(1)ELABORACIÓN DE UN MODELO QUE PERMITA PREDECIR LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y LA ESTABILIDAD DE LA LISOZIMA T4 EN FUNCION DE LA ENERGIA POTENCIAL LUCY RIVERA ROJAS DIRECTOR: Dr

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ELABORACIÓN DE UN MODELO QUE PERMITA PREDECIR LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y LA ESTABILIDAD DE LA LISOZIMA T4 EN FUNCION DE LA

ENERGIA POTENCIAL

LUCY RIVERA ROJAS

DIRECTOR:

Dr. LEONARDO LAREO

MAESTRIA EN BIOLOGIA

ENFASIS EN BIOLOGIA MOLECULAR COMPUTACIONAL FACULTAD DE CIENCIAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

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TABLA DE CONTENIDO

Página

1. Introducción...3

2. Objetivos...5

3. Antecedentes...7

4. Planteamiento del problema...14

5. Hipótesis...15

6. Marco Teórico...16

7. Procedimiento...22

8. Resultados...29

9. Análisis y Discusión de resultados...37

10. Conclusiones...50

11. Recomendaciones...51

12. Referencias...52

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INTRODUCCION

La combinación especial entre un espíritu muy observador y un trabajo experimental tosco y descuidado, visto así a la luz de las posibilidades tecnológicas del Siglo XXI; le permitieron a Alexander Fleming, llevar a cabo dos descubrimientos que revolucionarían la ciencia y la medicina.

Un cultivo de Staphylococcus, contaminado con el hongo Penicillium (un trabajo deplorable para nuestras posibilidades experimentales actuales), le permitió a Fleming encontrar la sustancia responsable de la lisis bacteriana, a la cuál llamó Penicilina.

De forma similar, padeciendo un resfriado, una gota proveniente de su nariz cayó sobre un cultivo bacteriano; las colonias fueron también lisadas. En 1922 anotó que un elemento bacteriolítico al que luego llamó lisozima, se encuentra en el moco nasal, en las lágrimas y en la saliva. Posteriormente encontraría que tal sustancia está presente también en los leucocitos, la piel, la leche y que además está ampliamente distribuida en plantas y animales.

Desde entonces, la lisozima se ha convertido en una amplia fuente de investigación. El hallazgo de lisozimas en fagos, bacterias, plantas, vertebrados e invertebrados; ha promovido el estudio de la evolución de las diferentes familias de lisozimas. La lisozima del huevo de gallina (HEWL) fue la primera enzima cristalizada con una alta resolución y la primera enzima para la cual fue propuesto con detalle un mecanismo de reacción.

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Las diferentes clases de lisozimas se han convertido por su amplia distribución en la naturaleza y por su relativa abundancia, en modelo de estudio bioquímico y biológico. Son modelo de estudio en enzimología, plegamiento, ingeniería de proteínas, cristalografía, biología molecular y regulación de la expresión genética, inmunología, evolución y farmacología.

Aprovechando la información existente, es posible utilizar la lisozima como modelo de estudio de estabilidad y actividad enzimática.

La lisozima del fago T4 (T4L) es una proteína de 164 aminoácidos que ha sido caracterizada enzimática y estructuralmente. Se han realizado alrededor de 300 mutaciones diferentes, 85 de ellas con estructura tridimensional conocida y actividad enzimática medida, lo que permitiría emplear este volumen de datos para generar un modelo predictivo del efecto de las mutaciones puntuales en la estabilidad y actividad enzimática de la misma.

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OBJETIVOS

GENERAL

Generar un modelo predictivo de la estabilidad y actividad enzimática para la lisozima T4 en términos de Energía Potencial de las diferentes mutaciones de la proteína.

ESPECÍFICOS

1. Emplear el modelo de campos de fuerza en la caracterización energética de las mutaciones de la lisozima del fago T4 (T4L) para las que se conoce estructura tridimensional.

2. Emplear el modelo de campos de fuerza en la caracterización energética de fragmentos de proteínas que contengan la mutación puntual en cada caso, y comparar los resultados con los obtenidos para la proteína completa.

3. Relacionar la actividad enzimática y la temperatura media de desnaturalización (Tm) de cada una de las mutaciones puntuales de la lisozima con la Energía Potencial calculada para cada molécula.

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4. Generar un modelo predictivo que permita seleccionar por desarrollos computacionales las mutaciones con mayor probabilidad de obtener un enzima con la estabilidad y actividad deseada

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ANTECEDENTES

La lisozima nativa del fago T4 ha sido mutada en múltiples puntos, de tal manera que se han obtenido mas de 300 mutaciones diferentes, de las cuales, alrededor de 120 aproximadamente han sido cristalizadas y determinadas las coordenadas cartesianas de los átomos que las conforman. En (MATTHEWS 1995) se reportan alrededor de 80 mutaciones diferentes con estructura terciaria, para las cuales además se ha determinado experimentalmente el porcentaje de actividad y algunas variables termodinámicas como ΔΔG de desnaturalización y ΔTm (cambio en la Temperatura media de desnaturalización).

Han sido realizados numerosos estudios de mutagénesis dirigida, tendientes a dilucidar las bases fisicoquímicas de la estabilidad de las proteínas. El modelo utilizado preferencialmente ha sido la lisozima del huevo de gallina (HEWL), la lisozima humana (HUL) y la lisozima del fago T4 (T4L). Una revisión hecha desde la década de los ochenta incluye entre otros, los siguientes reportes: MATTHEWS 1987; ALBERT, 1988; NICHOLSON, 1988; KUROKI, 1989; MATSUMURA, 1989a;

CONNELLY, 1991; DAOPIN, 1991; FUNAHASHI, 1996; GRAY, 1996; TACANO, 1997a; TAKANO,1997b; OHMURA, 1997; TAKANO, 1998; YAMAGATA, 1998.

PERRY y WETZEL, (1984), construyeron un mutante de la lisozima T4, mediante la técnica de mutagénesis dirigida, en el que la Isoleucina 3 es cambiada por Cisteína.

Este cambio permite la formación de un puente disulfuro con la Cisteína 97, proporcionando un aumento en la estabilidad de la proteína, medida como una mayor resistencia a la inactivación térmica y la conservación completa de la actividad enzimática.

ALBER (1987) y colaboradores, realizaron 13 sustituciones en la treonina 157 por aminoácidos tanto polares como no polares. Los mutantes mas estables fueron

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aquellos que permitieron la formación de puentes de hidrógeno similares a los presentados en el tipo salvaje.

