Caracterización de las alteraciones plaquetarias inducidas por interferones tipo I

Universidad de Buenos Aires

Facultad de Farmacia y Bioquímica

Laboratorio de Trombosis Experimental

Instituto de Medicina Experimental – CONICET

Academia Nacional de Medicina

CARACTERIZACIÓN DE LAS ALTERACIONES

PLAQUETARIAS INDUCIDAS POR

INTERFERONES TIPO I

Tesis de Doctorado

Autor: Lic. Leonardo Rivadeneyra

Director: Dr. Roberto Pozner

Directora adjunta: Dra. Mirta Schattner

Consejero de estudios: Dra. Alejandra Scazziota

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Reconocimiento

Mi reconocimiento al Instituto de Medicina Experimental, a la Academia

Nacional de Medicina y a la Facultad de Farmacia y Bioquímica por brindarme

el ámbito para realizar mis estudios de doctorado.

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por

otorgarme las becas que me permitieron llevar a cabo el presente trabajo.

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“Estudiar no es un acto de consumir ideas, sino de crearlas y

recrearlas.”

Paulo Freire

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Agradecimientos

A Roberto, por confiar en mí desde un principio, aún sin conocerme. Por permitirme entrar al laboratorio, brindarme el lugar para realizar este trabajo y conocer junto con vos a gente increíble. Gracias por estar siempre cerca mío, acompañarme, escucharme y estar siempre disponible para mis preguntas e inquietudes. Gracias por todas las anécdotas que me llevo, sin duda, no hay otro Pozner en otro labo. Gracias Rober!!

A Mirta, porque sin vos nada hubiera sido posible. Porque desde el primer momento en que te necesite me escuchaste y aconsejaste, tanto desde lo laboral como lo personal. Porque me guiaste de cerca en un principio y con el tiempo me fuiste dando la libertad que necesitaba. Porque esa confianza que me brindaste me hizo creer aún más en mí mismo. Gracias por todas las veces que me senté con vos a escribir, sin duda todo lo que me transmitiste se queda conmigo para el futuro. Porque sos un gran ejemplo de vocación, dedicación y fuerza de trabajo. Porque además de todo eso, que ya es un montón, siempre podemos charlar de alguna peli, serie o de cualquier otra cosa. Gracias por todo Mir!

Agos, gracias por ser mi primera gran compañera de trabajo y convertirte rápido en mi “esposa de paper”, me encantó! Porque volamos juntos (literalmente) y fue una experiencia inolvidable, no podría haber tenido mejores compañeras de viaje. Porque te acordás de mi cada vez que suena “la canción” y yo, sin duda, me acuerdo de vos. Porque me escuchaste siempre y me dejaste conocer tu faceta conversadora, y aunque a veces no hables, me miras y nos entendemos. Gracias por ser mi amiga, agradecerte ahora por leer la tesis con tu minuciosidad ya queda chico al lado de tu amistad. Te quiero!

Juli, gracias por compartir tantas cosas conmigo, música, chistes y todas esas cosas que solo vos y yo podemos decir! Siempre me prestaste tu oreja, me escuchaste y aconsejaste cuando lo necesite. Porque tengo el honor de ser uno de

5 los pocos a los que le respondes cuándo estas trabajando (bueno, casi siempre!!) y porque con el tiempo construimos una linda amistad. Gracias, te quiero!!

Pao, te convertiste rápidamente en mi primera gran confidente y nada podría haber sido mejor. Compartí con vos muchas de mis primeras quedadas hasta tarde y no podía sentirme más cómodo, siempre dispuesta a escuchar y, obvio, a conversar (casi casi, tanto como yo). Porque siempre me incentivaste en esas decisiones para las que soy medio lento y porque con el tiempo dejaste de ser una gran compañera de trabajo (que recibía mis abrazos) a una amiga (que ahora me los da!). Gracias!!! Te quiero!

Sole, gracias por estar siempre dispuesta a escucharme y darme una palabra justa de aliento y transmitirme tranquilidad. Porque con el tiempo dejaste de ser la “investigadora que aconseja” para ser mi amiga. Gracias por las salidas juntos, por emocionarte conmigo y darme un golpecito o apretarme el brazo y transmitirme todo lo que sentís! Y Porque cada vez que me llevas a casa me gusta que vayas despacito para poder hablar y chusmear un poco más con vos. Te quierooo! Gracias!!

Agus, fuiste de las últimas en entrar pero en seguida supe que tu faceta de “la nueva” iba a durar poco. Desde la primer salida juntos supe que iba a estar bueno tenerte cerca, y no me equivocaba. En seguida conectamos con las series y los miles de comentarios ácidos y en tiempo record pasaste de ser una compañera a ser mi amiga. Gracias por escuchar siempre mis catarsis, por compartir las tuyas y por hacerme compañía siempre que la necesito. Gracias!! Te quiero!!

A Tomás y Antonio, las incorporaciones más recientes, gracias por la compañía diaria y por estar dispuestos a ayudar siempre!. Gracias!

Majito, me encantó compartir todos esos años de trabajo con vos. Siempre dispuesta a ayudarme y a acompañarme y a escuchar mis interminables catarsis (cuantas H de los T compartidas! Jaja) y a darme una palabra dulce de aliento.

6 Gracias por todos los apodos que me dejaste, sin duda, nunca voy a conocer una apodadora como vos! Te extraño siempre!. Gracias! Te quiero!!

Alber, no podría haber sido más genial encontrarte en el labo. Gracias por todas las enseñanzas del principio, por los consejos y el aguante constante. Me encantó compartir mesada y ser vecinos de computadora con esos gritos que solo nosotros podíamos dar. Viajar con vos fue de las mejores cosas que me paso en el doctorado. Te extrañé en el lab te fuiste pero seguimos compartiendo el día a día y te convertiste en una gran amiga que ya siento irremplazable. Gracias por todo!

A Deni, gracias por la amistad que me brindaste en tiempo record (aguante SAIC-SAI!!), por estar siempre disponible para alguna visita por el lab y por compartir todo, desde laboral hasta lo personal. Estoy seguro que estamos en el comienzo de una gran amistad que va a durar mucho tiempo!

A los técnicos, becarios e Investigadores del Instituto, por su colaboración con reactivos, enseñanzas o, más importante aún, por la buena onda de los pasillos y los momentos compartidos en los laboratorios. Un particular agradecimiento a los técnicos del Bioterio (Tito y Gaby) por su gran colaboración!!

A la Dra. Cecilia Gamba y a todos los integrantes del Banco Público de Sangre de Cordón Umbilical del Hospital Garrahan por su cordial cooperación proveyendo las muestras necesarias para realizar parte de este trabajo.

A la Dra. Alejandra Scazziota, mi consejera de estudios, por su ayuda y guía durante el doctorado.

A Ricardo Gomez por sus críticas y aportes sobre este trabajo y por permitirme colaborar con él en tantos otros.

A Mati y Mandi, por las viejas épocas y la compañía constante cuando decidí emprender esta nueva etapa. Por ser mis amigos aún en las diferencias.

7 A Maia por hacerme compañía diaria, aunque no nos veamos seguido. Por escucharme y compartir tus cosas conmigo y por delirar juntos cada vez que miramos un capítulo nuevo de esas series que tanto nos gustan. Por ser una gran amiga! Te quiero!!!

A Majo, gracias por tantos momentos y charlas compartidas. Gracias por compartir conmigo todos los días desde la facu y seguir siendo cada vez más amigos. Por todas esas cenas catárticas que tenemos y por convertirte en una amiga entrañable! Gracias!! Te quiero!

A Dani, por acompañarme y ser mi amiga desde que “éramos unos niños”! Por compartir el día a día aunque no nos veamos seguido. Sos el claro ejemplo de que aún a la distancia, no solo se puede mantener una amistad, sino que puede volverse cada día más grande. Te quiero!!

A mi Papá, por haberme inculcado valores que quedaron conmigo para siempre. Por enseñarme que todo es mejor con bondad y amabilidad y por haber guiado mis decisiones. Seguramente estarías compartiendo conmigo este momento con mucho orgullo.

