Micropropagación de especies forestales Terminalia amazonia y validación y afinamiento del protocolo desarrollado para Vochysia spp

(1)

Escuela de Biología

Centro de Investigación en Biotecnología

Informe de Proyecto de Investigación

Micropropagación de especies forestales.

Terminalia amazonia

y validación y afinamiento del

protocolo desarrollado para

Vochysia

spp.

Dra. Ana Abdelnour Esquivel

Con la colaboración de

Ing. Laura Sánchez e Ing. Karol Jiménez

(2)

(3)

Introducción de material in vitro……….………34

Desinfección in vitro.. ……….36

Brotación. ……….36

Elongación……….38

Evaluación del Sistema de Inmersión Temporal (RITA)………39

RESULTADOS Y DISCUSIÓN………..46

Introducción del material in vitro………46

Desinfección in vitro……….49

Brotación………50

Elongación……….52

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES………..54

AGRADECIENTOS………..55

BIBIOGRAFÍA………56

(4)

Título del proyecto: Micropropagación de especies forestales. Terminalia amazonia y validación y afinamiento del protocolo desarrollado para Vochysia spp.

Autores: Dra. Ana Abdelnour Esquivel. Coordinadora

Colaboradoras: Ing. Laura Sánchez Ing. Karol Jiménez

RESUMEN

En Costa Rica varios programas de reforestación y de aprovechamiento del recurso forestal han dirigido los esfuerzos al estudio del comportamiento en plantación de algunas especies nativas, entre ellas las vochysias (V. guatemalensis) y el amarillón (Terminalia amazonia). La multiplicación in vitro permitiría la creación de plantaciones forestales, que a su vez, disminuirían la presión existente sobre el bosque natural, el funcionamiento de los procesos ecológicos, paisajísticos, de protección de suelos, agua y acumulación de carbono. El objetivo de esta investigación fue contribuir con los programas de conservación, mejoramiento genético, por medio del desarrollo de investigación conducente al establecimiento de protocolos de propagación masiva in vitro. Se evaluaron varios procedimientos de desinfección, antioxidantes, medios de cultivo y reguladores de crecimiento para el establecimiento aséptico de estacas de invernadero y campo y semillas. Se evaluaron combinaciones de medios de cultivo y reguladores de crecimiento para la inducción de la brotación, elongación y multiplicación del material. Se determinó que el uso de carbón activado o PVPP en el medio de cultivo y la exclusión del Fe permitieron controlar el grado de oxidación de los explantes. Tanto el medio de cultivo MS como WPM enriquecidos con BA (15 y 30 mg/l para T. amazonia) y AG3 (hasta 100mg/l para V. guatemalensis), indujeron la brotación de los explantes, su elongación y la multiplicación de ambas especies. Con la utilización del sistema de inmersión temporal (RITA) en V. guatemalensis se obtuvieron brotes más numerosos y vigorosos, que al ser transferidos a medio semisólido fueron capaces de elongarse. Se recomienda continuar la investigación en el uso de medios líquidos con el sistema de inmersión temporal y evaluar nuevos desinfectantes recientemente disponibles en el mercado.

Palabras clave: Micropropagación, desinfección, especies maderables, cultivo in vitro, Vochysia spp, Terminalia amazonia, botarrama, roble coral.

INTRODUCCIÓN

Costa Rica es un país con gran diversidad tanto de flora como de fauna. Según la lista oficial de especies publicada por el Sistema de Información de Recursos Forestales

(5)

debidamente localizadas por zonas geográficas (SINAC-Gerencia de Manejo de Recursos Naturales, 2012).

En la actualidad, las especies forestales presentan una problemática a nivel nacional, principalmente debido a la tala excesiva, al uso de semillas de mala calidad, de

características poco deseables, de muy poco valor genético cuyas características se transmiten de generación en generación (Oficina Nacional de Semillas, 2003). Bien

entendido el hecho de que el aprovechamiento desmedido del recurso forestal, especialmente de las especies consideradas endémicas, raras o amenazadas, ha

resultado en la disminución de individuos, que en muchos casos eran catalogados como excelentes árboles reproductores y que de seguir el mismo camino, se perdería el potencial de utilización de éstos recursos en forma comercial y ecológica, ya que

durante la explotación comercial tradicional se seleccionan los mejores árboles para el aprovechamiento, dejando individuos poco vigorosos en el campo y a medida que

transcurre el tiempo se provoca que la especie decline en su capacidad reproductiva y en la alteración del medio en que se desarrolla, lo cual repercute directamente en el

aprovechamiento futuro de estas especies, ya que la disponibilidad de material genético de calidad para programas de mejoramiento sería escaso o inexistente

(Quesada, 2004).

Por esta razón, se han estudiado técnicas biotecnológicas que permitan la multiplicación clonal del material, con el fin de conservar las características de interés de las especies forestales y que reduzca los tiempos necesarios para obtener árboles

adultos y productivos.

La multiplicación in vitro de especies forestales posee gran relevancia porque permitirían la creación de plantaciones forestales, que a su vez, disminuirían la presión existente sobre el bosque natural; además de contribuir significativamente en el

funcionamiento de los procesos ecológicos, paisajísticos, de protección de suelos, agua y acumulación de carbono (Alice et al. 2004).

En Costa Rica, varios programas de reforestación y de aprovechamiento del recurso forestal para el inicio de plantaciones comerciales han dirigido los esfuerzos al estudio

(6)

comparables a las que presentan otras especies valiosas pero introducidas, como la teca (Tectona grandis). Por los problemas arriba citados y de acuerdo con técnicos de FUNDECOR, estas especies presentan pocos individuos sobresalientes, además la semilla es escasa y no es producto del cruce controlado, por lo que no se podría

asegurar el mantenimiento de las características élite de algunos de los individuos seleccionados.

FUNDECOR (Fundación de Cordillera Volcánica Central), es una organización no gubernamental (ONG) establecida para promover la conservación y el uso sostenible

de los recursos naturales de la Cordillera Volcánica Central utilizando estrategias de mercado, conocimiento científico y tecnologías de punta para mejorar las políticas públicas de conservación. Han encontrado aliados para el cumplimiento de sus

funciones en varias organizaciones e instituciones estatales, entre las cuales destacan las universidades públicas, de ahí su acercamiento al ITCR, buscando investigadores

con experiencia en el campo del estudio y manejo de recursos genéticos. Especialmente buscando experiencia en propagación vegetativa masiva, modalidad de

propagación que cumplen las técnicas del cultivo in vitro, en particular la micropropagación.

Durante los últimos años FUNDECOR ha colaborado activamente con el CIB para el desarrollo de metodologías para la micropropagación de botarrama (Vochysia) y otras especies relacionadas de este género. A partir de esta colaboración se han obtenido resultados acerca del manejo y la selección del mejor material para el establecimiento

in vitro de las especies: desinfección, brotación y elongación. Por lo cual estos resultados deben ser validados. A la vez, los resultados han motivado a las partes involucradas a continuar con otras especies, como es el caso de Terminalia amazonia.

Como respuesta a ello, el Centro de Investigación en Biotecnología del Instituto Tecnológico de Costa Rica, ha unido esfuerzos con la Fundación para el Desarrollo de

(7)

Objetivo general

Contribuir con los programas de conservación, mejoramiento genético y establecimiento de plantaciones comerciales de primera calidad, por medio del

desarrollo de protocolos de propagación masiva in vitro de especies forestales nativas.

