Validación de un método analítico por HPLC para la cuantificación de Cetirizina diclorhidrato 5 mg/mL en solución oral gotas

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. |UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. M. IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Q. UI. INFORME DE PRÁCTICAS PRE-. Y. BI. O. PROFESIONALES. FA R. M. AC I. A. “Validación de un método analítico por HPLC para la cuantificación de Cetirizina diclorhidrato 5 mg/mL en solución oral gotas”. DE. PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE. BL. IO TE. CA. QUÍMICO FARMACÉUTICO. BI. AUTOR:. Br. GUARNIZ AGUILAR, David. ASESOR: Mg. RENGIFO PENADILLOS, Roger Antonio. TRUJILLO – PERU 2018 i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. BL. IO TE. CA. DE. FA R. M. AC I. A. Y. BI. O. Q. UI. M. IC A. A Dios en primer lugar que siempre derrama bendiciones y acompaña en todo momento.. BI. A mis amados padres, César y Sabina, Mis primeros maestros, consejeros y amigos. El amor y gratitud hacia ustedes, por la dedicación, tiempo y esfuerzo.. El Autor. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACION. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO: De acuerdo con lo dispuesto con las disposiciones legales y vigentes establecidas en el. reglamento de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la. Universidad Nacional de Trujillo, presento a vuestra consideración y elevado nivel. UI. M. IC A. de criterio profesional, el presente informe de prácticas pre-profesionales:. O. Q. “Validación de un método analítico por HPLC para la cuantificación de. AC I. A. Y. BI. Cetirizina diclorhidrato 5 mg/mL en solución oral gotas”. M. Es propicia esta oportunidad para hacer extensivo mi más profundo sentimiento de. FA R. agradecimiento a nuestra Alma Mater y a toda la plana docente que lo conforma, por. DE. su meritoria labor de educadores y por la formación profesional que nos han. CA. brindado a través de sus enseñanzas y experiencias. De manera muy especial. IO TE. agradecemos la valiosa colaboración de los señores Miembros del Jurado.. BI. BL. Trujillo, Junio del 2018. GUARNIZ AGUILAR, David. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. FA R. M. AC I. A. Y. BI. O. Q. UI. M. IC A. M.Sc. Miranda Leyva, Segundo Manuel PRESIDENTE. BI. BL. IO TE. CA. DE. Mg. Curo Vallejos, Yuri Freddy MIEMBRO. Mg. Rengifo Penadillos, Roger Antonio MIEMBRO. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. En el presente trabajo se realizó la validación del método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la cuantificación de Cetirizina diclorhidrato en Cetrixin-D solución oral gotas. Se utilizaron agua, dimetilformamida y fase móvil como diluyentes para el estándar y sólo dimetilformamida y fase móvil como diluyentes para las muestras. Condiciones cromatográficas: 231 nm de longitud de onda, 1,0 mL/min de flujo, 20 µL de volumen de inyección y 15 minutos de tiempo de corrida. Tanto estándar,. IC A. muestra, placebo y excipientes fueron analizados individualmente donde no se evidenció. M. interferencia alguna, asegurando que el método cumple con la especificidad. El porcentaje. Q. UI. de recuperación fue de 100,105%, para el test G de Cochran se obtuvo G exp. menor que G. O. tabla (0,6692 ˂ 0,8709) y en el test estadístico t-Student se obtuvo un p-valor mayor que el. BI. requerido (0,646 > 0,05), de manera que la exactitud es conforme. Para repetibilidad, se. A. Y. obtuvo un DSR de 0,427% y en prueba de normalidad Anderson-Darling un p-valor de. AC I. 0,683. En la precisión intermedia diferente analista la prueba de comparación de resultados. M. t-Student dio un p-valor de 0,461 y en la precisión intermedia diferente equipo se obtuvo. FA R. en el análisis de varianza un p-valor de 0,618, dando la conformidad en el parámetro de precisión. La linealidad del sistema y linealidad del método presentaron coeficientes de. DE. correlación de 1,0000 y 0,9994 respectivamente; por tanto la linealidad es conforme. En el. CA. parámetro de robustez por el método Youden-Steiner se observó que ningún factor superó. IO TE. el máximo efecto variable permitido (< 0,047) y por el método de ANOVA se obtuvo un pvalor de 0,785, de manera que hay conformidad en robustez. Los parámetros de validación. BL. determinados permiten dar como validado el método analítico propuesto para la. BI. cuantificación de Cetirizina diclorhidrato en Cetrixin-D solución oral gotas.. Palabras claves: Cetirizina diclorhidrato, HPLC, método analítico, solución oral gotas.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. In this paper the analytical method validation was performed by high performance liquid chromatography (HPLC) for the quantification of Cetirizine dihydrochloride in Cetrixin-D oral solution drops. Water, dimethylformamide and mobile phase were used as diluents for standard and only dimethylformamide and mobile phase as diluents for samples. Chromatographic conditions: 231 nm wavelength, 1,0 mL / min flow, 20 uL injection volume and 15 minutes approximate run time. Both standard, sample, placebo and. IC A. excipients were analyzed individually where no interference was evidenced, ensuring that. M. the method complies with the specificity. The recovery percent was 100,105%, for G. UI. Cochran test, G exp was less than G table (0,6692 < 0,8709) and for t-Student test p-value. O. Q. was obtained greater than that required (0,646 > 0,05) so the accuracy is consistent. For. BI. repeatability, RSD was 0,427% and Anderson-Darling normality test was obtained a p-. Y. value of 0,683. In the intermediate precision different analyst, t-Student comparison test. AC I. A. results gave a p-value of 0,461 and the intermediate precision different equipment was obtained in the analysis of variance a p-value of 0,618, giving conformity for parameter of. FA R. M. precision. The system linearity and linearity of the method presented correlation coefficients 1.0000 and 0.9994 respectively, therefore linearity is consistent. In the. DE. parameter robustness by the Youden-Steiner method was observed that any factor. CA. exceeded the maximum allowable variable effect (< 0,047) and by the method of ANOVA. IO TE. p-value of 0,785 was obtained, so that there is conformity for robustness. Certain validation parameters allow to give as validated analytical method proposed for the. BI. BL. quantification of Cetirizine dihydrochloride in Cetrixin-D oral solution drops.. Key words: Cetirizine dihydrochloride, HPLC, Analytical method, oral solution drops.. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE. Pág. CARATULA................................................................................................................. i DEDICATORIA.......................................................................................................... ii. IC A. PRESENTACIÓN ...................................................................................................... iii. M. JURADO DICTAMINADOR .................................................................................... iv. UI. RESUMEN .................................................................................................................. v. O. Q. ABSTRACT ............................................................................................................... vi. Y. BI. INDICE .................................................................................................................... vii INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 08. II.. OBJETIVOS ................................................................................................. 21. III.. MATERIAL Y MÉTODO ............................................................................ 22. IV.. RESULTADOS ............................................................................................. 53. V.. DISCUSIÓN .................................................................................................. 57. VI.. CONCLUSION ............................................................................................. 63. VII.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 64. BL. IO TE. CA. DE. FA R. M. AC I. A. I.. BI. VIII. ANEXOS ....................................................................................................... 68. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCION El control de la calidad forma parte de las Buenas Prácticas de Manufactura, en el cual se encuentran involucrados el muestreo, las especificaciones y las pruebas, así como también el procedimiento de organización, documentación y autorización que aseguren las realización de las pruebas pertinentes, y que no se autorice el uso de materiales ni la expedición de productos para su venta y provisión, sin que se haya establecido que su calidad es satisfactoria1.. IC A. El control de calidad es indispensable para garantizar que un producto farmacéutico. M. es elaborado con rigurosas exigencias de calidad, con ingredientes farmacéuticos. Q. UI. activos y excipientes de una composición cualitativa y cuantitativa establecida, para. O. que el producto en las condiciones normales de uso y duración del tratamiento. Y. BI. pueda ser utilizado con los efectos previstos para preservar o mejorar la salud 1.. AC I. A. Las sustancias farmacéuticas son biológicamente activas y pueden causar también, en grado variable, efectos indeseables. El riesgo de reacciones graves y de fracaso. FA R. M. terapéutico se acentúa cuando los productos son de calidad inferior o se administran incorrectamente. Para evitar ello, la elaboración, envasado y comercialización de. DE. productos debe sujetarse a las normas aceptadas internacionalmente 2. Posterior a esto, para verificar la calidad de la manufactura del medicamento, los análisis. CA. fisicoquímico y microbiológico también deben cumplir ciertas especificaciones. IO TE. siguiendo la normativa correspondiente para asegurar la calidad del producto.. BL. En la práctica la calidad es un concepto relativo, ligado al binomio producto-. BI. consumidor, en este sentido la calidad es el “grado de satisfacción que ofrece las características del producto en relación con las exigencias del consumidor”. En consecuencia se puede afirmar que la calidad no es una opinión subjetiva, sino una propiedad que posee todo producto, y si se quiere opinar sobre calidad, han de definirse sus características con parámetros cualitativos y cuantitativos 3. El análisis se considera hoy en día un proceso mediante el cual obtenemos información. Se realiza millones de análisis cada día en los ámbitos más variados: análisis de productos manufacturados, análisis medioambientales, análisis clínicos, forenses, químicos y físicos, en todos ellos se requiere una confianza en los. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. resultados obtenidos. La validación de las metodologías analíticas, junto con otras actividades englobadas en el área de aseguramiento de la calidad, permiten conseguir calidad, otorgando la confianza necesaria a la vez que confieren un grado elevado de comparabilidad entre los resultados de los análisis químicos4. Según la norma ISO/IEC 17025, los laboratorios deben validar todos los métodos que se utilicen en el laboratorio, tanto los desarrollados por ellos mismos como aquellos procedentes de fuentes bibliográficas, o desarrollados por otros. IC A. laboratorios. Además, también es necesario que el laboratorio valide los métodos de referencia aunque, en ese caso, no es necesario que el laboratorio realice una. UI. M. validación completa. Asimismo, el laboratorio debe validar todo el procedimiento. Q. analítico teniendo en cuenta el intervalo de concentraciones y de matrices de las. BI. O. muestras de rutina5.. Y. La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas. AC I. A. (evidencia objetiva), mediante estudios sistemáticos de laboratorio y demostrativos,. M. de que un método de análisis es lo suficientemente fiable, reproducible y cumple. FA R. requisitos particulares para producir el resultado previsto dentro de intervalos definidos. El proceso de validación permite el conocimiento de las características. DE. de funcionamiento del método y proporciona un alto grado de confianza en el. CA. mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo 6, 8.. IO TE. La validación de los métodos analíticos es una actividad fundamental en los sistemas de calidad de los laboratorios. El proceso de validación, guarda una. BL. estrecha relación con la representatividad de los resultados, dependiendo del. BI. objetivo de los análisis y del tipo de muestra7. Se define como método analítico a la adaptación específica de una técnica analítica para un propósito de medición seleccionado. La validación de un procedimiento analítico es un procedimiento para establecer por medio de estudios de laboratorio experimentales una base de datos que demuestren científicamente que un método analítico tiene las características de desempeño (exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad e intervalo, robustez) que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. pretendidas (análisis de rutina)8. La complejidad actual de las muestras y las exigencias respecto a los límites de cuantificación, la necesidad de detectar no solamente especies químicas, sino de mantener íntegras la configuración espacial (en los compuestos biológicos), el grado de oxidación (en especies inorgánicas), la polimorfía cristalina del compuesto, la integridad de las impurezas potenciales en el producto y sus excipientes, entre otros, exigen un trabajo intensivo de preparación de muestra y de extracción de los componentes de interés que solamente se consiguen mediante técnicas sofisticadas que precisan de un largo proceso de. IC A. preparación, en el que cada pequeño paso puede introducir