En otro estudio, se realizaron 25 mutaciones puntuales diferentes de T4L, sensibles a temperatura (ALBER,1987). Se encontró que los residuos con alta movilidad o con gran accesibilidad al solvente no contribuyen a la desestabilización de la proteína cuando son sustituidos, sugiriendo que estos aminoácidos son muy poco importantes para la estabilidad de la estructura. De igual forma, se sugiere que la proteína puede ser estabilizada adicionando aminoácidos que permitan nuevas interacciones en regiones rígidas o en aquellas sepultadas por la conformación plegada.

MATSUMURA y colaboradores(1988), realizaron13 mutaciones en T4L, en las que cambiaron la Isoleucina 3 por 13 aminoácidos diferentes cada vez. Para 11 de ellas (Leu, Val, Met, Ala, Thr, Ser, Gly, Glu y Asp), se encontró una relación lineal entre la hidrofobicidad del aminoácido y la estabilidad de la proteína (medida como ΔΔG, Kcal/mol). Estos resultados son consistentes con el hecho de que la cadena lateral de la Isoleucina 3 es uno de los mayores contribuyentes al núcleo hidrofóbico de la lisozima, por tanto, la sustitución en dicha posición, estará directamente relacionada con la estabilidad de la proteína. Se confirma así mismo, que la estabilización hidrofóbica en el plegamiento es proporcional a la reducción del área superfiicial accesible al solvente.

MATSUMURA (1989), construyó lisozimas T4 con múltiples enlaces disulfuro. Los puentes se encuentran entre los residuos 3-97, 9-164 y 21-142. Los mutantes contienen combinaciones diferentes de uno, dos o los tres puentes disulfuro.

Finalmente se observa que el incremento en la cantidad de enlaces disulfuro, aumenta la estabilidad térmica, incrementando hasta en 23,4 ºC la temperatura de fusión para el mutante con los tres enlaces disulfuro introducidos.

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SHOICHET (1995) encontró una relación muy interesante entre la estabilidad de una proteína y su función. Realizando mutaciones en el sitio activo de la lisozima T4, llegó a la conclusión de que aquellas sustituciones que incrementaron la estabilidad térmica de la proteína, redujeron o suprimieron completamente la actividad enzimática. Este resultado sugiere que si bien la estabilidad de la conformación tridimensional es importante para la actividad enzimática, los aminoácidos que conforman el sitio activo no la favorecen.

En este estudio se realizaron 21 mutaciones de las cuales 5 implicaron el Glutámico 11 catalítico (E11F, E11M, E11A, E11H y E11N), anulando la actividad catalítica pero incrementando la estabilidad en 0,1 a 4,3 ºC (medida como Tm). Cuatro de ellas implicaron al Aspártico 20 catalítico (D20N, D20T, D20S y D20A), anulando también la actividad enzimática y aumentando la estabilidad en 0,1 a 3,1 ºC. Las mutaciones restantes involucraron sitios de unión al sustrato (), las cuales redujeron sustancialmente la actividad enzimática (desde 0,4 hasta 0,002%) e incrementaron la estabilidad de 2,8 a 5,1 ºC.

La razón de estos resultados radica en que si bien la proteína tiende a plegarse de forma tal que su energía libre disminuya a cierto mínimo, los aminoácidos implicados en la catálisis o en el reconocimiento del sustrato, son bien, aminoácidos cargados o grupos polares que han sido secuestrados del entorno acuoso para encontrarse en la hendidura del sitio activo, o bien aminoácidos hidrofóbicos expuestos al solvente.

Estas dos situaciones, aunque permiten la catálisis enzimática, tienden a disminuir la estabilidad de la proteína.

WRAY, (1999), logró incrementar la estabilidad de L99G al incorporar la sustitución E108V. La sustitución en L99G, aunque no disminuye el % de actividad enzimática, rápidamente esta se anula durante el curso del ensayo, especialmente a temperaturas por encima de 20ºC. La proteína mutante formada por las sustituciones L99G/E108V, le confiere a la proteína una actividad enzimática y una estabilidad similares a la de la proteína nativa.

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Las bases físicas y químicas del plegamiento de las proteínas es también otro campo de investigación bastante amplio, en el que igualmente, HEWL, HUL y T4L, se han constituido en modelos de estudio. NAJBAR, (2000), identificó sitios potenciales de plegamiento en T4L, examinando regiones de estructura secundaria por Dicroísmo Circular. La hélice E, es una de las primeras estructuras formadas durante el proceso de plegamiento, mientras que las hélices D, F, G y H son dependientes de las interacciones terciarias formadas.

Respecto a la actividad enzimática de T4L, DAO-PIN (1989) encuentra una relación directa entre el campo electrostático del sitio activo de diferentes lisozimas (HEWL, HUL Y T4L) y su actividad catalítica. Los aminoácidos implicados en la catálisis de la lisozima T4 son el Glutámico 11 y el Aspártico 20. El glutámico 11 se encuentra protonado, y es indispensable como donador de H⁺ en la reacción de hidrólisis.

El mecanismo enzimático consiste en la protonación inicial del oxígeno del enlace glicosídico por parte del Glutámico 11 y en la estabilización de la carga positiva del complejo de transición por parte del Aspártico 20. Finalmente, el ataque de una molécula de H2O, genera el rompimiento del enlace y la recuperación del Glutámico 11 protonado. (Figura 1)

DAO-PIN (1989), calculó el potencial electrostático de la lisozima de huevo de gallina (HEWL), de la lisozima humana (HUL) y de la lisozima del fago T4 (T4L), con el Glutámico catalítico no cargado (protonado). En todas ellas se encontró una característica esencial: El gradiente entre las superficies equipotenciales positivas y negativa, coincide exactamente con la hendidura del sitio activo. La proximidad de las superficies equipotenciales positiva y negativa indica que debe existir una diferencia de potencial electrostático de 6 Kcal/mol a lo largo de una distancia de ~4Å

en la hendidura del sitio activo. Esto corresponde a un campo eléctrico de ~6 x 10⁶ V/cm en la dirección apropiada para promover el movimiento de la carga positiva desde el glutámico catalítico hacia el sustrato.

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Figura 1

Mecanismo de reacción de la lisozima del fago T4 (T4L). Aunque en el diagrama se indican los aminoácidos catalíticos Glu 35 y Asp 52 correspondientes a la lisozima del huevo de gallina (HEWL), el mecanismo de reacción para T4L es el mismo, teniendo en cuenta que en este caso los aminoácidos catalíticos son Glu 11 y Asp 20. Tomado de STRYNADKA, 1996.