Objetivos específicos

Desarrollar investigación conducente a promocionar la elongación y multiplicación de Terminalia amazonia. Se evaluará el efecto de varios medios de cultivo, reguladores de crecimiento y otras sustancias relacionadas para tratar de inducir la respuesta deseada.

Desarrollar investigación conducente a inducir la elongación y multiplicación de

(8)

Terminalia amazonia

Materiales y métodos

Material procedente de invernadero

En este documento se trató de resumir los principales procedimientos empleados.

Debido a que no siempre se contó con el material de campo, se mantuvo en invernadero un número de plantas que permitieran realizar inicialmente la

investigación. Se detallan las principales pruebas realizadas y sus resultados, a continuación sólo se abarcarán los principales resultados.

El objetivo principal de este trabajo fue determinar la condiciones necesarias para el establecimiento in vitro de T. amazonia, siendo una parte del proyecto de micropropagación de especies forestales desarrollado en el CIB con el apoyo inicial de de FUNDECOR y MICIT-CONICIT durante los años 2010 y 2011 y durante esta

ampliación (2012) apoyada por FUNDECOR.

Se trabajó con plantas de campo y de invernadero, a estas últimas se les

establecieron las condiciones sanitarias típicas de las plantas donadoras mantenidas en invernadero (aspersiones bisemanales con fungicidas y bactericidas, fertilizantes y

riego diario). Posteriormente se evaluó el efecto dos agentes desinfectantes, hipoclorito de sodio y cloruro de mercurio, en diferentes concentraciones y tiempos de

exposición (Cuadro 1). Además, se utilizaron una serie de antioxidantes, como ácido cítrico, ácido ascórbico, L-cisteína, PVPP, carbón activado y DTT, también se empleó

(9)

Cuadro 1: Soluciones desinfectantes evaluadas para el establecimiento aséptico in vitro de estacas de T. amazonia proveniente de invernadero.

Agente desinfectante Concentración

(10)

Cuadro 2: Tratamientos antioxidantes utilizados para el establecimiento in vitro de estacas de Terminalia amazonia mantenidas en invernadero.

Brotación

En cuanto a la brotación de esta especie se establecieron dos ensayos. El medio de cultivo evaluado en fue el mismo utilizado en la introducción: MS sin Cobre, sin Hierro,

con un pH de 5.1, complementado con 500 mg/l de Carbón activado, y con distintos reguladores.

(11)

Cuadro 3: Citocininas evaluadas para la inducción de la brotación in vitro en microestacas de Terminalia amazonia.

Material recolectado en campo

Cuando se inició el estudio con material recolectado en el campo, prácticamente se

tuvo que iniciar la investigación en establecimiento in vitro de estos materiales. Se realizaron un total de 17 pruebas de desinfección que permitieran introducir material

de Terminalia amazonia libre de contaminación a condiciones in vitro. Dichos protocolos incluyeron el uso de hipoclorito de sodio, alcohol, cloruro de mercurio,

(12)

Cuadro 4. Tratamientos empleados para la desinfección de estacas de Terminalia amazonia provenientes de campo, previo a su introducción al cultivo in vitro.

Tratamiento Sembrados Descripción de la desinfección

(13)

Desinfectante Concentración Tiempo

TT10 36

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 30% v/v 5min

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 10% v/v 10 min

Zerotolerance 50% 3 min

TT11 39

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 10% v/v 10 min

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 10% v/v 10 min (1962) al 100% + 3% sacarosa + 500mg/l de carbón activado, y diferían entre sí en la

(14)

Cuadro 5. Medios de cultivo empleados en el ensayo de brotación de Terminalia amazonia empleando medio semisólido para el subcultivo de las estacas in vitro.

Tratamiento Medio de Cultivo Explantes sembrados

BT1 2 ip: 3mg/l

Adicionalmente, se realizó un ensayo empleando medio inmersión temporal, mediante el sistema de RITA´s. Cada tratamiento consistió en dos RITA’s una colocada en el

cuarto frío (17±2ºC) y otra en el cuarto caliente (25±2ºC), cada una con cinco

explantes. Los detalles del medio de cultivo se muestran en el cuadro 6.

Cuadro 6. Medios de cultivo empleados en el ensayo de brotación de Terminalia amazonia empleando Sistema de Inmersión Temporal para el subcultivo de las estacas in vitro.

TTR1 TTR2 TTR3 TTR4

Sales MS 100% Sales MS 100% Sales MS 100% Sales MS 100%

Vitaminas MS Vitaminas MS Vitaminas MS Vitaminas MS

BAP: 30mg/l Kinetina: 10mg/l Zeatina: 0.5mg/l

2-iP: 3mg/l

AIA: 0,5mg/l

(15)

Multiplicación

Las estacas de Terminalia amazonia brotadas, tanto las provenientes de invernadero como de campo, fueron y se sembraron en medio M&S (1962) + 3% sacarosa +

0,05mg/l de BAP pH 5,7 para inducir la elongación y por ende la multiplicación.

Posteriormente, los explantes fueron subcultivados en medio de cultivo semisólido con

sales M&S (1962) al 100%, 3% sacarosa + 200mg/l de caseína hidrolizada + 0.5 mg/l de BAP. Para ello, se cortaron las hojas y la parte basal del tallo, para obtener una

realizó un lavado con agua. Luego, se lavaron con agua y jabón durante 10 minutos en agitación. Se retiró por completo el jabón y se realizó un último lavado con solución

antioxidante (1g/l de ácido ascórbico y 0,5g/l de ácido cítrico). Seguidamente se desinfectaron las semillas en cámara de flujo laminar siguiendo cinco protocolos

diferentes:

ST4: Cloro comercial (3,5% ia) al 40% v/v durante 10 minutos

Se sembraron las semillas con y sin testa. Todos los tratamientos se colocaron en medio de cultivo M&S (1962) al 100% + 500mg/l de carbón activado + 3% sacarosa en

(16)

Resultados

Material procedente de invernadero

Con base en los resultados obtenidos trabajando con el material experimental de T. amazonia mantenido en invernadero, se logró identificar una metodología eficiente para el establecimiento in vitro de este tipo de explante (Cuadros 7, 8 y 9). El tratamiento que mostró el mayor control de contaminación se observó en los ensayos

realizados con hipoclorito de sodio. La doble desinfección con hipoclorito de sodio al 3%

por 5 minutos de inmersión y luego al 1,5% por 10 minutos de inmersión, presentó un nivel

medio de asepsia con 62% a los 15 días de la siembra y un menor porcentaje de explantes

muertos debido a oxidación (50%). En este tratamiento la mayor contaminación se debió a

hongos con un 37,5%.

(17)

Cuadro 8: Evaluación de los tratamientos de desinfección con NaOCl después de 15 días de cultivo, expresado en porcentajes de la cantidad de explantes.

Con respecto al uso de cloruro de mercurio (HgCl2), se observó que conforme se aumentó la concentración del clouro de mercurio el porcentaje de explantes asépticos

(18)

Cuadro 9: Evaluación de los tratamientos de desinfección con HgCl2 después de 15 días de cultivo, expresado en porcentajes de la cantidad de explantes.

Al evaluar los tratamientos antioxidantes, después de un día de cultivo, se observó

algún grado de oxidación en el 100% de los explantes. En la Figura 1 se muestra el grado de oxidación, expresado como el porcentaje de explantes en cada una de las

clases cualitativas evaluadas para cada tratamiento. Los menores porcentajes de oxidación se presentaron en los tratamientos con los antioxidantes adicionados al

medio de cultivo, en especial con la adición de carbón activado (500mg/l) con un 53,3% de explantes clasificados con un bajo índice de oxidación u oxidación leve.