variaciones en el analito. UI. M. de interés9.. Q. Existen varios tipos de validación de metodología analítica que se mencionan a. BI. O. continuación:. Y. a) Validación Prospectiva: Es la que se realiza sobre un proceso antes de que sea. AC I. A. implementado, el cual puede darse para la fabricación de nuevos productos,. FA R. equipo o sistema para uso 10.. M. cuando hay cambios fundamentales en un proceso o cuando se incorpora un. DE. Es la validación que comúnmente se elige porque nos asegura el éxito del proceso antes de su implementación, además que se pueden elegir y controlar. IO TE. CA. las variables a ensayar en el proceso 10. b) Validación Retrospectiva: Es la que se realiza sobre el análisis de ensayos ya. BL. elaborados, en la cual se revisa y analiza con métodos estadísticos los. BI. parámetros físicos y los resultados analíticos de por lo menos 10 a 30 consecutivos, no debiendo existir cambios en la formulación, modificaciones sustanciales de equipo o instalaciones, ni cambios en el método de ensayo. El proceso se considera válido si al menos el 95% de los resultados analíticos cumplen con las especificaciones internas y al menos el 90% de los controles de proceso no tienen variaciones significativas11. c) Validación Simultánea: Es la que se produce cuando es imposible completar la validación antes de la puesta en el mercado del producto farmacéutico. Se da si sólo se ha producido un limitado número de lotes o si los lotes no se producen. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. frecuentemente o tal vez si la fabricación se ha producido con modificaciones y las pruebas demuestran que los parámetros estén conformes. En este caso, se incrementan las pruebas del número de análisis10. d) Revalidación: Se realiza cuando un método previamente validado ha sido modificado en alguno de los pasos del procedimiento establecido, o se ha variado alguno de los instrumentos, reactivo, de la matriz que contiene la muestra, de la proporción relativa del analito o material empleado. IC A. originalmente, y se realiza en periodos establecidos10, 12.. M. La validación empieza en la planificación, formalizada usualmente a través de un. UI. plan maestro de validación (PMV). Esta planificación incluye prever la realización. O. Q. de todas las instancias de calibración, mantenimiento, capacitación, desarrollo de. BI. documentos, etc., que corresponda, antes de comenzar con las actividades de. A. Y. validación propiamente dichas10, 13.. AC I. El plan maestro de validación viene a ser el desarrollo planificado y sistemático de. M. todas las actividades relacionadas que atañe al establecimiento en su totalidad y en. FA R. el que se describe que equipos, sistemas, métodos y procedimientos habrán de. DE. validarse y cuándo lo serán. En el documento deberá de especificarse la forma de presentación necesaria para cada documento de validación (IQ, OQ, PG en el caso. CA. de equipos y sistemas; validación de procesos; validación de métodos analíticos) e. IO TE. indicar que tipo de información deberá reflejarse encada momento 10. Indicará también por qué y cuándo se efectuarán las revalidaciones, ya sea después de. BL. hacerse modificaciones o cambios en la ubicación de equipos o sistemas, cambios. BI. de los procesos o equipos usados en la fabricación, o cambios en los métodos de valoración o equipos utilizados en las pruebas10, 13. Las categorías de métodos analíticos más comunes son las siguientes: Categoría I: Incluye los métodos analíticos para la cuantificación de los componentes mayoritarios, actividad biológica o potencia de las materias primas o de los principios activos (incluyendo conservadores) en productos biológicos y productos farmacéuticos, que miden el analito presente en una muestra determinada10, 14.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Categoría II: Incluye los métodos analíticos empleados para la determinación de impurezas en materias primas o productos de degradación en los productos biológicos o farmacéuticos. Pueden ser pruebas cuantitativas o pruebas de límite para determinar si la impureza está presenta en la muestra por encima o por debajo de un valor límite especificado. Cualquiera de las dos pretende reflejar las características de pureza de la muestra. Los parámetros de validación requeridos por una prueba cuantitativa son diferente a los de una prueba de cumplimiento de. IC A. límite10, 14. Categoría III: Incluye métodos analíticos para la determinación de las. UI. M. características de desempeño (ej. disolución, liberación de principios activos) de un. O. Q. producto farmacéutico10, 14.. BI. Categoría IV: Ensayos de identificación de productos farmacéuticos. Incluye. A. Y. pruebas para asegurar la identidad de un analito en una muestra10, 14.. M. AC I. Para cada categoría de análisis, se necesita diferente información analítica.. FA R. En la tabla se indica los elementos o parámetros que normalmente se requiere para. DE. cada una de estas categorías14.. Categoría II Análisis Pruebas Cuantitativos de Límite. Categoría III. Categoría IV. IO TE. CA. Parámetros de Desempeño Categoría Analítico I SI. SI. *. SI**. NO. Repetibilidad. SI. SI. NO. SI. NO. SI***. SI***. NO. SI***. NO. Especificidad. SI. SI. SI. SI**. SI. Límite de Detección. NO. NO. SI. *. NO. Límite de Cuantificación. NO. SI. NO. *. NO. Linealidad. SI. SI. NO. SI**. NO. Intervalo. SI. SI. *. *. NO. Precisión. BI. BL. Exactitud. Precisión Intermedia. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. * Puede requerirse, dependiendo de la naturaleza del método. ** Puede no ser necesaria en algunos casos. *** En casos donde la reproducibilidad ha sido realizada, la Precisión Intermedia no es necesaria.. Las características de desempeño de un método analítico se expresan en función de los parámetros analíticos. Estos parámetros analíticos considerados en validación son: a) Especificidad:. IC A. Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultánea o. M. separadamente los analitos de interés, de formas inequívocas, en presencia de. Q. UI. otras sustancias químicas que pueden estar presentes en la muestra.. O. Frecuentemente los términos ESPECIFICIDAD y SELECTIVIDAD se utilizan. BI. como sinónimos, aunque “especificidad” debería reservarse para aquellas. A. Y. situaciones donde la respuesta obtenida solo se puede producir con una única. AC I. entidad química, algo que no es posible cuando se refiere a procedimientos. M. analíticos que emplean instrumentación no específica. Como existen muy. FA R. pocos métodos que den respuesta sólo a un único analito, el término “selectividad” es normalmente más apropiado.. DE. La especificidad de un método analítico se debería determinar antes de iniciar. CA. el estudio de cualquier otro parámetros de validación, dado que debe conocerse. IO TE. en qué grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el analito, sin interferencias de otras sustancias relacionadas de una u otra. BI. BL. forma10.. b) Exactitud:. La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimental encontrado 10. Se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra, o como la diferencia entre la media de la valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza15.