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Aunque las tres lisozimas difieren ampliamente en su estructura primaria, poseen distribuciones similares de los residuos de aminoácidos cargados, lo cual conlleva a campos eléctricos similares en el sitio activo.

Alternativamente a este modelo de mecanismo catalítico, surge uno paralelo (KARPLUS, POST, 1996)que involucra no la protonación del oxígeno del enlace glicosídico, sino la protonación del Oxígeno del anillo glicosídico. El modelo fue interpretado para HEWL en donde los aminoácidos catalíticos son el Glutámico protonado 35 y el Aspártico 52, sin embargo, extrapolando para T4L, el mecanismo sería similar teniendo en cuenta que en este último caso los aminoácidos catalíticos son E11 y D 20. (Figura 2)

Mientras que en el primer modelo se plantea la distorsión del anillo del sitio D, la cual promueve el rompimiento del enlace C1-O4’ exocíclico; el segundo modelo no requiere la distorsión del anillo, y la protonación del Oxígeno endocíclico promueve el rompimiento del enlace endocíclico C1-O5.

Aunque ambos modelos son consistentes con los estudios mutacionales y con los datos cinéticos que suponen la formación de un ion oxicarbonio como paso limitante en la velocidad de la reacción, existe evidencia a favor y en contra tanto del primer modelo como del segundo. Para el segundo modelo es cuestionada la accesibilidad de la molécula de agua antes de la disociación de los anillos E y F del sustrato; para el primer modelo, los resultados que indicarían la distorsión del anillo D están sujetos a interpretaciones ambiguas.

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Figura 2

Modelos alternativos propuestos para el mecanismo de reacción de T4L.

El Esquema I indica el mecanismo endocíclico y el esquema II, el mecanismo exocíclico.. Aunque en el diagrama se indican los aminoácidos catalíticos Glu 35 y Asp 52 correspondientes a la lisozima del huevo de gallina (HEWL), el mecanismo de reacción para T4L es el mismo, teniendo en cuenta que en este caso los aminoácidos catalíticos son Glu 11 y Asp 20. Tomado de KARPLUS, 1996.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Propiedades como la estabilidad y actividad enzimática son importantes a la hora de definir la utilización industrial o farmacéutica de un enzima determinado; es por ello que surge la necesidad de encontrar un parámetro que permita predecir de forma precisa, rápida y económica dichas propiedades en los diferentes enzimas.

La medición experimental de la estabilidad (medida como Tm: Temperatura media de desnaturalización) y de la actividad de un enzima resulta, en la mayoría de los casos, en determinaciones costosas y dispendiosas.

Es claro que en la actualidad la tecnología de enzimas requiere la modulación de la actividad y estabilidad enzimáticas. Una de las formas consiste en crear mutantes de proteínas salvajes. Este procedimiento implica la utilización de tecnología costosa y laboriosa en la construcción de cada uno de los mutantes, la purificación de la proteína expresada y la determinación experimental de su correspondiente estabilidad y actividad. Para obtener un enzima con una actividad determinada, es necesario ensayar varios mutantes hasta encontrar aquel con las propiedades deseadas.

El objetivo principal de la presente investigación consiste en desarrollar un modelo que permita predecir la actividad enzimática de la lisozima del fago T4 a partir del cálculo de la energía potencial de cada una de las proteínas mutantes, de tal forma que mediante la conjugación de los resultados experimentales y el uso de herramientas computacionales, en un futuro sea posible la determinación rápida y económica de las propiedades de un enzima, disminuyendo así mismo, la proporción de ciencia basada puramente en el “ensayo y error”.

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HIPOTESIS

H1: Existe relación entre la Energía potencial total o parcial calculada y la Actividad enzimática de la lisozima T4.

H2: Existe relación entre la Energía potencial total o parcial calculada y la Temperatura media de desnaturalización (Tm) de la lisozima T4.

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MARCO TEORICO

La lisozima es una hidrolasa que cataliza el rompimiento de los enlaces β1-4 de los peptidoglucanos. El peptidoglucano es un entramado estructural rígido que constituye la pared celular de bacterias y está formado por cadenas polisacáridas paralelas unidas covalentemente por cadenas peptídicas transversales (Figura 3).

Esta estructura recibe también el nombre de mureína, que viene del latín murus, pared.

X

Y

X

Y

X

Y

X

Y

X

Y

X

Y

Figura 3

Representación esquemática de un peptidoglucano. Las cadenas formadas por los elementos X y Y, constituyen las cadenas de polisacárido. X es un resto de N-acetilglucosamina y Y un resto de ácido N-acetilmurámico. Las líneas verticales representan cadenas laterales tetrapeptídicas y las líneas horizontales son pentapéptidos que constituyen el enlace transversal. Los tetrapéptidos están unidos al ácido N-acetilmurámico mediante enlace amida con el resto de ácido láctico localizado en el carbono 3 del muramato.

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La lisozima rompe, específicamente el enlace formado entre el carbono 1 del ácido N-acetilmurámico (NAM) y el carbono 4 de la N-acetilglucosamina (NAG). (Figura 4)

O

o

CH2OH

H N H

C O

CH2 H O

R

H2O CH2OHo

H N H

C O

CH2

O ^CH2OHo

H N H

C O

CH2 O O

O

o

CH2OH

H N H

C O

CH2 O

H R

o

CH2OH

H N H

C O

CH2

O ^CH2OHo

H N H

C O

CH2 O O

H R

OH ^CH2OHo

H N H

C O

CH2

O ^CH2OHo

H N H

C O

CH2 O O

H R

HO H

NAG NAM NAG

NAG NAG

NAM

NAM NAM

R= ^H2C ^C ^H

COO

Figura 4

Rompimiento del enlace β1-4 glicosídico de la cadena polisacárida del peptidoglucano, por acción de la lisozima. NAM: Acido N-acetilmurámico, NAG: N-acetilglucosamina, R: residuo de ácido láctico

Los productos de la acción de la lisozima son disacáridos de la N-acetilglucosamina y del ácido N-acetilmurámico, a los que todavía se hallan unidas las cadenas laterales peptídicas. Una vez dividida la mureína de esta manera, la célula se hincha y la membrana celular se rompe.

La lisozima es una enzima que se encuentra ampliamente distribuida tanto en plantas como en animales, e inclusive en fagos y bacterias. Igualmente, en un mismo organismo, se encuentra distribuida en diferentes órganos y tejidos.

