INFORME TECNICO FINAL

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EVALUACIÓN SANITARIA PRELIMINAR DE GRANJAS CAMARONICOLAS CON EVENTOS DE MORTALIDADES ASOCIADOS A LA NECROSIS DEL HEPATOPÁNCREAS EN LA REGION NOROESTE DE MÉXICO

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Centro de Investigación en Alimentación y

Desarrollo, A.C.

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INFORME TECNICO FINAL

EVALUACIÓN SANITARIA PRELIMINAR DE GRANJAS CAMARONICOLAS CON EVENTOS DE MORTALIDADES ASOCIADOS A LA NECROSIS DEL

HEPATOPÁNCREAS EN LA REGION NOROESTE DE MÉXICO

Informe elaborado por: Dra. María . Soledad Morales Covarrubias y Dra. Sonia Soto Rodríguez

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Página 2 Resumen.

El presente informe comprende los resultados de la valoración de la problemática sanitaria y los análisis de camarones juveniles de camarón blanco (Litopenaeus vannamei), de seis muestreos realizados en Ahome, Angostura, Eldorado y Rosario, Sinaloa. Para la detección de patógenos se utilizaron análisis en fresco, bacteriológicos e histopatológicos. La integración de resultados de todos los análisis sugiere que las mortalidades atípicas se deben a una bacteriosis, posiblemente causada por vibrios que producen una toxina en la región oral (molino gástrico) asociada a una acelerada degradación del hepatopáncreas con posteriores cuadros asociados a infecciones secundarias, epibiontes y gregarinas similar a la reportada por Tran et. al. 2013, la cual presenta tres fases de desarrollo (inicial, aguda y terminal). Por lo tanto para poder identificar al posible agente causal de las mortalidades atípicas en las granjas del noroeste del país, se llevó a cabo un programa sistemático de toma, fijación y análisis de muestras en los estados afectados.

Zona de muestreo

En Sinaloa, se seleccionaron estanques de granjas afectadas (figuras 1 y 2) de Ahome, Angostura, Eldorado y Rosario.

Figura 1. Estanque seleccionado para la colecta de organismos debido a la presencia de organismos muertos flotando en el agua y en el fondo del estanque.

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Figura 2. Estanque seleccionado para la colecta de organismos debido a presencia de transparencia del agua.

Preservación y procesamiento de los organismos. Los organismos colectados, se

depositaron en contenedores de plástico con agua del estanque y aireación para su traslado al laboratorio de CESASIN y al CIAD-Mazatlán.

Preservación y procesamiento de los organismos. Los organismos colectados, se

depositaron en contenedores de plástico con agua del estanque y aireación para su traslado al CIAD-Mazatlán. Cada organismo fue procesado individualmente, registrándose alteraciones externas (Figura 3). El hepatopáncreas (Figura 4), fue seccionado en tres o cuatro partes de acuerdo a su tamaño para los siguientes análisis: a primera porción para el análisis bacteriológico, segunda parte para histopatología, la tercera para estudiosmetagenómicos y la cuarta para análisis en fresco.

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Figura 3. Organismo seleccionado en base al tamaño y opacidad en hepatopáncreas.

Figura 4. Hepatopáncreas con opacidad.

Procesamiento de muestras por análisis en fresco. El diagnóstico en fresco general se

realizó para revisar alteraciones en los diferentes órganos y tejidos de los organismos con base con base en los procedimientos publicados por Morales-Covarrubias 2010 y 2013.

Preservación y procesamiento de muestras para histología. La porción del

hepatopáncreas se fijó con solución Davidson AFA. Las muestras fueron depositadas en frascos y mantenidas en inmersión por 48 horas, tras de lo cual se enjuagaron con agua corriente y posteriormente se conservaron en alcohol etílico al 70%, hasta su proceso por

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histología de rutina convencional, utilizando la metodología de Bell y Lightner 1988 y Lightner 1996. El diagnóstico histopatológico general para revisar alteraciones en los diferentes órganos y tejidos de los organismos se realizó con base en lo publicado por Bell y Lightner 1988, Lightner 1996 y Morales-Covarrubias 2010.

Análisis bacteriológicos. En el análisis bacteriológico de los camarones y la interpretación

de resultados se aplicó la metodología descrita en Soto-Rodríguez et al. 2010.

Resultados

De un total de 188 organismos analizados (tabla 1), el 25% (47 camarones) presentaron características externas correspondientes a animales aparentemente sanos (Figura 5S), mientras que el 75% restante (141 camarones) presentaron nado errático, sin permanencia en la columna de agua, encontrándose la mayoría en el fondo del contenedor. El músculo presentó opacidad (Figura 5O) y expansión de cromatóforos, el hepatopáncreas se observó con atrofia y coloración pálida o blanquecina, el intestino se observó inflamado con el exoesqueleto blando.