También se pudo apreciar como los tratamientos con DTT reflejaron los mayores porcentajes de explantes con altos índices de oxidación (73.3%) Los tratamientos con

(19)

Figura 1: Efecto de los diferentes tratamientos antioxidantes en la intensidad de la oxidación en explantes de Terminalia amazonia (amarillón) después de 24 horas de cultivo in vitro.

La evaluación de la oxidación a los 15 días de cultivo, mostró que el porcentaje de

explantes clasificados como graves e intermedios aumentó en todos los tratamientos y por ende disminuyó el porcentaje de explantes categorizadas con oxidación leve. En la Figura 6 se puede apreciar como tratamientos como el 6 y 7 (con L-cisteína) y 11 (con

DTT) mostraron 100% de explantes clasificados como graves, resultando así un 0% de sobrevivencia para los tratamientos con L-cisteína (Figura 2).

(20)

Según los resultados obtenidos, se decidió que el protocolo a seguir para la desinfección de estacas de T. amazonia es el que se presenta a continuación:

1. Corta las estacas y colocarlas de inmediato en Solución Antioxidante (ácido cítrico 0,5 g/l y ácido ascórbico 1 g/l a un pH de 4.5).

2. Colocarlas 15 minutos bajo el agua del tubo, para remover impurezas. 3. Lavar con agua destilada y detergente Bactex, en agitación.

4. Colocarlas en Agrimycin y Benomil 5-8 g/l, disuelto en Solución Antioxidante, durante 2 horas.

5. Realizar la doble desinfección, con hipoclorito de sodio al 1,5% durante 12 minutos, y después de un lavado, se colocarlas en hipoclorito al 3%, durante 8 minutos.

6. Enjuagar tres veces con agua destilada estéril y cultivar en medio MS sin Cobre, sin

Hierro, con un pH de 5.1, complementado con 500 mg/l de Carbón activado. 7. Mantener durante 1 mes en oscuridad, a 20ºC.

La figura 3 muestra algunas imágenes que muestran los mejores resultados obtenidos

durante etapa de la investigación en desinfección, control de la oxidación de material de invernadero.

(21)

Los resultados mostraron baja brotación de las microestacas en las dos

concentraciones de las citocininas evaluadas: 30 mg/l de BAP y 10 mg/l de KIN, pero

con explantes verdes y vigorosos (figura 4).

Figura 4: Brotes obtenidos a partir de los explantes de Terminalia amazonia en medio de cultivo con citocininas.

Material recolectado en campo

Introducción in vitro

Se realizaron un total de 17 pruebas de desinfección que permitieran introducir a

condiciones de cultivo in vitro material de Terminalia amazonia libre de contaminación. Dichos protocolos incluyeron el uso de hipoclorito de sodio, alcohol, cloruro de

mercurio, peróxido de hidrógeno, agroquímicos, entre otros agentes desinfectantes, diversas combinaciones entre ellos y variaciones en los tiempos de exposición a los

(22)

Cuadro 10. Tratamientos empleados para la desinfección de estacas de Terminalia amazonia provenientes de campo, previo a su introducción in vitro.

(23)

Desinfectante Concentración Tiempo

TT10 36

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 30% v/v 5min Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 10% v/v 10 min

Zerotolerance 50% 3 min

TT11 39

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 30% v/v 5min Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 10% v/v 10 min

Los tratamientos en medio semisólido consistían sales M&S al 100% + 3% sacarosa + 500mg/l de carbón activado, y diferían entre sí en la combinación de reguladores de

(24)

Cuadro 11. Medios de cultivo empleados en el ensayo de brotación de Terminalia amazonia empleando medio semisólido para el subcultivo de las estacas in vitro.

Tratamiento Medio de Cultivo Explantes sembrados

BT1 2 ip: 3mg/l

Adicionalmente, se realizó un ensayo empleando medio inmersión temporal, mediante el sistema de RITA´s. Cada tratamiento consistió en dos RITA’s una colocada en el

cuarto frío (17±2ºC) y otra en el cuarto caliente (25±2ºC), cada una con cinco

explantes. Los detalles de los medio de cultivo se muestran en el cuadro 12.

Cuadro 12. Medios de cultivo empleados en el ensayo de brotación de Terminalia amazonia empleando Sistema de Inmersión Temporal para el subcultivo de las estacas in vitro.

TTR1 TTR2 TTR3 TTR4

Sales MS 100% Sales MS 100% Sales MS 100% Sales MS 100%

Vitaminas MS Vitaminas MS Vitaminas MS Vitaminas MS

BAP: 30mg/l Kinetina: 10mg/l Zeatina: 0.5mg/l 2-iP: 3mg/l

AIA: 0,5mg/l

(25)

Multiplicación

Las estacas de Terminalia amazonia brotadas, tanto de invernadero como de campo, se multiplicaron y se sembraron en medio descrito por Murashige y Skoog (M&S, 1962) + 3% sacarosa + 0,05mg/l de BAP pH 5,7. Posteriormente, los explantes fueron

subcultivados en medio de cultivo semisólido con sales M&S al 100%, 3% sacarosa + 200mg/l de caseína hidrolizada + 0.5 mg/l de BAP. Para ello, se cortaron las hojas y la

parte basal del tallo, para obtener una mayor absorción de nutrientes.

Introducción de semilla

Se introdujo semilla de Terminalia amazonia colectadas en campo, en la zona de Sarapiquí. Inicialmente, se redujeron las semillas, cortando los extremos de las

mismas y se realizó un lavado con agua. Luego, se lavaron con agua y jabón durante 10 minutos en agitación. Se retiró por completo el jabón y se realizó un último lavado con solución antioxidante (1g/l de ácido ascórbico y 0,5g/l de ácido cítrico).

Seguidamente se desinfectaron las semillas en cámara de flujo laminar siguiendo cinco protocolos diferentes:

Se sembraron las semillas con y sin testa. Todos los tratamientos se colocaron en

(26)

Resultados

Introducción in vitro

Se evaluaron los diferentes tratamientos de desinfección de material tomando en

cuenta la cantidad de explantes con bacteria, hongo, ambos contaminantes y la oxidación de los mismos. La figura 5 muestra los porcentajes de limpieza de explantes

en los diferentes tratamientos empleados. A pesar de que los tratamientos denotados desde el TT0 hasta TT9 presentan buenos porcentajes de limpieza, la mayoría de los

explantes mostraron oxidación, es decir, coloración café oscura en tallos y yemas, por lo cual se descartaron como tratamientos viables, debido al daño provocado por los

desinfectantes en el tejido vegetal.

Tomando como referencia los tratamientos TT10 al TT17, en los cuales los explantes

se mantuvieron verdes y saludables, se realizó un análisis ANOVA con un 95% de confianza, y se determinó que existen diferencias significativas entre tratamientos.

La prueba Tukey, mostró que los mejores tratamientos empleados son el TT10, TT13 y TT15, entre los cuales no se presentaron diferencias significativas.

Tomando en cuenta los resultados obtenidos, se decidió repetir el ensayo empleando los tratamientos TT10 y TT13 con material de la misma procedencia, lo cual permitiría

Explantes oxidados Explantes en buenas condiciones

(27)

tomar una decisión acerca del mejor tratamiento para la introducción, evaluando a la vez la capacidad de brotación de los explantes una vez sometidos a ambos

tratamientos de desinfección.