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(HOLTJE, 1996; FASTREZ, 1996; PRAGER and JOLLES, 1996; BEINTEMA and SCHELTINGA, 1996; HULTMARK, 1996).

La lisozima cumple claramente funciones antibacteriales, esencialmente bacteriolóticas, haciendo parte en la mayoría de los casos de la respuesta inmune inespecífica. (HULTMARK, 1996)

En bacteriófagos, la lisozima tiene la función de romper la pared bacteriana para facilitar la salida de las partículas virales recien formadas. En ciertas bacterias que poseen el gen codificador de lisozima, se cree que la lisozima actúa durante la división celular, facilitando la ruptura del peptidoglucano. (HOLTJE, 1996)

Se han definido diferentes familias de lisozimas, dependiendo de los alineamientos por secuencias. Tres de ellas son la tipo C (tipo “chicken”), tipo G (tipo “goose”) y tipo V (tipo viral). Aunque entre las diferentes familias existen diferencias significativas en sus secuencias, las estructuras tridimensionales son bastante similares. En todas ellas, el sitio activo está localizado en una hendidura que separa dos lóbulos conectados por una hélice. Los aminoácidos catalíticos se encuentran localizados hacia la porción amino-terminal de la proteína entre el lado carboxilo de una α hélice y la hoja β que le sigue. (FASTREZ, 1996)

La lisozima del fago T4 (T4L) pertenece a las lisozimas tipo V. Es una proteína soluble, de 18Kd y164 residuos de aminoácidos. Destruye la pared celular de su hospedero, Escherichia Coli, al final del ciclo de infección. Aunque posee dos residuos de cisteína (en las posiciones 54 y 97), no forma puentes disulfuro. Está constituida en su mayoría por hélices α, con una pequeña proporción de cadenas β.

La Figura 5, es un diagrama de la conformación tridimensional de T4L. Se aprecian los dos lóbulos en los que se divide la proteína, separados por un α hélice

En la figura 6 se muestra la hendidura del sitio activo, y se indican los aminoácidos catalíticos, Glutámico 11 y Aspártico 20.

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Figura 5

Estructura terciaria de la lisozima T4 (T4L) en la que se muestra los aminoácidos catalíticos: Glu 11 y Asp 20. Se logra apreciar los dos lóbulos de la proteína, separados por la hendidura del sitio activo.

Figura 6

Conformación tridimensional de T4L en la que se puede apreciar la hendidura del sitio activo. En amarillo se indican los aminoácidos Glu 11 y Asp 20.

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Se han realizado mas de 300 mutaciones de la lisozima T4 de las cuales, 120 aproximadamente han sido cristalizadas y determinadas las coordenadas cartesianas de los átomos que las conforman.

Los archivos de las coordenadas cartesianas de todas las proteínas que han sido cristalizadas se encuentran en PDB (Protein Data Bank) y son los datos de entrada para programas computacionales que manejan el modelo de campos de fuerza.

El modelo de campos de fuerza consiste en un conjunto de funciones de Energía Potencial, que representa las contribuciones de energía de las diferentes fuerzas inter e intramoleculares del sistema molecular.

El cálculo de Energías mediante el modelo de campos de fuerza, constituye lo que se ha llamado Mecánica Molecular. Aunque la explicación del comportamiento de los sistemas moleculares está basado en las leyes de la Mecánica Cuántica, los cálculos realizados con el modelo de Mecánica Molecular han dado buenos resultados. (ENGELSEN, 1994)

El conjunto de funciones de Energía Potencial es generalmente optimizado mediante la adición de parámetros, que reproducen, en lo posible, los datos experimentales de los sistemas moleculares tomados como referencia.

Por tanto, la Energía potencial total de una molécula puede ser escrita como una suma de términos, cada uno de los cuales está relacionado con un tipo específico de interacción:

Vtotal = Vb + Vθ + Vφ + Vχ + Vnb

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Donde Vb es la energía de deformación del enlace, Vθ es la energía de deformación de ángulos, Vφ es la energía de deformación de ángulos de torsión, Vχ es la energía de deformación fuera del plano y Vnb es la energía de interacciones de no enlace. Los términos primarios son aquellos para las interacciones de enlace y de no enlace, mientras que los otros términos son en principio considerados correcciones, aunque numéricamente pueden llegar a ser muy significativos.

Existen diferentes formas de la función de energía potencial para cada uno de los términos, con diferente grado de optimización. Se reproducen aquí en cada caso, las mas sencillas: (RASMUSSEN, 1997)

Vb = Σ ½ Kb (b – bo)²

Vnb = Σ (Aijr^--n - Bijr^-6 + eiejr^-1) Vθ = Σ 1/2 Kθ (θ − θo)²

Vφ = Σ 1/2 Kφ( 1 + cos nφ) Vχ = Σ 1/2 Kχ(χ − χo)²

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PROCEDIMIENTO

Para el desarrollo de esta investigación se incluyó la utilización de archivos de PDB (Protein Data Bank). PDB es una base de datos que contiene todas las proteínas a las cuales se les ha determinado su estructura tridimensional mediante difracción de rayos X o Resonancia Magnética Nuclear. Se encuentra en http://www.rcsb.org. Se utilizó así mismo los resultados experimentales de mediciones de Actividad enzimática¹ y de Temperatura media de desnaturalización (Tm) de investigaciones anteriores² (MATTHEWS, 1995).

Para esta investigación se empleó la amplia información experimental que hoy en día se encuentra con respecto a la lisozima del fago T4 en la aplicación de métodos computacionales, con el fin de encontrar relaciones y conclusiones coherentes.

Los cálculos de energía potencial fueron realizados mediante el modelo de campos de fuerza utilizando el programa Swiss-PdbViewer (SPDBV) v3.5 de

Glaxo Wellcome Experimental Research, (http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.html), implementado mediante los

parámetros de GROMOS 96. Los datos de entrada del programa son archivos PDB (Protein Data Bank) los cuales contienen las coordenadas cartesianas de los átomos constituyentes de la proteína, obtenidas de la estructura cristalina de cada mutante mediante difracción de rayos X.