Tabla 1. Muestreos abril a julio del 2013 en granjas con mortalidad atípica para detección del posible agente causal.

ZONA FECHA GRANJAS ANÁLISIS ORGANISMOS

Angostura 26 abril 5 Bacteriología Histología Virus

25 25 Pool Eldorado 13 abril 4 Análisis en

fresco

Bacteriología

20 23

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EVALUACIÓN SANITARIA PRELIMINAR DE GRANJAS CAMARONICOLAS CON EVENTOS DE MORTALIDADES ASOCIADOS A LA NECROSIS DEL HEPATOPÁNCREAS EN LA REGION NOROESTE DE MÉXICO Página 6 Histología Virus 23 Pool Ahome 27 mayo 4 Análisis en

fresco Bacteriología Histología Virus 30 40 24 Pool Eldorado 19 junio 1 Análisis en

fresco Bacteriología Histología Metagenómica 22 10 50 10 Eldorado 28 junio 2 Análisis en

fresco Bacteriología Histología Metagenómica 15 15 48 10 Eldorado 22 julio 1 Análisis en

fresco Bacteriología Histología Metagenómica 4 4 13 9 El Rosario 22 Julio 1 Análisis en

fresco Bacteriología Histología 5 5 5

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Figura 5. Camarón con características externas correspondientes a organismo aparentemente sano (S) y Camarón con músculo opaco (O).

Análisis en fresco

En los organismos analizados se observó deformación tubular de la región apical a proximal (Figura 6), con desprendimiento celular en grado 2 y 3, presencia de nódulos hemocíticos y encapsulación de túbulos, obteniéndose por esta técnica tres fases de degradación (necrosis) del hepatopáncreas (Figura 7).

Figura 6. Túbulo del hepatopáncreas con deformación de la región apical a proximal

S

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Página 8 FASE INICIAL

Deformación tubular de la región apical a distal.

FASE AGUDA

Desprendimiento celular severo, túbulos vacíos, necrosis tubular con células muertas en interior del lumen.

FASE TERMINAL

Infiltración hemocítica severa con presencia de túbulos melanizados, necrosis tubular, nódulos hemocíticos, encapsulación tubular y aglomerados de bacterias en el lumen de los túbulos.

Figura 7. Fases de degradación (necrosis) del hepatopáncreas utilizando análisis en fresco.

Análisis histológico

Los organismos presentaron desprendimiento progresivo y agudo de las células de los túbulos del hepatopáncreas, con disfunción de las células R, B, F y E que conforman el epitelio túbular, notándose en éstas últimas una disminución marcada en sus actividades de formación de nuevas células (mitosis). La afección de los túbulos del hepatopáncreas avanza de la parte interna (proximal) hacia la externa (distal) con aumento del tamaño de los núcleos en las células E del hepatopáncreas. Descamación de las células de los túbulos del HP, quedando libres con forma esférica en la luz de los conductos tubulares con

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inflamación moderada, sin presencia de cúmulos de bacterias en hepatopáncreas. También se observaron hepatopáncreas con infección bacteriana secundaria severa, agregación hemocítica, encapsulando las zonas con presencia de células muertas con melanización de las áreas más afectadas durante la fase avanzada de degradación del hepatopáncreas, notándose principalmente en las porciones proximales de los túbulos en algunos camarones. Al realizar la tinción de Giemsa se observaron agregados de bacterias en las setas del molino (criba) gástrico (Figura 8), intestino medio, nódulos hemocíticos y en lumen de los túbulos. Utilizando este análisis y al hacer la comparación con hepatopáncreas sanos (Figura 9) se observaron tres fases de desarrollo de degradación del hepatopáncreas (necrosis) severa del hepatopáncreas (Figura 10).

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Figura 9. Corte longitudinal de hepatopáncreas normal.

FASE INICIAL

Presencia de células epiteliales elongadas (E)

hacia el lumen (L), sin infiltración hemocítica.

FASE AGUDA

Desprendimiento progresivo y agudo (D) de las células del hepatopáncreas, con disfunción de

las células R, B, F, E, necrosis tubular (N) con células muertas en el

interior del lumen. La afección de los túbulos del hepatopáncreas avanza de la parte interna (proximal) hacia la externa (distal) con aumento del tamaño de los núcleos en las

células E del hepatopáncreas

FASE TERMINAL

Encapsulación de células y túbulos con infiltración hemocítica severa (H), presencia

de aglomerados de bacterias (B) en lumen de los túbulos y nódulos hemocíticos con y sin

melanización. E

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Figura 10. Fases de degradación (necrosis) severa del hepatopáncreas utilizando análisis histológico.

