PROGESTERONA MEDIANTE PROGESTINAS SINTÉTICAS”

UNIVERSIDAD

AUTONOMA

METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

Datos personales.

/Nombre: Gonzilez Núñez Leticia Matricula: 963.3588 1

Teléfono: S4298797

Licenciatura: Biología Experimental División: Ciencias Biológicas y de la Salud Unidad Universitaria: Iztapalapa

Título del Proyecto de Investigación, Docencia o Difusión de la Cultura del que depende el servicio social.

Evaluaci6n de l a actividad estrogénica de levonorgestrel y sus metabolitos no fenólicos reducidos en el anillo A. Aprobado por Consejo Divisional, sesión 4.01

Título del trabajo del Servicio Social.

/%duccii,n de la expresión del ARNm del receptor de progesterona, mediante progestinas sintéticas.

Lugar de realización.

Se realizi, en l a Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, en el laboratorio de Endocrinología Molecular (S-229) en el irea de Reproducción Animal Asistida, departamento de Biología de l a Reproducción.

Nombre del asesor.

Dr. Pablo Damiin Matzumura. Profesor Titular C, Tiempo Completo. Departamento de Biología de Reproducción.

Vo.Bo. Asesor

"-

6

6

DE

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LA

EXPRESION

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DEL N

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DEL

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KECEPTOR

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PROGESTERONA MEDIANTE PROGESTINAS SINTÉTICAS”

La incorporación de la terapia anticonceptiva hormonal oral a l a práctica mkdica

en el siglo X X fue hndarnental en la historia de la humanidad, ya que permitió implementar, a partir de 1960, programas de planíficacibn familiar en países en desarrollo para enfrentar con éxito el acelerado crecimiento de la población mundial. En México, la tasa global de fecundidad descendió de casi 7 hijos por mujer

en

1970 a menos de 3 hijos por mujer en 1999, teniendo un estimado de 2.4 para el aií0 2002 (Pgrez-Palacios et.aZ., 2000 j,

al

tiempo que contribuy6

a

mejorar la salud reproductiva y a incrementar la calidad de vida de las

mujeres

mexicanas (Pérez-Palacios et.ab., 2000; Boongarts, 1986).

La priictica de la planificacióh farniliar ha sido uno de los factores que ha contribuido a la reducción de la fecundidad en nuestro país. El advenimiento de las progestinas sintkticas permitió el desarrollo de una amplia variedad de métodos

y estrategias para la regulación de

la

fertilidad, como la anticoncepción oral o

inyectable, dispositivos intrauterinos, anillos vaginales rnedicados, implantes anticonceptivos subdémicos y, recientemente, la anticoncepción de emergencia (Pérez-Palacios e t d ,2000).

En la actualidad

se

dispone de una amplia variedad de fomulaciones hormonales anticonceptivas orales de acción prolongada con gran eficacia progestacional y

actividad biológica prolongada. L a mayoria de las progestinas sintéticas que se usan cotidianamente en la cll’nica son esencialmente derivados químicos de la 19- nor testosterona (19-nor T) como la noretisterona de primera generacih, y fewnorgestrel de segunda generacidn; o de l a 17-acetoxiprogesterona (Pkrez- Palacios et.al., 1987). La aparicidn de la tercera generación de compuestos esteroides de la serie 19 nor

T

con mayor actividad progestacional, como el gestodeno, han sido ampliamente utilizados en diversas fomulaciones

anticonceptivas y han contribuido al desarrollo de metodos anticonceptivos hormonales más efectivos en

la

regulación de 3a fertilidad, beneficiando a millones de mujeres en el mundo

(Kuhl,

1996).

la hipófisis, inhiben la síntesis y liberación de las gonadotropinas hipofisiarias, como la hormona luteinizante (LH) y l a hormona estimulante del folículo (FSH), interfiriendo así con el proceso de la ovulación (Hemrika et. n/., 1993)

Los efectos biológicos de las progestinas sintéticas de la serie 19-nor T son mediados por su unión con el receptor intracelular de progesterona, aunque está bien docunlentado que progestinas sintéticas como la Noretisterona (NET) y el Levonorgestrel (LNG) son capaces de ejercer efectos hormonales de tipo androgénico, estrogénico e incluso antihormonales, además de su esperado efecto progestacional (Vilchis et nl., 1986; Cabeza er al., 1995; Lemus et d., 1997).

Es importante sehalar que el anillo A de las propestinas sintéticas de la serie 19- nor T es idéntico al anillo A de la testosterona, por lo que estas progestinas son reconocidos como substratos adecuados por las enzimas Sa-esteroide reductasas tipo I y I1 para formar los correspondientes metabolitos dihidro derivados que, por acción de las enzimas 3a- y 3fb”idroxiesteroide deshidrogenasas, son biotransformados a los respectivos compuestos tetrahidroreducidos (Larrea et. al.,

1987; Lelnus et. a/., 200 1 ).

Se han demostrado los mecanismos de acción responsables de la expresión de los múltiples efectos de tipo hormonal de N E T y también se ha demostrado que esta progestina se biotransforma a nivel periférico a compuestos reducidos en el anillo-

A de la mol&ula, como la 5a dihidro NET y los tetrahidros 3 P , 5 a NET, y 3a,5a

NET (Larrea et. n/., 1987). Asi los diferentes efectos son mediados por sus

productos de hioconversión metabólica, los cuales al unirse selectivamente a receptores de andrógenos o de estrógenos (Chávez et a / . , 1985) pueden ejercer efectos agonistas, sinérgicos o antagonistas (Vilchis et . a / . , 1986; Lemus et . al.,

1997).

Por otra lado, se ha relacionado el uso de anticonceptivos hormonales con el incremento en el riesgo del desarrollo de carcinoma mamario, una neoplasia maligna dependiente de estrógenos, aunque esta información esta aun sujeta a

confirrnacion (Botella et.nl. , 1992: Schatz et.cr/., 1993). Y también se ha demostro que la adición de dosis altas de GSD a cultivo de células MCF-7, derivadas de cancer rnamario estrogeno-dependiente (Catherino et. G/. , 1 993: Schoonen et. al.,

1995a) y células T47D de carcinoma mamario ductal (Shoonen et.n/., 199Sb), fue

capaz de inducir el crecimiento y la proliferaci6n de las células mantenidas en

1993), lo que sugiere fuertemente una actividad de tipo estrogénico ejercida por el GSD.

Estudios epidemiológicos recientes han señalado que los anticonceptivos hormonales orales que contienen GSD, a diferencia de los que contienen LNG, inducen un incremento de 1.5 a 2 veces en el riesgo de tromboembolismo venoso profundo, incluyendo infarto pulmonar (Poulter et.aZ., 1995; Farley et.aJ., 1995).