1 La actividad enzimática de la lisozima T4 fue medida mediante la hidrólisis del peptidoglicano que constituye la pared celular de células de Micrococcus lysodeikticus inactivadas mediante luz u.v. La hidrólisis fue medida por ensayos turbidimétricos. (HOLTJE, 1996b)

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El modelo de campos de fuerza utiliza la función energía potencial con la siguiente forma:

Eptot = Σ ½ Kb (b – bo)² +Σ 1/2 Kθ (θ − θo)² + Σ 1/2 Kφ( 1 + cos nφ) +

enlace ángulos torsión

+ Σ 1/2 Kχ(χ − χo)² + Σ ( Aijr^--12 - Bijr^-6 ) + Σ eiejr^-1

impropios no enlace electrostática

Se calculó la energía potencial total y parcial (la energía potencial total es la suma de las energías de enlace, de ángulos, de torsión, impropios, no enlace, y electrostática) para tanto la lisozima nativa del fago T4, como para cada uno de las mutantes construidos y reportados en MATTHEWS (1995). El resultado de estos cálculos fue correlacionado con el % de actividad enzimática y con la temperatura media de desnaturalización (Tm). Los valores de % de actividad enzimática y de Tm fueron medidos experimentalmente y reportados igualmente por MATTHEWS (1995). En el Anexo 5 se encuentra el código de PDB, la descripción de el(los) aminoácido(s) reemplazado(s), el % de Actividad enzimática, Tm y el pH al cuál fueron determinados los parámetros termodinámicos para cada una de las proteínas utilizadas en el análisis.

Las variables utilizadas son las siguientes:

Variables independientes:

Ee: Energía de enlace

Ea: Energía de ángulos

Et: Energía de torsión

Ei: Energía de impropios

Ene: Energía de no enlace

Eele: Energía electrostática

Etot: Energía total

2 Tm, la temperatura media de desnaturalización es la temperatura a la cual la mitad de las moléculas de proteína se encuentran desnaturalizadas. El grado de desnaturalización es medido por dicroísmo circular.

(BRANDEN, 1991)

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Variables dependientes:

Act: %Actividad

Tm: Estabilidad

Con el fin de encontrar la mejor correlación entre las variables, se generaron tres Grupos de datos así:

GRUPO 1: Lisozima T4 Nativa (3LZM³) y 82 mutantes diferentes

GRUPO 2: Fragmentos de las 82 mutantes, constituido cada uno de ellos por la región del sitio activo y el(los) aminoácido(s) reemplazado(s). Los aminoácidos considerados aquí dentro del sitio activo incluyen los reportados en SHOICHET, 95 (Glutámico 11 y Aspártico 20, aminoácidos responsables de la actividad catalítica; y Serina 117, Glicina 30 y Asparagina 132, aminoácidos implicados en la unión al sustrato), y aquellos que mediante el programa SPDBV v3.5 fueron encontrados cerca de la hendidura del sitio activo de la lisozima T4 nativa (3LZM).

Los aminoácidos considerados como constituyentes de la región del sitio activo, para la lisozima T4, fueron los siguientes:

D10, E11, G12, R14, Y18, D20, T21, E22, G30, H31, L32, K35, Q105, M106, G107, T109, G110, S117, N132, R137, W138, Q141, T142.

Cada fragmento fue extractado, utilizando SPDBV v3.5, del correspondiente archivo de PDB que contiene las coordenadas cartesianas atómicas.

Así por ejemplo, para la mutante 1L10 que consiste en el cambio de Treonina 157 por Isoleucina, el fragmento que pertenece al Grupo 2 es:

D10, E11, G12, R14, Y18, D20, T21, E22, G30, H31, L32, K35, Q105, M106, G107, T109, G110, S117, N132, R137, W138, Q141, T142, I157.

3 3LZM es un código de PDB (Protein Data Bank)

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GRUPO 3: 28 mutantes pertenecientes al Grupo 1, que contienen un único aminoácido cambiado y un % de actividad enzimática diferente a ~WT*⁴.

El Grupo 3 se subdivide en:

GRUPO 3A: Proteínas completas de las 28 mutantes.

GRUPO 3B: Fragmentos de 41 aminoácidos de las 28 mutantes.

GRUPO 3C: Fragmentos de 27 aminoácidos de las 28 mutantes GRUPO 3D: Fragmentos de 19 aminoácidos de las 28 mutantes GRUPO 3E: Fragmentos de 13 aminoácidos de las 28 mutantes

Cada fragmento de los grupos 3A a 3E, contiene el aminoácido que ha sido reemplazado en cada mutante e igual número de aminoácidos por encima y por debajo de su secuencia; así por ejemplo, el Grupo 3B que está constituido por fragmentos de 41 aminoácidos, cada uno de ellos está conformado por el aminoácido reemplazado, 20 aminoácidos mas por encima y 20 mas por debajo de la secuencia polipeptídica.

La razón de la construcción de cinco GRUPOS 3 atiende a la necesidad de encontrar la mejor longitud del fragmento de proteína (donde se encuentra la mutación puntual) que proporcione una mejor relación entre la actividad enzimática y la estabilidad presentada, con la Energía total o parcial calculada.

El procedimiento realizado se llevó a cabo en cuatro etapas, las cuales se describen a continuación:

ETAPA I: Se exploraron las relaciones entre cada par de variables según se muestra en el diagrama:

4 Una actividad enzimática correspondiente a ~WT* indica que es aproximadamente igual a la

“wild type”, es decir, ~100%.

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B1 B2 B3

Tm B1

B2 B3

Ee Ea Et Ei Ene Eele Etot

% Act

Ee Ea Et Ei Ene Eele Etot

ETAPA II: Se realizó Regresión Múltiple para combinaciones diferentes de las variables independientes; Ee, Ea, Et, Ei, Ene y Eele ; con respecto a la variable dependiente en cada caso,: %Act o Tm, como se muestra en el siguiente esquema:

Independientes: Ee, Ea, Et, Ei, Ene, Eele Dependiente: % Act

Ecuación generada:

% Act = b₁Ee + b₂Ea + b₃Et + b₄Ei + b₅Ene + b₆Eele + intercepto

B1 B2 B3

Independientes: Ee, Ea, Et, Ei, Ene, Eele Dependiente: Tm

Ecuación generada:

Tm = b₁Ee + b₂Ea + b₃Et + b₄Ei + b₅Ene + b₆Eele + intercepto

ETAPA III: Se realizó Análisis por Componentes Principales (PCA) . El objetivo de realizar PCA consiste en reducir el número de variables independientes correspondientes a las 6 Energías parciales, a un número menor de variables correlacionadas llamadas Componentes. El PCA fue hecho mediante “Statistica

(27)

6.0”. Posteriormente, con las Componentes Principales resultantes se realizó regresión múltiple con cada una de las variables dependientes: %Act o Tm. El esquema seguido fue el siguiente:

B1 B2 B3

u Variables Independientes: C₁, C₂, C₃,....

