Aplicaciones de la biotecnología en gramíneas forrajeras

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(1)APLICACIOI{ES DE III BIOTECNOI,OGIAEN GRAI{INEASFORR.IIERAS'+. Rodrigo Artunduaga S. H. r.. INTRODUCCION. En la ú1tina década, se han desarrollado una gran variedad de nuevas parg la nodificación netodologías, genética de célu1as vegetales, aspectos que ofrecen muchas posibilidades, en términos de avance, en la investigación de las ciencias biol.ógicas, y en la utilización de estos nuevos conoclDientos para el Eejoramiento de los cultivos. k pllnera de estas áreas está reLacionada con el aislaniento, nanipulación y subsecuente creci¡¡iento de células vegetales conpletas y de aquellas deaprovistas de su pared cel,ular: protoplastos. El segundo caropo, ADN reconbinante detallada de genes individualee.. (rADN), pernite. la. manipulación. Estas dos áreas de investigación se han asociado con e1 concepto de biotecnoLogía y son potencialnente aplícables a una arnplia varieáad de especies vegetales. Tanbién ofrecen la posibilidad de manipular materíal genético que de otra forna podría ser inposible La técníca de ADN recombinante en particular, ha contribuíclo mucho en Ia comprensión de Ios necanismos básicos ile 1as plantas a nivel rnolecular; además, en nanos de los fitomeJoradores, genetistas, fisió1ogos, bÍoquínj.cos, pató1ogos y biólogos moleculares, éstas técnicas pueden ayudar a Ia identificación y nanipulación eventual de genes individuales y múltip1es que controlan funciones inportantes e;1a planta. Así nismo, se esuá estudiando e1 desarrollo y construcci.ón de agentes vectores para la transferencia de genes entre plantas, de plantas a microorganisnoa y viceversa. La régeneración de plantas, a partir . de céIulas indlviduales, es uno de los requisitos indispensabJ.es para eI éxito de 1os experinentos que tienen que ver con nodificación genética. Este aspecto está siendo rutinariaüent efectuado en ¡nuchas especies, pero con el objeto de aprovechar al máxino l-os beneficios de Ia biotecnología. Estos- resultados deben extenderse a las principales especies vegetales cultivad.as por el horobre para su a1i-mentación. EJ. principal problena a superar *. Contribución Programa de Genética Vegetal. Agropecuario, fCA.. Instiruto. Colombiano. x* Ph,D. Coordinador Nacional del Programa de Genética Vegeta1. ICA. A.A. 151123 E1 Dorado, Bogotá.. 73.

(2) natural de 1as graníneas, leguminosas de grano y para ser regenerados in vitro, a Partír de cé1ulas. es la dificultad pastos forrajeros individuales. II.. DE PLANTASIN VIIRO REGENERACION. Muchos factores afectan el éxito de regenerar plantas in vitro: tanadel explante ' luz, temperaÉura, orientaño, tipo y edad fisiológÍca medio, ffecuencia del subcultivo, época del e1 ción dél explante en año en la cual se toma e1 expJ-ante, acumulación y tipo de gas presente in vitto y vigor de 1a donde se hace el cultivo en e1 recipiente planta donante, entre otros. Estos factores deben tenerse en cuenta, pero quizás las tree variables principales a considerar, cuando se inicia el estudio de una especie vegetal específica, son : (Fi8. 1). - Genotipo. E1 genotipo de 1a Planta eecogido para micropropagación, Algunos se propagan fáclJ-Ia respuesta ín vitro. puede iniluenciar definitivanente ' no se propagan in vi.tro. nente, nientraa otros, de1 genotipo han sido reportados en 4gq@!gg Efectos especlficos andraeanum (Pierlk et aL' 1974); solanente una tercera parte d-e A' Dentro de ésta, estudiada, fué capaz de formar callo. a"dr"..rrt, Enicatnente el 572 forn6 calJ.o y subsecuentemente produjo plantas. Tanbién se encontraron diferencias en 1a inducción de ca1lo a partir de 9erg&igg sp, (Abo de anteras en varios cultivares de1 cultivo qne pTodu.io c-alio varió porcentaje de anieras El a1 1976). Ni1 et EL de IO a 627.. de Hussey (Zib et al, 1970) observó que 1a respuesta norfológica fragnentos de tal1o de Gladiolus sp. variaba con eI cultivar ut.ilizado. En Narcissus sp. (Seabrook Cummings, 1978), se observó variación Las diferencias se Presenclonal en re.spuesta al cultivo in vitro. en la propagación de taron en tiempo de supervivencia del cultivo, tallos que sobrevivían al ser transplantados aI suelo y en Ia respuesEn algunos casos, 1as a la intensidad de la luz. ta norfólógica pueden refLeiar genotipos, diferentes entre en respuesta, diferencias para Ia horroonales u nutriclonales requerimieñtos en diferencias y de los órganos desarrollo y creciniento subsiguiente diferenciación una de constitutivos Planta. factor a tener en cuenta Por los anteriores aspectos, el principal especie determinada, es el conouna en al- inicj-ar una investigación, de 1a número de cultivares nayor del cer 1as posibles resPuestas vitro' in ser cultivados esoecie estudiada, a.