Existe controversia sobre los efectos de tipo estrogénico ejercido por NET, LNG y GSD, ya que se ha demostrado que estas progestinas no se unen a l receptor de estrógenos (Wilde y Balfour, 1995; Kuhl, 1996) y que están impedidas estéricamente para aromatizarse, por lo que no son capaces de ejercer ningún efecto de tipo estrogénico (Wilde y Balfour, 1995; Kuhl, 1996; Fotherby et. d . ,

1994). Han demostrado de que NET, LNG y GSD, a nivel periférico y en órgano blanco, son eficientemente biotransfornlado a compuestos no fenólicos reducidos en el anillo-A (Stanczyk y Roy, 1990; Lemus et. al., 1992; Tauber et. al., 1989; 1,emus et. al., 200 1) y cuyos tetrahidros derivados interactúan con el receptor intracelular de estrógenos y que además son capaces de inducir efectos biológicos de tipo estrogénico, lo que permite sugerir que los derivados tetrahidro reducidos 3P,5a- y 3a,5cc de estas progestinas sintéticas de la serie 19-norT podrían ser los responsables de los efectos estrogénicos atribuidos a NET, LNG y GSD (Vilchis

et. al., 1986; Lemus et. al., 2000).

U n modelo experimental generalmente empleado como un marcador biológico de actividad estrogénica es la inducción del receptor da progesterona dependiente de estrógenos y para esto realizan la técnica por gradiente lineal de sacarosa en l a

hipófisis anterior de l a rata hembra adulta (Vilchis et. d . ? 1986; Lemus et. al.,

2000), los receptores intracelulares de progesterona son específicamente dependientes de estrógenos, por lo que despues de l a castración de los animales, la presencia de estos receptores ya no puede ser detectada. El hecho de que el efecto inducido por la castración, puede ser revertido con la administración exógena de estrógenos o de compuestos que tengan la capacidad de ejercer efectos de tipo estrogénico ha sido bien documentado (Evans et. al., 1978; Vilchis et. cr/.,1986; Santillan et.

al.,

200 1)

Se ha encontrado actividad de tipo estrogénico de los metabolitos reducidos en el anillo A, particularmente con los tetrahidro reducidos, esto se pudo demostrar in

analizo con un sistema de transactivación en células HeLa en el que hay un gen de expresión que regula la transactivación del REh y que regula la transcripción del gen reportero de cloranfenicol acetil transferasa (CAT) (Lemus et al., 2000; Santillan et. al. , 200 I).

Resultados demuestran que los tetrahidro derivados de Noretisterona, Levonorgestrel y Gestodeno, no solo son capaces de interactuar con los receptores intracelulares del citosol de órganos blanco a la acción hormonal, sino que ejercen efectos biológicos de tipo estrogénico como el incremento del peso uterino de ratas castradas. Y también l a inducción de receptor de progesterona (RP), dependiente de estrógenos, en hipófisis anterior de ratas hembras castradas (Vilchis et . al., 1986; Lemus et al., 2000; Santillán et al., 2001). El RP es un factor de transcripción y es miembro de la superfamilia de receptores nucleares. Se han descrito dos isoformas del RP designados RP-B (1 10-120 KDa) y RP-A (72-86 KDa), la diferencia entre estas es de 164 aminoácidos presentes en el extremo amino-terminal de RP-B. Ambas isoformas son codificadas por el mismo gen pero son reguladas por distintos promotores. En la rata, y en el ser humano son originadas por distintos RNAs mensajeros. La isoformas del RP tienen

diferente función: RP-B actúa como un activador transcripcional de genes, mientras que RP-A no activa la transcripcibn pero funciona como un fuerte represor de la actividad transcripcional mediada tanto por RP-B, como por otros receptores a hormonas esteroides (Conneely y Lydon, 2000).

Se han estudiado los efectos del estradiol (E2) y la progesterona (P4) en l a

expresión de las isoformas del RP tanto en homogeneizados como en los diferentes tipos celulares del oviducto del pollo, y se ha observado que el E1 induce la expresión del RP-A pero no de RP-B en el epitelio glandular y el

estroma. La relación de las isoformas varia en el endometrio humano durante el ciclo menstrual y que la expresibn del RP-B aumenta al administrar estrógenos en

forma de anticonceptivos orales en la fase folicular. Esta inducción del RP-B puede explicarse debido a que anticonceptivos como el gestodeno y el norgestrel poseen propiedades estrogénicas. La noretisterona es capaz de inducir la expresión del RP por medio de sus tetrahidros reducidos. La regulación de su expresión por hormonas esteroides se presenta de manera tejido y célula específico lo que indica que existe un mecanismo muy fino de regulacibn de la transcripción mediada por las isoformas del RP y su ligando (Guerra-Araiza y Camacho-Arroyo, 2000)

Con el conocimiento de que estas progestinas S@ biotransforrnan a compuestos

productos de conversión metabólica. Una de las técnicas clásicas para cuantificar la actividad de tipo estrogénico de algún compuesto es la inducción del receptor de progesterona (RP) que es dependiente de estrógenos, en la hipófisis de ratas hembras castradas por más de 28 días. Posteriormente el extracto hipofisiario se purifica, se incuba con un ligando especifico marcado radiactivamente y se separa el complejo RP-ligando por medio de ultracentrifugación diferencial. Esta técnica es muy sensible, pero es extremadamente tardada, se utilizan un gran numero de animales y grandes cantidades del compuesto.

En el presente trabajo se planteo la posibilidad de implementar tkcnicas de Biología Molecular para facilitar la determinación de l a expresi6n del RP

OBJETIVO GENERAL

Implementar las técnicas de biología molecular para cuantificar la expresión del receptor de progesterona, estrógeno-dependiente en hipófisis anterior de rata hembra adulta castrada, a travks de su ARNm.

OBJETIVOS ESPEC~FICOS

1 .-Inducción del receptor de progesterona con 17P-estradiol y con 3P,5a-

Noretisterona.

2.-Sintesis del ADN complementario del receptor de progesterona.

MÉTODO

I.- MODELOS EXPERIMENTALES

Se utilizaron ratas hembra adultas (Rattus norvegicus), Wistar con pesos entre 250

y 300g mantenidas bajo condiciones de luz controlada con 12h luz y 12h

oscuridad (luz de 07:OO a 19:00h), con libre acceso a agua y alimento hasta el momento de ser sacrificadas.

Grupos de 5 ratas cada uno se ooforectomizarón bilateralmente por incisi6n abdominal bajo anestesia de KetamindRompun (Ketalín@, Laboratorios Galen, México y Rompun, Bayer de México; 50 y 67mgKg de peso corporal

respectivamente) y se mantuvieron en el bioterio hasta el día del tratamiento a los

28 días postcastración.

El derivado reducido de la progestina sintética Noretisterona, 3P,5cc-noretisterona,

se administró por vía subcutánea 100, 250 y 5001-18 empleando como vehículo

propilenglicol en un volumen de 100~1, diariamente durante seis días consecutivos. Se utilizaron grupos de ratas a los que se les administró benzoato de estradiol (5pg/lOOpl) como el control positivo o vehículo (aceite de maíz 100~1)

11.-ANÁLISIS DE LA EXPRESIóN DEL ARNm-rRPA

(Hibridación por "NORTHEN BLOT")

A.- AISLAMIENTO DE ARN TOTAL

(Método de TRIZOLB)

Se congelaron las hipófisis a -7OOC en tubos de poiipropileno, nuevos y estériles en forma individual, despuks se agregó lml de1 reactivo TRIZOL" (Gibco BRL, MD) por cada hipófisis. Se homogeneizó completamente en un homogenizador tipo Politrón'K y se incubó durante 5 minutos para permitir la disociación completa del complejo de nucleoproteinas. Después se agregó 200p1 de cloroformo y se agitó vigorosamente por 15 segundos. Posteriormente se virtio ei contenido en un tubo de rnicrocentrífuga tipo Eppendorf de 1.5 r n l nuevo y estéril. Se incubó por 3

minutos y se centrifugó a no más de 12,000 x g (1 1,400 rpm, Centrífuga Eppendorf) por 15 minutos. Formándose tres fases [Fase inferior roja (orgánica=lípidos y proteínas), interfase blanca (proteínas y ADN), fase superior incolora (acuosa) con el ARN].