A Guada y Mamá, dos de las personas más importantes de mi vida. Mami, sos un ejemplo de superación, seguiste siempre adelante y siempre pensando en nosotros. Guanki, sos una gran hermana, sé que siempre voy a poder confiar en vos y contar con tu ayuda, así como vos con la mía. Gracias por ayudarme a encontrar el camino hace muchos años cuando no sabía muy bien que hacer, sin ustedes esto no hubiera sido posible. Gracias por incentivarme, escucharme y estar siempre a mi

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Publicaciones

Parte de los datos presentados en esta Tesis dieron lugar a las siguientes publicaciones:

1. Poly (I:C) downregulates platelet production and function through type I interferon.

Rivadeneyra L, Pozner RG, Meiss P, Fondevila C, Gomez RM, Schattner M. Thrombosis and Haemostasis 2015; 114(5). [Epub ahead of print]

2. Pathogenic mechanisms involved in hematological alterations of Arenavirus-induced Hemorrhagic fevers.

Schattner M, Rivadeneyra L, Pozner RG, Gomez RM. Viruses 2013; 5: 340-51.

Presentaciones a congresos:

1. Alteraciones de la megacario/trombopoyesis y la función plaquetaria mediada por interferón beta.

Rivadeneyra L; Pozner RG, Fondevila C, Meiss R, Gomez RM, Schattner M. Acta Bioquímica Clínica Americana 2014, P52. Pag. 73.

2. Rol del interferón beta en la producción y función de plaquetas.

Rivadeneyra L, Pozner RG, Fondevila C, Meiss R, Centurión M, Gomez RM, Schattner M. Medicina (Buenos Aires) 2013; 73 (Supl. III): 410.

3. Type I interferon dampen platelet production and function.

Rivadeneyra L, Pozner RG, Negrotto S, Fondevila C, Gomez RM, Schattner M. J Thrombosis and Haemostasis 2013 Vol. 11. 111. El trabajo fue premiado con un travel award para su presentación.

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INDICE

RESUMEN ... 12

ABREVIATURAS ... 15

INTRODUCCIÓN ... 18

Desarrollo megacariocítico y producción de plaquetas ... 19

1.1 Megacariocitopoyesis ... 19

1.2 Trombopoyesis ... 22

1.3 Rol del microambiente medular en la formación de plaquetas ... 26

Fisiología plaquetaria ... 30

2.1 Generalidades ... 30

2.2 Estructura ... 31

2.3 Respuestas de activación plaquetaria ... 32

2.4 Ciclo de vida de las plaquetas ... 36

Interferones tipo I ... 37

3.1 Generalidades ... 37

3.2 Reconocimiento de ARN viral y producción de IFN I ... 38

3.3 Trombocitopenia mediada por IFN I ... 39

OBJETIVOS ... 42

Objetivo general ... 43

Objetivos específicos ... 43

MATERIALES Y MÉTODOS ... 44

4. Ensayos in vitro... 45

4.1 Avales y consentimiento informado ... 45

4.1 Purificación de células hematopoyéticas CD34+ humanas ... 45

4.2 Expansión de MCs ... 46

4.3 Tratamiento con Poly (I:C) o IFN I ... 46

4.4 Expresión de glicoproteínas de membrana ... 46

4.5 Capacidad de unión del fibrinógeno en plaquetas derivadas de cultivo ... 47

5 Ensayos in vivo ... 47

5.1 Animales ... 47

5.2 Diseño experimental ... 48

5.3 Recuento de sangre periférica ... 48

10

5.5 Expresión de CD61 extracelular y P-selectina intracelular. ... 49

5.6 Unión de fibrinógeno y exposición de P-selectina ... 49

5.7 Secreción de FvW y RANTES de los gránulos  ... 50

5.8 Formación de agregados mixtos plaquetas-neutrófilos ... 50

5.9 Formación de filopodios y lamelipodios (spreading) de plaquetas ... 51

5.10 Ensayo de adhesión en placa ... 51

5.11 Tiempo de sangría ... 51

5.12 Retracción del coágulo ... 52

5.13 Histología de médula ósea ... 52

5.14 Aislamiento de células de la médula ósea ... 53

5.15 Obtención del ARN total ... 53

5.16 Síntesis de ADN complementario ... 54

5.17 Amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ... 54

5.18 Determinación de los niveles de IFN plasmáticos y de MO ... 55

5.19 Determinación de PGI2 plasmática ... 55

5.20 Análisis estadístico ... 55

RESULTADOS ... 56

6. Efectos del Poly (I:C) y de los IFN I en las respuestas efectoras de plaquetas generadas in vitro ... 57

6.1 Los IFN I y el Poly (I:C) inhiben la unión del fibrinógeno a la integrina IIb3 plaquetaria ... 57

6.2 Expresión de la integrina IIb ... 59

7. Ensayos in vivo ... 60

7.1 Efectos de la producción de IFN sobre el recuento plaquetario ... 60

7.2 Evaluación del efecto directo del Poly (I:C) sobre la funcionalidad plaquetaria ... 61

7.2 Efecto del Poly (I:C) sobre los MCs residentes en la MO ... 63

7.3 El Poly (I:C) afecta las respuestas funcionales de las plaquetas ... 65

7.4 El Poly (I:C) altera la hemostasia primaria ... 68

7.5 Las alteraciones mediadas por Poly (I:C) no están asociadas a un efecto agudo sobre las plaquetas ... 71

7.6 Las alteraciones mediadas por Poly (I:C) dependen de su concentración 75 7.7 Las alteraciones plaquetarias correlacionan con los niveles de IFN plasmáticos ... 79

7.8 El IFN es el mediador involucrado en las alteraciones de la megacario/trombopoyesis mediada por Poly (I:C) ... 81

11 DISCUSIÓN ... 85 CONCLUSIÓN ... 100 BIBLIOGRAFIA ... 103

12

RESUMEN

13 Los interferones tipo I (IFN I) son elementos claves en la respuesta inmune antiviral que regulan diferentes procesos de varios tipos celulares gracias a su capacidad inmunomoduladora y antiproliferativa. Varios tipos de interferones han sido aprobados para su uso en humanos para el tratamiento de la hepatitis C y, junto con la quimioterapia y la radioterapia, en el tratamiento del cáncer entre otros. A pesar de sus efectos beneficiosos, uno de los efectos no deseados es la inducción de trombocitopenia debido a su efecto antiproliferativo. Además, la disminución del número de plaquetas es un fenómeno frecuentemente observado durante el curso de diferentes infecciones virales. Estudios previos incluyendo reportes de nuestro grupo, mostraron que los IFN I eran capaces de regular selectivamente la producción plaquetaria abriendo nuevos mecanismos sobre el modo de acción de esta citoquina. De esta manera, en este trabajo de Tesis profundizamos el conocimiento del rol de los IFN I sobre el proceso de megacario/trombopoyesis.

Utilizando un modelo de generación de megacariocitos y producción de plaquetas humanas in vitro encontramos que el Poly (I:C) (mimético de los productos ARN doble cadena de replicación viral e inductor de la síntesis de IFN I), además de alterar cuantitativamente la biogénesis plaquetaria, también produce alteraciones a nivel cualitativo ya que las plaquetas de cultivos tratados con este ARN doble cadena presentaron una menor capacidad de unir fibrinógeno, una de sus principales funciones hemostáticas. Esta alteración fue reproducida por IFN y recombinante humano y no estuvo asociada a una menor expresión de su principal receptor, la integrina IIb3.

Los hallazgos in vitro fueron confirmados en modelos experimentales in vivo en los cuales se observó que la administración de Poly (I:C) en ratones indujo un aumento en los niveles de IFN tanto plasmáticos como medulares. Este aumento se vio acompañado de una disminución en el recuento plaquetario y un aumento en el volumen plaquetario medio (VPM). La trombocitopenia no fue debida a un mayor consumo de plaquetas ni a un menor número de megacariocitos, sino a un aumento en el tamaño de los mismos y un menor contacto con los sinusoides medulares. Las plaquetas de los animales tratados mostraron disminuida su función hemostática

14 (unión de fibrinógeno y liberación de factor von Willebrand) y pro inflamatoria (exposición de P-selectina, formación de agregados mixtos y liberación de RANTES). La alteración en el recuento y la funcionalidad plaquetaria tuvieron un fuerte impacto en la hemostasia primaria prolongando el tiempo de sangría y disminuyendo la adhesión de las plaquetas. Sin embargo, de manera contraria, el spreading plaquetario y la retracción del coágulo fueron mayores.