La ectoparásitosis asociada con la presencia de Zoothamnium sp (grado de severidad 1) y

Leucothrix mucor (grado de severidad 2 y 3) se observaron en todos los organismos

analizados afectando principalmente las dendobranquias. Otra de las enfermedades registradas fue la endoparásitosis causada por gregarinas con estadíos de sicigias en intestino medio (Figura 11) y gametocistos de gregarinas en ciego hepático posterior.

Figura 11. Corte longitudinal de intestino medio con presencia de diferentes estadíos de sicigias.

Análisis bacteriológico

Los resultados muestran niveles bajos de vibrios en hepatopáncreas (<104 UFC/g) en comparación con niveles normales (105 UFC/g), no se presentaron colonias bioluminiscentes y hubo una dominancia de colonias amarillas sensibles a enrofloxacina (MIC) y norfloxacina (MIC). Al realizar los conteos de vibrios por fases de desarrollo de la degradación (necrosis) severa del hepatopáncreas se observa mayor presencia de bacterias

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en estómago en la fase aguda (Figura 12) y bajo porcentajes de vibrios en estómago en fase aguda y alto en fase terminal (crónico) (Figura 13).

Figura 12. Conteo de vibrios por fase de desarrollo de la degradación (necrosis) severa del hepatopáncreas

Figura 13. Porcentaje de vibrios por fase de desarrollo de la degradación (necrosis) severa del hepatopáncreas.

Conclusiones Lo g UFC / g en T CBS

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La integración de resultados de todos los análisis sugiere que las mortalidades atípicas se deben a una bacteriosis, causada por vibrios asociada a una degradación (necrosis) severa del hepatopáncreas similar a la reportada por Tran et. al. 2013, la cual presenta tres fases de desarrollo (inicial, aguda y terminal) con presencia alta de bacterias en estómago (molino).

PROPUESTAS DE LAS POSIBLES ACCIONES A SEGUIR

 Identificar el o los agentes causales y sus factores asociados en relación a las mortalidades atípicas en el camarón blanco (Litopenaeus vannamei) en el noroeste de México.

 Epidemiología del Síndrome de la Necrosis Aguda del Hepatopáncreas en camarones de cultivo.

 Investigación sobre la presencia del Síndrome de la Necrosis Aguda del Hepatopáncreas en camarones silvestres del noroeste de México.

 Realización de cursos de análisis en fresco para detección de alteraciones en túbulos del hepatopáncreas y sintomatología externa de organismos con Síndrome de la Necrosis Aguda del Hepatopáncreas.

Referencias bibliográficas

BELL, T.A.; LIGHTNER, D.V. 1988 Fixation and normal penaeid histology. A handbook of normal penaeid shrimp histology. World Aquaculture. Society. Baton Rouge, USA. Pp 1-114.

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LIGHTNER, D. V. 1996 Diagnostic procedures for diseases in shrimp. A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp. World Aquaculture. Society. Baton Rouge. Pp 1-220.

MORALES-COVARRUBIAS, M. S. 2013 Camarón. Análisis en fresco, herramienta de diagnóstico. Editorial Impresos Unión Maya., Primera Ed. CIAD-OIRSA. Pp 1-80.

MORALES-COVARRUBIAS, M. S. 2010 Detección mediante análisis en fresco e histopatología. Enfermedades del camarón. Editorial Trillas, SA de CV., 2da Ed. Pp 1-130.

SOTO-RODRIGUEZ, S. A., GOMEZ GIL, ROQUE, A. AND LOZANO, R. 2010. Density of vibrios in hemolymph and hepatopancreas of diseased Pacific White shrimp,

Litopenaeus vannamei, from northwestern Mexico. J. World Aquacult. Soc. 41: 76-83.

TRAN. L., NUNAN, L., REDMAN, R.M., MOHNEY, L.L., PANTOJA, C.R., FITZSIMMONS, K., AND LIGHTNER, D.V. 2013. Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. J. DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS. 105: 45–55

GRUPO DE TRABAJO

Dr. Miguel Betancourt Lozano - coordinador CIAD Mazatlán

BACTERIOLOGÍA

• Dr. Bruno Gómez Gil R.

• Dra. Sonia Araceli Soto Rodríguez • QFB Carmen Bolán M.

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• IBQ Karla Guadalupe Rendón A. VIROLOGÍA

• M.C. Leobardo Montoya Rodríguez • Dra. Alejandra García Gasca

HISTOPATOLOGÍA Y ANÁLISIS EN FRESCO

• Dra. Ma. Soledad Morales Covarrubias • Dra. Cristina Chávez Sánchez

• MVZ Rodolfo Lozano Olvera • B.P. José A. Velázquez Garay ADMINISTRACIÓN

• Lic. Carlos Salas APOYO

• Julio Cabanillas Ramos -CESASIN [email protected]