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la exactitud utilizando un mínimo de nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración,. cubriendo. el. intervalo. especificado. (es. decir,. tres. concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) 15. La exactitud o bien se podría llamar “inexactitud”, debe ser tan pequeña como sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia. Dicho de otro modo, la exactitud del analito debe acercarse al 100%12. No se debe confundir exactitud y precisión. La precisión está relacionada con. IC A. la dispersión de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicación de lo. M. cerca que está del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy precisas. UI. pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un. BI. O. Q. cierto grado de precisión10.. A. Y. c) Precisión:. AC I. La precisión expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una. FA R. en las condiciones prescritas.. M. serie de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea. La procedencia de las muestras destinadas al estudio de la precisión puede ser. DE. de muestras reales o preparadas en el laboratorio.. CA. El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad o el más –. IO TE. menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Como consecuencia de la existencia de. BL. estos errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas. BI. circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de ensayo no pueden ser siempre controlados (analistas, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión10. La precisión engloba diferentes tipos de estudio:. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Fuente: Quattrocchi O., Andrizzi S., Laba R. Introducción a la HPLC Aplicación y Práctica.. 1. Repetibilidad: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos aparatos y reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y en un período de tiempo corto. La repetibilidad se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación (desviación estándar relativa) de una serie de medidas. Uno de los factores que más puede influir en la repetibilidad del método de. IC A. análisis es la concentración del analito, ya que la desviación estándar de. M. las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentración del. O. Q. UI. analito10.. BI. 2. Precisión Intermedia: Estudia la variabilidad del método efectuando una. A. Y. serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas. AC I. (diferentes analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio.. M. En el estudio de la precisión intermedia se deben considerar aquellas. FA R. circunstancias en las que se pretende desarrollar el método de ensayo. El analista debe evaluar los efectos causados al variar una serie de factores.. DE. Típicos factores a estudiar incluyen el día, el analista, el instrumento, etc.. CA. No es necesario estudiar cada uno de estos factores individualmente si no. IO TE. que es suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el conjunto. BL. de factores está dentro de los límites establecidos10.. BI. 3. Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios. La precisión de un método analítico se expresa generalmente como el coeficiente de variación de una serie de medidas. La reproducibilidad de dicho método de análisis se determina analizando una serie de alícuotas procedentes de lotes homogéneos en diferentes laboratorios, diferentes analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales distintas pero siguiendo el procedimiento descrito en el método10.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la repetibilidad utilizando un mínimo de nueve determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) o usando un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba15.. d) Linealidad e Intervalo: La linealidad es la capacidad del método para proporcionar resultados que son. IC A. directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a. M. la concentración del analito en la muestra dentro de un intervalo establecido.. UI. Siempre que sea posible se buscará una respuesta de tipo lineal que facilitará su. O. Q. trazado, interpolación e interpretación. Si no se puede lograr la linealidad, se. BI. puede utilizar un modelo no lineal. El objetivo es obtener un modelo que. AC I. ya sea lineal o no lineal10, 15.. A. Y. describa con precisión la relación de concentración en función de la respuesta,. M. El Intervalo se define como el rango o amplitud entre la concentración superior. FA R. e inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, del intervalo10, 15.. DE. exactitud y linealidad del método descrito en los extremos al igual que dentro. CA. Aunque el proceso lógico consistirá en evaluar cuáles son los límites de. IO TE. concentración en los que el método analítico pierde su linealidad, normalmente se toma como punto de partida un intervalo de concentraciones ya establecido. BL. de acuerdo con la experiencia, el conocimiento analítico de la técnica empleada. BI. y principalmente en función de las especificaciones10. Las concentraciones por debajo del intervalo de concentración definido pueden introducir un error debido a una pobre relación señal-ruido, mientras que las concentraciones que exceden el intervalo de concentración definido pueden introducir un error debido a dispersiones múltiples 15. La ICH recomienda que, para establecer la linealidad, se utilicen un mínimo de cinco concentraciones. También recomienda que se consideren los intervalos especificados mínimos que se indican a continuación:. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Valoración de un Fármaco (o producto terminado): de 80% a 120% de la concentración de prueba.. . Determinación de una Impureza: de 50% a 120% del criterio de aceptación.. . Uniformidad de Contenido: un mínimo de 70% a 130%. de la. concentración de prueba, a no ser que se justifique un intervalo más amplio o más apropiado, basándose en la naturaleza de la forma farmacéutica.. IC A. Pruebas de Disolución: ±20% por encima del intervalo especificado 15.. M. . Q. UI. e) Robustez:. O. La robustez de un método analítico es la medida de su capacidad para. BI. permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos. A. Y. parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad “estabilidad” durante su. AC I. empleo en rutina.. M. Es por tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para. FA R. proporcionar resultados válidos en presencia de pequeños cambios respecto de las condiciones descritas en el método, susceptible de producirse durante su. DE. utilización10.. CA. Variaciones habituales son el pH de la fase móvil, la composición de la fase. IO TE. móvil, diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura y la velocidad de flujo15.. BL. También comprende la medida en que los analitos se mantengan estables. BI. durante todo el procedimiento de análisis, incluido su almacenamiento antes y después de éste. En general, la medición se hace comparando patrones recién preparados con una concentración conocida. con patrones similares. almacenados durante diferentes períodos de tiempo y en diferentes condiciones16. La evaluación de la robustez puede realizarse durante la fase de desarrollo del método analítico y no necesariamente durante la validación14. En la selección de variables a considerar debe utilizarse todo el conocimiento ya adquirido durante el desarrollo analítico para minimizar el número de. