener los valores de expresión para mili.

Estos datos fueron normalizados coli los valores obtenidos para actina.

Como se puede observar eii la Tabla lV y Figura 11, no se detectó expresión del gen mili

eii las imiestras de ltepatopancreas ni de branquia, pero si en las dos muestras de pleópodo,

aunque el nivel de expresión es muy bajo. Sin embargo, inesperadamente para el caso del

inúsciilo cl nivel de expresión fué muy alto y casi se compara con el nivel de expresión

obtenido para el pedúnculo ocular siii pigmentos, Aunque en un artículo de Yodmuang et

al (2004) se encontró asimismo la expresión de mih en músculo así como en branquias de

Peiiaeiis monozlou, los autores concluyen que al secuenciar el geii amplificado en inúsculo

este correspondió a otro gen. Con lo que respecta a los resultados de este trabajo si bien los

análisis se realizaron por duplicado estos se realizaron a partir de una sola muestra de

tejido, por lo tanto los datos tendrían que corroborarse con un mayor itúinero de muestras

de organismos diferentes y en caso de que estos resultados se repitan se tendria que

secuenciar el gen como se hizo en el trabajo referido. Si bien pudieramos esperar la

presencia de la proteína Ml`H en la ltemolinfa y por tanto quizás cn músculo, no

cspcrariamos detectar altos niveles de ARNm del gen mili en este tejido.

La expresión de los genes mih y ch/1 lia sido analizada cn otros organismos como

Melupenaeus eiisis (Chan, et ali 1998) y P. monodou (Udoinkit el al 2004) utilizando

tejidos coino ganglio cerebroide, branqiiia, corazón, epiderinis, músculo, intestino, ovarios

y testículos. Estos autores sugieren expresión de estas hormonas no solo cn cl pcdunculo

corazón y brauquia (Sun, 1995; Chan et ul., 1998; Gu et nl., 2002; Udoinkit et al., 2004

Tabla IV. Cuantilicación relativa de mi/1.

_T____._i___z

47

cerebro, nervio ventral y ganglio, aunque también se ha detectado la expresión de c/¡li en

).

"ÑiuÉs'i'i1/ts 'W ÃCT šii MIH l"E><i›nnsióN V 7 SD i

AC

(Pedúnculo)

ÍÍB (Pedúuculo)

_ C _

(Hepatopáncreas) D (Branquias) ' E (Pleópodo) G (Músculo) F (Pleópodo) 1'* RELATIVA ,,,¬.___

4xio'

2.š2›<1o“ ñ

sasxio'

"b,1i14s

441x1o*'

Á

roexio*

1.i1›t1o*

oioovai

efes xibì V 1.99x io* Wim

_1_

"" 7 'Wa

6.93 X io

í

2.14 X 1o

2.40 X io

i.:sx1o*

t

szaxioi

saøxio

C 4.47 X 1'<›*'7[?1.í›7 X io'

ll

1o4›<1o '

*im o .00027

0.00163

6.37›t1o“' '

mixto' W " santo'

0.66051' '

0.90 0.80 g 0.70

§ o.eo

»iz o.so

Explosión

Pad Ped Pígm. Hep Bra Ple Ple Mus

Muestras

Figura 11. Cuantificación relativa de mih en diferentes tejidos de L. vannamei.

Con lo que respecta ala expresión del gen mih en los pedúnculos, esta fue 10 veces mayor

en las muestras de pedúnculo ocular sin pigmento en comparación con las muestras de

pedúnculos con pigmentos. Esto sugerla que los pigmentos estaban interfiriendo con la

unión del SYBR Green al ADN recién amplificado. Para corroborar esto se realizaron

nuevas corridas de PCR de tiempo real con muestras de pedúnculo con pigmento y se

observó el ADN amplìficado mediante el conrimiento de las muestras en geles de agarosa

al 2% y posterior tinción con bromuro de etidio. Como se observa en la figura 12, aún

cuando no se detectó señal de fluorescencia por PCR de tiempo real en muestras problema,

los genes si se amplificaron lo que sugiere fuertemente que el pigmento presente en las

49

menor de la doble cadena de ADN y es posible sugerir que el pigmento ocupe este lugar e

impida que el colorante se una.

Figura 12. Muestras amplificadas por PCR Tiempo Real, corridas en un gel de agarosa y tenidas con bromuro de etidio.

Debido a lo anteriormente expuesto se intentó eliminar el pigmento de las muestras de

ADNc que se tenían para las diferentes salinidades con dos tratamientos de re-extracción:

el método A consistió en una re-extracción final con fenol-cloroformo y precipitación con

isopropanol; el método B en una re-precipitación final a base de isopropanol únicamente.

Al final de cada tratamiento se observaron pastillas prácticamente blancas de ARN

coronadas con pigmento púrpura; pero los resultados no fueron más favorables ya que a

pesar de observarse amplificaciones especificas en gel de agarosa, cuando las mismas

muestras fueron sometidas a PCR de tiempo real los resultados fueron negativos. Por esta

razón se concluyó que el método de PCR de tiempo real utilizando el colorante