BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA

BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

AL LABORATORIO DE AL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA MICROBIOLOGIA

Dr. Diego Faccone

Servicio Antimicrobianos Departamento Bacteriología

Instituto Nacional de Enfermedades infecciosas

ANLIS – “Dr. Carlos G. Malbrán”

CONTENIDOS CONTENIDOS

I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS

II. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA III. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

IV. METODOLOGÍAS MOLECULARES V. TIPIFICACIÓN MOLECULAR

VI. EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR

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SEMINARIOS SEMINARIOS

1- INTEGRACIÓN BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA MICROBIANA

2- BIOINFORMÁTICA  ADN

3- BIOINFORMÁTICA  PROTEÍNAS 4- INTEGRADOR CURSADA

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Bibliografía Bibliografía

- Lewin B., “Genes”

- Alberts B., “Biología Molecular de la Célula”

BIOLOGÍA MOLECULAR

BIOLOGÍA MOLECULAR

ADN ARN Proteína

Replicación

Transcripción Traducción

Transcripción inversa

Replicación

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR DOGMA CENTRAL DE LA

BIOLOGIA MOLECULAR

Francis

Francis CrickCrick (1958/1970)(1958/1970)

ESTRUCTURA DEL ADN

1

Desoxiadenosina (adenina)

nucleósido

Nucleótido

N

HC N N

C N

CH NH₂

OH

P P P O

Desoxiribonucleotido = ADN

BASE

O

H H H H

OH H

CH₂

1´

3´ 2´

4´

O 5´

P O OH HO

BASE

O

H H OH H

OH H

CH₂

1´

3´ 2´

4´

O 5´

P O OH HO

Ribonucleotido = ARN

Mono- Di-

Tri-

ADENINA - ATP

- ADP - AMP

N HC

N N C N

CH NH₂

OH

P P P O

GUANINA - ATP

- ADP - AMP

N

C N

N C N

CH O

H₂N H

OH

P P P O

TIMINA - TTP - TDP - TMP

N C

N

CH₃ C

CH O

H

C O

OH

P P P O

(H, uracilo  ARN)

CITOSINA - CTP

- CDP - CMP

N C

N C

CH NH₂

CH O

OH

P P P O

DESOXINUCLEOTIDOS (dNTP´s)

H C 2

A

P

H C 2

G

P

H C 2

T O

P OH

H C 2

C

P P P

P O

-O O

O

Grupo fosfato

3’

5’

2C O

G

P

H₂C O

A

P

H₂C O

C

P

2’: d

esoxi

OH

H₂C O

T

P P P

J. D. WATSON and F. H. C. CRICK ... 2 de abril de 1953, Molecular Structure of Nucleic Acids.

A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid.

Nature 171: 737.

BIOSINTESIS DE ADN

2

P O P O

P O P O P

OH O

P _O

P P

OH

5’ 3’

ADN (OH)

+ desoxinucleótido trifosfato (dNTP) ADN (OH)

+ PPi

Replicación semiconservativa

Original Nueva Nueva Original

REPLICACIÓN DEL ADN

3

Organismo Bacteria Levaduras Insectos Raton Plantas

No. repl.

1 500 3.500 25.000 35.000

Longitud 4.200 kb 40 kb 40 kb 150 kb 300 kb

Velocidad 50.000 pb/min 3.600 pb/min 2.600 pb/min 2.200 pb/min

Origen de replicación (región rica en A-T):

único (bacterias), oriC múltiple (eucariontes)

REPLICON:

fragm. de ADN en el cual sucede un evento individual de replicación;

posee los elementos

necesarios para el control replicativo.

5’

3’

5’

3’

Horquilla de replicacion

* ADN replicasa: DNApol III, síntesis (sub. , polC, dnaE).

* Primasa (ARNpol; dnaG), fragm. ARN 10 pb : 3’

5’

Cadena

“lagging”

Cadena “leading”



ENZIMAS:

* Helicasa + prot. SSB, desenrolla ADN doble cadena:

 

* DNApol I: actividad exonucleasas 3’ 5’ “proof reading” + 5’ 3’.