Se transfirió la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga de 1.5 m1 nuevo y estéril y se agregaron SOOpl de isopropanol para precipitar el RNA, se incubó por 24 horas. Despues se centrifugó a no más de. 12,000 x g durante 10 minutos. El Rh'A

se observo colno un "pellet" blanco. Se decantó el sobrenadante sobre un pedazo de papel higiénico y se agregó lml de etanol al 75% en DEPC. Se mezcló la muestra con "vortex" hasta que "se desprendiera el pellet". Se centrifugó a no nlás de 7,500 x g (9,000 rpm) por S minutos. Se sect cuidadosanlente el RNA con una pipeta Pasteur estéril, con la punta adelgazada, conectada al vacío. No se permitió que el RNA seque totalmente, ya que esto disminuir6 notablemente su solubilidad.

Por último se resuspendió el RNA en 20-30pl de agua estkril con DEPC (0.1% v/v) pipeteando repetidamente y se guardó a -20°C.

Todas las incubaciones realizadas fueron a temperatura ambiente (TA) y las centrifugaciones a 4 " ~ o TA. Se utilizó solo material nuevo y estéril y guantes durante todo el manejo del RNA.

B.- ELECTROFOWSIS DE ARN EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES

Los A m ’ s se separaron según su peso molecular mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 .O% (Gibco BRL, grado Biología Molecular) conteniendo la solución amortiguadora de ácid0 (3-jIN-Morpholinol propanosulfónico (MOPS)

1OX y formaldehído al 37% como desnaturalizante.

Para la preparación de las muestras se alicuotarón 1Opg de ARN total de cada una, ajustando los volúmenes con ddH20-DEPC (Dietilpirocarbonato) a un volumen final de 101.11 en tubos para centrífuga tipo Eppendorff de O.5ml. Se adicionaron 101.11 de la solución desnaturalizante FMF (50% formamida, MOPS pKa=7.2 a

25*C, 6.5% formaldehído) cada muestra, se calent6 a 75OC en un baño de aceite (,Boekel Industries Inc., USA) por 5 minutos, se mantuvo en hielo por 5 minutos y se centrifugo a 7500 rpm.

Después de la desnaturalización, a cada muestra se les adicionó 2 . 0 ~ 1 de la solución de carga para ARN (30% glicerol, O. 1 % azul de bromofenol y O. 1 YO xilen cianol) y 0 . 2 ~ 1 de la solución de bromuro de etidio lOpg/ml. Una vez depositadas las muestras en los pozos del gel, éste se cubrici totalmente con 1X MOPS y se

llevo a cabo el corrimiento electroforético a 150 V por 1 .O horas.

El marcador de peso molecular de IOOOpb, se trato de igual forma que las

muestras que se analizaron.

C.- TRASFERENCIA POR CAPILARIDAD (BLOTTING)

111.-SiNTESIS DE LA SONDA (cDNA) DEL RECEPTOR DE

norvegicus)

PROGESTERONA-ISOFORMA A EN H I P ~ F I S I S DE RATA (Rattus

La síntesis de la sonda para poder detectar la región de unión al ligando del receptor de progesterona c o m h para las isoformas

A

y B se realizó a partir de la secuencia reportada previamente por Park-Sarge y Mayo (1 991) y obtenida del Banco de Cenes (GeneBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) con nhmero de acceso S64044, de donde se obtuvo la secuencia para mandar sintetizar dos oligonucleótidos (Accesolab, Mkxico), cuyas secuencias se enlistan a continuación a partir de la selección usando el programa PRIMER 3 (http://www- genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3 www.cgi) y verificados con el programa de la universidad de Stanford, California, EUA (http://genome- www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer2), donde se tomó en cuenta la

temperatura de hibridación óptima, l a adecuada relación de bases GC/AT y evita

l a formación de enlaces inter e intracatenarios entre las mismas sondas.

5"CCC ACA GGA GTT TGT CAA GCT (2-3'

(PRA+R/S; oligonuceótido superior o sentido), posiciones 180 a 201

5' -TAA CTT CAG ACA TCA TTT CCG G-3'

(PRA+B/A; oligonucleótido inferior o antisentido), posiciones 504 a 484

Las posiciones de los oligonucleótidos se enumeran con respecto a la secuencia reportada con el número de acceso S64044 (GeneBank) citada a continuación, y corresponden a la posiciones PRA+B/S = 2381 a 2403 y PRA+R/A = 2707 a 2686 de la secuencia completa del receptor de progesterona reportada posteriormente por los mismos autores (1994) y con número de acceso

TITLE Transient expression of progesterone receptor messenger RNA in ovarian granulosa cells after the preovulatory luteinizing hormone surge JOURNAL Mol. Endocrinol. 5 (71, 967-978 (1991)

MEDLINE 9204 937 9 PUBMED 1840636

REMARK GenBank staff at the National Library of Medicina created this entry [NCBI qibbsq 640441 from the original journal article. This sequence comes from Fig 1 B.

FEATURES source

gene

CDS ~

Location/Qualifiers 1 . . 5 4 8

/organism="Rattus sp. " /db xref="taxon: 10118" 1. . 5 4 8

/partial

/gene="progesterone receptor steroid-binding domain" 22.. 528

/partial

/gene-"progesterone receptor steroid-binding domain" /note="This sequence comes from Fig LB"

/codon-start=l

/product="progesterone receptor steroid-binding domain" /protein id="AA320244.1"

/db-xref="GI: 238395"

/ t r a n s l a t i o n = " Q Y S W M S L M V F G L G W R S Y K H V S e Q M L Y L ~ F Y SZCLTMWQIPQEFVKLQVTHEEFLCMKVLZLLLLNTIPLE~LR§QSQFEEMRS5Y~RELI KAIGLRQKGVVPSSQRFYQLTKLLDSLHRLVKQLHLYCLNTFIQSRAZAVEFPEMMSE VIAAQLPKI It

BASE COUNT 141 a 122 c 137 g 148 t

ORIGIN

1 gatgaccaga taactctcat tcagtactcc tgqatgagcc tgatggtgtt tggcctgggg 61 tggaggtcgt acaagcatgt cagtggacag atgctatatt ttgcacctga tctaatcctg 121 aatgagcaga ggatgaagga gttgtcattc tactcgctgt gccttaccat gtggcaaatc 181 ccacaggagt t t g t c a a g c t ccaggtgacc cacgaggagt tcctctgtat gaaagtctta 241 cttcttctta acacaattcc tttggaaggc ctgaggagtc aaagccagtt tgaagagatg 301 aggtcaagct atattcggga attgatcaag gcaattggct taagacagaa aggggtggtc 361 cccagttcac aacgcttcta tcaacttaca aaacttcttg acagcttgca tgatcttgtg 421 aaacagctcc acctgtactg cttgaatacg ftcatccaat cccgggcaet ggctgtggaa

481 tttccggaaa tgatgtctga agttattgct gcccagttgc ccaagatcct ggcagggatg

541 gtgaaacc// Revised: July 5, 2002.