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ensayos a realizar. En un diseño normal de “una variable por vez”, el estudio de 5 variables resultaría en 25 = 32 ensayos. Por eso, cuando los factores a evaluar en el estudio de robustez son muchos, se recurres a un diseño global que permite agruparlos, reduciendo el número de ensayos a efectuar 15. Un diseño muy utilizado es el de Youden y Steiner, que permite estudiar el. AC I. A. Y. BI. O. Q. UI. M. IC A. efecto de n variables en n+1 ensayos12.. FA R. M. Fuente: Quattrocchi O., Andrizzi S., Laba R. Introducción a la HPLC Aplicación y Práctica.. Las variables seleccionadas se indican con letras: las letras mayúsculas (A, B,. DE. C, D, E, F) corresponden al nivel alto y las letras minúsculas (a, b, c, d, e, f) al. CA. nivel bajo de la variable en cuestión. Luego se selecciona uno o más. IO TE. parámetros a medir y se obtienen los resultados indicados con las letras s, t, u, v, w, x, y, z. Estos resultados corresponden a uno o más parámetros en estudio:. BI. BL. concentración hallada, resolución, asimetría, etc12.. f) Límite de Detección y Límite de Cuantificación: Se entiende por límite de detección la mínima cantidad del analito en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones experimentales y se expresa en unidades de concentración (%, ppm, ppb, etc.)10, 12. Se define también como la concentración mínima que puede distinguirse del ruido de fondo con un determinado grado de confianza. Para estimar el límite de detección pueden utilizarse varios métodos, todos los cuales dependen del. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. análisis de especímenes en blanco y el examen de la relación entre la señal y el ruido. Por lo general se acepta un requisito mínimo de relación señal/ruido de 2/1 ó 3/112, 15, 16. El límite de detección es por tanto un término sólo cualitativo, no robusto y puede resultar afectado por cambios menores del sistema analítico (ej., temperatura, pureza de los reactivos, efectos de matriz, condiciones instrumentales. En ambos términos se encuentra un rango de concentraciones en las que si bien no puede cuantificarse el analito en cuestión con razonable. IC A. certeza, si puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos10, 16.. M. Se entiende por límite de cuantificación de dicho método, la mínima cantidad. UI. de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones. O. Q. experimentales descritas, con una adecuada precisión y exactitud.. BI. El límite de cuantificación es por lo tanto un término cuantitativo10.. A. Y. Generalmente se mide la señal de fondo (relación señal/ruido); efectuando. AC I. mediciones repetidas sobre un blanco o placebo. La relación señal/ruido. FA R. M. habitualmente aceptable es de 10/110, 12, 15.. Las formulaciones farmacéuticas son mezclas complejas que incluyen, además de. DE. un o más componentes medicinalmente activos, una serie de excipientes tales como. CA. diluyentes, desintegrantes, colorantes, y saborizantes12.. IO TE. La mayoría de los métodos de análisis son en los casos más favorables selectivos, pero no específicos. Por ellos, cuando se trata de muestras complejas la separación. BL. del analito de las posibles interferencias es una etapa esencial. Uno de los mejores. BI. métodos para conseguir esa separación, y posiblemente, el más utilizado es la cromatografía17. La cromatografía líquida de alta performance (HPLC), es una técnica de separación constituida por una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida. Las separaciones se logran por partición, adsorción o procesos de intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria empleada12. Ésta es una de las técnicas cromatográficas más utilizada. Esta técnica deriva de una evolución de la cromatografía preparativa en columna, la que se realizaba en. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. Para que el flujo de fase móvil fue razonablemente rápido las partículas de fas estacionaria debían ser de gran diámetro (150 – 200 um) lo que se traducía en una separación poco eficaz y, a pesar de todo, lenta. Para aumentar la eficacia de la separación y así incrementar a la resolución era necesario emplear fases estacionarias con tamaño de partícula mucho menos (entre 2 y 5 um), ya que la difusión de los solutos entre las fases móvil y estacionaria se hace más rápida. Pero ello implica la necesidad de impulsar la fase móvil con un sistema de alta presión,. IC A. nace así la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 17.. UI. M. Las ventajas sobre esta técnica radican en su alta sensibilidad, fácil adaptación a las. Q. determinaciones cuantitativas exactas, aplicabilidad a sustancias de interés general. BI. O. (industria, salud, medio ambiente), en determinación de compuestos no volátiles. Y. (alto peso molecular, iones metálicos), etc.. AC I. A. Los compuestos a analizar se disuelven en un líquido orgánico y la mayoría de las. M. separaciones tienen lugar a temperatura ambiente. Por lo tanto, la mayoría de las. FA R. drogas, sean compuestos no volátiles o térmicamente inestables, pueden analizarse mediante esta técnica sin riesgo de descomposición. El tiempo de elución de un. DE. compuesto puede ser descrito por su factor de capacidad, ya que depende de la. CA. naturaleza química del compuesto analizado, la composición y la velocidad de flujo. IO TE. de la fase móvil y la composición y el área superficial de la fase estacionaria. Solo los compuestos que tienen diferentes factores de capacidad pueden ser separados. BL. por HPLC12.. BI. Dentro de los productos farmacéuticos de nuestro medio podemos encontrar a la Cetirizina diclorhidrato, el cual es un antagonista de segunda generación selectivo del receptor de Histamina H1 que ha demostrado su eficacia tanto en pacientes atópicos como no atópicos, al inhibir los signos y síntomas de la alergia. Es un polvo blanco soluble en agua y prácticamente insoluble en acetona y en cloruro de metileno15.