* ADN ligasas:

REPLICACIÓN DEL ADN

3

TRANSCRIPCIÓN

4

ARN Ribosomal ARN Mensajero ARN Transferencia

ADN ^RNApol Proteína

 rpoA: ensamblado enz., reconocimiento del Pr, activadores



’

rpoB rpoC

catálisis

 rpoD: especificidad del Promotor

Promotor ARN

INICIACIÓN

5’

3’

Codificante

Templado 5’

+1: Inicio ARN

17 bp 7 bp TTGACA TATAAT

upstream downstream

- 35 - 10

TRANSCRIPCIÓN

4

REGIÓN PROMOTORA

B Rho-dependiente 5’

-UUU

A Ter. Intrínsecos

5’

hairpin loop

stem

G-C

UUUUUU

50-90 pb;

C, G

+

Rho

TRANSCRIPCIÓN

4

REGIÓN TERMINADORA

ARN

TERMINACIÓN

Protección:

5’-CAP + 3’-poliA

Sin protección BACTERIAS

EUCARIONTES

Transcripción +

Traducción +

Degradación

Transcripción

Vida ½ 2 min.

Vida ½ 4-24 hs.

Procesamiento post-transcripción

“splicing”:

ARNm maduro Sin

procesamiento posterior

TRANSCRIPCIÓN

4

UNIDAD TRANSCRIPCIONAL

PROMOTOR “REGIÓN CONTENIENDO: GEN - GENES” ´TERMINADOR

ADN 5’

A T A G A T C C C T T C

ARNm

A U A G A U C C C U U C

ARNt ARNt ARNt ARNt

PROT. ^NH2

Ile - I Asp - D Pro - P Phe - F

COOH

Aminoacil-ARNt

5’

3’OH CC A AAG

Phe

Anticodón

TRADUCCIÓN: CÓDIGO GENÉTICO

5

RIBOSOMA

DEGENERACION 4 nucleótidos 4

=64 codones

C-G-A-T

20 aminoácidos

UAA

UAG Stop ^UGA

Trp

UGU UGC

Cys

UUC

Phe

UUG Leu CAU

CAC

His

CAG

Gln

AAU

AAC

Asn

AAG

Lys

GAC

Asp

GAG

Glu

AGU

AGC Ser AGA

AGG Arg UAU

UAC

Tyr

AUG

Met

Ile

CUU CUC CUA CUG Leu

UCU UCC UCA UCG Ser

ACU ACC ACA ACG

Thr

CGU CGC CGA CGG Arg GUU

GUC GUA GUG

Val

CCU CCC CCA CCG

Pro

GCU GCC GCA GCG

Ala

GGU GGC GGA GGG

Gly

TRADUCCIÓN: CÓDIGO GENÉTICO

5

Región

codificante RIBOSOMA

50S

30S

21 proteínas diferentes

70S

66% ARNr

5’

+1

AAACAGGAGG ^{(10 nuc)} AUG^UCGAAGCAA 30 nucleótidos

GUGUUG

Iniciación AUG Shine-Dalgarno

(RBS) AGGAGG TRADUCCIÓN

6

UUU 3’

AAA - - C AAUUGGUAGUGGAGGAAU 5’

UUUUUA - - -

GUCCCA GUC GAU GCG UGAUGA

UAAUAA UAGUAG

AUGAUG UUU AAA UAC

Sitio P Sitio A

Canal de salida

Transpeptidación

3’

UGGUAGUGGAGGAAU

5’

UUU UUA GUCCCA

GUC GAU

GCG UGAUGA UAAUAA UAGUAG

AAA - - C AAU - - -

AUG UUU

UAC AAA

AAU

UUU

NH₂

AAA GGU

CAG CAG

UAC UUU AAA

CUA

3’

AAA - - C AAUUGGUAG UGGAGGAAU

5’

UUU - - -

GUCCCA GUC GAU GCG UGAUGA

UAAUAA UAGUAG

AUG UUA UUU

AAU

NH₂

3’

UGA

5

UGA UAAUAA

UAGUAG CGC

UAC UU

U U AA

AAA GGU

CAG CAG

CUA

AAA

NH₂ COOH

Plegamiento

CGC

3’

AAA - - C AAUUGGUAG UGGAGGAAU

5

UUUUUA - - - GUCCCA

GUC GAU UGAUGA

UAAUAA UAGUAG

AUG GCG UUU

UU U U AA

AAA GGU

CAG CUA CAG

AAA

NH₂ COOH

5’- UCC AUG CAA CAU GGA UGC GAU ….

