Utilidad del análisis de gota seca en hiperckemias

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Utilidad del análisis de gota seca

en hiperCKemias

Dr. Cristóbal Colón Mejeras

Unidade de Diagnóstico e Tratamento das Enfermidades Conxénitas do Metabolismo Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela

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Prevalencia conocida en cribado neonatal

1978-2013. Un caso por cada x RN vivos

Patología Prev.

Hipotiroidismo Congénito (CH) 2.472 Fibrosis Quística (CF) 10.763 Fenilcetonuria (PKU) 12.222 Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena

media (MCAD) 18.962 Leucinosis (MSUD) 32.591 Acidemia Metilmalónica (MMA) 40.260 Acidemia Glutárica Tipo I (GA I) 40.633 Déficit de Biotinidasa (BIOT) 68.087 Galactosemia (Def.

gal-1-P-uridil-transferasa GALT) 68.442

Patología Prev.

Déficit 3-OH Acil-CoA Deshidrogenasa

cadena larga (LCHAD) 71.107 Acidemia propiónica (PA) 94.809 Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena

muy larga (VLCAD) 142.214 Tirosinemia tipo I (TYR I) 228.139 Citrulinemia (CIT) 284.428 Homocistinuria Clásica (HCY) 284.428 Deficiencia Primaria de Carnitina (CUD) 284.428 Déficit de 3-OH-3-Metilglutaril-CoA

Liasa (HMG) 284.428 Acidemia isovalérica (IVA) 284.428

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Polímeros ramificados de glucosa

• Son la vía más antigua de almacenamiento

universal de energía en las células y

probablemente se sitúe ya en los albores del

origen de la vida celular.

• Dos formas claramente diferenciadas:

–

Glucógeno en animales.

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Glucógeno

• Es la principal vía de almacenamiento de

carbohidratos pero no llega al 1% de la

energía almacenada en nuestro organismo, ya

que ésta es la función del tejido adiposo.

• Sin embargo, es la principal fuente de energía

para los músculos.

• Y es crucial para la homeostasis, pues es

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Dónde se encuentra el glucógeno

• Hígado en donde puede

haber 400 g de

glucógeno

• Músculo esquelético con

1200 g de glucógeno

• Cerebro, en los astrocitos

• Pulmones fetales, en los

neumocitos tipo 2

(responsables de la

producción de

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Glucogénesis

Glucógeno sintasa que une los

monómeros de glucosa

Glucogenina (GYG1 GYG2) que inicia la

polimerización de la

glucosa y se encuentra en el núcleo del polímero

Enzima ramificante que crea una nueva rama cada 10-14 glucosas

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Glucógeno

Häggström, Mikael. "Medical gallery of Mikael Häggström 2014". Wikiversity Journal of Medicine 1 (2). DOI:10.15347/wjm/2014.008. ISSN 20018762.

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Glucogenolisis

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Glucogenolisis

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LISOSOMA GLUCÓGENO Enzima desramificante (GSD IIIa, b, c) Fosforilasa hepática (GSD VI) Fosforilasa muscular (GSD V) Enzima ramificante Enlaces α 1-6 (GSD IV) Glucógeno sintasa Enlaces α 1-4 (GSD 0) Fructosa-1,6-BP GLUCOSA-1-P Dihidroxiacetona-P Glucosa Piruvato Lactato Lactato deshidrogenasa (GSD XI) α-1,4 y α-1,6 glucosidasa (GSD II) Glucosa-6-fosfatasa (GSD Ia) Transportador Glucosa-6-fosfato (GSD Ib, c, d) Fosfofructoquinasa (GSD VII) Fructosa-6-P GLUCOSA-6-P Aldolasa A (GSD XII) Fosforilasa quinasa (GSD IXa1, a2, b, c, d) Gliceraldehido 3-P Glicerato 2-P Fosfoglicerato mutasa 2 (GSD X)

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1932 Joannes Cassianus Pompe (Holanda) describe la enfermedad en un bebé de 7 meses que fallece por hipertrofia cardiaca idiopática

1955 Christian René de Duve (Bélgica) describe los lisosomas

1963 Henri-Géry Hers (Bélgica) describe la deficiencia de la enzima α-1,4 glucosidasa como causa de la enfermedad

1986-1988 Frank T. Martiniuk (USA) y Arnold J.J. Reuser (Holanda), consiguen la estructura del gen que codifica el enzima y describen numerosas mutaciones

2001 Néstor Chamoles describe técnica analítica en gota seca 2006 FDA aprueba Tratamiento enzimático sustitutorio

75 años de Enfermedad de Pompe

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Retraso en el diagnóstico clínico en la

Enfermedad de Pompe

2 4,7 0 1 2 3 4 5 n=168 niños Eda d m edi a ( m es es ) Primeros síntomas Diagnóstico 24 33 0 5 10 15 20 25 30 35 n=255 niños y adultos Eda d m edi a ( año s)

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Herramientas diagnósticas en Pompe

• Cardiacas

–

Rx. RM

–

EKG

–

Eco

• Pulmonares

–

Espirometría

–

Rx, RM

–

Pulsioximetría

–

Estudios del sueño

• Musculares

–

EMG

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Diagnóstico Analítico de Pompe

• Creatina kinasa sérica (CK)

• Alanina, aspartato aminotransferasa (ALT/AST)

y lactato deshidrogenasa (LDH)

• Glucosa tetrasacárido urinaria (Glc

₄

)

• Biopsia muscular: invasiva

• Técnicas moleculares: paneles genéticos

• Medición actividad α-glucosidasa

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Medición de actividad α-glucosidasa

–

Fibroblastos: Se requiere biopsia de piel. Los cultivos

de fibroblastos tardan 4 semanas y hay que añadir el

tiempo de 3 días para medir la actividad

α-glucosidasa.