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PROBLEMA ¿Cumple el método por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la cuantificación de Cetirizina diclorhidrato 5 mg/mL en solución oral gotas con los. OBJETIVOS:. UI. M. II.. IC A. parámetros de validación de acuerdo a los criterios de aceptación establecidos?. O. Validar el método por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la. BI. . Q. Objetivo general:. A. Y. cuantificación de Cetirizina diclorhidrato 5 mg/mL en solución oral gotas.. M. Determinar los parámetros de validación: linealidad, exactitud, precisión,. FA R. . AC I. Objetivos específicos:. especificidad y robustez, del método por cromatografía líquida de alta resolución. DE. (HPLC) para la cuantificación de Cetirizina diclorhidrato 5 mg/mL en solución. Evaluar los parámetros de validación mencionados de acuerdo a los criterios de. IO TE. . CA. oral gotas.. BI. BL. aceptación establecidos.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. MATERIAL Y MÉTODO 1. MATERIAL 1.1. MUESTRA Y ESTÁNDAR MUESTRA PARA ANÁLISIS: Nombre: CETRIXIN-D SOLUCION ORAL GOTAS Presentación: Frasco por 15 mL. IC A. Cantidad: 12 frascos. Q. Nombre: CETIRIZINA DICLORHIDRATO. UI. M. ESTÁNDAR SECUNDARIOS:. BI. O. Número de análisis: S-11/15. Y. Tipo de estándar: Estándar secundario tipo A. AC I. FA R. M. Potencia: 99,947 % tal cual. A. Proveedor: DVA HEALTH&NUTRITION GMBH. PLACEBO PARA ANÁLISIS:. DE. Nombre: CETRIXIN-D SOLUCION ORAL GOTAS. CA. Presentación: Frasco por 15 mL. IO TE. Cantidad: 03 frascos. BL. 1.2. REACTIVOS Y SOLVENTES Agua purificada. •. Agua ultrapura. •. Acetonitrilo grado HPLC. •. Lauril sulfato de sodio grado ACS. •. Dimetilformamida grado ACS. •. Trietilamina grado ACS. •. Ácido fosfórico grado ACS. BI. •. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.3. MATERIALES DE LABORATORIO Fiolas: 10mL, 25mL, 50mL, 100mL. . Pipetas volumétricas: 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL, 6mL. . Probetas: 25mL, 50mL, 500mL, 1000mL. . Pipetas graduadas: 1mL, 2mL, 10mL. . Vasos de precipitación: 100 mL. . Varillas de vidrio. . Espátulas. . Pizeta con agua purificada. . Termómetro. . Tapas de plástico para fiolas. . Viales para HPLC. . Tapas y septas para viales. . Filtros jeringa de nylon de 0,2 µm de porosidad. . Jeringas de plástico: 5mL, 10mL, 20mL. BI. BL. IO TE. CA. DE. FA R. M. AC I. A. Y. BI. O. Q. UI. M. IC A. . 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.4. EQUIPOS DE LABORATORIO CODIGO. EQUIPO. OBSERVACIONES Marca: HITACHI Modelo: LACHROM ELITE MÓDULOS:. CC-CL-101. CROMATÓGRAFO. Bomba: L-2130. LÍQUIDO DE ALTA. Inyector automático: L-2200. RESOLUCION (HPLC). Horno: L-2350. IC A. Detector DAD: L-2455 Detector Conductividad:L-2470. UI. M. Calibración y/o verificación: Conforme. Q. Marca: THERMO SCIENTIFIC. O. Modelo: DIONEX ULTIMATE 3000. BI. MÓDULOS:. CROMATÓGRAFO. A. LÍQUIDO DE ALTA. Y. CC-CL-147. Pump: LPG-3400SD. DE. FA R. M. AC I. RESOLUCION (HPLC). Column compartment: TCC-3000 SD UV Detector: VWD-3100 EC Detector: ECD 3000 RS Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI Modelo: LACHROM ELITE MÓDULOS:. CA IO TE. CC-CL-55. Autosampler: WPS-3000TSL. CROMATÓGRAFO. Bomba: L-2130. LÍQUIDO DE ALTA. Inyector automático: L-2200. BL. RESOLUCION (HPLC). Horno: L-2300 Detector UV: L-2400. BI. Detector IR: L-2490 Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI Modelo: LACHROM ULTRA CROMATÓGRAFO. CC-UC-104. LÍQUIDO ULTRA DE ALTA RESOLUCION (HPLC). MODULOS Autosampler: L:2200U Pump A: L-2160U Pump B: L-2160U Horno: L-2300 Detector DAD: L-2455U. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI Modelo: LACHROM ULTRA MODULOS CROMATÓGRAFO CC-UC-103. Autosampler: L:2200U. LÍQUIDO ULTRA DE ALTA. Pump A: L-2160U. RESOLUCION (HPLC). Pump B: L-2160U Horno: L-2300 Detector UV-VIS: L-2420U. IC A. Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI. UI. M. Modelo: LACHROM MERCK HITACHI LÍQUIDO DE ALTA. Bomba:L-7100. O. Q. MODULOS. BI. CC-CL-30. CROMATÓGRAFO. RESOLUCION (HPLC). Horno: L-7350 Detector DAD: L7455 Calibración y/o verificación: Conforme Marca: HITACHI Modelo: LACHROM MERCK HITACHI. CROMATÓGRAFO. MODULOS. LÍQUIDO DE ALTA. Bomba:L-7100. CA. CC-CL-13. DE. FA R. M. AC I. A. Y. Inyector automático:L-7200. IO TE. RESOLUCION (HPLC). Inyector automático:L-7200 Horno: L-7350. BL. Detector UV: L-7400 Calibración y/o verificación: Conforme. BI. Marca: AGILENT Modelo: 1100 MODULOS CROMATÓGRAFO. ID-HP-01. LÍQUIDO DE ALTA RESOLUCION (HPLC). Bandeja: N/A Desgasificador de vacío: G1379A Bomba Isocrática: G1310A Automuestreador Líquido: G1313A Compart. Columna Termostatizado: G1316A Detector de Arreglo de Diodos: G1315B. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Calibración y/o verificación: Conforme Marca: OHAUS CC-BL-58. Modelo: AR2140 BALANZA ANALITICA. Serie: K171 1227140153 P Calibración y/o verificación: Conforme Marca: OHAUS. CC-BL-70. Modelo: DV215CD BALANZA ANALITICA. Serie: 1129322623 Calibración y/o verificación: Conforme. CC-PH-65. IC A. Marca: THERMO Modelo: ORION STAR SERIES. POTENCIOMETRO. M. Serie: 017400. UI. Calibración y/o verificación: Conforme. O. Q. Marca: BRANSON EQUIPO DE. Modelo: 5510E-DTH. BI. CC-BU-66. ULTRASONIDO. Y. Serie: ENC 100733933G. COLUMNA. CROMATOGRAFICA. DE. C-020/14. FA R. M. AC I. A. Calibración y/o verificación: Conforme. Dimensiones: 125 mm x 4,0 mm Porosidad: 5 µm Tipo: LiChrospher 100 RP-18 endcapped. CA. Lote: F1839333 Serie: 425442. IO TE BL BI. C-006/14. Marca: Merck. Marca: Merck Dimensiones: 150 mm x 4,0 mm COLUMNA. CROMATOGRAFICA (alternativa para robustez). Porosidad: 5 µm Tipo: LiChrospher 100 RP-18 endcapped Lote: HX305117 Serie: 349342. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. MÉTODO 2.1. MÉTODO ANALITICO A VALIDAR: 2.1.1. VALORACIÓN DE CETIRIZINA DICLORHIDRATO Declarado. : Cetirizina diclorhidrato 5 mg/mL. Método. : Cromatografía Líquida (HPLC). Especificación : 4,50 mg/mL – 5,50 mg/mL (90,0% - 110,0%). IC A. SISTEMA CROMATOGRÁFICO. M. Equipos:. UI.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Merck Hitachi D.A.D. Q.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Merck Hitachi UV-VIS. BI. O.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Elite UV-VIS. Y.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Elite D.A.D. AC I. A.  Cromatógrafo Líquido LaChrom Ultra UV-VIS  Cromatógrafo Líquido LaChrom Ultra D.A.D. FA R. M.  Cromatógrafo Líquido Agilent  Cromatógrafo Líquido Dionex Ultimate 3000. CA. DE. Columna Cromatográfica: L1 (5µm); 125 mm x 4,0 mm. IO TE. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS : 231 nm. Flujo. : 1,0 mL/min. Tiempo de corrida aprox.. : 15 minutos. Volumen de inyección. : 20 µL. BI. BL. Longitud de onda. REACTIVOS Fase móvil: Disolver 2,88 g de lauril sulfato de sodio en 600 mL de agua purificada, adicionar 11 mL de trietilamina, ajustar a pH 2,85 ± 0,05 con ácido fosfórico y mezclar. Adicionar 450 mL de acetonitrilo y mezclar. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 um de porosidad, desgasificar en vacío por 3 minutos.