1: NM-022847. Rattus norvegícus ...[g i: 124082911

LOCUS NM 022847 3056 bp mRNA linear ROD 24-JAN-2001 DEFINITION "Rattus norvegicus Progesterone receptor (Pgr] , mRNA. ACCESSION NM-022847

VERSION NM 022847.1 ~r:12408291 SOURCE Norway rat.

ORGANISM R a t t u s norvegicus

Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;

Mammalia; Euthería; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Rattus.

REFERENCE 1 (bases 1 to 3056)

AUTHORS Park-Sarge,O.K. and May0,K.E.

TITLE Regulation of the progesterone receptor gene by gonadotropins and cyclic adenosine 31,51-rnonophosphate in rat granulosa cells

JOURNAL Endocrinology 134 ( 2 ) , 709-718 (1994) MEDLINE 94130817

gene

CDS

-

COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not y e t been subject t o final NCBI review. The r e f e r e n c e sequence was derived from L16922.1.

FEATURES L o c a t i o n / Q u a l i f i e r s s O u r c e 1. .3056

/ o r g a n i s m = " R a t t u s n o r v e g i e u s "

/strain="Sprague-Dawley"

/ d b - x r e f = " t a x o n : l O l l 6 "

/chromosome="8" /map=" 8 q l 1 /cell_line="HTC"

/ t i s s u e - t y p e = " p l a c e n t a " / t i s s u e - l i b = " p h a g e PR1.5"

l. .3056 /gene="Pgr"

/db-xref-"LocusID: 25154" /db-xref="RATMAP: 39707" / d b - x r e f = " R G D : ~ l l

l. 2772 / g e n e = l l P g r n / c o d o n - s t a r t = l

/product="prsgesterone receptor"

/protein-id="NP 074038.1" /db-xref="GI : 12408292"

/db xref="LocusID: 25154" /dbrxref="RATMAP: 39707" / d b - x r e f = " R G D : ~ l l

/ t r a n s l a t i o n = " M T E L Q A K D P R T L H T S G A A P S P T H V G S P L L A R L D ~ D ~ ~ Q G S ~ ~ § D ASSVVSPIPISLDRLLFSRSCQAQELPDEKT&NBQSLSDVEGAFS~EASRRRSRN~R A P E K D S R L L B S V L D T L L A P S G P E Q S Q T S P P a C E A I T S W C L L

L S P L M S R P E S K I 4 G D S S G T G A G Q K V L P K A V S ~ ? R Q L L L F S Q Q ? A T

A P R V S L E Q D A P V A P G R S P L A T T ~ R F I H V P I L P L N H A L L A A R T R Q L L E ~ D S Y D G G ~ QVPFAPPRGSPSAPSPPVFCGDFFDCTYPFEGDPKEDGFPVY~EFQ?~~LKIKEEEEG T E A A S R S P R P Y L L A G A S A A T F P D F 3 L P F R P F R A F P S R P G E V S P V S S ~ G ~ ALECILYKAEGAPPTQGSFAPEPCKPPAASSCLLPRDSLP~PTSS~PAIYPPLGL~ G L P Q L G Y Q A A V L K D S L g B V Y P P Y L N Y L R P D S E A S a S P Q Y G ~ ~ S L F Q K I C L ~ C ~ D E ~ S ~ CHYGVLTCGSCKVFFKRAMEGQHNYLCAGRNDCIVDKIRR~CPACRLRKCCQAGMVL GGRKFKKFNKVRVMaALDGVALPQSVAFPNESQTLGQRITF§~NQE~QLVPPLINLLM S I E P D W Y A G H D N T K P D T S S S L L T S L N Q L G E R Q L L § ~ ~ S K S L F ~ F ~ N L H I D D Q I T L I Q Y S ~ S L M V F G L G W R S Y K H V ~ G Q M L Y F ~ ~ D L I L N E Q R M K E L S F Y S L C L T ~ Q I ~ Q E ~ V K L Q V T H E E F L C M K V L L L L N T I F L ~ G L R S Q S Q F E E M R S S Y I G L R Q K G V V ~ S SQRFYQLTKLLDSLHDLVKQLHLYCLNTFIQSRALAVEFPEMMSEVI~QLFK~LAGM

VKPLLFHKK"

VEVEEDGGLETEGSAGPLLKSKPRaLEGMCSGGGVTANAPPGGVTL,V~KEDSR~S

misc f e a t u r e 1 . . 1 6 6 2

/gene=" Pgr "

/ n o t e = " P r o g r e c e p t o r ; R e g i o n : P r o g e s t e r o n e r e c e p t o r "

/db-xref="C~D:pEam02161t1

/gene="Pgr"

/db xref="CDD: ZnF C4 I'

/gene="Pgr"

/note="zf-C4; R e g i o n : Z i n c f i n g e r " / d b x r e € = " C D D : p f a m O O Z 0 5 "

misc f e a t u r e 1 6 5 7 . . 1 8 6 6

/note="ZnF-C4; Region: c4 z i n c f i n g e r i n n u c l e a r hormone receptors"

mlsc f e a t u r e 1 6 6 3 . . 1887

""

/gene="Pgr"

/note="hormone-rec; Region: Ligand-binding domain of

n u c l e a r hormone receptor"

/db-xref="CDD:pfamO0104"

/gene="Pgr"

/db-xref="CDD:HOLI" _ _ misc f e a t u r e 2137..2547

/note="HOLI; Region: Ligand binding domain o f hormone r e c e p t o r s "

BASE COUNT 658 a 901 c 818 g 679 t ORIGIN

1 a t g a c t g a g c t g c a g g c a a a g g a t c c g c g g a c t c t c c a c a c a t c t g g c g c c g c g c c c t c c 61 c c c a c c c a c g tc g g g t c t c c c t t g c t t g c a c g c t t g g a c c c g g a t c c c t t c c a g g g g a g t 121 c a g c a c t c g g a c g c a t c g t c t g t a g t c t c g c c a a t a c c g a t c t c c c t g g a c c g g c t g c t c 181 t t c t c t c g g t c c t g c c a g g c t c a g g a g c t c c c a g a c g a a a a g a c a c a a a a t c a g c a g t c g

241 c t g t c c g a c g t g g a g g g a g c t t t c t c t g g a g t g g a a g c c t c g c g c c g a a g a a g c a g a a a t 301 c c c a g a g c t c c g g a g a a g g a c a g c a g a c t c t t a g a c a g t g t c t t a g a c a c c c t g t t g g c g 3 6 1 c c c t c g g g g c c c g a g c a a a g c c a a a c c a g c c c t c c a g c c t g c g a g g c c a t c a c t t c t t g g

421 t g t c t c t t t g g g c c a g a g c t t c c a g a a g a c c c c c g c a g t g t c c c c g c t a c c a a g g g g t t g 481 t t g t c c c c g c t c a t - g a g c c g gccagagagc aaggctggcg acagctccgg gacaggagca