Las alteraciones observadas tanto en el tamaño de los megacariocitos como en su distribución en la médula ósea, así como en las respuestas efectoras de las plaquetas mostraron una correlación lineal con los niveles de IFN I producidos, fueron reproducidas por la administración de Imiquimod (un inductor de IFN I estructural y funcionalmente diferente al Poly (I:C)) y ninguna de ellas se observó en ratones deficientes del receptor de los IFN I que fueron tratados con ambos inductores.

En conjunto, estos datos presentan a los IFN I como nuevos reguladores de la megacario/trombopoyesis y señalan que el aumento de estas citoquinas podría ser uno de los mecanismos asociados a la trombocitopenia que subyace a las infecciones virales u otras patologías que cursan con altos niveles de IFN I. Además, estos hallazgos abren nuevas avenidas para la investigación de los procesos que subyacen a la fisiopatología de la biogénesis plaquetaria.

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ABREVIATURAS

16 ADN: Ácido desoxiribonucleíco

ADP: Adenosin difosfato ARNdc: ARN doble cadena ARNsc: ARN simple cadena ATP: Adenosin trifosfato CD40L: CD40 ligando

CMH: Células Madre Hematopoyéticas FHA: Fiebre hemorrágica argentina FvW: Factor von Willebrand

IFN I: Interferones tipo I

IFNAR: Receptor de Interferón tipo I IL-1: Interleuquina 1

IQ: Imiquimod

IRF9: Factor regulador de interferón 9

ISGF3: Factor génico estimulado por interferón 3 ISRE: Elementos de respuesta sensibles al interferón JUNV: Virus Junín

LCMV: Virus de la coriomeningitis linfocítica

MAVS: Adaptador mitocondrial de señalización antiviral MCp: Megacariocitopoyesis

17 MO: Médula ósea

NFB: Factor de transcripción nuclear k B ON: Óxido nítrico

PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos PGI2: Prostaciclina

Poly (I:C), P(I:C): Ácido poliinosínico-policitidílico SCA: Sistema canalicular abierto

SDF-1: Factor derivado del estroma 1 SDM: Sistema de demarcación de membrana STD: Sistema tubular denso

TLRs: Receptores tipo Toll TPO: Trombopoyetina TXA2: Tromboxano A2

18

INTRODUCCIÓN

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Desarrollo megacariocítico y producción de plaquetas

1.1 Megacariocitopoyesis

La megacariocitopoyesis (MCp) es el proceso por el cual las células madre hematopoyéticas (CMH) son comisionadas, proliferan y se diferencian a megacariocitos (MCs) maduros. Los MCs son células altamente especializadas cuya función es producir y liberar plaquetas a la circulación sanguínea. Estas células son fácilmente identificables dentro de la médula ósea (MO) ya que poseen un gran tamaño y un núcleo multilobulado y poliploide.

Conceptualmente, la MCp puede ser dividida en dos grandes etapas. La primera proliferativa, la cual permite expandir el número de células que darán lugar a los precursores megacariocíticos y una segunda madurativa. Durante esta última etapa, se producen los dos procesos principales que darán lugar a un MC maduro: la endomitosis a nivel nuclear y la maduración citoplasmática. Si bien a lo largo del tiempo se han utilizado diferentes características morfológicas, tinciones histológicas o marcadores bioquímicos para diferenciar los diferentes estadios del desarrollo megacariocítico se distinguen, en general, dos tipos de progenitores en la MO en base a su morfología. El primero de ellos es el megacarioblasto que se asemeja a un linfocito tanto en tamaño como en morfología, aunque podemos distinguir un núcleo bilobulado. A continuación, se desarrolla el promegacariocito el cual se caracteriza por poseer un núcleo con forma de riñón con dos o cuatro juegos de cromosomas (4 u 8N) pero con un mayor espacio citoplasmático que el anterior estadio, haciendo que su tamaño sea de hasta 50 m. Finalmente, el MC es el de mayor tamaño (entre 50 y 150m) y su citoplasma posee gránulos [1, 2]. Las características morfológicas diferenciales de estos tres estadios se muestran en la Figura 1.

20 A diferencia de otras células, los progenitores megacariocíticos poseen un ciclo celular particular ya que existe un defecto en el final de cada ciclo que resulta en la formación incompleta del anillo contráctil (compuesto de miosina II y F actina), cuya función es proveer la fuerza necesaria para la separación celular. Durante este proceso las células duplican el contenido de ADN pero no completan la telofase ni realizan citocinesis [3, 4]. Este fenómeno ocurre al final de la fase proliferativa en donde los precursores megacariocíticos mononucleares salen del estadio diploide para convertirse en células progenitoras que poseen un contenido de ADN que va desde 4 hasta 64 o 128N en un mismo núcleo polilobulado [5, 6]. Si bien este proceso no ha sido completamente esclarecido, se cree que su función principal es realizar una amplificación génica para incrementar la síntesis de proteínas requeridas para completar la maduración granular y promover el aumento en el tamaño celular [7]. Cabe señalar que la importancia de la poliploidización fue demostrada recientemente en el trabajo de Trakala y colaboradores, en donde demostraron que si se bloquea la endomitosis los MCs son capaces de poliploidizar por mecanismos alternativos [8].

A medida que transcurre la maduración, los MCs inician una serie de cambios a nivel citoplasmático mediante los cuales se forman diferentes tipos de gránulos, aumenta el número de organelas y se desarrolla un sistema de endomembranas. De esta manera, el citoplasma de los MCs adquiere características ultra estructurales

Figura 1. Progenie megacariocítica. Micrografías de la progenie megacariocítica reconocible en la médula ósea visualizada con tinción de hematoxilina-eosina. Adaptado de Michelson, A.D., Platelets. 2013, 3rd edition. Oxford, United Kingdom: Elsevier.

21 únicas, incluyendo un sistema de demarcación de membrana (SDM), el ensamblaje del sistema tubular denso (STD) y la formación de gránulos [2].

El SDM está formado por una extensa red de canales de membrana compuestos por túbulos y cisternas aplastadas que derivan de invaginaciones tubulares de la membrana plasmática. Dicho sistema es detectable en el estadio final del desarrollo megacariocítico y se vuelve evidente en MCs maduros, en donde atraviesa todo el citoplasma. El SDM permite que los MCs y las plaquetas posean una mayor superficie de contacto con el medio externo y constituye un reservorio de membrana para la formación y extensión de proplaquetas (estructura a partir de la cual se liberan las plaquetas que será explicada posteriormente) [9-11].

El STD constituye el principal reservorio de calcio intracelular y es donde se sintetizan las prostaglandinas en plaquetas [12]. A diferencia del SDM, este sistema no se encuentra en contacto con el medio exterior y deriva del retículo endoplásmico [13].

Otra característica de la maduración megacariocítica es la aparición progresiva de una variedad de gránulos secretorios. Los más abundantes son los  y si bien estos gránulos fueron considerados una población homogénea de organelas circulares de entre 200 y 500 nm, hoy se sabe que su morfología puede ser tubular y su contenido es heterogéneo [14, 15]. Estas estructuras se originan de manera endógena empaquetando proteínas desde el trans-Golgi [16] o a través de la captación de proteínas plasmáticas mediante procesos de endocitosis mediada por receptor o por pinocitosis [17]. Las diferentes moléculas presentes en los gránulos  se detallan en la Tabla 1.

22 Por otra parte, los gránulos densos son de aparición más tardía, menos numerosos que los  y presentan un tamaño menor (250 nm en promedio). Su nombre se debe a que son reconocibles mediante micrografía electrónica por su centro electro denso [18] y contienen ATP, ADP, serotonina, cationes divalentes y polifosfatos [19].