C₁= a₁₁Ee + a₁₂Ea + a₁₃Et + a₁₄Ei + a₁₅Ene + a₁₆Eele C₂= a₂₁Ee + a₂₂Ea + a₂₃Et + a₂₄Ei + a₂₅Ene + a₂₆Eele . . . . . . . .

Variables Dependientes:

%Act o Tm

u Regresión Múltiple:

Ecuaciones Generadas:

%Act = C₁+ C₂+ C₃+ ...+ Intercepto Tm = C₁+ C₂+ C₃+ ... + Intercepto

ETAPA IV: Se realizaron análisis adicionales entre las variables:

• Optimización del modelo que relaciona el % de Actividad enzimática con la Energía potencial.

Para este procedimiento se utilizó valores de polaridad de aminoácidos reportados por GRANTHAM,1974.

Aminoácido Polaridad

SER 9,2

ARG 10,5

LEU 4,9

PRO 8,0

THR 8,6

ALA 8,1

VAL 5,9

GLY 9,0

ILE 5,2

PHE 5,2

(28)

TYR 6,2

CYS 5,5

HIS 10,4

GLN 10,5

ASN 11,6

LYS 11,3

ASP 13,0

GLU 12,3

MET 5,7

TRP 5,4

• Relación ΔTm y Actividad enzimática

Se utilizaron los valores de ΔTm y Actividad enzimática reportados por Matthews, 1995

(29)

RESULTADOS

RESULTADOS ETAPA I

GRUPO I

Los resultados de los cálculos de Energía potencial total y parcial se encuentran en la Tabla 1.1 del Anexo 1. En los gráficos 1.1 a 1.7 del Anexo 1, se encuentra la relación entre la Energía potencial total y parcial con % Actividad. Las representaciones gráficas de las relaciones entre Energía potencial total y parcial, y estabilidad (Tm) no son mostradas.

La Energía total toma valores que van desde aproximadamente –8000 KJ/mol, hasta 31000 KJ/mol, aproximadamente. Las Energías de enlace, ángulos, torsión e impropios son todas positivas y oscilan entre rangos de 1000 a 37000KJ/mol, 700 a 2300 KJ/mol, 800 a 1200 KJ/mol y desde 300 a 1500 KJ/mol, respectivamente.

Las energías de no enlace y electrostática son negativas y oscilan entre –4300 a -2400 KJ/mol, y desde – 6500 a –5700 KJ/mol. Los gráficos 2.1 a 2.7 muestran la relación entre Ep total y parcial y el % de Actividad.

GRUPO 2

Los resultados de los cálculos de Energía potencial total y parcial del Grupo 2 se encuentran en la Tabla 2.1 del Anexo 2. Todos los valores fueron positivos, exceptuando algunas proteínas cuya Energía de no enlace fue negativa.

(30)

Las representaciones gráficas de las relaciones entre Energía potencial total y parcial, y estabilidad (Tm), así como las correspondientes a Energía potencial total y parcial, y % de Actividad; no son mostradas.

GRUPO 3

Las tablas 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 y 3.5 del Anexo 3, muestran los valores obtenidos para la Energía total y parcial de los Grupos 3A, 3B, 3C, 3D y 3E respectivamente.

Los valores de Energía electrostática obtenidos para los Grupos 3A y 3B fueron todos negativos. Para los Grupos 3C a 3E, progresivamente, a medida que el tamaño del fragmento de proteína considerado va disminuyendo, se obtiene mayor cantidad de valores positivos para la Energía electrostática.

Las representaciones gráficas de las relaciones entre Energía potencial total y parcial, y estabilidad (Tm), así como las correspondientes a Energía potencial total y parcial, y % de Actividad; no son mostradas.

RESULTADOS ETAPA II

GRUPO 1

Los resultados de la Regresión Múltiple para el Grupo 1 se indican en las tablas 1.2 a 1.7 del Anexo 1. Para cada variable dependiente, % Actividad y Estabilidad, se realizó regresión múltiple para tres combinaciones diferentes de las 6 variables independientes, correspondientes a las Energías parciales:

(31)

• Todas las Energías parciales

• Energías de enlace: Ee, Ea, Et y Ei

• Energías de no enlace: Ene y Eele

Se realizaron combinaciones adicionales, cuyos resultados no son mostrados aquí.

En la Tabla #1 se resumen los resultados obtenidos

Tabla # 1. Resumen de los resultados de Regresión Múltiple para el GRUPO 1

# GRUPO Variable Variables Coeficiente de Coeficiente Dependiente independientes correlación de

múltiple determinación

Todas las Energías parciales 0,35 0,12

Ee, Ea, Et, Ei, Ene, Eele

% Act Energías de enlace 0,19 0,04

Ee, Ea, Et y Ei

Energías de no enlace 0,32 0,10

GRUPO 1 Ene, Eele

Tm Energías de enlace 0,33 0,11

Ee, Ea, Et y Ei

Ene, Eele

GRUPO 2

Los resultados de la Regresión Múltiple para el Grupo 2 se indican en las tablas 2.2 a 2.7 del Anexo2. Para cada variable dependiente, % Actividad y Estabilidad, se realizó regresión múltiple para tres combinaciones diferentes de las 6 variables independientes correspondientes a las Energías parciales:

Se realizaron combinaciones adicionales, cuyos resultados no son mostrados aquí.

(32)

En la Tabla # 2 se resumen los resultados obtenidos

Ee, Ea, Et y Ei

GRUPO 2 Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

Ene, Eele

GRUPO 3

En las tablas 3.6 a 3.11 del Anexo3, se muestran los resultados de la Regresión Múltiple para diferentes combinaciones de las 6 variables independientes del Grupo 3C. En la Tabla # 3 se resumen los resultados obtenidos.

Los resultados de los Grupos 3A, 3B, 3D y 3E, no son mostrados, pero el resumen de los resultados obtenidos, es indicado en la Tabla # 3. Exactamente, para cada variable dependiente, % Actividad y Estabilidad, se realizó regresión múltiple para tres combinaciones diferentes de las 6 variables independientes correspondientes a las Energías parciales:

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# GRUPO Variable Variables Coeficiente de Coeficiente

Dependiente independientes correlación de

Ee, Ea, Et y Ei

GRUPO 3A Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

GRUPO 3B Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

GRUPO 3C Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

GRUPO 3D Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

Ene, Eele

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Ee, Ea, Et y Ei

GRUPO 3E Ene, Eele

Ee, Ea, Et y Ei

Ene, Eele

RESULTADOS ETAPA III

GRUPO 1

En las tablas 1.8 y 1.9 del Anexo 1 se indican los resultados del PCA obtenidos para el GRUPO 1. En la tabla 1.8 se puede apreciar el % de varianza de la Energía total para cada componente y en la tabla 1.9 se muestran los coeficientes calculados para cada variable independiente de cada componente generado. Para la regresión múltiple se tomaron los tres primeros componentes, para los cuales el

% de varianza es del 91,54%.