541 g g g c a g a a g g t g c t g c c c a a a g c g g t g t c a c c a c c c c g g c agctgttgct c c c g a c c t c g 601 g g g a g t g c t c a c t g g c c c g g g g c a g g g g t g a a g c c a t c t c a g c a g c c t g c t a c g g t g g a g

661 g t g g a g g a g g a c g g t g g t c t c g a g a c c g a g g g c t c t g c g g g t c c g c t t c t g a a g a g c a a a 721 c c t c g a g c a c tg g a a g g c a t g t g t a g c g g a g g a g g a g t c a c a g c c a a c g c g c c c g g c g c g 781 g c c c c a g g a g g c g t c a c c t t g g t c c c c a a g g a a g a t t c c c g g t t t t c t g c t c c c a g g g t c 841 t c c t t g g a g c a a g a c g c t c c a g t t g c c c e c g g g c g c t c c c c a c t g g c c a c c a c a g t g g t g 901 g a t t t c a t t c a c g t g c c c a t t c t g c c t c t g a a c c a c g c t c t c c t a g c c g c c c g c a c c c g g 961 c a g c t g c t g g a g g g a g a c a g c t a c g a c g g c g g g g c t g c a g c g c a a g t c c c t t t t g c t c c a 1021 c c t c g g g g c t c g c c c t c c g c g c c a t c c c c g c c g g t g c c c t g c g g t g a c t t c c c a g a c t g c 1081 acctaccctc c a g a a g g c g a c c c t a a a g a g g a c g g g t t c c c a g t t t a c g g c g a a t t c c a g

1141 cctcccggct tgaagatcaa ggaggaggag gagggcacgg a g g c t g c t t c c c g c t c g c c g 1201 c g c c c c t a c c t g t t g g c c g g a g c c a g c g c c g c c a c c t t c c c a g a c t t c c c g c t g c c g c c g 1261 c g g c c g c c g c g a g c g c c a c c c t c c a g g c c c g g a g a g g c g g c g g t a g c c g c c c c g a g c g c c 1321 g c g g t g t c g c c a g t g t c c t c g t c g g g c t c c g c a c t g g a g t g c a t c c t g t a c a a a g c g g a g 1381 g g c g c g c c g c c c a c g c a g g g t t c g t t c g c c c c a t t g c c c t g t a a a c c c c c g g c c g c c a g c 1441 t c c t g c c t g c t t c c c c g g g a c a g c c t g c c c g c c g c t c c g a c c t c c t c g g c a g c a c c g g c c 1 5 0 1 a t c t a c c c g c c g c t c g g c c t c a a t g g g c t c c c t c a g c t g g g t t a c c a g g c c g c g g t g c t c

1561 a a g g a c a g c c t g c c c c a a g t c t a c c c g c c c t a c c t c a a c t a c c t g a g g c c a g a t t c a g a a

1621 g c c a g c c a g a g c c c a c a a t a t g g c t t t g a t tccttacctc a g a a g a t c t g t t t a a t c t g c 1681 ggggatgaag c a t c t g g c t g t c a c t a t g g t g t g c t t a c c t g t g g g a g c t g c a a g g t c t t c 1741 t t t a a g a g g g c g a t g g a a g g g c a g c a t a a c t a t t t a t g t g c c g g a a q a a a t g a t t g c a t t 1801 g t t g a t a a a a t c c g c a g a a a a a a c t g t c c a g c a t g t c g t c t g a g a a a g t g c t g t c a g g c t

1861 g g c a t g g t c c t t g g a g g t c g t a a g t t t a a g a a g t t c a a t a aagtccgagt t a t g a g a g c c 1921 c t c g a t g g t g t t g c t . c t c c c c c a g t - c a g t g g c c t t t c c t a a t g a g a g c c a g a c c c t g g g c

1981 c a g a g a a t c a c a t t t t c a c c a a a t c a a g a g a t t c a a c t g g t t c c g c c a c t c a t c a a c c t g 2041 c t c a t g a g c a t t g a a c c t g a t g t g g t t t a t g c a g g g c a t g a c a a c a c a a a g c c c g a c a c t 2101 t c c a g c t c t t t g c t g a c c a g t c t c a a c c a a c t a g g c g a g a g g c a g c t g c t t t c a g t a g t c 2161 a a a t g g t c t a a g t c t c t g c c a g g t t t c c g g a a c t t a c a c a t c g a t g a c c a g a t a a c c c t g

2221 a t t c a g t a c t cctggatgag cctgatggtg tttggcctgg g g t g g a g g t c gtacaagcat 2 2 8 1 g t c a g t g g a c a g a t g c t a t a t t t t g c a c c t g a t c t a a t c c t g a a t g a g c a g a q g a t g a a g

2341 g a g t t g t c a t t c t a c t c g c t g t g c c t t a c c a t g t g g c a a a t c c c a c a g g a g t t t g t c a a g 2401 c t c c a g g t g a c c c a c g a g g a g t t c c t c t g t a t g a a a g t c t t a c t t c t t c t t a a c a c a a t t

2 4 6 1 c c t t t g g a a g g c c t g a g g a g t c a a a g c c a g t t t g a a g a g a t g a g g t c a a g c t a t a t t c g g

2521 g a a t t g a t c a a g g c a a t t g g c t t a a y a c a g a a a g g g g t g g t c c c c a g t t c a c a a c g c t t c 2581 t a t c a a c t t a c a a a a c t t c t t g a c a g c t t g c a t g a t c t t g t g a a a c a g c t c c a c c t g t a c

2821 t t t t g t c t c a g t c a g g a c a g t c a g e t c t g t g t c t t t a t a a t g t c c t t c t g a a a g c c t t a c

2881 g t g t a t a c a t a t c a c a c t g t a a a c t t a g g a g a a a a c c a a t g a a a t t t g g a t t t t c c t t t g 2941 t g a t g t c t a a g t a g a a t t t t t a a a g t g t t t t g t g c a c c c a t a t t t t g a g a g t t t a c a t g g 3 0 0 1 t t a a a a a a g g a c t a a a g t t g a t t g t a t a a g t a a a c t a t a t c t c a c c c g t g t t a t t t //Revised: July 6, 2002.

Con la finalidad de demostrar que

l a s

muestras usadas en la hibridacicin por Northen Blot contienen la misma concentracibn de

BRN,

o en su. caso hacer el

ajuste de la concentración correspondiente, se sintetiz6 el ADNc de ciclofilina de

rata (Cyc; sonda de normalizacibn) 8 partir de la secuencia descrita por Danielson et. al. (1988) y reportada en el GeneBank con número de accesa "19533,

empleando el mktudo de RT-PCB a partir del ARW de cerebro de rata hembra.

I: M19533. Rat cyclophilin m...[gi:203701]

LOCUS RATCYCA 743 Bp mRNA l i n e a r ROD 27-APR-1993 D E F I N I T I O N Rat cyelophilin mRNW, c o m p l e t e c d s .

ACCESSION M19533

VERSION M19533.1 GI:203701

KEYWORDS c y c l o p h i l i n .