Brotación

Inicialmente, en ninguno de los tratamientos evaluados se observó brotación de las

yemas, a pesar de que las estacas introducidas permanecieron verdes y con apariencia saludable. En la mayoría de los casos, con el tiempo las estacas se

oxidaron sin mostrar la presencia de brotes (figura 6). Por lo anterior, fue necesario variar los tipos, combinaciones y concentraciones de reguladores de crecimiento

empleados con el fin de generar la señal hormonal necesaria para la brotación de las yemas axilares, tomando en cuenta la concentración endógena que tienen los

explantes y el nivel relativamente alto de citocininas vs. auxinas que generalmente se requiere para que el tejido manifiesta la formación de nuevos brotes (Jordán y

Casaretto, 2006).

En los siguientes ensayos evaluados se presentó brotación en el medio suplementado

con 15 mg/l de BAP, sin embargo, por el bajo porcentaje de brotación y por no ser una respuesta significativa, su repetitividad debe ser confirmada (figura 7).

(28)

En cuanto al cultivo de los explantes de T. amazonia en el sistema de inmersión temporal (RITAs), se observó una alta oxidación de los explante y no se evidenció la

presencia de brotes.

Multiplicación

Las estacas de Terminalia amazonia multiplicadas y sembradas en medio M&S + 3% sacarosa + 0,05mg/l de BAP (pH 5,7) mostraron buenas condiciones, sin embargo su

crecimiento no ha sido del todo satisfactorio, debido a que el crecimiento es muy lento, lo que ha retrasado la multiplicación rutinaria de las estacas (figura 8).

Introducción de semilla

Los tratamientos de desinfección de semilla mostraron altos porcentajes de éxito, tomando en cuenta la baja incidencia de hongos y bacterias. Los resultados se muestran en la figura 9.

Figura 7. Estaca de T. amazonia brotada en medio de cultivo suplementado con 15mg/l de BAP. A: Brotación a los 15 días de subcultivo. B: Brotación a los 21 días de

subcultivo. C: Brote a los 28 días de subcultivo

A

B

C

(29)

Los análisis estadísticos realizados mostraron que no existen diferencias significativas

entre los diferentes tratamientos de desinfección, ni entre semillas con y sin testa que empleaban el mismo tratamiento de desinfección (en el caso de ST1, ST2 y ST3).

A pesar de que se informó a los investigadores acerca de la baja viabilidad de las semillas previo a la introducción, se obtuvo germinación en condiciones in vitro, la mayoría ellas cultivadas con testa y una sin ella, tal como se muestra en las figuras 10 y 11.

Figura 10. Semillas de T. amazonia en proceso de germinación. A: Semilla con testa. B: Semilla sin testa

Figura 11. Plántulas de Terminalia amazonia germinadas in vitro.

Figura 9. Porcentaje de limpieza obtenido en mediante tres tratamientos de desinfección de semillas de Terminalia amazonia

(30)

Discusión

Esta investigación indicó que el manejo del material vegetal en invernadero, tratando de darle las condiciones sanitarias que reduzcan el inóculo de contaminantes, antes

de su desinfección superficial para introducirlo a condiciones in vitro, permitiría el uso de desinfecciones menos drásticas y aumenta la posibilidad de lograr explantes asépticos. Además, la doble desinfección con NaClO al 3% y 1,5%, durante 5 y 10

minutos respectivamente fue el mejor tratamiento para controlar la oxidación de los explantes de T. amazonia, al combinar las respuestas esperadas: una contaminación baja y una baja mortalidad de los explantes por oxidación. La selección del tratamiento antioxidante depende de la especie con se trabaje. Terminalia amazonia posee una gran cantidad de taninos y fenoles, que rápidamente pueden ser oxidados. También presenta pubescencia o tricomas que favorecen y aumentan la oxidación del

explante por requerir una fuerte desinfección. Durante este estudio, la evaluación de una variedad de antioxidantes permitió descartar compuestos que dañaron el material,

o que no influyeron en la reducción de la oxidación, se logró incluso seleccionar el método más apropiado de adicionaros, al igual que el método de desinfección que

causó menor daño al tejido y mayor porcentaje de explantes asépticos. En general, los resultados obtenidos parecen indicar que el uso de las citocininas BAP y Kinetina es el camino a seguir para promover la brotación de yemas en explantesde Terminalia amazonia y que sería conveniente evaluar otras concentraciones y mezclas de citocininas.

Los compuestos fenólicos son exudados por la herida del tejido hacia el medio, a la vez son atrapados por el gelificante y acumulados formando un área negra alrededor

del explante, resultando la inhibición del crecimiento (Monzon, 2005). No todos los compuestos que se producen son inhibidores del crecimiento, pero frecuentemente se

encuentra que, una vez producida la decoloración, el crecimiento se inhibe y los tejidos se mueren, a no ser que se tomen medidas oportunas.

La extensión de la oxidación y la inhibición del crecimiento depende mucho del genotipo, este influye en la cantidad de sustancias fenólicas producidas así como en

su toxicidad y es especialmente problemático en especies que contienen niveles altos de taninos y otros hidroxifenoles (Chinchilla, 2008), como es el caso del roble coral.

El ácido ascórbico inhibe la oxidación reduciendo el complejo fenólico, este compuesto en la micropropagación puede actuar en dos formas como reductor o como vitamina, en los resultados reportados en roble coral (Figura 6) este compuesto en combinación

(31)

intermedios de explantes con una fenolización grave (53,3%, 66,7% y 60%). Resultados similares obtuvo Cisne et al (sf) en mora, el ácido ascórbico no tuvo ningún efecto estimulador sobre las variables evaluadas, aunque este pudo haber tenido cierto efecto sobre la inhibición de sustancia fenólicas.

Por otro lado el ácido cítrico es un ácido tricarboxilo muy común en las plantas, es cobre en el sitio activo de la enzima (Romero, 2004).

La combinación de ambos antioxidantes en roble coral tuvo resultados similares a los obtenidos por Concepción et al (2005) en guayaba (Psidium guajaba) y Alonso (2002) en geranio (Pelargonium sp), los cuales reflejaron una reducción de la oxidación pero no de manera eficiente. Se reporta que el ácido ascórbico es sólo efectivo durante un

corto periodo de tiempo ya que se puede convertir rápidamente en un oxidante muy fuerte (Alonso, 2002).

Otro de los compuestos antioxidantes utilizados fue la L-cisteína, aminoácido que en una solución neutra, se ha usado en el cultivo in vitro de mora (Rubus glaucus), donde se comprobó que resulta tóxico al ser utilizado en concentraciones mayores a los 100mg/l, provocando la muerte de las plantas aún y cuando se esterilizó en la autoclave (Cisne et al, sf). Este resultado fue similar al obtenido con las tres concentraciones evaluadas en T. amazonia, en la cual a los 15 días de cultivo la oxidación fue casi del 100% causando la muerte de los explantes.

En cuanto al DTT o reactivo de Cleland, se ha utilizado para retardar la oxidación, especialmente de grupos –SH, ya que reduce disulfidos cuantitativamente (Monzon,

2005), igualmente este antioxidante ha sido utilizado Parakmeria lotungensis, Pinus virginiana y Strelitzia reginae (Ziv & Halevy, 1983) citados por Azofeifa (2009); sin embargo, este reactivo no resultó eficiente en T. amazonia en las concentraciones evaluadas.

En cuanto a los antioxidantes más empleados dentro del medio de cultivo se menciona el carbón activado, este compuesto no es tóxico y teóricamente se puede adicionar en

(32)

reducción de la fenolización en los explantes. Resultados similares reportó Borges & Sosa (2008) para el cultivo in vitro del ñame, al evaluar cuatro concentraciones diferentes (0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/l) observaron que las de menores concentraciones presentaron los mejores resultados sin presentar diferencias significativas entre ellos.