MARCO ABIERTO DE LECTURA = ORF

7

5’- UC CAU GCA ACA UGG AUG CGA U ….

5’- U CCA UGC AAC AUG GAU GCG AU ….

5’- UCCAUGCAACAUGGAUGCGAU….

5’-

UCCAUGCAACAUGGAUGCGAUGUCGAAGUAUUGACUAA...

MLA (ORF)

1º AUG

2º 3º

AUG ^AUG UGA L

UAA L

AUG AUG UGA

AUG

ARNm es policistrónico

RBS

Genes

Promotor

ORF´S

7

Varios genes bajo el comando de un solo Pr

Genes regulatorios

+

OPERON

Gen regulatorio

Operador

Pr Pr

Regulador (represor)

LacI (-)

LacZ lacZ

LacY lacY

LacA lacA Pr

+

ARNm

NH₂ COOH

Estructura primaria Estructura secundaria

Estructura terciaria

NH₂ COOH

Estructura cuaternaria

NH₂ COOH

NH

2

OH CO NH

2

CO OH

HN²

OC HO

Aminoácido

R – C – COOH NH₂

Enlace peptídico

H O COOH R – C – C – NH – C – R

NH2 H

GENETICA MICROBIANA

GENETICA MICROBIANA

MUTACIONES

8

ADN

A T A G A T C C C T T C

PUNTUALES:

PUNTUALES:

ADN

A T A G A T G C C T T C

Replicaci Replicaci ó ó n n

ADN

A T A G A T C C C T T C

REARREGLOS:

REARREGLOS:

inserci inserció ón n

A T A G A

T C C C T T C

deleci

deleci ó ó n n

PUNTUALES:

PUNTUALES:

Transición

:

Purina (A) Purina (G) Pirimidina (C) Pirimidina (T)

Transversión

:

Purina (A, G) Pirimidina (T, C)

Espontáneas Inducidas por agentes mutagénicos

URACILO N

C N C

CH O

H

CH O

CITOSINA N

C N C

CH NH₂

CH O

ác. nitroso

Ejemplo:

mutación

inducida C ≡ G ác. nitroso T = A G ≡ C A = T ác. nitroso

MUTACIONES

8

10^-7 / 10^-11 por base 10^-6 por gen

Físicos

Químicos

 Modificación qca.

 Agentes alquilantes

 Agentes intercalantes

Biológicos

elementos genéticos Sitio dirigida  Ingenieria genética

codón AAC Asparagina

codón UAG Stop

codón UAU Tirosina

codón UAC Tirosina

TRANSCRIPCION

ARN

TRADUCCION Mutación

MISSENSE

Mutación NONSENSE

Mutación

SILENCIOSA WILD TYPE

PROTEINA

5’…T A C…

…A T G…5’

M U T A C I O N E S

REPLICACION NORMAL

A

A C

T

T G T A C

A T G T A G

A T C T A T A T A

PUNTUALES:

PUNTUALES:

MUTACIONES

8

Alelos

MUTACIONES

8

REARREGLOS:

REARREGLOS: Inserció Inserci ó n de ADN exó n de ADN ex ógeno geno

ORF

INSERTO

Interrupción ORF:

- Proteína quimera: ¿funcionalidad?

- Proteína trunca

Interrupción promotor:

- Modificación nivel de expresión:

¿expresión?

- Expresión de proteína del inserto

MUTACIONES

8 REARREGLOS: REARREGLOS: Deleció Deleci ó n de ADN n de ADN

ORF

ELEMENTO MOVIL

Eliminación ORF:

- Perdida de funcionalidad

ORF

ELEMENTO MOVIL

Escisión

Duplicación ORF

GENOTIPO: información genética de un organismo

FENOTIPO: características o propiedades observables de un organismo, resultantes de su genotipo.