–

Linfocitos. Los neutrófilos tienen una α-glucosidasa

adicional (maltasa-glucoamilasa) y por eso no valen

los leucocitos. Necesario procesar la muestra fresca y

enviar en hielo o congelada los linfocitos aislados.

–

Gota de sangre seca. Menos invasiva. Si urge, el

resultado está en 2 días. Puede ser empleada para

cribado neonatal.

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(17)

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(19)

Estado de la Muestra

75% motivos de repetición

• Obtención:

–

Mal impregnadas

–

Sobreimpregnadas

–

Empleo de alcohol

• Manipulación:

–

No secar al sol ni con una fuente de calor*

–

Efecto

“

cromatográfico

”

por secado inadecuado

–

Contaminación con heces, bacterias, hongos etc.

• Retraso en el envío y/o recepción de las muestras

en la Unidad

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Influencia de anticoagulante en gota

seca de sangre impregnada en papel

sin aditivo 2,06 heparina 2,04 citrato 2,01 EDTA 1,93 1,85 1,90 1,95 2,00 2,05 2,10 alfa-galactosidasa

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Reacción enzimática con sustrato

marcado

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Factores que afectan a la actividad

enzimática

• Temperatura

• pH

• Concentración del sustrato (saturación)

• Concentración del enzima (defecto

enzimático)

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Determinación directa

–

La más fiable, mejor sobre leucocitos o

fibroblastos. Ejemplo: Enf. de Fabry

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Enfermedad de Fabry

• Una enzima implicada: alfa-galactosidasa A.

• N-acetilgalactosamina como inhibidor de la

alfa-galactosidasa B.

• Se intentan reproducir la condiciones

fisiológicas a pH 4,4, 37ºC durante 20 horas.

• Se detiene la reacción cambiando a pH 10 y en

donde la 4MU se vuelve fluorescente.

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Ejemplo determinación enzimática

Cont. Fluorescencia nmol pmol

S3 50282 0,855 855 S3 46127 0,855 855 S4 28490 0,428 428 S4 28490 0,428 428 S5 15681 0,214 214 S5 14164 0,214 214 S6 7453 0,107 107 S6 7538 0,107 107 S7 3855 0,053 53 S7 3923 0,053 53 S8 2095 0,027 27 S8 2041 0,027 27

Muestra FluorescenciaFluor-blanco pmol umol/L/h

LS-14024 25408 19603 331,39 5,2 LS-14026 11649 10120,5 171,09 2,7 LS-14028 1932 158,5 2,68 0,0 C.LOW 1703 100 1,69 0,0 y = 56,089x + 1769,2 R² = 0,9886 0 20000 40000 60000 0 200 400 600 800 1000

Concentración 4MU

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Determinación indirecta

–

Cuando existe superposición de diversos enzimas.

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Alfa-glucosidasas

• 4 enzimas glucosidasas implicadas:

–

Alfa-glucosidasa lisosomal (GAA) que es la que nos interesa

medir y se activa a pH 3,5-6,0. Residuo Trp

–

Dos alfa-glucosidasas que se activan a pH 7,0-7,5.

–

Maltasa-glucoamilasa (MGA) que se activa a pH 3,0-8,0

superponiéndose a todas las anteriores. Residuo Tyr

• Se intentan reproducir las condiciones fisiológicas

trabajando a pH 3,9 y 6,5, incubando 24 h a 37°C.

• Se intenta inhibir la MGA con una molécula por la que

tiene más apetencia que la GAA, la acarbosa.

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Resultados Pompe

• Una actividad glucosidasa total baja en medio

ácido

orienta hacia

cualquiera de estas interpretaciones (no excluyentes):

– Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática, empleo de EDTA, leucopenia, …)

– Que estamos ante un posible caso de E. Pompe.

– Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamente normal.

• Una actividad glucosidasa

neutra

baja orienta hacia cualquiera de

estas interpretaciones (no excluyentes):

– Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamente normal.

• Una

actividad

glucosidasa

ácida

inhibida

baja

indica

(no

excluyentes):

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Resultados alfa-glucosidasa

0

10

20

30

40

50

60

70 0%

20%

40%

60%

80%

100%

Inicio infantil Inicio juvenil Inicio adulto

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Muestras con Historial Clínico

Pediátrico

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0% 20% 40% 60% 80% 100% 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0% 20% 40% 60% 80% 100% Hiper CKemia

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Resultados motores y de supervivencia de los pacientes que fueron diagnosticados por NBS en comparación con los diagnosticados clínicamente. En rojo los casos del cribado (NBS); en verde los casos diagnosticados clínicamente tratados y en azul los casos no diagnosticados clínicamente y no tratados (historia natural). A, curva de supervivencia de Kaplan-Meier ajustada por edad. B, curva de supervivencia de Kaplan-Meier de pacientes sin soporte ventilatorio

Long-Term Prognosis of Patients with Infantile-Onset Pompe Disease Diagnosed by Newborn Screening and Treated since Birth