Los resultados de la regresión múltiple se indican en la tabla # 4

GRUPO 2

En las tablas 2.9 y 2.10 del Anexo 2 se indican los resultados del PCA obtenidos para el GRUPO 2. En la tabla 2.9 se puede apreciar el % de varianza de la Energía total para cada componente y en la tabla 2.10 se muestran los coeficientes calculados para cada variable independiente de cada componente generado. Para la regresión múltiple se tomaron los cuatro primeros componentes, para los cuales el % de varianza es del 86,23%.

Los resultados de la regresión múltiple se indican en la tabla # 4

(35)

GRUPO 3

En las tablas 3.12 y 3.13 del Anexo 3 se indican los resultados del PCA obtenidos para el GRUPO 3C. En la tabla 3.12 se puede apreciar el % de varianza de la Energía total para cada componente y en la tabla 3.13 se muestran los coeficientes calculados para cada variable independiente de cada componente generado. Para la regresión múltiple se tomaron los cuatro primeros componentes, para los cuales el % de varianza es del 91,86%. Los resultados de los GRUPOS 3A, 3B, 3D y 3E, no son mostrados. Los resultados de la regresión múltiple se indican en la tabla # 4

Tabla # 4. Resumen de los resultados de Regresión Múltiple del PCA

para los GRUPOS 1, 2 y 3C

C1

% Act C2 0.32 0,10

GRUPO 1 C3

C1

Tm C2 0,26 0,07

C3

C1

% Act C₂ 0,40 0,16

C3

GRUPO 2 C4

C1

Tm C2 0,52 0,27

C3

C4

C1

% Act C2 0,67 0,45

C3

GRUPO 3C C4

C1

Tm C2 0,36 0,13

C3

C4

(36)

RESULTADOS ETAPA IV

Los resultados obtenidos para realizar los análisis adicionales se encuentran consignados en el gráfico 4.1 y en la Tabla 4.1 del Anexo 4. En la sección Análisis y Discusión de resultados se hará referencia a ellos.

(37)

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

ETAPA I

GRUPO 1

En el gráfico 1.1 se relaciona la Energía potencial total con el % de Actividad enzimática. Como es posible observar, no existe una correlación clara entre las dos variables. La mayoría de los cálculos de Energía total se agrupan en un rango que va aproximadamente desde -4000 KJ/mol hasta –8000 KJ/mol. Dentro de este rango, se encuentran proteínas cuya actividad enzimática oscila entre 18, 20, 50, 70, 100% e inclusive 110, 140, 280, 320 y 370%.

Obsérvese además que, la Energía total de 7 proteínas mutantes se encuentra fuera de este rango, presentando valores inclusive positivos (desde 12124,622 KJ/mol hasta 30866,670 KJ/mol).

Puesto que la Energía total es el resultado de la suma de las Energías de enlace, ángulos, torsión, impropios, no enlace y electrostática; los gráficos 1.2 al 1.7 permiten encontrar la explicación al comportamiento descrito:

El gráfico 1.2, en el que se relaciona la Energía de enlace con el % de Actividad, indica que el valor de la Energía de enlace de estas 7 mutantes es bastante alto con respecto al valor de las proteínas restantes (desde 19377,795 KJ/mol hasta 36201,524 KJ/mol con respecto a la gran mayoría de proteínas cuya Energía de enlace varía desde 800 KJ/mol hasta 1800 KJ/mol aproximadamente)

La Energía de ángulos, torsión e impropios (gráficos 1.3, 1.4 y 1.5) aportan a la Energía total una cantidad aproximadamente igual a la que aportan la Energía de

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enlace para la mayoría de las proteínas, pero para las 7 cuya Energía de enlace es bastante mayor, el aporte no resulta muy significativo (entre 300 y 2300KJ/mol); por tanto la razón de los altos valores (e inclusive positivos) de Energía total de estas 7 proteínas se debe a la Energía de enlace calculada para ellas.

El cálculo de la Energía de no enlace y de la Energía electrostática, proporciona valores negativos para todos los casos. Los valores oscilan entre –2400 KJ/mol hasta –4200 KJ/mol aproximadamente para la Energía de no enlace, y entre – 5700 KJ/mol y –6400 KJ/mol aproximadamente para la Energía electrostática.

Para las 7 proteínas en cuestión, estos valores son pequeños comparados con los valores de la Energía de enlace, por tanto la Energía total es aún positiva. Para las proteínas restantes, estos valores son inclusive mayores a los que se presentan para la Energía de enlace, ángulos, torsión e impropios;

proporcionando una Energía potencial total negativa.

La pregunta que surge ahora es, ¿cuáles son las mutaciones realizadas en estas 7 proteínas que hacen que su Energía de enlace sea bastante elevada?

La proteína numerada con 1 (139L) es N68C/A93C/WT*, esto es:

N68C/A93C/C54T/C97A.

En 139L se presentan 4 reemplazos con respecto a 3LZM. Dos de ellos, C54T y C97A, eliminan las dos únicas Cisteínas existentes originalmente, sin embargo, estas dos cisteínas, no forman enlace disulfuro. Las otras dos, N68C y A93C, agregan cisteínas, las cuales forman 2 puentes disulfuro intermoleculares entre dos moléculas simétricamente relacionadas. Esto es, C68 de una molécula forma enlace disulfuro con C93 de la otra; y C68 de esta última forma enlace disulfuro con C93 de la primera.

139L al formar puentes disulfuro intermoleculares, puede ser rápidamente cristalizada (HEINZ, 1994), sin embargo, su actividad enzimática es nula.

(39)

Las proteínas numeradas del 2 al 7 (L99F/M102L/V111I/WT* (1L80), L99F/V111I/WT* (1L79), L99F/M102L/F153L/WT* (1L82), M102L/WT* (1L77), V111I (2L78), L99F/M102L/V111I/F153L/WT* (1L81)), contienen mutaciones de Aminoácidos que se encuentran en el núcleo hidrofóbico de la proteína. Fueron construidas mediante mutagénesis dirigida (HURLEY, BAASE, MATTHEUS, 1992) con el objeto de examinar empaquetamientos alternativos del núcleo hidrofóbico.