1.2 Trombopoyesis

La culminación de la maduración megacariocítica da comienzo a un proceso conocido como trombopoyesis. Si bien desde 1906 se reconoce que las plaquetas derivan de los MCs [20], el mecanismo por el cual se forman y liberan a circulación permaneció inexplorado durante muchos años. Para explicar dicho mecanismo fueron propuestos diferentes modelos que incluían el brote de las plaquetas desde la periferia del MC [21, 22], la fragmentación citoplasmática a partir del SDM [22, 23] y la liberación de procesos proplaquetarios que luego liberarían plaquetas individuales [24]. Muchos abordajes experimentales que intentaron distinguir cuál de estos mecanismos era funcional resultaron infructuosos debido a la falta de caracterización del factor de crecimiento específico de los MCs.

Finalmente, en 1994, cinco grupos de trabajo, mediante diferentes estrategias pudieron sentar las bases que permitieron establecer que el principal factor humoral responsable del desarrollo megacariocítico/plaquetario y su receptor eran la

23 trombopoyetina (TPO) y el c-mpl, respectivamente [25-29]. Hoy sabemos que la interacción TPO/c-mpl es la principal responsable del crecimiento y desarrollo de MCs a partir de la CMH [30]. Estos hallazgos dieron inicio a una nueva era de sistemas de cultivo que permitieron estudiar la biogénesis plaquetaria y comprender mejor el proceso de trombopoyesis.

El modelo actualmente aceptado propone que la biogénesis plaquetaria ocurre mediante la formación de dos intermediarios entre el MC maduro y las plaquetas libres, las proplaquetas y las preplaquetas [31]. Este modelo establece que los MCs maduros extienden procesos citoplasmáticos largos y ramificados denominados proplaquetas, que están compuestos por engrosamientos en tándem del tamaño de plaquetas conectados por finos puentes citoplasmáticos [24]. Las primeras evidencias surgieron en el año 1969, cuando se registraron múltiples imágenes de proplaquetas extendiéndose dentro de los sinusoides medulares [32, 33]. Luego, estas estructuras proplaquetarias fueron obtenidas de manera espontánea a partir de cultivos in vitro de MCs derivados de CMH de hígado fetal murino [24, 31, 34] y de CMH humanas estimuladas con TPO [35-37].

Durante la formación y extensión de las proplaquetas el MC concentra todo su citoplasma en las extensiones proplaquetarias. Este proceso comienza con la erosión de uno de los polos del citoplasma causando la formación de pequeños pseudópodos. A continuación, estos pseudópodos comienzan a elongarse formando finos túbulos de diámetro uniforme mientras que se ramifican y se forman engrosamientos a lo largo de toda su longitud. Estas ramificaciones se condensan en forma lamelar y vuelven a dividirse, amplificando el número de ramificaciones en cada ciclo de conversión lamelar/ramificada. Eventualmente, las proplaquetas se desprenden del cuerpo del MC y este se transforma en un núcleo residual rodeado por una red de procesos proplaquetarios (Figura 2) [24].

24 La fuerza necesaria para la extensión de los procesos proplaquetarios está provista por el citoesqueleto de tubulina y actina [38, 39]. Dentro de las diferentes isoformas de tubulina, la 1 es la principal en los MCs y su reorganización es esencial para la formación y extensión de las proplaquetas [40]. Cuando el MC comienza a generar proplaquetas, los microtúbulos se organizan de manera cortical formando haces gruesos por debajo de la membrana plasmática. Luego, comienzan a extenderse pseudópodos y los microtúbulos forman arreglos lineales que se prolongan por toda la longitud de la proplaquetas. El extremo más distante de cada uno de estos procesos tiene un engrosamiento del tamaño de una plaqueta que contiene un anillo de microtúbulos [31]. Además de participar en la elongación de las proplaquetas, los microtúbulos también permiten el transporte de organelas y gránulos dentro de las proplaquetas nacientes. Estas estructuras intracelulares se asocian a proteínas motoras (tal como la kinesina) y son enviadas individualmente desde el cuerpo del MC hacia el interior de las proplaquetas, moviéndose bidireccionalmente hasta que son capturadas por el extremo proplaquetario [41]. En cuanto al citoesqueleto de actina, su función ha sido menos estudiada y solamente ha sido establecido que la F-actina se encuentra presente a lo largo de toda la proplaqueta y es la encargada de generar el curvamiento inicial para que se genere una bifurcación proplaquetaria [42]. Una vez que los engrosamientos proplaquetarios contienen todos los componentes de una plaqueta funcional, las proplaquetas son escindidas del cuerpo del MC y liberadas hacia el torrente sanguíneo [43].

Figura 2.Generación de proplaquetas. Secuencia de fotos en el tiempo que muestran los eventos esenciales que llevan a la formación de proplaquetas in vitro. (A) La producción de proplaquetas comienza cuando el citoplasma del MC se erosiona en un polo (asterisco blanco). (B y C) Las proplaquetas (flecha blanca) se extienden a lo largo del cuerpo del MC a medida que se extienden y ramifican. (D) Finalmente, las proplaquetas se contraen y se separan del cuerpo celular residual del MC (flecha blanca). Adaptada de Italiano JE, et al.

25 En el año 2010, se describió un nuevo intermediario de la biogénesis plaquetaria conocido como preplaquetas. Estas estructuras se encuentran en la sangre periférica, tienen mayor tamaño que una plaqueta y presentan forma circular o de mancuerna. Estas dos formas son interconvertibles entre sí y permite a las preplaquetas mezclar y volver a distribuir el contenido granular. Finalmente la forma de mancuerna se escinde por su parte central dando lugar a dos plaquetas libres (Figura 3) [31].

Diferentes trabajos fortalecen este modelo de generación de plaquetas, aunque recientemente Nishimura y colaboradores demostraron que cuando existe una necesidad aguda de plaquetas los MCs son capaces de liberar plaquetas funcionales sin formar pre ni proplaquetas en un mecanismo regulado por la interleuquina 1 (IL-1). Mediante este proceso el rendimiento de plaquetas es aproximadamente 20 veces mayor que el que se obtiene mediante la formación de proplaquetas. De esta manera, durante el estado estacionario la trombopoyesis respondería al modelo proplaquetario regulado por TPO, mientras que, ante una necesidad extrema se activaría este nuevo mecanismo dependiente de IL-1[44].

A pesar de los grandes avances logrados en el conocimiento de este proceso, existen aún numerosos interrogantes acerca de la trombopoyesis, como por ejemplo

Figura 3. Modelo de producción de plaquetas. (A) La formación de proplaquetas comienza con la extensión de finos pseudópodos que se extienden utilizando el citoesqueleto de tubulina. El final de cada proplaqueta contiene un engrosamiento del tamaño de una plaqueta y las mitocondrias y gránulos (esferas amarillas y naranjas) son transportadas a dichos extremos. (B) El MC completo se convierte en proplaquetas que son liberadas a circulación junto con las plaquetas a través de los sinusoides medulares. (C) Las proplaquetas pueden interconvertirse en preplaquetas en circulación. Finalmente, esta forma de mancuerna se escinde por el centro para liberar dos plaquetas individuales. Adaptada de Semin Thromb Hemost 2013;39:15–24.

26 cuáles son las señales que inician el proceso de formación de proplaquetas o los mecanismos que llevan a su fragmentación para formar las preplaquetas. Incluso, se desconocen las fuerzas que promueven que las preplaquetas en forma de mancuerna se escindan para dar lugar a las plaquetas funcionales tal y como las conocemos.

1.3 Rol del microambiente medular en la formación de plaquetas

La MO es un tejido complejo protegido por los huesos y dedicado a la producción de los diferentes tipos celulares que componen la sangre [45]. Dentro de las cavidades de los huesos, la MO se constituye como una red tridimensional de sinusoides ramificados rodeados por colonias de células hematopoyéticas inmersas en una malla de componentes de la matriz extracelular y factores humorales (Figura 4). Las células que componen el estroma medular incluyen osteoblastos, células endoteliales, macrófagos, células reticulares no fagocíticas (incluyendo miofibroblastos y células adventicias sinusoidales) y células madre mesenquimales [46]. Las células estromales de la MO regulan la hematopoyesis a través de la expresión de citoquinas u otras macromoléculas solubles o unidas a membrana, contra receptores para integrinas y otras moléculas de adhesión presentes en la superficie de las células hematopoyéticas [30].