(3) a.. Genotipo;. b.. clase de Explantet Medio Nutritivo. c. Co¡nponentes de1. ,.. F:¡ctorcsa Considerar. ,, I . Genotipr 2. Ti¡m de Eyhne -1.llqlio Nm'ii¡'t¡. Figura. 1.. Factores a considerar. en regeneración de plántas. in vj-uro.. b. Explante.Un explante es un pedazo de tejido u órgano reaovído Cono regla de la planta, con el propósito de ser cultivado Ín vitro. general, los explantes Euy pequeños tienen una baja tasa de sobrevivencia en cultivo. Se han utilizado nuchas clases de explantea: cotiledones ' hiPocotilos ' tallo, raíces, pétalos, sépa1os, -tejido Provehojas, yena terntnal, niente dei óvuio, enbriones e inflorescencias maduras. Para una especie en particular, deterninado tipo de planta responde oejor -a1 cultivo. Paia el caso de gra:níneas forrajeras es aceptado que inflorescencl-as innaduras con c¿lulas activas mitóticamente, son el meior tiPo dB explante. - Conponentes del nedio nutritivo, Esta es la variable nás importante. En general el nedio nutritivo se conpone d e : Macronutrientes : N, P, K, Ca, Mg' Fe. Micronutrientes : Mn, Cu, Zn, B, Na' Cl, I , S , M o , C o ' A 1 ' N l .. t).

(4) es Sucrosa. Fr¡ente de carbono y energía, La sustancia preferida Glucosa y Fructuosa, pueden ser sustituídos en algunos casos, Pero otro tipo de azúcares son una fuente pobre en carbohidratos. Vitaninas: piridoxina, tiamina ' entre oLros. ácido nicotínico, Cuando los requerimientos nutricionales para una especie defernínada no se han precisado, se agregan vitaüinas, como medida de precaución. los aminoácidoÉ Aminoácidos. Dadas las materias primas esenciales, por usados en 1a sínLesis de proteína, deberian ser sintetizados plantas verdes. Algunas veces, cuando los requerimientos nutricioalgunas nales no son conocidos, son agregadas al nedio nutritivo mezclas de aminoácidos. -. Agar,. Es opcional. -. Agua.. Debe ser desmineralizada. -. Repuladores rJc r-rr.imiento.. Con el descubrirniento del papel inderaíces pendiente de auxinas y cítocininas en la formación de tallos, que uno de los rnecanísy cat1o, Skoog y Mi11er (1957) establecíeron mos básícos regulatorios es eI balance entre 1os niveles de estos Trabajando con tabaco encontraron dos grupos en el medio nutritÍvo. favoreque un porcentaje alto de auxina, en relacíón con citocinj'na es beneficic¡sa contraria la relación ce 1a forrnación ¿e raíces; para 1a formación ale tallos y un radio intermedio pronueve la fornación de ca1lo. varían considerablernente Los niveles para morfogénesis requeridos entre genotipos, por 1o que niveles apropiados deben ser deterninapues aún diferentes dos paia cada especie o variedad en estudío, en pueden variar p l a n t a , n í s m a 1 a tipo; d e de explantá, dentro u s a d as a u x i n a s . F á s L a s y sus requerimíentos de auxinas citocininas. ( I B A ) ; á c i d o ( t l Á ) ; á c i ¿ o i n d o l b u t í r i c o son: ácldo indoloacético . t r i c l o r o f e n o x i a c é t i á c i d o 2,4 diclorofenoxiacético Q,4'D;) ; 2.5.5.; (CPA). Las citocininas' co (2.4'5'T) y ácido clorofenoxíacético Purina (BA), Bencilanino res coir¡mente uladas son 6-benciladenina (BAP).. III. Ia regeneración -. in v i t r o. IN VITRO REGENERACION puede cumPlirse. en tres. 'Fornración de órganos Organogénesis Directa. de la planla o explante produce tal1os cuando Cuando 1as hojas se prómotor de los mismos. En este caso' a un rnedio inductor de raíces'. TO. vías díferentes: en la cual una Parte en medio es cultivada fornan se transfíeren son usaCas dos clases.

