Técnicas biología molecular
• Electroforesis
• PCR
Técnicas biología molecular
• Electroforesis
• PCR
Electroforesis
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para la separación
de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos)
según la movilidad de estas en un campo
eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por
tamaños
moleculares
y
carga eléctrica
. Para la
separación se usa un gel de agarosa (para
ácidos nucleicos) o poliacrilamida (para
Electroforesis
• La electroforesis en gel se puede usar para separar
fragmentos de ADN, basándose en propiedades como el tamaño o la forma. Usa una corriente eléctrica para
separar moléculas de diferente tamaño.
• Electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a
Electroforesis
Electroforesis
• Usando una pipeta, muestras de ADN son
cargadas dentro de cavidades hechas en
el gel de agarosa. Las muestras de ADN
son incoloras, pero investigaciones
añaden un camino teñido de azul. Esto
hace más fácil cargar las muestras y
Electroforesis
• Los grupos fosfato en la cadena principal de
ADN llevan oxígenos cargados
negativamente
,
dándole a la molécula de ADN una carga
negativa total, el ADN cargado negativamente
se mueve hacia el polo positivo de la cámara de
electroforesis. Los grupos fosfato en la cadena
principal de ADN llevan oxígenos cargados
negativamente, dándole a la molécula de ADN
una carga negativa total, el ADN cargado
Electroforesis
• Las moléculas de ADN se mueven a
través del gel, los fragmentos más
Electroforesis
• Sharp, Sambrook y Sudgen introducen el uso
del colorante fluorescente, bromuro de etidio,
para teñir el ADN. El bromuro de etidio se une a
la doble hélice de ADN y brilla cuando es
iluminado con luz ultravioleta. Esto permite a los
investigadores ver en donde los fragmentos de
ADN separados terminan.
• El tamaño de cualquier fragmento de ADN
puede determinarse comparándolo con
Técnicas biología molecular
• Electroforesis
• PCR
PCR
• PCR:Polymerase Chain Reaction –
PCR
• Amplificar
ADN
• El objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ADN particular,
partiendo de una única copia de ese
PCR
• Para realizar la técnica se necesitan:
• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con
temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa).
• Dos primers, que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, que son
reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no
mucha distancia (no más de 4 kb. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
PCR
•
Ciclo de
amplificación
:
1. Desnaturalización:
2. Alineamiento
PCR
1. Desnaturalización:
PCR
2. Alineamiento:
El primer se unirá a su secuencia complementaria
en el ADN molde para esto se baja la
temperatura a 50–65° C durante uno a varios
minutos, permitiendo así el alineamiento. La
polimerasa une el híbrido de la cadena molde y
el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
PCR
3. Elongación:
La temperatura se aumenta a 72° C, esto
permite que el Taq polimerasa
se adjunte
a cada primer y extienda (sintetice) una
PCR
Técnicas biología molecular
• Electroforesis
• PCR
• Secuenciación
SECUENCIACIÓN
(Método de Sanger):
• Para la secuenciación se necesita: • Una plantilla de ADN
• Un primer complementario al ADN que se va a secuenciar
• ADN polimerasa • 4 nucleótidos
SECUENCIACIÓN
• Para empezar la reacción de secuenciación, la mezcla de componentes es climatizada (96°), así las dos hebras de ADN complementarias se separan.
• Luego la temperatura baja y así el primer encuentra su secuencia complementaria en la plantilla de ADN
• Finalmente la temperatura se incrementa un poco, esto permite que la enzima ADN polimerasa se una al ADN y cree una nueva hebra de ADN. • La secuencia de este nuevo ADN es complementaria a la hebra de ADN
original.
• Como hay miles de millones de moléculas de ADN en el tubo de prueba, la hebra puede terminar en cualquier posición, esto da como resultado
SECUENCIACIÓN
• La reacción de secuenciación es transferida al gel de poliacrilamida, el gel se pone en un secuenciador de ADN para electroforesis y
análisis.
• Cada tipo de dideoxinucleotido emite una luz de color de una longitud de onda característica y es registrada como una banda coloreada en una imagen de simulación del gel.
• El programa de computador interpreta los datos y genera un
electroferograma con picos coloreados representando cada letra en la secuencia. N es una posición en la cual el nucleótido no puede determinarse.
• Los fragmentos de la reacción de secuenciación en la imagen de simulación del gel se leen de la parte inferior a la superior,
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• Electroforesis
• PCR
• Secuenciación
PROFILING
• La tecnología denominada huella digital de ADN (DNA
fingerprinting) permite comparar muestras de ADN de diversos orígenes.
• En esta técnica los investigadores utilizan también las enzimas de restricción para romper una molécula de ADN en pequeños
fragmentos que separan en un gel al que someten a una corriente eléctrica (electroforesis)
• Se puede obtener así un patrón de bandas o huella característica de cada organismo. Se utiliza una sonda (fragmento de ADN
marcado) que hibride (se una específicamente) con algunos de los fragmentos obtenidos y, tras una exposición a una película de rayos X, se obtiene una huella de ADN, es decir, un patrón de bandas
PROFILING
RAPD: Random Amplification of Polymorphic
DNA – Amplificación Aleatoria de ADN
Polimórfico.
• Es un tipo de reacción PCR, pero los segmentos
de ADN que son amplificados son
aleatorios
.
• RAPD: Se usa un
primer
corto (8-12
nucleótidos), luego se procede con la PCR
PROFILING
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
-Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción.
• Se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos.
RFLP
• El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la técnica
molecular PCR, luego tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de
diferentes longitudes.
• Los fragmentos de restricción se separan mediante
electroforesis en geles de acrilamida. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en
particular.
• Enzimas de Restricción: es capaz de cortar un