SOURCE R a t ( S p r a g u e - D a w l e y ) b r a i n , cDNA t o mRNA, clone pcD 15:8-1. ORGANISM R a t t u s n o r v e g i c u s

Eukaryota; Metazoa; Chordata; C r a n i a t a ; V e r t e b r a t a ; E u t s l c o s t o m i ; Mammalia; E u t h e r i a ; R o d e n t i a ; S c i u r o g n a t h i ; M u r i d a e ; M u r i n a e ;

R a t t u s .

REFERENCE 1 ( b a s e s 1 t o 743)

AUTHORS Danielsan,P.E. I Forss-Petter,S., Brow,M.A., Calavetta,L. I

T I T L E plB15: a cDNA c l o n e o f t h e r a t mRNA encoding cyclophilin

JOURNAL DNA 7 ( 4 ) , 261-267 (1988) MEDLINE 88283345

PUBMED 3293952

Douglass, J . , M i l n e r , R . J. a n d S u t c l i f f e , J . G .

COMMENT D r a f t e n t r y and c o m p u t e r - r e a d a b l e s e q u e n c e f o r [l] k i n d l y p r o v i d e d

FEATURES L o c a t i o n / Q u a l i f i e r s by P.E.Danielson, 30-JUN-1488.

s o u r c e 1. .743

/ o r g a n i s m = " R a t t u s n o r v e g i c u s "

/db x r e f = " t a x o n : 10116" <l. .743

/product-"CYC mRNA"

/ n o t e = " c y c l o p h i l i n " / c o d o n - s t a r t = l

/protein-id="AA?i41009.1"

/db-xref="GI : 2 0 3 7 0 2 1 1 -

CDS

43. .537

/ r r a n s l a t i o n = " M V N P T V F F D I T A D G E ~ L G R V C F E L F A ~ ~ ~ ~ T A E N ~ ~ L S T G E K

G F G Y K G S S F H R I I P G F M C Q G G n F T R H N G T G G K S T Y G E K F E N AGPNTNGSQFFICTAKTEWLDGKHVVFeKVKEGMSIVEAMERFGSRNGKT~KKITISD

CGQL"

BASE COUNT 185 a 180 c 178 g 200 t

O R I G I N U n r e p o r t e d .

61 t t c t t c g a c a t c a c g g e t g a t g g c g a g c c e t t g g g t c g c g t c t g c t t c g a g c t g t t t g c a 1 2 1 g a c a a a g t t c c a a a g a c a g c a g a a a a c t t t c g t g c t c t g a g c a c t g g g g a g a a a g g a t t t

1 8 1 g g c t a t a a g g gttcctcctt t c a c a g a a t t a t t c c a g g a t t c a t g t g c c a g g g t g g t g a c 2 4 1 t t c a c a c g c c a t a a t g g c a c t g g t g g c a a g t c c a t c t a c g g a g a g a a a t t t g a g g a t g a g

301 a a c t t c a t c c t g a a g c a t a c a g g t c c t g g c a t c t t g t c c a t g g c a a a t g c t g g a c c a a a c 3 6 1 a c a a a t g g t t c c c a g t t t t t t a t c t g c a c t g c c a a g a c t g a g t g g c t g g a t g g c a a g c a t 4 2 1 g t g g t c t t t g g g a a g g t g a a a g a a g g c a t g a g c a t t g t g g a a g c c a t g g a g c g t t t t g g g 4 8 1 t c c a g g a a t g g c a a g a c c a g c a a g a a g a t c a c c a t c t c c g a c t g t g g a c a a c t c t a a t t t

5 4 1 c t t t g a c t t g c g g g c a t t t t a c c c a t c a a a ccattccttc t g t a g c t c a g g a g a g c a c c c

601 c c a c c c c a t c t g c t c g c a a t a c c c t g t a a t c t c t g c t c t c a c t g a a g t t c t t t g g g t t c c 6 6 1 a t a t t t t c c t cattcccctt c a a g t c t a g c a g g a t t g c a a a g t t a a g t t t a t g a t t a t g a 7 2 1 a t a a a a a c t a a a t g a g a a g t gtt

/ /Revised: July 5, 2002.

Primer3 Output

OLIGO INICIO FIN LONGITUD Tm %GC . SENTIDO 2 35 254 20 5 9 . 5 7 5 0 . 0 0

5' GGT GAC TTC ACA CGC CAT AA 3'

ANTISENTIDO 4 35 416 20 60.11 50.00

5'CTT CCC AAA GAC CAC ATG CT 3'

TAMAÑO PEL PRODUCTO PE PCR: 201 pb

1 c t t t g c a g a c g c c g c t g t c t c t t t t c g c c g c t t g c ~ g c a g a c a t g g t c ~ a c c c c a c c g t g

61 t t c t t c g a c a t c a c g g c t g a t ~ ~ c ~ a q ~ c c ~ t g g g t c g ~ ~ t c t ~ c ~ t ~ ~ a ~ c ~ g t ~ ~ g ~ ~ 121 gacaaagttccaaagacagcagaaaactttcgtgctctgagcactggggagaaag~attt

181 ggctataagggttcctcctttcacagaattattccaggattcatgtgccagggtggtgac

241 t t c a c a c g ~ c a t a a t g g c a ~ t g g t g g c a a g t c c a t c t a c g g a g a g a a ~ t t t g a g g a t g a g 301 aacttcatcctgaagcatacaggtcctggcatcttgtccatggcaaatgctggaccaaac

361 acaaatggttcccagttttttatctgcactgccaagactgagtggctggatggcaagcat

421 g t g g t c t t t g g g a a g g t g a a a g a a g g c a t g a g c a t t g t g a a t t g t ~ g ~ a g c - c a t ~ g a ~ c g t t t t g ~ ~ 481 t c c a g g a a t g g c a a g a c c a g c a a g a a g a t c a c c a t c t c c g a c t g t g g a c a a c t c t a a t t t

541 ctttgacttgcgggcattttacccatcaaaccattcaat~cc~ttccttctgtagctc~ggagagcaccc

601 c c a c c c c a t c t g c t c g c a a t a c c c t g t a a t c t c t g c t c t c a c t g a a g t t c t t t g g g t t c c 661 atattttcctcattccccttcaagtctagtctagcaggattgcaaagttaagtttatgattatga

La síntesis y amplificacicjn del ADNc-rRPA se rediz6 mediante

f

a

tknicas de retrotranscripcih seguido de la reacción en cadena de la polimerasa

(RT-PCR)

a partir del AfCNm obtenido de

la

hipófisis anterior de ratas hembra tratadas con

benzoato de estradiol, empleándose el estuche de amplificación GB CO BRLQ

En un tubo 0.2 m1 estM se colocaron los siguientes componentes:

l p l de RNA total (aprox. SOpg/pl) 1 pí de oligo (dT)12-lg, (O.Spg/pl)

10~1 de HzO-DEFC

Se incubó

a

7OoC por 1 O min, seguido por 1 min en hielo, Se centrifugo para bajar

todo la muestra.

Por separado se preparci la siguiente mezcla y se adicionó cada componente en el

orden indicado.

2p1 1OX PCR buffer

lp1 1 O mM mezcla de dNTF's [dATP, dCTP, dGTP, dTTP]

2 4 0.1 M

DTT

2 ~ 1 25mM MgCl2

Se adicionaron los 7pl de la mezcla al tubo de la reacción y se incubó a 42'C por

5

min. Se agreg6 1 pl(200 unidades) de la enzima SUPER SCRIPT 11, se agit6 y se incubó a 42'C por SO

rnin.