(5) de medios nutrÍtivos diferenEesI uno pronotor de hojas y otro de ralces. Este método es aoplianente utilizado etr la prJpagatión comercial de plantas hortícol-as y algunas especies ¿e trutales. I-as plantas obtenidas por este método son genéralmente idénticas a 1a donante y 1a incidencia de pLantas anorrales es bastante baia Duesto oue 1as células participante¡ en la formación de yemas axilar-es i"tán pió*ir"t aL Eeriste¡Do apical y fornan parte de1 té.iido neristenático, no están diferenciadas y son citológicanente estable;, (Figura 2). - organogénesis Indirecta a través de1 callo. En este caso, los órganoa se constituyen después de la fornación de ca1lo. l¿e céIulas de1 expl-ante d son inducidas a dividirse y forroar una larga naaa de células no organizadas, denoninadas callo. Después de rianipularse e1 nedio nutritivo se fornan los tallos Para fornar de v raíc¿s. nuevo utra planta, son requeridas, al nenis tres diferentes clases de nedio nutritivo. las pJ-antas regeneradae por esta vla nuestran varlabilidad genética y nuchas son chi-neras, clebido a su orlgen nuJ-ticeluLar. (Figura 3). - Enbriogénesis Somática. En este caso, 1as plantas puetlen ser producidas en un solo paso. En esta vla se forna ta11o conteniendo estructuras bipolares, adventicias (embriones no provenientes de fertilización) ca11o que, conteniendo estos embriones sonático9, es llamado E. CALIO, Ultimamente se ha desarroll-ado un gran interés por estudiar los factoes que incrementan la formación de E. CALIO, pórque ofrece muchasventajas coÍlo: - Ahorro considerable de material y nano de obra, pues un sólo paso produce plantaa' coup1etas.. Exptonte in¡clol. Figura 2.. I,. Esquena para organogénesÍs directa.. 77.

(6) r Exploñte ¡nlcial Ptóntulo coflplero Colto ?,. Figura. 3.. Esquena de organogénesis. - Se pueden produeir. a través. grandes cantidades. de callo'. de plantas-. -. se puede rnantener por nuch.o tie139, La competencia enbriogénica por la.rgos Periodos' san pero].oa 10 que permite sostener el cultivo apreciable en el porcentaje de regeneración'. -. 1as de 1as plantas regeneradas por esta,vía El orígen unicelular para- el aíslamiento genético, para e1 hace más propicias "n?li"is para producir investigación de fuente poslble y .oto de protoplásto= sustancías antiSer'¡inadoras agt.g"rles o senl11as ar-"ificia1es, -que ".a, rnanejarlos co¡to cualpermita ineñe y recubrirlos con mat;ria1 quier semilla.. inicíales fueron conducidos trabajos ín vitro, En zanahoria cultivatla se demoscual el en período 1958), en enbriogénesis somáticá-( SGird, de em1a iniciación para é= críticá tró que l"a presencia ¿u los emde "u"i.t." germinación 1a agi'1íza su cantid.d briones y ai disninuír briones somáticos (Fígura 4).. 78.