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PROCEDIMIENTO Solución Estándar: Pesar 31,2 mg de Cetirizina diclorhidrato estándar de referencia tal cual y transferir a una fiola de 25 mL. Adicionar 5 mL de agua purificada, sonicar por 5 minutos hasta completa disolución y llevar a temperatura ambiente. Adicionar 2 mL de dimetilformamida, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Transferir 2,0 mL de la solución anterior a una fiola de 25. IC A. mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar una. O. Q. UI. porosidad (Concentración: 0,1 mg/mL).. M. porción de esta solución por membrana de nylon 0,2 µm de. BI. Preparación de la muestra: Pesar una cantidad equivalente a 5. Y. mg de Cetirizina diclorhidrato (aproximadamente 1 mL de muestra). AC I. A. en una fiola de 50 mL. Adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil,. FA R. M. sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar una porción de esta. DE. solución por membrana de nylon 0,2 um de porosidad. IO TE. CA. (Concentración: 0,1 mg/mL).. BL. 2.2. RECOLECCION DE DATOS. BI. 2.2.1. DETERMINACIÓN DE LA GRAVEDAD ESPECÍFICA Se determinó la gravedad específica en las muestras de ambos lotes a trabajar, utilizando un picnómetro de 10 mL de capacidad debidamente calibrado (Ver Anexo Nº 1).. 2.2.2. CALCULOS Para los parámetros de Precisión (Ver Anexos Nº 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16) y Robustez (Ver Anexo Nº 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28) Se utilizó la siguiente fórmula: 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 𝑋=. 50 𝐴 𝑚𝑝 𝑊 𝑠𝑡 2 𝑃𝑜𝑡%𝑡/𝑐 × × × × × 1 × 𝐺. 𝑒. 25 25 100 𝑊 𝑚𝑝 𝐴 𝑠𝑡. Donde: : mg de Cetirizina diclorhidrato/mL. A mp. : Lectura de Área de muestra problema. A st. : Lectura de Área del Estándar de referencia. W st. : Peso del Estándar de referencia, en mg. W mp. : Peso de muestra problema, en gramos. IC A. X. UI. M. Pot%t/c : Potencia del estándar en porcentaje de droga tal. O. : Gravedad específica. Y. BI. G.e.. Q. cual. A. Para el parámetro de Exactitud (Ver Anexo Nº 3). M. AC I. Se utilizó la siguiente fórmula:. 𝐴 𝑚𝑝 𝑊 𝑠𝑡 2 𝑃𝑜𝑡%𝑡/𝑐 × × × × 50 𝐴 𝑠𝑡 25 25 100. DE. FA R. 𝑋=. Esta fórmula es una forma reducida de la anterior, debido a que se. CA. necesita hallar porcentaje de recuperación, y solo se hace uso de. IO TE. estándar (materia prima) y placebo.. BI. BL. Para el parámetro de Linealidad (Ver Anexos Nº 32 y 33) Se realizaron los cálculos según las diluciones hechas y concentraciones halladas.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3. PARAMETROS DE VALIDACION14 2.3.1. ESPECIFICIDAD Se analizó por separado estándar, muestra, placebo y cada uno de los excipientes según el método analítico, en la proporción indicada en la orden de manufactura del producto. Tanto placebo y excipientes se analizaron con la cantidad equivalente de cada uno a 5 mg de principio activo según indica el. M. IC A. método analítico en “Preparación de la muestra”.. UI. Se detallan las cantidades y modificaciones para el logro de las. BI. Pesar 30 mg de Pseudoefedrina sulfato estándar de referencia. Y. . O. Q. concentraciones finales según cada insumo utilizado:. A. tal cual (se utiliza como excipiente debido a que el método es. AC I. para Cetirizina diclorhidrato), transferir a una fiola de 50 mL,. M. adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5. FA R. minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar 5 minutos y llevar a temperatura ambiente, completar a volumen con fase. DE. móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de. Pesar 103,6 mg de Propilenglicol, transferir a una fiola de 50. IO TE. . CA. porosidad.. BI. BL. mL, adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar 5 minutos y llevar a temperatura ambiente, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad.. . Pesar 258,0 mg de Sorbitol solución al 70%, transferir a una fiola de 50 mL, adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar 5 minutos y llevar a temperatura ambiente, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Pesar 125,0 mg de Glicerina, transferir a una fiola de 50 mL, adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar 5 minutos y llevar a temperatura ambiente, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad.. . Pesar 40,0 mg de Acetato de sodio anhidro, transferir a una fiola de 10 mL, adicionar 0,4 mL de dimetilformamida, mezclar. IC A. y sonicar por 5 minutos. Adicionar 4 mL de fase móvil, sonicar. M. 5 minutos y llevar a temperatura ambiente, completar a. Q. UI. volumen con fase móvil y mezclar. Transferir 1,0 mL de la. O. solución anterior a una fiola de 50 mL, completar a volumen. BI. con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2. A. Pesar 50,0 mg de Sacarina sódica, transferir a una fiola de 10. AC I. . Y. µm de porosidad.. M. mL, adicionar 0,4 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar. FA R. por 5 minutos. Adicionar 4 mL de fase móvil, sonicar 5 minutos y llevar a temperatura ambiente, completar a volumen. DE. con fase móvil y mezclar. Transferir 1,0 mL de la solución. CA. anterior a una fiola de 50 mL, completar a volumen con fase. IO TE. móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad.. BI. BL. . Medir 0,15 mL de Esencia de caramelo, transferir a una fiola de 10 mL, adicionar 0,4 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 4 mL de fase móvil, sonicar 5 minutos y llevar a temperatura ambiente, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Transferir 1,0 mL de la solución anterior a una fiola de 50 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad.. Se realizó 01 inyección tanto para estándar, muestra, placebo y cada excipiente, asimismo, para la fase móvil y diluyente. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3.2. EXACTITUD Se realizó mediante la adición de una concentración conocida del principio activo Cetirizina diclorhidrato al placebo. Preparación del estándar: Se realizó según indica el método analítico. Concentración final de Cetirizina diclorhidrato: 0,1 mg/mL.. IC A. Se realizaron 05 inyecciones.. M. Preparación de la Solución Stock:. UI. Pesar 50 mg de Cetirizina diclorhidrato estándar de referencia tal. O. Q. cual y transferir a una fiola de 50 mL. Adicionar 10 mL de agua. BI. purificada, sonicar por 5 minutos hasta completa disolución; llevar. Y. a temperatura ambiente, adicionar 2 mL de dimetilformamida,. AC I. A. completar a volumen con fase móvil y mezclar. Preparar por. M. triplicado.. FA R. Preparación de las muestras:. DE. La adición de las cantidades de principio activo se hicieron en tres. CA. niveles de concentración: 80%, 100% y 120%.. IO TE. Muestra 80%: Transferir 4,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL de. BL. dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20. BI. mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 03 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02 inyecciones por muestra. Muestra 100%: Transferir 5,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 03 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02 inyecciones por muestra. Muestra 120%: Transferir 6,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20. IC A. mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar. UI. M. por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 03. Q. muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02. Y. BI. O. inyecciones por muestra.. A. 2.3.3. PRECISION. M. AC I.  