El carbón activado no solo reduce la oxidación, sino también en concentraciones bajas promueve el crecimiento o desarrollo en algunas especies como reporta Pedroza &

Alonso (2009) en orquídeas, donde además de favorecer los procesos de crecimiento en las orquídeas, se menciona que potencializa el efecto de los fitorreguladores.

El último agente antioxidante evaluado para la introducción del roble coral fue la polivinylpolipirrolidona (PVPP), la absorción de esta sustancia química es más limitada, debido a la complejidad del fenol. Con el uso de PVPP tanto en el medio

líquido como semisólido se obtuvieron los mejores resultados en cuanto al control de la oxidación y por ende la sobrevivencia de los explantes de T. amazonia. Resultados similares reporta Concepción et al (2005) con la introducción de guayaba y el uso de 500mg/l y 250mg/l de PVPP, obteniendo un 100% de las yemas sin síntomas de

fenolización, mencionando que los resultados se debieron a sus características de polímero, que le confieren funciones de absorción específicas para determinadas

moléculas de compuestos orgánicos, como son los fenoles, los cuales son adsorbidos por el PVPP a través de las moléculas de hidrógeno, previniendo así su oxidación y

polimerización (Concepción et al, 2005).

Existen varias técnicas para inhibir la oxidación del tejido vegetal una vez introducido

al cultivo in vitro, entre esas técnicas se encuentra el tratamiento con bajas temperaturas o choque térmico, como se reporta para dos especies africanas de carácter medicinal (O. bullata y W. salutaris), las cuales fueron mantenidas a 4°C durante 24 horas, en una solución antioxidante de ácido cítrico y con ácido ascórbico a un pH de 4.5, esta combinación de tratamientos fue efectivo para O. bullata mientras que para W. salutaris la necrosis de los explantes fue mayor que sin este tratamiento (Kowalski & Van Staden, 2001). Los resultados obtenidos con W. salutaris fueron similares a los expresados por roble coral con este mismo tratamiento, la disminución de la temperatura no causó efecto positivo en la inhibición de la oxidación.

Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos en esta investigación, se concluyó que el

(33)

superficial para introducirlo a condiciones in vitro, permite el uso de desinfecciones

daños en el tejido vegetal de Terminalia amazonia causando una mayor oxidación del explante y por consiguiente su muerte. Por otro lado el hipoclorito de sodio, fue un

desinfectante gentil con el tejido vegetal del roble coral y no así con los hongos o bacterias presentes en el material vegetal. Además, la doble desinfección con NaClO al 3% y 1,5%, durante 5 y 10 minutos respectivamente fue el mejor tratamiento para

controlar la oxidación de los explantes de T. amazonia, al combinar las respuestas esperadas: una contaminación baja y una baja mortalidad de los explantes por

oxidación. En cuanto a los antioxidantes, los tratamientos que incluyeron de L-cisteína y DTT en las tres concentraciones evaluadas causaron daños en el tejido vegetal

provocando la muerte del explante. Por otra parte los tratamientos con el antioxidante dentro del medio de cultivo produjeron una mejor respuesta al reducir la fenolización,

siendo los tratamientos de PVPP a 10g/l en medio semisólido y PVPP a 5g/l en medio líquido, los mejores tratamientos para Terminalia amazonia.

La selección del tratamiento antioxidante depende de la especie con se trabaje. Terminalia amazonia posee una gran cantidad de taninos y fenoles, que rápidamente pueden ser oxidados. También presenta pubescencia o tricomas que favorecen y

aumentan la oxidación del explante por requerir una fuerte desinfección. Durante este estudio, la evaluación de una variedad de antioxidantes permitió descartar compuestos

que dañaron el material, o que no influyeron en la reducción de la oxidación, se logró incluso seleccionar el método más apropiado de adicionaros, al igual que el método de

desinfección que causó menor daño al tejido y mayor porcentaje de explantes asépticos. Mencionar también que existen medidas para la reducción de la oxidación

como el uso de medios de cultivo libres de cobre y hierro, la colocación de los explantes una vez introducidos en el cuarto de crecimiento frío en oscuridad por dos

semanas y realizar varios subcultivos, todas estas medidas se hicieron para el establecimiento in vitro de roble coral con el objetivo de contribuir a la reducción de la fenolización. Además así se permite llegar a algunas recomendaciones que se han de considerar en los ensayos subsecuentes. Para la realización de este trabajo la mayor

dificultad presentada fue la fuente del material vegetal, por lo que se recomienda tener suficiente material en el invernadero para mantenerlo con las condiciones de sanidad

(34)

cantidad de explantes libres de contaminantes exógenos. Así mismo se recomienda el establecimiento de un protocolo de desinfección diferente para los explantes

provenientes del campo, debido a que están cargados con una mayor cantidad de contaminantes exógenos que son más resistentes a la desinfección con NaClO. Sin

importar el origen del explante, ya sea que provenga del invernadero o del campo es recomendable realizar pruebas con antibióticos para disminuir o eliminar la presencia

de las bacterias endógenas. Igualmente debido a la ausencia de brotes durante este periodo de introducciones se recomienda realizar un ensayo con reguladores de

crecimiento para estimular la brotación del explante (se está trabajando en este aspecto actualmente). Al tener determinado el antioxidante con mejor respuesta de sobrevivencia, se debe realizar una mayor cantidad de ensayos para tener

repetitividad y garantizar la efectividad del tratamiento. Por lo tanto, los ensayos se han continuado, tanto en búsqueda de un control máximo de la contaminación y de la

oxidación así como implementando en el medio de cultivo deferentes tipos y suministrado por FUNDECOR, específicamente de fincas ubicadas en Sarapiquí. Con

el fin de evaluar el mejor tratamiento para obtener material clonal de V. guatemalensis de plantas élite, libre de contaminantes como hongos y bacterias se han probado

doce tratamientos diferentes, los cuales se detallan en el cuadro 13.

Para cada tratamiento se redujo el material proveniente de campo, y se realizaron dos

(35)

Cuadro 13. Tratamientos de desinfección de estacas de Vochysia guatemalensis para

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 10% 15 min

Alcohol 70% 3 min

HgCl2 0,1% 16 min

VT1

16

Agroquímicos 2 horas

Zerotolerance 80% 4 min + 4 min

Alcohol 70% 3 min

VT2 71

HgCl2 0,2% 15 min

VT3 (invernadero)

10

Alcohol 70% 3 min

Zerotolerance 50% (estéril) 4 min

VT4 81

Agroquímicos 1 hora

Hipoclorito de Sodio (3,5%ia) 10% (estéril) 10 min

Alcohol 70% 30 seg

VT6 10

Agroquímicos 1 hora

Alcohol 70% 30 seg

VT8 37

Agroquímicos 1,5 hora

Alcohol 70% 30 seg

Hipoclorito de Sodio (5%ia) + HCl 6N (1:1) 12 min

VT9 12

Agroquímicos 1,5 hora

Alcohol 70% 30 seg

(36)

VT10 182 Tradicional

Alcohol antes del cloro

VT11 61

Alcohol 70% 3 min

*Agroquímicos: Agry-Gent Plus 8WP, Afungil 50WP y Zetarán 76WG (4g/l de cada uno) + amoxicilina (500mg/l).

Una vez finalizada la etapa de desinfección los explantes se sembraron en medio de

cultivo líquido con sales WPM al 50%, vitaminas WPM, 3% de sacarosa, pH 5.8 dispensado en tubo y empleando el sistema de puente con papel filtro para soporte el

explante y ascenso del medio por capilaridad.