(7) VÍas rlc lbgcnclucirirr tn Vitro (4) 4.. q. Enhiox<t¡csi¡ St¡t¡¡ititz¡. Erd-r. ¡¡¡.t¡. I. {V}. ffil. 2.44. ). ,ltrJ. Para el caso de enbriogéúesis en zanahoria, que. es- e} sis: n?-T:1:1:: el explante es cultivaáo en nedio (l'tS) con 2.4'-D para la lnducclon de callo, Su formación se obtiene en tree o cuatro se[laflas' al cual Cultivos en suspensión pueden mantenerae en Eedio nutritivo gin nedio a el cultivo at*"fi".e no se le agrega ag8r ¡ cuando y eI posterior desarrollo 2.4.-D ee índuce 1a fornación ü"a "tutron"" de éetos en plantas. Sln enbargo, referente a especies monocotiledóneas v especlficaFente ls vla envitro es bastante dlf ícif. eri pastosl 1a regeneración in -dificil. briógénesis somática es aún ñá-s. En eI caso ale pastos, la regeneración tle plantas "erdes -y.-sall::?1::. ffiiMt"-r"*,"-*.#;#"ffi.*J""'ffi (Artunduaga, 1988).. il.. M0LECUI"AR BIOITOGLII. El desarrollo de una planta requ: de los cuales depende cle 1a exPrel tructura y función de las céIulas el- producto final de la expresión.

(8) I. por 10s factores 1a expresión de 1os genes puede esLar modificada c o m o : c a l i d a d y ambientales de nutriencantidad de luz, disponibilidad p a t ó g e n o s , o r g a n i s m o s tes, etc. Esta situación se conpllca un poco por que e1 hecho de más la célula veget.al no tiene uno sino tres genoq u e i-nteractúan, convirtiéndo1a, desde el punto de vista genético' mios m á s compleja de todas 1as células (Figura 5). en le Adenás del genomio de1 núcleo, un sistena genético completo está localizado en el cloroplasto y en Ia mitocondria, sin embargo, no todos estos organelos sintetizan pues e1 genomio sus propias proteínas, nuclear juega un papel- importante de liderazgo en este aspecto (Chilton 1983). El mecanj-smo por el cual e1 gene se expresa está conenzando a ser pero eI entender cóno se regulan los genes está bien caracterizado, pobremente entendido. Las interacciones los tres genomios y entre el anbiente para el crecimiento y desarrollo de una planta son aún incomprendidos (Chombon, 1981) . Clonaje de Genes Vegetales. El clonaje de genes puede ser definido de como e1 aislamiento y amplificación de una secuencia individual un gene, mediante inserción de esta secuencia dentro de una bacteria donde pueda ser replicada. Existen muchos métodos para clonaje, pero general es aislar el principio la secuencia genética de los nillones de secuencias presentes en e1 organismo y replicarlo muchísinas veces en un hospedero (usualmente un plásmido bacterial). ADN Reconbinante. La aplicación de 1as técnícas de ADll reconbinante está teniendo un tremendo imDacto en el énfasj-s que las industrias químicas y farnacéuticas están dando a 1a biotecnoiogía. QuÍzás uno de los aspectos nás importantes en estas técnicas es el descubriniento de un grupo de enzimas bacteriales experimental que se conocen cono Endonucleasas de restricción. el papel principal En Ia naturaleza, de estas enzinas es defender la bacteria bien sea de ADN invasor, de un phago o de otro típo de bactería. En 1953 se descubrió que sí e1 ADN de un tipo de Escherichia en otro EÍpo es introducido coli el ADN forándó-EJ-EáElnucleasas de E. coli, d-espedazado por ciertas qu. estTñ-"tt la célu1a recipíente, pero solamente hasta 1960 las endonucleasas de restricción (Figura 6). fueron identificadas meMoléculas de ADN reco¡nbinante pueden ser creadas artificialnente o (pLásurido diante inserci6n de genes foráneos en ADN de un vector enzima virus); como Las dos cadenas de ADN son tratadas con Ia misma e¡ sus de ADN son comPlenentarios ¡r si se les coloca en las condrcrolntos pueden ser ligados Permanentet' Los híbridos así Producidos son insertados nediante ínfección hosped-era y así _se cle otra bacteria (clonaje), pueden replicar ésto pernite obtener cantidades sustanciares del gene foráneo en mención.. 80.

(9) Oxigeno. F,eguladore6 del Crec¡m¡enlo. Secreción. I. Nutrientes. Figura -. Gen6mi< 5.- Interacción túan entre sf ' dur¿ de Ia célula, hasti Parte de un tej id( Lres Genomios está c o n d i c í o n e s P r e v aI r. 8t.