Para teminar la reacci6n se incubó a 7OoC por 15 min e

inmediatamente después se colocó en hielo, y se centrifugó a 1 1000

rpm

por 1

min. Se adicionó 1 pl de RNasa H y se incub6 a

3

7

'

C

p o r

20

min

y se colocb

en

hielo. Las incubaciones se realizaron en un termociclador Perkin Elmer, modelo

B.-AMPLIFICACI~N DEL ADNC POR REACCI~N EN CADENA

DE

LA

POLIMERASA (PCR).

Se adicionó en un tubo de 0.2

m1

esteril l a siguiente mezcla.

5

PI

1OX PCB buffer 3 1-11 25

m M

MgC12

1 Pl 10

m M

dNTP mix 1

Pl

Oligo Sentida (10pM) 1 PI Oligo Antisentido (1OpM) 21-11 CDNA (Producto del RT)

3 6 . 5 ~ 1 Hz0 dd estéril

Se centrifug6 la mezcla (1 1000 rmp por 30 segundos) y se adicionó 0 . 5 ~ 1 de AmpliTaqB DNApol.

Se usaron las siguientes temperaturas para los ciclos en el termociclador

#ciclos 1

25

1

CONDICIONES

DE

REACCI6N TemperaturdTiempo

9 4 ' ~ / S rnin

94'C / 30 S

63.5'C / 30 S

72'C / 30 S

72'C / 7 min

y 4OC el resto del tiempo

Se separaron los fragmentos de PCR por una electroforesis en m gel de agarosa al

1 .ti %

en

0.5X de TBE: ácido bbrico, Tris-base,

Etilendiaminotetracetico

(EDTA);

a 1OOV por 45 minutos. Y por último se purificó mediante columnas de exclusión

C.-MARCAJE DE LAS SONDAS DE ADNc

Se empleó el protocolo de marcaje al azar “Radom Primer DNA Lebeling System@” (Gibco BRL,

MB),

el cual se detalla a continuación:

En un tubo para mjcrocentrifuga tipo Eppendorf de 0.5ml se desnaturalizaron 50ng del ADNc en

un

volumen máximo de 2Opl de TE (Tris-HCI, EDTA) en el baño de aceite a 95’C por 5 minutos, e inmediatamente se pasa a hielo.

Por otro lado se mezclaron los siguientes componentes:

- 1 ~ 1 0 . 5 M dATP (en 3 mM Tris-HC1, pH 7.0, 0.2 mM EDTA). -1 pl0.5 M dGTP (en 3 mM Tris-HCl, pH 7.0, 0.2 mN EDTA).

-1pl0.5 M dTTP (en 3

m M

Tris-HC1, pH 7.0, 0.2 mM EDTA).

- 2 0 ~ 1 de 2.5X Random Primers Solution [I25 mM Tris-acetato, pH 6.8, 2.5mM acetato de magnesio, 25mM 2-mercaptoetanol, 50pg/ml cebadores oligo desoxirribonuclecjtidos (octámeros al azar)]

-5 pl de[32P]-dCTP.

-ddHzO hasta

un

volumen de 49p1 (incluyendo el ADNc).

Esta mezcla se adicionó al

ADN

desnaturalizado y se le agregó 1 pl de la enzima DNA polimerasa (fragmento de Klenow 4 UVpl). La mezcla de reacción se incubó a 37OC por lo menos 2 horas. Al finalizar el periodo de incubación se agregarh 5pl del buffer de detención (Stop buffer: 0.2

M

EDTA, pH 7.5). Las sondas marcadas se purificaron en columnas conteniendo Sephadex G-50

superfino ( P h m a c i a , NJ).

D.- PURIFICACI~N POR COLUMNA DE

LA

SONDA MARCADA

Se invirtió la columna, y se colocó en un tubo más grande y se sacó la solución. Se

E.-PREHIBRIDACIÓN DE LA SONDA DE ADN MARCARA E

HIBRfDACIÓN DE

LA

IbfEmRBNA DE NYLON.

Se empleb el protocolo esthdar descrito por el fabricante de la membrana Z-

Probe GT@. Primero se realizó la prehibridacibn, se cubrió totalmente y en forma homogénea la superficie de l a membrana, y para bloquear las uniones inespecíficas, se empleó una solución con 0.25 M Na2KPO4, pH 7.2 y 7% SDS (dodecilsulfato de sodio), utilizando 1 5 0 ~ 1 de solución por cm2 de membrana. Se colocó a la membrana dentro de una bolsa junto con la solución de prehibridacibn y se incubri por lo menos durante 3 horas a 65OC

en

agitación constante (140

vm)*

Despuds se cortó una esquina de la bolsa para desechar la solucidn de

prehibridación

y

se adicionó 150yl de solución de hibridaciWcm2 de membrana,

se depositó la sonda sintetizada y purificada en la bolsa, se se116 y se incubó a

65'C, en agitación constante durante 24h.

Terminado el periodo de incubación se determinó cualitativamente la

radiactividad con

un

contador, para determinar el tiempo de los lavados.

Se lav6 la membrana con 3 5 0 ~ 1 de solución de lavado (20

mM

NazHP04, pH 7.2,

5%

SDS) por om2 de membrana a 65OC por 30-60 rnin.

Después de los lavados, se sec6 suavemente el exceso de

la

solución de hibridacibn que quedaba en la membrana con papel kigienico, se coloc6 en la

ACTIVIDADES REALIZADAS.

a) Revisión de l a bibliografía relacionada con el proyecto.

b) Participación en la implementación de la técnica de “Northern blot” para RP.

c) Diseño de los oligonucleótidos usados en la amplificación de la sonda del complementario del ácido desoxirribonucleico (ADNc) por medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS.

Se estandarizarón tócnicas de biologia molecular para la cuantificación de la expresion de RNAm del Receptor de Progesterona, dependiente de estrógenos, inducido por el metabolito de una progestina sintética.

Por otro lado aprendi a diseñar oligos para la realizacion de la técnIca PCR., Conoci y aprendi las técnicas de hibridacion de ácidos nucleicos, los procesos moleculares de sisntesis de ADN a partir de

RNA.

A N h I S I S Y DISCUSI6N

DE

RESULTADOS

A) EXTRACCI~N

DEL

ARN

Los primeros experimentos se realizaron para obtener muestras de ARN adecuadas para ser analizadas por la tecnica de Northem blot, es decir que no se

encontrafan degradadas.

En

la figura 1 se muestra

un

gel de agarosst al 1.2% en

condiciones desnaturalizmtes (formamida

al

7%) donde se pueden observar los

ARN’s obtenidos del

mismo

tejido, una porci6n del 16bulo frontal de cerebro de

rata hembra adulta castrada por 28 días. En los carriles 2 y 5 muestras adecuadas para ser analizadas, en los carriles 3 y 4 muestras con una muy alta concentración

de

A R N

(sobrecargadas),

carril

6 muestra con bajo contenido de

ARN

y carril 7 una muestra degradada. L a integridad de los A m ’ s se puede observar en funcibn de las bandas de los ARN ribosomales con pesos de 285 (superior) y 18s

(inferior)

en

cada

carril,

donde la banda del ARN de mayor peso debe ser de igual

o mayor concentración que

Ia

ligera para ser aceptable para trabajar en la técnica de Northem blot.