Desinfección in vitro

Debido al alto porcentaje de contaminación en los explantes de Vochysia guatemalensis después de la introducción, se buscó un protocolo que permitiera desinfectar los explantes in vitro, o bien, controlar la contaminación principalmente por bacteria. Para ello, los cada uno de los explantes fue retirado del tubo de cultivo y sumergido de manera individual, durante 3 minutos, en la solución desinfectante

respectiva que, a su vez fue preparada en condiciones de asepsia, con agua destilada estéril. Posteriormente se realizaron tres lavados y se sembraron los explantes en el

mismo medio de introducción (WPM 50% + 3% sacarosa, pH 5.8).

Se evaluaron tres soluciones del desinfectante comercial Zerotolence

®

27SL

(peróxido de hidrógeno), al 100%, 50% y 30% v/v. Se sembraron 10 explantes por tratamiento y se evaluaron a las seis semanas de realizado el experimento.

Brotación

(37)

Cuadro 14. Tratamientos de brotación de estacas de Vochysia guatemalensis en

E6 Control sin reguladores de crecimiento

Debido a los resultado obtenidos, principalmente, las buenas condiciones mostradas en los explantes cultivados en el tratamiento E1, se decidió repetir el ensayo y realizar

modificaciones. Para ello, se conservó siempre el número de clon, se cortó la base del explante y se colocaron en tres diferentes medios de cultivo detallados en el cuadro

(38)

Figura 12: Botes de Vochysia guatemalensis en etapa de elongación. Brotes después de cuatro semanas de cultivo (imágenes superiores) y ocho semanas después de haber sido retiradas del medio con giberelinas (imágenes inferiores).

A pesar de haber obtenido la elongación de los brotes, la calidad de los mismos dirigió la investigación a optimizar este proceso. Como se observa en la figura 12, las hojas son poco desarrolladas. Se realizó un ensayo con tres tratamientos para elongación

de material de Vochysia guatemalensis en medio semisólido, empleando los medios detallados en el cuadro 16.

Cuadro 16. Composición de los medios de cultivo empleados para elongación de los brotes deVochysia guatemalensis .

Tratamiento Descripción del medio

SS1 WPW 50% + 1mg/l kin + 3mg/l AG3

SS2 WPW 50% + 1mg/l kin + 50mg/l AG3

(39)

Evaluación del Sistema de inmersión temporal (RITA)

Para la disponibilidad de material para el trabajo en RITA se inició con una

introducción de Vochysia guatemalensis proveniente del invernadero del CIB, para lo cual se modificó el protocolo de introducción de clones de esta especie, el cual se muestra a continuación junto con la modificación propuesta.

Se recolectó material mantenido en invernadero. El material se recortó en estacas de uno o dos nudos. Las estacas se lavaron con agua destilada y jabón antibacterial Bactex® dos veces, con una duración de 15 min por lavado en agitación. Se

realizaron lavados con abundante agua destilada hasta eliminar la espuma. Los explantes se incubaron en una solución de agroquímicos conteniendo Agrymicin,

Benomil y Zetarán (5 g/l de cada una) + 0.5 g/l de Amoxicilina. En cámara, se realizaron 4 lavados con agua destilada estéril. Seguidamente los explantes fueron

incubados en una solución de NaOCl al 10% durante 10 min. Se realizaron 3 lavados con agua destilada estéril y se incubaron de nuevo en la misma solución desinfectante

pero al 30% por 10 min. Los explantes se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril. Se incubaron los explantes una solución de etanol al 70% durante 2 min y de

nuevo se realizaron 3 lavados con agua destilada estéril. Para la desinfección se agregó a los explantes una solución de HgCl2 al 0.1% durante 15 min. Pasado este periodo, se realizaron 5 lavados con agua destilada estéril. Finalmente, las estacas fueron cultivadas en medio WPM líquido al 50% con puentes de papel filtro.

Se sembraron un total de 37 explantes, los cuales fueron colocados a 25±2 °C y luz directa y fueron subcultivados cada tres semanas. Del total de explantes iniciales, se obtuvo un remanente de 2 estacas, siendo la mayor causa de pérdida la

contaminación por hongo.

El medio de introducción correspondió a sales y vitaminas WPM al 50%, sin

reguladores, al 3% de sacarosa y un pH de 5.8; por otra parte, el medio de subcultivo consistió en sales y vitaminas WPM al 50%, suplementado con 5 mg/l de kinetina, 10

mg/l de BAP y 100 mg/l de pantotenato de calcio, al 3% de sacarosa y un pH de 5.8.

Al ser insuficiente la brotación generada con el medio de subcultivo original, se

procedió a plantear 5 tratamientos de inmersión temporal en RITA con la finalidad de

promoverla, los cuales se presentan en el cuadro 17; cabe destacar que por RITA se

colocaron 200 ml de medio de cultivo. Para todos los casos el medio contenía 3% de

(40)

Cuadro 17. Composición de los tratamientos propuestos para promover la brotación de explantes de Vochysia guatemalensis.

Tratamiento Sales y vitaminas Suplementos Clon/explante

T1 WPM, 50%

El tiempo de inmersión para los tratamientos 1 y 2 se estableció en 2 minutos en un intervalo de 12 horas, mientras que se cambió a 1 minuto cada 12 horas para los tratamientos 3, 4 y 5. La evaluación de los tratamientos de brotación se realizó

transcurridas un cinco semanas desde la colocación de los explantes, con lo cual se evidenció que los explantes colocados en T1, T3 y T4 no presentaron un incremento

en la brotación, el explante en T2 se contaminó con hongo y bacteria y el explante en T5 fue el único que mostró una respuesta positiva en cuanto a brotación, tal y como se

(41)

Figura 13. Explantes de Vochysia guatemalensis en RITA : a) Clon 101-3 en medio T3 (1 mg/l kinetina + 50 mg/l de AG3 + 3 ml/l PPM , b) Clon 101-3 en medio T5 (MS + 100

mg/l pantotenato de calcio + 7 mg/l AgNO3).

La concentración de nitrato de plata en el medio T5 se mostró como el suplemento favorecedor de la brotación de V. guatemalensis, y su utilización en este ensayo respondió a la sugerencia de los autores Parimalan, Giridhar y Ravishankar (2011), para la elongación de brotes de Bixa Orellana (achiote), en una concentración de 40 μM en medio M S, es decir, aproximadamente 7 ml/l. El nitrato de plata es una sal inorgánica, que actúa como antiséptico y desinfectante.

Una vez concluido el tiempo del ensayo de brotación, se procedió a trasladar los explante de T3 y T4 al medio T5, para promover la brotación, mientras que con el explante procedente de T5 se realizó una prueba de cambio de medio para corroborar si con la adición de BAP como regulador, era posible promover la elongación de los brotes. Además ya se contaba con nuevos explantes brotados provenientes de introducciones y subcultivos anteriores de clones, por lo que en el cuadro 15 se muestra la distribución de los mismos. Los explantes fueron sometidos a una inmersión de 1 minuto cada 12 horas en 200 ml de medio de cultivo.

La evaluación de los explantes en proceso de brotación y elongación se realizó a las cinco semanas después de montados los tratamientos, y los resultados obtenidos se muestran en el cuadro 15.