(10) /¡UI\,1 l{¡.cofilulN^l{ | ri. Al)N plnsrrridol¡ncle¡i¡|.. < -. i ncor¡rorncirirr rlcl Al)N (le la plarrlo c l o r t n n l ce n e l l ) N A r l c l ¡ r h s r t t i t f t r ¡rnrnfornrlr ¡rhslrir.loAl)N r e c o n l h i ¡ r alrer.. ^l)N rlc la phnla don¡nle.. ?. Insetckir¡rlel l)NA clclpl:rsrniclo tccorr¡bir¡nrr lc crr<.1¡rroto¡rlaslo rlc In phrrln,. l)iccslirin etrzirrrllic:ttlc. parn la irarerlcetrrtar. ohle]ler prrlloltlnsl.ts.. w {. Selecciílncrrirla<los:r ¡rara i r l e rl i [ i c a ¡ l a s c é h ¡ h s I rnrrs[ornrndts.. Ik'gerrcra<'irirr (le l)lflnlíts rlc los protr)lllaslos lrntts[orrrrl<l<ls,. ADN. Recombinante.. 82.

(11) Ahora se está investigando en Ia adaptación de las técnicas de ADN reconbinante para ser utillzadas en células vegetáles cono reciPlentes; uno de los principales problemas en este aspecto es que los genes para 1as nás importantes caracLeríst j-cas vegetales no han sÍdo ldentificados. Hasta 1980 muy pocos genea vegetales habían sido clonados' pero posterior a este año, e1 nú¡nero aunentó bastante. las proteínas de almacenaje de las senlllas han sido uno de los ¡Dayoresgrupos para investiSación, 1as cuales son sidtetizadas rápidaEente en un período nuy corto' durante eI deearrollo de la senilla. Su expresión es expecífica del teJido y correeponde a un tienpo deterEinado; su slntesis está correlacionada con nivel,es superioreJ al 502 del ARNn de las células. francés Se ha realizado clonaje en *ir, cebada, soya, arveja y frl¡ol y se ha denostrado que e1 gene que codifica phaseolin en french beans fué e1 priner gene vegetal én el-cual 1a presencia de secuencías (tripletas) específicas actúan cono puntos de coníenzo y puntos de interrupción para J-a sítnesia de ARNn (Sun et al, 1981). Algunas de las aplicaciones. del clonaje de genes podrían ser:. a.. El aislamiento de d.eterEinados genes de una planta, su nodlficación y posterior incorporación dentro de 1a nisna planta.. b.. E1 uso de genes vegetales en organismos unicelulares ración de productos vegetales valiosos.. para Ia elabo-. Genetistas vegetales han enfocado su atención en un plásnido bacterial llamado T, el cual se encuentra en Aprobacteriun tunefacieqs.- Esta bacteria causa la formación de agallas en plantas dicotiledoneas ' nediante Ia transferencla plásmido (I1¡nado T de un súnento ae il ADN) en Ia cél-ula vegetal. El T AtN se inserta a sí mis¡no aL azar en un segmento del cromoso¡uade la célula de 1a planta' ciertos 8,enes que llevan consigo el T ADN previenen diferenciacién celular, causando que las células infectadas crezcan incontroladamente y forEen un tumor. Otros genes dentro del T ADN inducen a la céIula enferna a producir Ia enzima opino sintetasa, la cual caxaLiza la síntesis de un aminoácido rico en nitrógeno (opinos). Este a¡rinoácido es requerído por A. tumefasciens cono su fuente de nitrógeno. ADN foráReo En 1a Figura 7 se esquematiza una forna de introducir 'lJn en céluIas vegetales, plásurido reconbinante es construlilo de un Ti p1ásmido modificado (que no causa en Ia planta la producción der turnor) y de un ADN foráneo. Por nedio de infección este plásnido nodificado se integra dentro de un cromoso¡¡ahospeclero (1a integración. 83.