PRECISION DEL SISTEMA INSTRUMENTAL. FA R. Se realizó solo con principio activo Cetirizina diclorhidrato según indica el método analítico en “Solución estándar”.. DE. Concentración final de Cetirizina diclorhidrato: 0,1 mg/mL.. IO TE. CA. Se realizaron 05 inyecciones.. BI. BL.  REPETIBILIDAD Preparación del estándar: Se realizó según indica el método analítico. Concentración final de Cetirizina diclorhidrato: 0,1 mg/mL. Se realizaron 05 inyecciones. Preparación de las muestras: Se realizó según indica el método analítico. Se prepararon 06 muestras. Se realizaron 02 inyecciones por muestra.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  PRECISION INTERMEDIA DIFERENTE ANALISTA: El ensayo se realizó de la misma manera que en la Repetibilidad pero ejecutado por otro analista calificado.. DIFERENTE EQUIPO: El ensayo se realizó de la misma manera que en la Repetibilidad pero analizado en los siguientes. IC A. equipos HPLC:  HPLC LaChrom Merck Hitachi UV-VIS (CC-CL-13). UI. M.  HPLC LaChrom Merck Hitachi D.A.D (CC-CL-30). Q.  HPLC LaChrom Elite UV-VIS (CC-CL-55). BI. O.  HPLC LaChrom Ultra UV-VIS (CC-UC-103). Y.  HPLC LaChrom Ultra D.A.D (CC-UC-104). A.  HPLC Agilent 1100 (ID-HP-01). FA R. 2.3.4. LINEALIDAD. M. AC I.  HPLC Dionex Ultimate 3000 (CC-CL-147). DE. LINEALIDAD DEL SISTEMA Se trabajó dentro del intervalo de 50% a 150% de la concentración. CA. de trabajo.. IO TE. Para el estudio de linealidad del sistema se prepararon soluciones a partir del principio activo Cetirizina diclorhidrato que contengan. BI. BL. concentraciones de 50%, 75%, 100%, 125% y 150% de la concentración final (0,1 mg Cetirizina diclorhidrato / mL). Preparación de la Solución Stock: Pesar 31,25 mg de Cetirizina diclorhidrato estándar de referencia tal cual y transferir a una fiola de 50 mL. Adicionar 10 mL de agua purificada, sonicar por 5 minutos hasta completa disolución; llevar a temperatura ambiente, adicionar 4 mL de dimetilformamida, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Preparar por duplicado.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Preparación de las concentraciones: Concentración 50%: Transferir 2,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 02 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02 inyecciones por muestra.. IC A. Concentración 75%: Transferir 3,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar.. UI. M. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 µm de porosidad. Se. Q. prepararon 02 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se. BI. O. realizaron 02 inyecciones por muestra.. A. Y. Concentración 100%: Transferir 4,0 mL de la Solución Stock a. AC I. una fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar.. M. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 µm de porosidad. Se. FA R. prepararon 02 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se. DE. realizaron 02 inyecciones por muestra. Concentración 125%: Transferir 5,0 mL de la Solución Stock a. CA. una fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar.. IO TE. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 µm de porosidad. Se. BL. prepararon 02 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se. BI. realizaron 02 inyecciones por muestra. Concentración 150%: Transferir 6,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 25 mL, completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon de 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 02 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02 inyecciones por muestra.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. LINEALIDAD DEL METODO Se trabajó dentro del intervalo de 80% a 120% de la concentración de trabajo. Para el estudio de linealidad del método se prepararon muestras adicionando principio activo Cetirizina diclorhidrato al placebo, que contengan concentraciones de 80%, 90%, 100%, 110% y 120% de la concentración final (0,1 mg Cetirizina diclorhidrato / mL).. IC A. Preparación de la Solución Stock:. M. Pesar 50 mg de Cetirizina diclorhidrato estándar de referencia tal. UI. cual y transferir a una fiola de 50 mL. Adicionar 10 mL de agua. O. Q. purificada, sonicar por 5 minutos hasta completa disolución; llevar. BI. a temperatura ambiente, adicionar 2 mL de dimetilformamida,. Y. completar a volumen con fase móvil y mezclar. Preparar por. AC I. A. duplicado.. FA R. M. Preparación de las concentraciones: Concentración 80%: Transferir 4,0 mL de la Solución Stock a una. DE. fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL de. CA. dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura. IO TE. ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar. BL. por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 02. BI. muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02 inyecciones por muestra. Concentración 90%: Transferir 4,5 mL de la Solución Stock a una fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 02. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02 inyecciones por muestra. Concentración 100%: Transferir 5,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar 20 mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar. IC A. por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 02. M. muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02. Q. UI. inyecciones por muestra.. BI. O. Concentración 110%: Transferir 5,5 mL de la Solución Stock a. Y. una fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL. A. de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar. AC I. 20 mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura. M. ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar. FA R. por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 02 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02. CA. DE. inyecciones por muestra.. IO TE. Concentración 120%: Transferir 6,0 mL de la Solución Stock a una fiola de 50 mL y agregar 1,0 mL de placebo. Adicionar 2 mL. BL. de dimetilformamida, mezclar y sonicar por 5 minutos. Adicionar. BI. 20 mL de fase móvil, sonicar por 5 minutos y llevar a temperatura ambiente. Completar a volumen con fase móvil y mezclar. Filtrar por membrana de nylon 0,2 µm de porosidad. Se prepararon 02 muestras (01 muestra por cada Solución Stock). Se realizaron 02 inyecciones por muestra.. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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