El medio S1T5 consistió de sales y vitaminas M S al 100%, 1 mg/l de BAP y 100 mg/l de pantotenato de calcio, al 3% sacarosa y un pH de 5.8. No obstante este tratamiento (RITA 6) generó una multibrotación, probablemente debido a que la benzilaminopurina (BAP) es una citocinina que promueve la formación de brotes (Vilchez et al., 2009). Lo anterior se respalda con las imágenes de la figura 9.

a

(42)

Cuadro 15. Distribución de clones de Vochysia guatemalensis en RITA con medio

Cuadro 16. Resultados del tratamiento de brotación T5(MS + 100 mg/l pantotenato de

calcio + 7 mg/l AgNO3) y medio S1T5 (M S al 100%, 1 mg/l de BAP y 100 mg/l de

pantotenato de calcio, al 3% sacarosa y un pH de 5.8) en explantes de Vochysia guatemalensis en RITA .

RITA Resultado de la evaluación

(43)

Figura 14. Explantes de Vochysia guatemalensis en RITA 6 con medio de S1T5: a) Explante al inicio del tratamiento, b) Explante al final del tratamiento.

En las figuras 15, 16, 17 y 18 se muestran las imágenes comparativas entre la

apariencia de los explantes en las RITA 1, 2, 3 y 8 al inicio del tratamiento y al concluir el mismo.

Figura 15. Explantes de Vochysia guatemalensis en RITA 1 con medio de T5: a) Explante al inicio del tratamiento, b) Explante al final del tratamiento.

a _b

(44)

b a

(45)

Una vez concluido el período de cinco semanas para la promoción de la brotación, los explantes sobrevivientes se emplearon en el montaje de tres tratamientos en RITA para la elongación de los brotes, como se detalla en el cuadro 16. Estos explantes serán evaluados en cinco semanas para corroborar la respuesta generada. Al igual que en tratamientos anteriores, por RITA se colocaron 200 ml de medio de cultivo y la inmersión es de 1 minuto cada 12 horas. Además todos los medios contienen 3% de sacarosa y pH de 5.8.

Cuadro 16. Composición de los tratamientos propuestos y distribución de clones para promover la elongación de explantes de Vochysia guatemalensis en RITA

RITA Procedencia de

completamente libre de reguladores, por lo que parte de este último ensayo consiste en evaluar en un período también de cinco semanas, la respuesta de dos explantes,

uno de la RITA 1 (invernadero) y otro de la RITA 6 (101-3), en tubos de ensayo con 20

ml de medio semisólido M S al 100% de sales y vitaminas, pH 5.7 y 3% sacarosa,

(46)

Figura 18. Explantes de Vochysia guatemalensis en medio M S semisólido sin reguladores: a) Explante proveniente de RITA 1, b) Explante proveniente de RITA 6.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Introducción de material in vitro

De los tratamientos evaluados, no se ha logrado obtener material completamente limpio, ya que la mayor parte del mismo se presentó una bacteria con el tiempo de cultivo. Se han presentado contaminantes por hongo y bacteria las primeras semanas

después de la introducción, mientras que en algunos casos, el material que aparentemente se encontraba limpio en las primeras evaluaciones (de los siete a los

21 días), evidenció la contaminación después de este periodo de cultivo, principalmente bacteriana, por lo cual se catalogaron como contaminantes endógenos.

En el cuadro 17 se muestran los resultados de los diferentes tratamiento de desinfección de estacas de Vochysia guatemalensis evaluados a los 21 días de cultivo responsables de las mayores pérdidas por contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas (Carranza et al. 2003).

(47)

Cuadro 17. Evaluación de tratamientos de desinfección para introducción de estacas de V. guatemalensis.

Tratamiento Sembrados Contaminación Oxidación Remanente % Éxito

Las principales limitantes del establecimiento in vitro de explantes procedentes de plantas leñosas son presencia de microorganismos contaminantes y la oxidación de los explantes causada tanto por el efecto de los desinfectantes causado directamente

sobre el material vegetal, como por la liberación de compuestos fenólicos provocada por el estrés del proceso de esterilización y corte de los segmentos introducidos (Biasi

et al., citado por Borges et al., 2004; Azofeifa, 2009) (figura 19)

Los contaminantes endógenos, como su nombre lo indica, son aquellos que se

encuentran presentes en los tejidos internos de los explantes y son uno de los factores

Figura 19. Principales limitantes del proceso de introducción de V. guatemalensis. A: Contaminación con bacteria endógena en el medio de cultivo. B: Hongo sobre el soporte. C: Oxidación

(48)

La presencia de bacterias endógenas en el cultivo de V. guatemalensis es esperado desde la perspectiva de que este tipo de contaminantes son frecuentes en cultivos in vitro iniciados a partir de explantes tomados de árboles adultos crecidos en campo; en el caso de las bacterias, pueden tardar en aparecer en el cultivo debido a que

generalmente se mantienen latentes por semanas o incluso meses, hasta que los mecanismos de resistencia de las plantas in vitro se debiliten o surjan cambios en el medio ambiente del frasco de cultivo que favorezcan su crecimiento visible, incluso se reporta que la presencia de citocininas puede inhibir su crecimiento (Carranza et al. 2003 y Marín et al., 2011).

Como respuesta a la presencia de contaminantes endógenos en los explantes, se proponen prácticas de cultivo que permitan reducir la carga de contaminantes, tales

como el subcultivo frecuente y por períodos cortos de los explantes.

Además, Marín et al (2011), lograron inhibir por completo el crecimiento microbiano en una variedad de manzano, mediante tres subcultivos sucesivos de los ápices en medio de cultivo con antibiótico (cefotaxima concentración de 150 mg/l), a partir de los

cuales no se detectó ningún crecimiento bacteriano en el medio ni en placas PYGA.

La adición de antibióticos al medio de cultivo, es una práctica viable que puede

probarse en V. guatemalesis como mecanismo para reducir la carga bacteriana o bien eliminar la contaminación, tomando en cuenta las variaciones en los métodos de

desinfección que se han realizado en los últimos ensayos (George et al. 2008).

Para ello deben realizarse ensayos de aislamiento de las bacterias endógenas más

comunes en la especie y sensibilidad a antibióticos (Reed et al., 1995).

Es importante mencionar que se obtuvo brotación en las estacas introducidas in vitro, inclusive en medio sin reguladores de crecimiento y que la presencia de bacteria

(49)

Desinfección in vitro

La desinfección del material introducido in vitro, empleando el producto comercial Zerotolence® 27SL, redujo la carga bacteriana en los explantes, sin embargo, no logró

eliminar por completo la contaminación endógena presente en los mismos. Los resultados de la evaluación se muestran en el cuadro 18.

Cuadro 18. Resultado de los tratamientos de desinfección de explantes de Vochysia guatemalensis establecidos in vitro a las 6 semanas de realizado.

Tratamiento Descripción

El Zerotolerance®, posee como ingrediente activo el peróxido de hidrógeno (27%), el cual actúa como fungicida, alguicida y bactericida de amplio espectro. Su actividad

antimicrobiana está basada en su potente poder oxidante, que le permite reaccionar con grupos sulfhidrilo y dobles enlaces en proteínas y lípidos, afectando por lo tanto a la membrana citoplasmática. Puede además inducir la formación de radicales libres

que actúan contra el ADN, lípidos y otros componentes celulares esenciales (Block, citado por Perera et al., 2012).

(50)

Estos resultados muestran que, si bien el tratamiento D1 presenta un mayor porcentaje de desinfección, se reduce el porcentaje de brotación de los explantes y

aumenta la oxidación de los mismos. Esto puede deberse a la acción fitotóxica del agente desinfectante sobre el explante, que es en muchas ocasiones, el responsable

de acentuar el problema de oscurecimiento en los mismos (Aliyu, 2005). Es importante mencionar que los explantes, ya fueron sometidos a otro tratamiento de desinfección

previo, con detergentes, como el hipoclorito de sodio y alcohol que remueven las ceras naturales que protegen el explante, permitiendo una mayor absorción de los

desinfectantes pero a la vez haciéndolos más susceptibles a los daños por oxidación (Lallana et al 2006).