Dentro de la MO, los mecanismos de diferenciación celular y tránsito hacia el torrente sanguíneo están estrictamente regulados para satisfacer los diferentes requerimientos fisiológicos. La arquitectura medular permite reconocer diferentes nichos cuyo microambiente mantiene y regula un tipo particular de célula progenitora. En base a la composición y localización de los diferentes tipos celulares se definen dos microambientes o nichos medulares. Uno vascular compuesto principalmente por células endoteliales, células reticulares y células estromales mesenquimales llamado nicho vascular [47, 48] y otro asociado al endostio (interfase entre el hueso y la MO) compuesto por osteoblastos o células de su linaje llamado nicho osteblástico o endostial [49]. Históricamente, los MCs se asociaron al nicho vascular donde fueron observados adyacentes a los sinusoides medulares tanto in vivo como ex vivo [33,

27 43]. Sin embargo, estudios más recientes demostraron que estas células pueden estar ubicadas en porciones anatómicas diferentes asociándose tanto al nicho vascular como al osteblástico [50, 51]. El modelo actual propone que a medida que los MCs maduran, migran del nicho osteoblástico al vascular para finalmente liberar desde allí las proplaquetas a la circulación [52].

El colágeno tipo I es el componente más abundante del nicho osteoblástico [53]. Curiosamente, la unión de MCs a este tipo de colágeno inhibe la formación de proplaquetas [54, 55] sugiriendo que en condiciones fisiológicas el nicho osteoblástico impide la formación de dichas estructuras [56]. Por otra parte, utilizando un modelo de co-cultivo de osteoblastos junto con CMH, se observó que las células forman un nicho que favorece la deposición de colágeno tipo I y crea un entorno que promueve su diferenciación al linaje megacariocítico pero no permite completar su maduración ni que se extiendan las proplaquetas [57]. Esto apoya la idea de que el colágeno tipo I en el nicho osteoblástico actúa como supresor de la formación de proplaquetas permitiendo al mismo tiempo la MCp en sus primeros estadios de diferenciación.

28

Figura 4. Anatomía de la médula ósea. Las CMH en un humano adulto residen principalmente dentro de la MO que es un órgano complejo que contiene diferentes tipos celulares, tanto hematopoyéticos como no hematopoyéticos. (A) Anatomía de un hueso con las diferentes partes que lo conforman. (B) La interfase entre el hueso y la MO se denomina endostio. Esta estructura se encuentra cubierta de células que recubren el hueso incluyendo osteoblastos y osteoclastos. Las arterias transportan oxígeno, nutrientes y factores de crecimiento dentro de la MO y se extienden hasta coalescer en un sinusoide central que conforma la circulación venosa. Los sinusoides son vénulas especializadas que componen una red reticular de vasos fenestrados que permiten que las células entren y salgan a circulación. (C) Arquitectura funcional de la MO. La maduración megacariocítica se produce desde el nicho endostial al vascular mientras migran debido principalmente al gradiente de citoquinas y quemoquinas. Lo MCs maduros (flechas negras) se apoyan sobre los sinusoides (línea punteada azul) para liberar proplaquetas a circulación.

29 Durante los estadios finales de la trombopoyesis, los MCs se localizan en las cercanías de los sinusoides medulares en donde entran en contacto con una gran variedad de citoquinas y quemoquinas que son producidas y liberadas por los diferentes tipos celulares del nicho vascular. Dentro de ellas, el factor derivado del estroma 1  (SDF-1, del inglés Stroma-derived Factor-1 ) fue la primera quemoquina implicada en el direccionamiento de los MCs hacia el nicho vascular [58]. El SDF-1 regula la migración de los MCs a través de su receptor específico, el CXCR4, por lo que su expresión durante la MCp está delicadamente regulada [59]. Finalmente, la importancia de las quemoquinas en la MCp fue demostrada por Avecilla y colaboradores que observaron el restablecimiento de la trombopoyesis en ratones knock out para la TPO y su receptor mediante el suministro de SDF-1 en conjunto con el factor de crecimiento de fibroblastos [60]. En línea con estos estudios, ha sido recientemente reportado que la administración de SDF-1 o la estabilización de esta citoquina endógena aumenta la asociación de los MCs con los sinusoides medulares y consecuentemente la trombopoyesis. En particular, utilizando un modelo de injuria por irradiación, los autores demostraron que la fluctuación dinámica en la distribución espacial y temporal del SDF-1 se correlaciona con el posicionamiento de los MCs dentro del nicho vascular [61]. Además, otro trabajo ha mostrado recientemente que algunas señales angiogénicas también se encuentran involucradas en la relocalización de los MCs en el nicho vascular provocando un aumento de la producción plaquetaria [62].

En resumen, la idea de los MCs como células estáticas de la MO ha ido evolucionando hacia un modelo dinámico en el cual estas células maduran a medida que migran por los diferentes nichos dirigidos por estímulos específicos. De este modo, el nicho osteoblástico proporciona un entorno que permite que los precursores megacariocíticos proliferen, se diferencien y comiencen a madurar, mientras que el nicho vascular promueve principalmente la trombopoyesis.

30

Fisiología plaquetaria

2.1

Generalidades

Las plaquetas, descubiertas en 1882 por Giulio Bizzozero, han sido tradicionalmente consideradas como restos citoplasmáticos de los MCs [63]. Sin embargo, en la actualidad se considera que son células anucleadas y que, además de su rol fundamental en la hemostasia y la trombosis, participan también en el desarrollo de diferentes procesos tales como la remodelación tisular, procesos inflamatorios y el control de infecciones virales y bacterianas [64, 65]. Tal diversidad funcional es consistente con el hecho de que las plaquetas en los mamíferos se originaron durante el curso de la evolución a partir de un tipo de célula defensiva y multifuncional representada filogenéticamente por los actuales trombocitos de los artrópodos, peces, aves y reptiles [66]. Las plaquetas pueden realizar funciones tan variadas debido a que, además de interactuar con otras plaquetas y con moléculas de la matriz extracelular, son capaces de interaccionar y modificar la activación de neutrófilos, monocitos y linfocitos [67]. Además, liberan potentes moléculas desde sus gránulos que participan y modifican los procesos anteriormente mencionados.

En condiciones normales, las plaquetas circulantes no se adhieren a la pared de los vasos sanguíneos, a los leucocitos o entre ellas debido a las propiedades anti trombóticas del endotelio vascular. La lesión de un vaso provoca el reclutamiento de plaquetas circulantes que se adhieren a proteínas de la matriz subendotelial. Las plaquetas retenidas se activan y liberan mediadores solubles que actúan no solamente de manera autócrina, sino también reclutando y activando otras plaquetas circulantes generando un sistema de retroalimentación positiva que favorece la unión plaqueta-plaqueta, fenómeno conocido como agregación plaquetaria y que es esencial para la consolidación del trombo [68]. Si bien este proceso constituye un elemento clave en la hemostasia normal, la activación plaquetaria en lugares inapropiados puede provocar, por ejemplo, una trombosis arterial que es la principal causa de infarto de miocardio [69].

31

2.2

Estructura

Desde el punto de vista morfológico, las plaquetas son los elementos celulares más pequeños de la sangre (2 – 5 m de diámetro). La membrana plasmática de las plaquetas desempeña un papel fundamental en su respuesta hemostática debido a que es la encargada de interaccionar con proteínas plasmáticas, subendoteliales o vasculares desencadenando procesos de activación plaquetaria y conectando así elementos extracelulares con el citoesqueleto plaquetario. Esta membrana presenta una apariencia rugosa debido a pequeñas invaginaciones que se extienden por toda su superficie (Figura 5). Sus pliegues podrían proveer un reservorio de membrana plasmática necesario para que las plaquetas puedan adherirse y extenderse sobre la superficie injuriada (proceso conocido como adhesión plaquetaria). A lo largo de todas estas invaginaciones se encuentran pequeñas aperturas que se conectan al sistema canalicular abierto (SCA). Este sistema constituye una serie de canales abiertos hacia el espacio exterior que facilitan el proceso de secreción y permiten el acceso de sustancias hacia el interior de la plaqueta [70].