Genotipo relevante: diferencias con el organismo “wild-type”

rpsL lacZ hisC1

recA

Str^R: resistente a streptomicina LacZ^-: no fermenta galactosa HisC^-: no sintetiza histidina

RecA^-: incapaz de recombinar

MUTACION: cambio heredable en la secuencia de bases del genoma de un organismo.

MUTANTE: organismo cuyo genoma posee una mutación.

GENOTIPO Y FENOTIPO

9

REVERSIONES

10

Cepa salvaje o wild type

Mutante por sustitución Mutación

puntual

Revertante verdadera

Mutación puntual en el mismo sitio

Revertante 2º sitio

supresora

Mutante por

deleción

Deleción

Mutante por inserción

Inserción _Deleción

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: TRANSFORMACIÓN

11

Recombinante (gen en mosaico)

RecA

Alelo R (exógeno) Alelo S

(bacteriano) ADN

“desnudo”

Cepa

COMPETENTE

“Uptake”

de ADN

Cepa

TRANSFORMANTE Recombinación

Homologa

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: TRANSFORMACIÓN

11

Natural

Bacillus,

Streptococcus Haemophilus Neisseria

Inducida

Peterson MM 51.1051-70 (2004)

Estado de competencia  15-20 min

Morrison RM 151:445-451 (2000)

Membrana celular

CSP

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO:

TRANSDUCCIÓN

12

Receptor

Genoma viral

Cola

Cápside

Inyección

Ciclo lítico Bacteriófagos:

Multiplicación Lisis bacteriana

Integración

Duplicación bacteriana

Inducción

Ciclo lisogénico

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO:

TRANSDUCCIÓN

12

cl

O_L/P_L O_R/P_R

Regulación ciclos lítico y lisogénico del fago

Lambda

Head Tail Recomb Replic Lys

P_R´

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: TRANSDUCCIÓN

12

Bacteriófagos

Fago λ

• dsADN

• Ciclos lítico y lisogénico

• 48,5 Kb

• E. coli

Fago T4

• dsADN

• Ciclo lítico

• 165 Kb

• E. coli

•Presencia de genes esenciales y no esenciales

Fago M13 ^{• ssADN}

• Ciclo lítico

• 6,4 Kb

• E. coli

• Requiere pili F para infección

Transducción

• Transducción generalizada: ADN bacteriano es empaquetado en el fago

 una proporción de ADN bacteriano es inyectado en una nueva célula

infectada  recombinación homologa.

(10⁵-10⁸/cel; límite empaquetado)

• Transducción especializada: La

escisión imprecisa del profago hace que el genoma viral contenga ADN

bacteriano (perdida de genes virales)  fago defectivo?

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: CONJUGACIÓN

13

Cepa DADORA Cepa ACEPTORA Receptor

Plásmidos

• extra-cromosomómico

• autoreplicativo (replicasa)

• heredable MOB

MPF

Genes relacionados con la movilidad = MOB o Dtr (DNA-transfer replication)

Genes relacionados con la conjugación/apareamiento = MPF (mating pair formation)

ss-ADN

Cepa DADORA Cepa TRANSCONJUGANTE Rep Replicasa

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: CONJUGACIÓN

13

MOB MPF

oriT relaxasa T4CP T4SS

Movilizable

Conjugativo

T4SS

MOB

MPF

MOB

- oriT = Origen de transferencia - Relaxasa = Reconoce oriT en cis

T4CP = Proteína de acoplamiento tipo IV

- T4SS = Sistema de secreción tipo IV

No movilizable (sin modulo MOB o

MOB funcional)

No movilizable Movilización de plásmidos

T4CP

MOB

MPF

 oriT + Relaxasa

ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: CONJUGACIÓN

13

Plásmidos Características

- Extracromosómico: autoreplicativo y heredable - Tamaño variable: 2-300 Kb

- Numero de copias variable: 1-200 copias/célula (bajo-medio-alto) (xej. ColE1 ⋍20 copias)

- Rango de hospedador: amplio o acotado - Incompatibilidad: más de 20 grupos de INC

- Distintas funciones: rutas metabólicas, factores de virulencia, genes de resistencia

- Baja frecuencia de perdida de plásmido (<10

cél) - Sistemas veneno/antídoto (plásmidos R1)

- Plásmidos movilizables < plásmidos conjugativos

(genes MPF)