Por otra parte, el tratamiento D3 muestra un porcentaje de desinfección bajo (20%), y

brotación de 100%, de lo cual se puede inferir que los microorganismos contaminantes no afectan específicamente la etapa de brotación de los explantes, sin embargo, el

objetivo del proyecto es contar con material limpio por completo de los mismos.

Como consecuencia, el tratamiento D2, muestra un mejor balance entre la cantidad de

explantes libres de contaminantes y la brotación de los mismos, es decir, el proceso de desinfección no provoca un daño profundo en las yemas que impida su posterior

brotación.

Con los subcultivos, se notó que la aparición de una bacteria endógena en todos los

tratamientos, lo cual indica que la desinfección superficial reduce la carga bacteriana, pero no es suficiente para obtener material libre de contaminantes.

Brotación

Los tratamientos denotados como E1 (suplementado con 1mg/l de Kinetina) y E5 (60mg/l de AG3) mostraron los mejores resultados de brotación con porcentajes de 63,6 y 66,6% respectivamente según se muestra en el cuadro 19.

Cuadro 19. Evaluación del ensayo de brotación de estacas de Vochysia guatemalensis en condiciones in vitro

Tratamiento Brotes Oxidación Pérdidas Total %Brotación

(51)

Los explantes provenientes del tratamiento E1 se muestran en mejores condiciones, es decir, con brotes más desarrollados y, en apariencia, más saludables, por lo cual se

decidió repetir el ensayo y realizar modificaciones (figura 21). Para ello, se conservó siempre el número de clon, se cortó la base del explante y se colocaron en tres

diferentes medios de cultivo detallados en el cuadro 20.

Cuadro 20. Evaluación del efecto de la kinetina (kin) y el ácido giberélico (AG3) en la brotación de estacas de Vochysia guatemalensis en condiciones in vitro

Tratamiento Descripción _{# Sembrados} _Brotación% _{grandes *}% Brotes % _Elongación

E1 1mg/l de Kin

16 68,75 12,50 0

E1 mod

1mg/l de kin + 100mg/l de AG3

18 66,67 16,67 0

E7 100mg/l de AG3

17 64,71 11,76 0

* Con más de tres hojas formadas. Todos los medios se prepararon con las sales WPM al 50% + PPM 3ml/L + 3% sacarosa

Mediante el análisis estadístico ANOVA empleando el programa Minitab 15.1.0.0, se

determinó que no existen diferencias significativas entre los tratamientos evaluados, es decir, la presencia de AG3 en el medio de cultivo no provoca cambios significativos en la brotación de los explantes.

(52)

Elongación

Con base en los resultados obtenidos se puede inferir que el uso de RITA’s para la

obtención de brotes saludables sería muy recomendable. Una vez obtenidos lo9s

brotes, los cuales mostraron una calidad sobresaliente, su transferencia a medio semisólido para la elongación sería lo recomendable.

En cada uno de los medios de cultivo evaluados, los brotes conservaron su coloración

verde y apariencia saludable, sin embargo no se obtuvo elongación de los mismos, es

decir, crecen similares a rosetas y no se obtienen entrenudos alargados como se muestra en la figura 22.

Este comportamiento pudo deberse a la ausencia de la señal hormonal necesaria para desencadenar la división celular de las células en el meristemo respectivo o bien, el

crecimiento de las células de la zona de elongación.

Por lo general, las auxinas son las fitohormonas que influencian tanto la división, como

el crecimiento y diferenciación celular sin embargo, la elongación de los tallos, requiere de un balance en la concentración hormonal en el medio de cultivo, principalmente de

auxinas y citocininas, ya que los explantes poseen niveles endógenos de reguladores del crecimiento, especialmente poliaminas, los cuales actúan como cofactores morfogénicos (Sánchez et al., 2002; Jordán y Casaretto, 2006). En algunas ocasiones,

(53)

se dificulta encontrar el tipo de hormona y la concentración exógena necesaria para la elongación de los brotes en condiciones in vitro, ya que altas concentraciones pueden causar un efecto inhibitorio de este proceso, mientras que la reducción de los niveles, ya sea de auxina o citoquinina, tiene efectos distintos Sánchez et al., 2004).

Por otra parte, la presencia la bacterias endógenas en el cultivo puede afectar tanto el crecimiento de brotes como a la organogénesis de brotes y raíces adventicias; como

en el caso de manzano, donde se determinó que el inhibir el crecimiento bacteriano por medio de antibióticos, mejora el crecimiento en los brotes y la expansión de las

(54)

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Los resultados obtenidos en este año de investigación en Terminalia amazonia y Vochysia guatemalensis mostraron la factibilidad de introducir, brotar las estacas e inducir la elongación de los brotes producidos. Sigue siendo la etapa de

establecimiento in vitro de las especies la más limitante. El material de campo, por coexistir por años con otros organismos en su ambiente natural, desarrollan relaciones

estrechas con ellos y esto resulta en la necesidad de aplicar desinfecciones muy drásticas a los explantes, lo que conduce a daños severos y fuertes oxidaciones. Por

lo anterior es importante lograr un equilibrio entre concentración y tipo de desinfectantes y daño al explante, de manera que un porcentaje razonable de material

experimental resulte aséptico, con oxidación de moderada a leve y sea capaz de brotar. Estas consideraciones son importantes ya que no siemp0re es posible

mantener el material de interés en invernadero.

Debido a que una vez establecidos in vitro, después de un mes o más de cultivo, los explantes muestran contaminación por hongos, pero principalmente por bacterias, la desinfección in vitro, utilizando los desinfectantes estériles, combinado este procedimiento con subcultivos sucesivos y por períodos cortos en medio de cultivo

con antibióticos con lo cual podría eliminarse la bacteria endógena que se presenta.

El uso de otros sistemas de cultivo, adicionales al medio semisólido y líquido sobre

puente de papel filtro, por ejemplo, el sistema de inmersión temporal en el periodo de elongación y multiplicación de brotes es recomendable para Vochysia guatemalensis, no así para Terminalia amazonia, que por su alta susceptibilidad a la oxidación no resistió este tipo de sistema de cultivo.

Se logró la elongación y multiplicación de los brotes de Terminalia amazonia, utilizando diferentes reguladores de crecimiento y sus combinaciones, sin embargo, el

lento crecimiento de estos brotes parece direccionar la investigación a acelerar el periodo de crecimiento de la especie. También fue factible la desinfección de semillas

de Terminalia amazonia empleando hipoclorito de sodio en concentraciones bajas, lo cual no afectó la viabilidad de las mismas y permitió tener material para realizar ensayos de multiplicación y cultivo in vitro de esta especie. Lo más recomendable en esta etapa de la investigación es la adquisición de semillas con mayores porcentajes de viabilidad, ya que esta especie parece tener semilla recalcitrante. En estos casos

(55)

ingreso al laboratorio, ya las semillas recalcitrantes pierden su capacidad de germinación en pocos días.

AGRADECIMIENTO

A la Vicerrectoría de Investigación y Extensión del Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR), a la Fundación para el Desarrollo de la Cordillera Volcánica Central

(FUNDECOR) y al MICIT-CONICIT por el apoyo financiero para el desarrollo de esta investigación. A los Estudiantes-asistentes del Centro de Investigación en