Inmediatamente por debajo y alrededor de toda la membrana plasmática, se encuentra un anillo de microtúbulos, el cual mantiene la forma discoidea de la plaqueta en reposo (Figura 5). Además, posee un sistema formado por filamentos de actina-miosina que está involucrado en el cambio de forma y la retracción del coágulo luego de la activación plaquetaria [71].

El citoplasma plaquetario contiene mitocondrias (que desempeñan un rol fundamental en el metabolismo energético), peroxisomas y partículas de glucógeno [72]. Además, las plaquetas presentan tres tipos de organelas secretorias: lisosomas y gránulos  y densos [73, 74], siendo estos dos últimos característicos del linaje (Figura 5).

32

2.3

Respuestas de activación plaquetaria

La activación plaquetaria puede ser dividida conceptualmente en cuatro etapas (Figura 6).

Adhesión: como primera respuesta a la injuria vascular las plaquetas se adhieren a diferentes componentes de la matriz subendotelial expuesta. Esta matriz contiene varios ligandos reconocidos por diferentes receptores plaquetarios incluyendo colágeno [75], factor von Willebrand (FvW) [76], laminina [77], fibronectina [78] y trombospondina-1 [79]. Dependiendo de las condiciones del flujo sanguíneo, la adhesión plaquetaria ocurre por diferentes mecanismos. En vasos sanguíneos donde las fuerzas de cizallamiento son elevadas, como en la microcirculación o en vasos estenóticos, la unión inicial ocurre principalmente por la unión al FvW subendotelial. El FvW se encuentra depositado en los gránulos de las células endoteliales y las plaquetas, en el subendotelio y en circulación [80]. Las plaquetas no interaccionan con el FvW circulante ya que tiene ocultos sus sitios de unión (evitando la agregación plaquetaria intravascular), pero el FvW es capaz de unirse al colágeno expuesto por la injuria vascular y, como consecuencia de esta unión, cambia su conformación permitiendo su reconocimiento por la subunidad Ib del complejo glicoproteico

Figura 5. Micrografía electrónica de la estructura plaquetaria. (A) Fotografía electrónica de barrido en donde se observa la estructura rugosa de la membrana plaquetaria. (B) Microscopía electrónica de transmisión de una sección de la plaqueta mostrando los diferentes componentes intracelulares. Se observa un anillo de microtúbulos en la periferia de la célula debajo de la membrana plasmática. La membrana se invagina en varios puntos para formar el SCA. Los gránulos  son los más numerosos y los gránulos densos deben su nombre a su alta densidad electrónica. Adaptado de Michelson, A.D., Platelets. 2013, 3rd edition. Oxford, United Kingdom: Elsevier.

33 GPIb/V/IX plaquetario [81]. Dado que esta interacción es reversible, no provoca una adhesión estable sino que genera interacciones transitorias que provocan el rodamiento inicial (thetering) sobre el sitio injuriado [82-84]. Para estabilizar esta adhesión rápida y transitoria se necesitan contactos adicionales entre las plaquetas y la matriz extracelular expuesta. En la adhesión estable a la matriz subendotelial participan diferentes integrinas entre las que se encuentran: la 21 que también se une al colágeno, la 51 que une fibronectina y la IIb3, laintegrina plaquetaria más abundante, que interactúa con la fibronectina, el FvW y, su principal ligando, el fibrinógeno [85-87].

Cambio de forma: Desde el punto de vista morfológico, la adhesión de las plaquetas a proteínas de la matriz extracelular desencadena varios cambios que van desde la formación de filopodios hasta la extensión de lamelipodios que provocan el esparcimiento completo de la plaqueta o full cell spreading [88].

Secreción del contenido de los gránulos: como resultado de la activación plaquetaria provocada por la adhesión inicial, y de manera concomitante con el cambio de forma, los gránulos plaquetarios ( y densos) se centralizan formando una estructura denominada granulómero para finalmente ser secretados. Los gránulos se fusionan con el SCA y su contenido soluble difunde en el medio extracelular mientras que la proteínas integrales de la membrana granular quedan expuestas en la membrana plasmática [89]. Alguno de los productos de secreción provenientes de los gránulos densos (como el ADP y la serotonina) además de actuar sobre la misma plaqueta de la que fueron secretados, estimulan otras plaquetas cercanas favoreciendo el crecimiento del trombo plaquetario [90].

Los gránulos  son los más abundantes en las plaquetas, constituyendo aproximadamente el 10% de su volumen. Además, la fusión de estos gránulos con el SCA le permiten a la plaqueta incrementar su tamaño (entre 2 y 3 veces aproximadamente), hecho necesario para el cambio de forma y spreading

plaquetario. La secreción de los gránulos  está asociada principalmente con la participación de las plaquetas en la reparación de heridas, la formación de nuevos

34 vasos (o angiogénesis) y la respuesta inflamatoria. Frente a una injuria vascular, la completa detención de la hemorragia está determinada por la secreción de factores de crecimiento de los gránulos  como el factor de crecimiento fibroblástico, epidermal, hepatocítico, insulínico tipo 1, transformante  y de endotelio vascular los cuales promueven la invasión de fibroblastos del tejido conectivo adyacente hacia el interior de la herida y facilitan la formación de una cicatriz [91]. Además, varias de estas moléculas mitogénicas conjuntamente con la liberación de metaloproteasas promueven la angiogénesis [92].

Los gránulos  también contienen en su membrana moléculas como la P-selectina y el CD40 ligando (CD40L) que facilitan la adhesión de las plaquetas con otras células circulantes. Cuando la plaqueta se activa, estas moléculas que están en la membrana de los gránulos se fusionan con la membrana celular y la exposición de las mismas en la superficie celular facilita la interacción de las plaquetas con el endotelio y células inflamatorias como monocitos, neutrófilos y linfocitos [65, 93, 94]. El resultado de esta interacción es la activación de estos tipos celulares dando como resultado la expresión y/o liberación de moléculas de adhesión y de sustancias bioactivas por parte de los leucocitos que amplifican la respuesta inflamatoria. Las plaquetas también contribuyen significativamente a este fenómeno ya que ,además de contener moléculas de adhesión celular, los gránulos  contienen altas concentraciones de citoquinas y quemoquinas que activan las células endoteliales e inducen el reclutamiento, la activación y migración de leucocitos al foco inflamatorio [92].

Agregación: Luego de la adhesión de una monocapa de plaquetas sobre el FvW y el colágeno expuesto en el subendotelio, el cambio de forma y la liberación del contenido granular, el siguiente paso requerido para la formación del trombo es el reclutamiento de nuevas plaquetas circulantes. Estas plaquetas se activan y adquieren la capacidad de unirse unas con otras en un proceso conocido como agregación plaquetaria [68, 95]. Esto es posible gracias a la generación local de agonistas solubles que son secretados durante la liberación del contenido granular,

35 tales como el ADP o a la producción de tromboxano A2 (TXA2) por parte de las plaquetas adheridas y también por la trombina generada como consecuencia de la exposición del factor tisular en la superficie plaquetaria y la consecuente activación de la cascada de coagulación [68]. El paso final de la formación del trombo plaquetario es la unión a fibrinógeno que por sus características de molécula multivalente permite la formación de puentes estables entre plaqueta y plaqueta resultando en la formación y consolidación del agregado plaquetario [96].

36

2.4 Ciclo de vida de las plaquetas

Las plaquetas humanas tienen una vida media de 7 a 10 días, luego de lo cual son removidas de la circulación. La eliminación de las plaquetas ocurre principalmente en el bazo y el hígado por macrófagos esplénicos o células de Kupffer, respectivamente, que reconocen señales fagocíticas expresadas en la superficie de las plaquetas [97]. Si bien los mecanismos por los cuales las plaquetas son detectadas para ser eliminadas de la circulación no están completamente dilucidados, se sabe que este reconocimiento puede llevarse a cabo a través de diferentes vías. Como ejemplo se puede mencionar el reconocimiento a través de los receptores scavenger que reconocen la fosfatidilserina expresada en la superficie de plaquetas o aquellas plaquetas que presentan una menor densidad de residuos de

Figura 6. Función hemostática de las plaquetas. (A) El primer paso en la formación del trombo plaquetario es la exposición del FvW, colágeno y otras proteínas de la membrana basal que provocan la adhesión plaquetaria. (B) Las plaquetas que se adhieren, se agregan entre si y liberan mediadores, tales como el ADP y el Tromboxano A2, que activan plaquetas

circulantes. Además la superficie plaquetaria adquiere un fenotipo procoagulante que permite la generación de gran cantidad de trombina. (C) La trombina cataliza la deposición de fibrina y se forma el tapón hemostático que detiene el sangrado.