(12) TRANSFEITENCIA I)E GNNES I'hsnrido¡trodificldo T¡ ^t)N. Al)N forltneo. I En,lnnu.l*aso f de reslrícción.. Los gcrrescarrsnrr les del l uuxrr sotr in¡cfivos.. I l,. rle Err<klnttclcnsn reslricción.. ADN fecon¡binn'lle ¡llasnrido.. J. Figura. 7,. Transferencia. cólrrhs vegelale*. lur""r". de Genes.. 84.

(13) t. se puede medir por la producción en la enzina opino sintetasa. Después de que l-as células han sido cultivadas, Las plantas son regeneradas a partir de1 cultivo celular. Si las células de éstas planEas reti€nen plásni,do y su ADN foráneo, todo el proceso de ingeniería genétÍca ha sido logrado. - l'fanipulación genética de las células en cultivo, Uno de estos procedi-rdientos genéticos es la transferencia de ADN foráneo, el cual es introducido a1 ADN de un vehículo portador (plásnido o virus). 0tro procediniento es la fusión de céIulas genéticamente diferentes, a Ias cuales se l-es ha removído 1a pared celular. Cuando dos de estos protoplastos se fuafonan, fornan un hlbrido que contienen 1a infornación genética de ambas cé1ulas. Así, Ios genes de especies distantenente relacionados pueden ser conbinados sin las restricciones de los cruces naturales, generando un potencial para La creación de nuevas pl"antas (Figura 8). - Selección de las células transforn rdaa. iística deseada es resistencia a la toxina no, la seJ-ección podría ser el creciniento de la toxina y la selección de 1os clones posteriores .. Por e ie¡¡plo. si la caracteproducLd; poi cierto patógede las células en presencia resistentes por selecciones. EI c¡eciniento de células haploides por medio de1 cultivo de anteras prooete ser nuy útÍ1 en la inducción y selección de canbios genéticos. Asi. altáraciones recesivas en ei genonio.que.son producidas.por.,.nu:a-" . ción, u otros medios, son expresadas innediatamente sin los efectoa. - Regeneración de plantas a partir del cultivo de células. Los protoplastos pueden ser inducj"dos a regenerar su pared celular y proliferar para fornar una nasa de células no diferenciada (callo); con alteraciones de 1os componentes del nedio nutritivo en e1 cual se está cultivando; el callo puede inducirse a producir hojas y raíces, o eubriones somáticos, los cuales producirán una planta. V.. APLICACIONESPOIENCIIII,ES. - Cultivo de neristenos apicales. Para erradicar virus de plantas de reproducción vegetativa se ha utilizado con rnucho éxito y d u r a n t e varios años e1 cultivo de neristenos apicales, e1 cual es de extensa aplicación en orna¡Dentales. se ha Para el caso de meristemos apícales en gramineas forrajeras, usado esta técnica con excelentes resultados, en especies de Loliun' Festuca, Phleum y Dactyles. Dale Ia utilizó para eliminar virus del S5.

(14) FUSTON¡)E nROTOPt_^S-t OS (ELtMtN^CIONOPC¡ONALl)E UN pA|TENTALctNOMtO). Fusión. --+ o. <_. @. o ü. [\{edic¡l¡tos¡rtiv¡ L, Floitli¡r:2 n likrres prir¡lr rn T e j i r l o; c o r r g l o r n e r n d o celr¡l:rr. folcote L. Itledlcaeo Pkriilin: 2 n. ü. Fftrres:nrn¡rlllo. @. Tejitlo: rntndfllo foli¡r. I. S:rlivax f¡lcole h lb¡idos Ploidio:4 n Jrloresverdes. F1gu::a. B.. Fusión. de Protoplastos. entre. 86. dos especies. de Alfalfa..