Las proteínas del 1 al 7 tienen distancias de enlace marcadamente diferentes a las encontradas en 3LZM, por tanto, el valor de Energía de enlace es bastante alto comparado con el obtenido para la lisozima T4 nativa.

Esta afirmación está apoyada por la expresión empleada en el cálculo de Energía de enlace Σ ½ Kb (b – bo)² .

Los reemplazos realizados en estas 7 proteínas no favorecen la actividad enzimática (por debajo todas del 100%), así mismo, la estabilidad de cada molécula, medida en términos de Tm, tampoco es favorecida como es posible apreciar en la tabla 5.1.

Como es posible observar en los gráficos 1.1 a 1.7, no es clara la relación existente entre Energía total y cada una de las Energías parciales, con el % de actividad enzimática. Así mismo, no es clara la relación entre Energía total y cada una de las Energías parciales, con Tm

GRUPO 2

En las representaciones gráficas (no mostradas) que relacionan la Energía potencial total y cada una de las Energías parciales con el % de actividad enzimática y con Tm; no se observa correlación entre las variables; sin embargo, es posible analizar algunos aspectos:

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La Energía de enlace es numéricamente muy pequeña con respecto a la Energía de enlace presentada por las proteínas completas (GRUPO 1). Este resultado es esperado, pues en el GRUPO 2 el número de enlaces para los cuales se realiza el cálculo es mucho menor (por dos razones: el número de aminoácidos es abiertamente menor; y la mayoría de ellos no se encuentran conectados)

El mismo análisis se realiza para Energía de ángulos, Energía de torsión y Energía de impropios.

La Energía de no enlace presenta valores tanto positivos como negativos. Estos resultados son obtenidos del cálculo mediante la expresión Σ ( Aijr^--12 - Bijr^-6 ), en la que el término Bijr^-6 tiene que ver con la Energía de repulsión y es positivo, y el término Aijr^--12 es referente a la Energía de dispersión (atracción) y es negativo.

La Energía electrostática presenta valores positivos únicamente, en contraste con la Energía electrostática calculada para el GRUPO 1 en donde todos los valores fueron negativos. Vale la pena aclarar aquí que valores negativos son atractivos (resultados de la interacción de una carga positiva y una negativa) y valores positivos son repulsivos (resultantes de la interacción de dos cargas bien sea, ambas positivas o ambas negativas).

Los valores positivos para la Energía electrostática obtenidos para el GRUPO 2, se deben a que el programa SPDBv 3.5 utilizado en los cálculos, agrega a cada aminoácido desconectado un Oxígeno y 2 Hidrógenos terminales. De esta manera, se agregan dos átomos de carácter positivo, por uno de carácter negativo.

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GRUPO 3

En las representaciones gráficas (no mostradas) que relacionan la Energía potencial total y cada una de las Energías parciales con el % de actividad enzimática y con Tm; no se observa correlación entre las variables; sin embargo, es posible observar que a medida que los fragmentos son mas pequeños, una mayor cantidad de ellos poseen un valor de Energía electrostática positiva. Esto concuerda con el hecho de que cuando se realizan cálculos de Energía potencial de fragmentos de proteína, mediante SPDBV 3.5, éste agrega en el extremo Amino terminal 2 Hidrógenos y en el Carboxilo terminal, un Oxígeno. Es decir, coloca 2 átomos de carácter positivo por uno de carácter negativo. A medida que los fragmentos se van haciendo mas pequeños, la diferencia en cargas agregadas es cada vez mas notoria, tendiendo a ser la Energía electrostática cada vez mas positiva.

ETAPA II

Los coeficientes de correlación y de determinación calculados para los Grupos de datos 1 y 2, y reportados en las Tablas # 1 y 2, respectivamente, indican una asociación pobre entre las variables analizadas. Sin embargo es posible apreciar que los coeficientes de correlación múltiple (r) y de determinación (r²), para la regresión entre todas las energías parciales y el % de actividad enzimática de el Grupo de datos 2 (0,42 y 0,18 respectivamente); son ligeramente mayores a los encontrados para el Grupo 1 (0,35 y 0,12 respectivamente). De la misma forma, los coeficientes de correlación múltiple (r) y de determinación (r²), para la regresión entre todas las energías parciales y Tm de el Grupo de datos 2 (0,53 y

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0,28 respectivamente); es mayor al encontrado para el Grupo 1 (0,39 y 0,15). Esto sugiere que los análisis en los cuales se tiene en cuenta fragmentos de proteínas en lugar de proteínas enteras, proporcionan una mejor indicación de la relación entre las variables, probablemente debido a que gran parte de la proteína enmascararía los efectos resultantes de la(s) mutación(es) que tendrían que ver con la variación en actividad y estabilidad enzimática.

Según estos resultados se puede concluir que para proteínas completas, el 12%

de la variación en el porcentaje de la actividad enzimática es explicada por la variación en las energías potenciales parciales; y el 15% de la variación en la estabilidad de la proteína (medida como Tm) es explicada por la variación en las energías potenciales parciales. De igual forma, para fragmentos de proteínas compuestos por la región del sitio activo y el(los) aminoácido(s) reemplazados, el 18% de la variación en el porcentaje de la actividad enzimática es explicada por la variación en las energías potenciales parciales; y el 28% de la variación en la estabilidad de la proteína (medida como Tm) es explicada por la variación en las energías potenciales parciales.

Para los Grupos de datos 3A, 3B, 3C, 3D y 3E, los cuales están conformados por fragmentos de aquellas proteínas en las que se ha cambiado un único aminoácido; los coeficientes de correlación (r) y de determinación (r²) alcanzan un valor máximo de 0,69 y 0,47 respectivamente, (ver tabla #3), para el análisis del grupo 3C que involucra todas las energías parciales como variables independientes y el % de Actividad enzimática, como variable dependiente. Los resultados obtenidos sugieren que el 47% de la variación en la Actividad enzimática de mutantes de T4L en las cuales se ha reemplazado un único aminoácido, es explicada por la ecuación:

%Act = 0,06Ee + 0,08Ea + 1,07Et + 0,63Ei – 0,37Ene + 0,09Eele – 223,93

Donde los valores de los coeficientes de cada una de las variables independientes y del intercepto se encuentran en la tabla 3.6 del Anexo 3.