37 ácido siálico en su superficie [98, 99]. Más aún, un estudio reciente en ratones, identificó un mecanismo de retroalimentación mediante el cual las plaquetas envejecidas y desialiladas, no solo son removidas, sino que además estimulan la producción de TPO en los hepatocitos lo cual le permite mantener un número estable de plaquetas en circulación [100].

Interferones tipo I

3.1

Generalidades

Los interferones tipo I (IFN I) fueron las primeras citoquinas en ser descubiertas en 1957, cuando Isaacs y Lindenmann reportaron la existencia de un factor secretado por células de pollo en respuesta a la infección con influenza que tenía la capacidad de “interferir” con la replicación viral [101]. Hoy sabemos que los IFN I son las principales proteínas producidas durante la infección viral y su efecto se debe principalmente a tres funciones [102]. En primer lugar, inducen un estado celular antimicrobiano en la célula infectada y en las células circundantes a la misma limitando así la diseminación del agente infeccioso, particularmente patógenos virales. También, modulan la respuesta inmune innata de manera balanceada promoviendo la presentación antigénica y la función de las células Natural Killer

mientras que restringen la producción de citoquinas pro inflamatorias. Por último, activan la inmunidad adaptativa favoreciendo el desarrollo de linfocitos T y B antígeno específicos y disparando la memoria inmunológica [103].

Existen siete clases de IFN I: IFN , ,  y. Las dos últimas variantes son las más estudiadas y mientras que hay solamente una variante funcional de IFN existen varias del IFN. La mayoría de las células producen IFN, mientras que las células sanguíneas, particularmente las células dendríticas plasmocitoides, son productoras predominantes de IFN[102]

Todos los IFN I son capaces de inducir un estado celular antiviral mediante la unión a un receptor transmembrana común llamado IFNAR (del inglés, interferon

38

alpha receptor) [104]. La activación de dicho receptor conlleva a la activación de una cascada de señalización que activa dos quinasas de la familia Janus, Tyk2 y Jak1, lo que resulta en el reclutamiento de STAT1 y la consecuente unión a STAT2 que se encuentra unido al receptor. De esta manera, los heterodímeros STAT1-STAT2 se disocian del receptor y son capaces de migrar al núcleo en donde se asocian con el factor regulador de interferón 9 (IRF9) para formar un complejo trimolecular llamado factor génico estimulado por interferón 3 (ISGF3). Finalmente, el ISGF3 se une a las secuencias consenso conocidas como elementos de respuesta sensibles al interferón (ISRE) desencadenando la transcripción de genes antivirales específicos [105]. Con respecto a la expresión del IFNAR, nuestro grupo recientemente demostró su expresión en el linaje megacariocítico desde las CMH hasta los MCs maduros, pero no en plaquetas. Además, encontramos que los MCs tienen la capacidad de sintetizar, liberar y de responder al IFN I aumentando la expresión de proteínas antivirales [106]. De esta manera, estos hallazgos presentan a los MCs no solo como células respondedoras al IFN I sino también como células capaces de detectar una infección viral y responder frente a ella.

3.2

Reconocimiento de ARN viral y producción de IFN I

Una de las principales familias de receptores responsables del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) son los receptores tipo toll (TLRs, del inglés Toll-like receptors). Hasta la fecha, han sido identificados 10 TLRs en humanos y 13 en ratones, siendo comunes en ambos del 1 al 9. Los TLRs involucrados en el reconocimiento de ARN viral son el 3, 7 y 8 [107]. El TLR3 interacciona con el genoma de virus ARN de doble cadena (ARNdc) como los reovirus, así como con ARNdc provenientes de los procesos de replicación de la mayoría de los virus [108]. Por su parte, el TLR7 reconoce el ARN viral de cadena simple (ARNsc) y detecta virus como el de la inmunodeficiencia humana o influenza [109-111]. Además, los humanos (pero no los ratones) también detectan el ARNsc a través del TLR8. Tanto el TLR3 como el TLR7 pueden ser activados por moléculas sintéticas. Por ejemplo, los derivados de imidazoquinolonas, como el Imiquimod y análogos de guanina, estimulan al TLR7 y 8 mientras que el TLR3 reconoce, entre

39 otros, al ácido poliinosínico-policitidílico [Poly (I:C)] [108, 112]. Una vez que estos receptores son activados desencadenan una cascada de señalización que culmina con la activación de los factores de transcripción NFB y AP1 que dirigen la síntesis de citoquinas pro inflamatorias. Además, cada uno de ellos activa su correspondiente factor regulador de interferón IRF3 e IRF7. El IRF3 activado favorece principalmente la producción de IFN mientras que el IRF7 regula tanto la producción de IFN como  [113]

Una vez que los componentes virales alcanzan el citoplasma, las moléculas de ARN son detectadas por una segunda línea de reconocimiento, las helicasas RIG-I (del inglés, retinoic acid-inducible gene I) y MDA-5 (del inglés, Melanoma Differentiation-Associated protein 5) [107]. Estos receptores inducen la activación del factor de transcripción NFB y del adaptador mitocondrial de señalización antiviral (MAVS) y las quinasas TBK1 e IKKi que activan el IRF3 e inducen la transcripción de IFN[114]. Estas helicasas también tienen la capacidad de responder a la estimulación por moléculas sintéticas, entre ellas es de gran importancia la activación de MDA-5 por Poly (I:C) [115].

3.3

Trombocitopenia mediada por IFN I

Desde su descubrimiento, los IFN I atrajeron un gran interés como potenciales agentes terapéuticos frente a infecciones gracias a su actividad antiviral. Sin embargo, recién a fines de la década del 60 se logró la producción y purificación de IFN I humanos para su uso clínico.

El primer reporte de una aplicación clínica de estas citoquinas apareció a mediados de 1970 cuando Cantell y colaboradores obtuvieron pequeñas cantidades de IFN purificado (aunque con un bajo grado de pureza) a partir de glóbulos blancos de dadores sanos [116]. Con este logro, el grupo de Cantell pudo aportar evidencia importante, aunque no suficiente, para el tratamiento de pacientes que sufrían diferentes patologías virales como el resfrío común, la queratoconjuntivitis herpética y la varicela [117-119]. Años más tarde, se encontró que los IFN I eran

40 capaces de inhibir las infecciones crónicas mediadas por el virus de la leucemia murina [120] y desde ese momento se comenzó a tratar pacientes infectados con el virus de la hepatitis B con IFN obteniendo resultados positivos [121]. Finalmente, los reportes sobre uso de los IFN I para el tratamiento exitoso de cáncer renal [122], melanomas malignos [123], linfomas y leucemias [124] reavivó el interés clínico por estas citoquinas. Actualmente, se han desarrollado numerosas terapias con estas citoquinas entre las que podemos incluir la hepatitis viral [125], el sarcoma de Kaposi asociado al SIDA [126], cierto tipo de leucemia [127], la trombocitemia esencial [128], algunos procesos de autoinmunidad sistémica [129] o la esclerosis múltiple [130].

A pesar de su eficacia terapéutica, existen una serie de efectos adversos asociados al uso de esta droga que pueden llevar a la finalización prematura del tratamiento. Entre ellos, reviste gran importancia su acción supresora de la hematopoyesis, que si bien es útil para el tratamiento de desórdenes proliferativos, resulta nociva cuando se lo administra para controlar infecciones virales, tumores sólidos o enfermedades autoinmunes. En este sentido, la trombocitopenia es una de las causas más frecuentes de disminución de dosis o incluso suspensión de la terapéutica con IFN , por ejemplo en pacientes con hepatitis virales [131].