(15) nosaico en ryegrass anual (Ioliun multiflorum ]-qrh), pero, bn la mayoría de pastos forrajeros 1a transnisión por vÍrus no es el principal probIena, ya que 1a propagación es por semilla sexual y los virus importantes no son transnitidos por este Dedio (Conger, 1985). Sin enbargo, por parte de Ia erradj-cación de virus puede encontrar aplicación, los fitonejoradores que deseen nantener por nruchosaños cl-ones parentaIes y otros genotipos que seleccionen en condición vigorosa y sana. Esta tecnología está disponible. y puede ser usada, si es necesario.. - Propagación nas 'a. Nuevamente, el clonaje in vitro ha sldo y es exitosanente usado en una amplia gama de cultivos de reproducción asexual específicamente ornanentales. En varios casos los nuevos brotes son fornados por yenas advent.icias relacionada con estados o axilares y en esta regeneración i.n vftro, que -implican dediferencíación y redediferenciaci6n, existe evidencia que puede inducir a cambios fenotípicos y cromosónicos, variabilidad que es altanente indeseable para clonaje, pero puede tener un uso potencial como nejoramiento. - Enbriogénesis somática. Con bastante certeza se afÍrna que plantas regeneradas, vía ernbriogénesis somática, son estables genéticamente. la producción de embriones somáticos, a Sran escala,.pin glLe Pre+enten 'en'eI canbic¡s fenoripicoe o cronosómicos, puede ser nuy- inpóitáhce mejoramiento de pastos, con el hábito de crecirniento que ng Dosea rizonas o est<¡lones para la propagación vegetativa, lo que pernitiría la propagación directa de plantas seleccionadas. Para aplicar. esta tecnología se requiere:. a. la posibilidad de producir econónicamente, una cantidad considerable de enbriones somáticos. b. E1 desarrollo de métodos que pernitan nanejar estos embriones como ' si fueran semÍllas sexuales (artificiales) c'. Mantenimiento comprobado de estabilidad producidas en estos embriones somáticos-. genética. en las. plantas. Cultivo de anteras. de 1íneas homocigotas en Pastos E1 desarrollo perennes auto-incompatibles es virtual-DenEe inposible. Sin enbargo, la producción de doble haploides' a través del cultivo de anteras, es un cambio de incalculables proyecciones Para 1os fitomejoradores. Por ejernplor permitiría el uso controlado de cruces para naximizar 1a heterocigocidad en casos como la alfalfa y otros pastos Pt¡jiplorrles aióganos. ót.

(16) Aunque 1a técnica se ha desarrollado con éxi.to en cereales y naí2, e1 progreso en pastos ha sido mucho más lento.. como arroz. Variación somaclonal. A pesar: de que gran parte de los pastos perennes son alógarnos po1Íploides con alLo grado de heterocigocidad y por lo somacl-oy selección de variantes tanto de variabilidad, la índucción y aplicados en aLgunos nales puede ser útil para estudios básicos g e n o t i p o s e s p e ci f i c o s . - Rescate de embriones. Esta técnica y ha sido ha estado disponible híbrídos aplicada durante varios aborto y producir años para evitar entre algunas especies vegetales, pero, enel caso de Pastos, su aplicae intergeción ha sído limitada porque muchos cruces interespecíficos néricos han sido efectuados en gramíneas sin e1 uso de 1a técnica de rescate de ernbriones. - Cultivo de céLulas y protoplastos. Como se anotó anEeriornente genétiun paso esencial para podei utilizar las técnicas de ingeniería de céLulas individuaca es el de generar plantas a través del cultivo para 1a tona de obietos les y de protoplastos. Estos tienen afinídad externos, incluyendo ADN foráneo. La fusión de protoplastos es esencial para la creación de híbridos Sin embargo, somáticos entre relacÍonadas. especies distantemente en el caso de pastos, no se han reportado Plantas fuertes regeneradas por medio de protoplastos, en una forna que pueda ser replicada'. w.. oo$clusror{B. de En 1os últiraos años se ha progresado bastante en el desarrollo m ás n u c h o p e r o s e n e c e s i t a cultivos p a s t o s in vitro foirajeros, de e s p e c i e s g r a d o , l a s m a y o r estudio e-investigación para cubrir, en de uso actual y potenci-a1 en eI país. Algunas técnicas a. Cultivo. esLán disponibles. de meristemos apicales. b. Inducción y selección. para ser aplicadas. para erradicación. de variantes. E11as incluyen:. de algunos virus.. sonaclonadas.. c. Rescate de embriones y uso de1 cultivo. de haploÍdes.. El clonaje y 1a ingeniería gen6tica están distantes de ser aplicados' evaluación de .la hasta que ia prine-ra etapa de cultlvo de Lejidos, y regeneradas respuesta de 1as especies a ser cultivadas in vitro piEEá se. efecEuada a iravés del cultivo individualel de células en forma rutinaria.. 88.

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