Sin bien los efectos beneficiosos del tratamiento de las diferentes patologías con IFN I son claros, las bases moleculares por las cuales el recuento plaquetario disminuye aún no están completamente dilucidadas. En pacientes tratados con IFN I, se describieron diferentes mecanismos que conducen a una disminución en el recuento plaquetario. Estos incluyen el efecto anti proliferativo a nivel medular que detiene el crecimiento de células mieloides [132] y, en casos más raros y esporádicos, trombocitopenia inmune [133, 134] y púrpura trombocitopénica trombótica [133, 135, 136]. En un modelo murino de expansión de MCs in vitro se postuló al IFN como inhibidor directo de la MCp afectando la proliferación y polipolidización de MCs inducidas por TPO [137]. En cambio, posteriormente fue reportado que el tratamiento con IFN disminuye la producción de plaquetas sin alterar la generación de MCs utilizando un modelo in vitro de MCp humana [138]. En

41 un intento de poder dilucidar estas controversias, y a través de estudios in vitro con MCs humanos, nuestro grupo de trabajo demostró que el destino de los MCs depende de la concentración de IFN I a la que son expuestos. De esta manera, mientras que las altas concentraciones disminuyen marcadamente la proliferación de los MCs, bajas concentraciones de IFN I afectan selectivamente la producción plaquetaria [139].

La trombocitopenia también está asociada frecuentemente a infecciones virales [140-146]. Si bien los mecanismos involucrados son diversos y dependen esencialmente de la naturaleza del virus, un estudio pionero de Iannacone y colaboradores mostró que ratones que se encontraban infectados con el arenavirus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) presentaban una alteración de la agregación plaquetaria inducida por ADP junto con una reducción del 80% del número de plaquetas circulantes, siendo ambas alteraciones dependientes de un aumento en los niveles de IFN I [147]. En concordancia con estos hallazgos, nuestro de grupo de trabajo demostró que la infección de CMH o MCs con el virus Junín (arenavirus causante de la Fiebre Hemorrágica Argentina [146]) o el tratamiento con Poly (I:C), inhibe selectivamente la formación de proplaquetas y la liberación de plaquetas de manera dependiente de la producción de IFN I, sin afectar la sobrevida celular o la generación de MCs [139]. Todos estos datos apoyan fuertemente la idea de que los IFN I son nuevos reguladores de la megacario/trombopoyesis y que el aumento en los niveles de estas citoquinas como resultado de una infección viral serían los responsables de la trombocitopenia frecuentemente observada en pacientes que cursan con infecciones virales.

42

OBJETIVOS

43

Objetivo general

La producción de IFN I es una respuesta sistémica de la inmunidad innata frente a la infección con diferentes tipos de virus y además estas citoquinas son utilizadas para el tratamiento de diferentes patologías. Una de las complicaciones tanto en la infección viral como durante el tratamiento con IFN I, es la disminución en el número de plaquetas. Los mecanismos asociados a estas trombocitopenias así como sus bases moleculares no se encuentran completamente dilucidadas. Estudios recientes de nuestro laboratorio sugieren que la producción parácrina de IFN I – en particular  y –, por células hematopoyéticas de la MO podría ser uno de los mecanismos involucrados en la trombocitopenia mediada por virus y además que las concentraciones de IFN I determinan un efecto selectivo sobre la biogénesis y funcionalidad plaquetaria.

A partir de estos hallazgos el objetivo del presente trabajo de Tesis fue profundizar el rol de los IFN I en la regulación cuali/cuantitativa de la megacario/trombopoyesis.

Objetivos específicos

1. Estudiar la funcionalidad de plaquetas generadas in vitro a partir de células hematopoyéticas humanas CD34+ estimuladas con TPO tratadas con Poly (I:C) o IFN I recombinante.

2. Evaluar las alteraciones cuanti/cualitativas de MCs y plaquetas en ratones tratados con Poly (I:C) como análogo sintético del ARNdc e inductor de IFN I.

3. Evaluar si otro inductor de IFN I como Imiquimod muestra efectos similares al Poly (I:C).

4. Corroborar la implicancia de la vía de los IFN I como mediadores de los efectos en la megacario/trombopoyesis mediante el uso de ratones knock out para su receptor.

44

MATERIALES Y MÉTODOS

45

4.

Ensayos in vitro

4.1

Avales y consentimiento informado

El proyecto fue avalado por el Comité de Ética de los Institutos de la Academia Nacional de Medicina. Se recolectaron muestras de sangre de cordón umbilical de origen humano obtenidas de partos normales a término con el consentimiento informado de la madre en concordancia con los lineamientos del Banco Público de Sangre de Cordón Umbilical, institución que proveyó las muestras.

4.1

Purificación de células hematopoyéticas CD34

humanas

Las muestras de sangre de cordón se diluyeron al medio con PBS estéril y se centrifugaron a 180 x g durante 15 min para obtener el plasma rico en plaquetas (PRP). Luego de descartar el PRP, se recompuso el volumen inicial con PBS y se aislaron las células mononucleares (CMN) utilizando un gradiente de Ficoll-Hypaque 1.077 g/cm3 (GE, Buckinghamshire, UK) que fue centrifugado a 480 x g a temperatura ambiente (TA) durante 30 min. La interfase resultante fue recolectada y luego de dos lavados con PBS (500 x g durante 10 min a 4ºC) los glóbulos rojos residuales fueron lisados con una solución de NH4Cl 0,17 M y las CMN remanentes se recuperaron por centrifugación en PBS.

La purificación de células CD34+ se realizó utilizando la técnica de inmunoselección magnética positiva empleando un kit comercial (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Alemania). Brevemente, las CMN se incubaron durante 15 min con IgG humana para bloquear los sitios de unión inespecífica y con un anticuerpo monoclonal anti-CD34 conjugado con un hapteno. Luego de un lavado con PBS suplementado con EDTA (2 mM) y albúmina sérica bovina (BSA, del inglés bovine serum albumin) al 0,5% (PBS/EDTA/BSA), las células se incubaron con un anticuerpo anti-hapteno conjugado a microesferas magnéticas y tras eliminar el exceso de anticuerpo mediante un lavado, las células se resuspendieron en PBS/EDTA/BSA. Finalmente, se realizó una selección magnética positiva utilizando una columna adosada a un imán que retiene las células CD34+ pero permite la elusión, por sucesivos lavados, de las células negativas para dicho marcador. La

46 pureza se determinó mediante citometría de flujo incubando 1x104 células con un anticuerpo anti-CD34 conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC), que reconoce un epítope diferente al anticuerpo utilizado para la purificación, o su correspondiente control de isotipo, durante 15 min a 4ºC y posteriormente fueron fijadas con paraformaldehido (PFA) 1%. Las muestras fueron analizadas mediante un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos). En los casos donde se obtuvo una pureza menor al 95% de células CD34+ se realizó una segunda columna de selección [139].

4.2

Expansión de MCs

Los MCs fueron expandidos a partir de células CD34+ resuspendidas en medio IMDM suplementado con TPO humana recombinante (75 ng/ml, Peprotech, DF, México), solución de albumina-insulina-transferrina (BIT, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) y penicilina/streptomicina (100 U/ml y 100 g/ml, respectivamente, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada), en una concentración de 1x105 células/ml. Los días 3, 7 y 10 de cultivo se agregó TPO fresca (25 ng/ml) y luego de 11-14 días, los cultivos mostraron diferentes características específicas de madurez megacariocítica: a) Desaparición de CD34, b) más de 75% de células CD61+, c) aumento del tamaño celular y d) expresión de CD42b en las células CD61+ [139].

4.3

Tratamiento con Poly (I:C) o IFN I

Los MCs fueron tratados con diferentes concentraciones de Poly (I:C) (InVivoGen, San Diego, CA, Estados Unidos) o IFN o  humano recombinante (gentilmente cedido por la Dra. Daniela Cecconi, Laboratorio Tuteur, Buenos Aires, Argentina) al día siete de cultivo. Los controles se realizaron utilizando un volumen similar del diluyente de cada uno de los compuestos.

4.4

Expresión de glicoproteínas de membrana

La expresión de la glicoproteína plaquetaria IIb3 se determinó mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD61 (β3) (Becton