Figura I . Gel de agarosa al 1.2% conteniendo muestras de

B) OBTENCION DEL ADNs DEL

RP

Los ADN complementarios (ADNc) del receptor de progesterona (RP) y de ciclofilina (Cic) se obtuvieron por medio de la tkcnica de retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) con base en las secuencias y las temperaturas descritas en “Material y Métodos”, empleando el ARN total obtenido del cerebro de ratas hembra castradas por 28 dias (figura 1, carril 5). Se obtuvieron bandas Únicas de los productos que se muestran en la figura 2 con pesos moleculares aparentes de 365 pares de bases (pb) y 485 pb para el receptor de progesterona (carriles 2-5) y de Cic (carriles 1 y 6) respectivamente, determinados mediante el programa cornputacional incluido en el analizador de imágenes “Eagle Eye” (Stratagene, CA) y usando como marcador de peso molecular (M) la “escalera” de 100 pb (Invitrogene).

Los productos de PCR heron purificados a travCs de columnas de exclusión molecular, cortando las bandas del gel de agarosa. Los productos purificados fueron analizados nuevamente en geles de agarosa al 1.5% y se emplearon como sondas para determinar la expresión de sus respectivos A m ’ s (W y Cic) en la técnica de Northern blot.

de

RT-PCR

del Bp (carriles 2-5) y de ciclofilina (carriles 1 y 6). El marcador de peso molecular

c)

ESTANDA’RIZACI~N

DE

LA

T ~ C N I C A DE NORTHERN BLOT

Después de la ovariotomía de las ratas hembras se mantuvieron durante 28 días antes de ser inyectadas de acuerdo al siguiente cuadro:

f

GRUPO

1

TRATAMIENTO

1

CONCENTRACX~N

1

250 pg/ día en 100 pl par 6 días

3p, Sa-Noretisterona (3P-NET 250) .

4

500

pg/

día

en

1 00 pl par 6 dias

3p, 5a-Noretisterona (3P-NET 500)

3 5 pg/día

en

100

pl

por 6 días

Benzoato de estradiol (BE)

2 Vehículo (Vh; aceite

de maíz) 100 pl por 6 días

“ .

i 5 3p, 5a-Noretísterona (3g-NET 100) 100 pg/ día

en

100 pl

por

6 días

,

Una vez obtenidos los ARN totales de cada una de las muestras se separaron por

medio de una electroforesis

en

geles de agarosa al 1.2 % en condiciones

desnaturalimtes según lo descrito en “Material y Métodos”. La concentración de

las muestras separadas por electroforesis se estandariz6 mediante geles

preparativos con la finalidad de tener la misma concentracibn de cada upa de las

muestras como se muestra en la figura, 3 procurando

realizar

repeticiones de cada

muestra por triplicado y de cada tratamiento se incluyeron al menos 6 hipófisis de

animales con

el

mismo tratamiento.

Figura 3 Gel de agarosa al 3.2 % en condiciones

desnaturalízantes donde se observa la separación de los A m ’ s de hipófisis obtenidas de animales con los

siguientes tratamientos: Vh=cmil 1, BE-carril 2, 3p-

NET

500=ca~iles 3 y 4,

3

P-NET 250=carrifes 5 y 6 ; 3p-

NET 100=carriles 7 y 8. Mrmarcador de peso mofecuku

D) TRATAMIENTQS EXFEfiIMENTALES

Después del corrimiento electroforético se analizó el contenido del ARNm que codifica para la isoforma A del receptor de progesterona de rata (RP) por la técnica de hibridacicin denominada “Northern blot” y se utiliz6 una sonda para determinar la exprqsión del

ARNm

de la ciclofilina (Cic) como control de normalización, expresando los resultados como el cociente de la expresión del

RP

con respecto al de Cic, medido en unidades cipticas o píxeles y analizados por densitometría para obtener un valor numkrico. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Se observaron la expresión de por lo menos 3 bandas de diferentes pesos moleculares, calculiindose aproximadamente de 7.1 kilobases (Kb), 5.6 y 3.3 s e g h se observa en la figura 4. Con base en los reportes de la literatura se analizó la banda de menor peso molecular (3.3 Kb) para hacer comparaciones entre los tratamientos, ya que es la que se observa en todas las muestras analizadas y presenta el comportamiento esperado. Otros autores reportan la presencia de hasta 7 bandas con pesos moleculares que oscilan de 14 a 1 .S Kb (Conneely y Lydon, 2000) en diferentes tejidos de la rata. Una posible explicación a este fenómeno es la presencia de transcritos que han sido cortados (splicing) en forma diferencial, incluyendo el transcrito primario (de mayor peso molecular) del cual se originan los demas.

Kb

7.1

3.3

Figura 4, Autorradiografia representativa de un experimento donde se muestran 3 bandas que corresponden a transcritos de pesos moleculares diferentes. Carril 1= Vh, carril 2=

BE,

carril 3=

La expresibn del

RB

obtenido de hipbfisis de b a l e s castrados e inyectados con

el vehículo (aceite de rnaiz) se tomó como la expresión basal (aproximadamente

8%) con respecto a la expresiún observada en los animales castrados y tratados

con 5pg de benzsato de estradiol por día durante 6 días consecutivos (testigo

positivo) que se tom6 C O ~ O el 100%. La expresih del ARN que codifica para ei

RP

en hipófkis de animales castrados y tratados con

3P-NET

h e del 85%, 60% y

25% respectivamente para las concentraciones de 500, 250 y 100 pg del

metabolito inyectado por día durante 6 días consecutivos. En la figura SA se

puede observar la gr&?ca con resultados descritos y en la figura

5B

una autorradiografia representativa de la expresión de los ARNm de

RB

y Cic.

A

I 2 O

1

3 o0

80

XzDE

1

T n36

d

O

Figura 5. Expresión de los ARNm que codifican al receptor de progesterona

(RP)

en hipófisis de ratas hembra castradas

"1

ASB

Figura 6. Expresi6n del receptor

de

pragesterona

(RP)

dependiente de estrógenos en hipófisis de ratas hembras

castradas par 28 dias e inyectadas según lo descrito en el

La figura 6 muestra los resdtados de un experimento reportado previamente en el

cual se determina indirectamente la expresih del receptor de prugesterona intrahipofisiario, donde cada tratamiento se realizi, por triplicado y se emplearon de 20 a 25 ratas

p a

generar una poza por cada gmpo.

La

inducción del RP, el

cual es dependiente de estrcigenos, se realizd de la misma fonna en la cual se realizaron las tratamientos en este trabajo, solamente que se emplearon menos

ratas por grupo (6 animales) y cada una se analiza en fomra individual

(sextuplicado) y el material es suficiente para repetir el experimento en por lo menos 3 ocasiones. Es extracto hipofisisario es incubado con un ligando de alta

afinidad al R P , el

ORG-2058

marcado isotbpicamente can tritio

(3H).

La

separacidn del Bp unido a su ligando se realin5 mediante ultracentrifiLgaGiÓn

en

gradientes continuos de sacarosa. Posteriormente se fraccionaron cada uno de los

gradientes y se contcl la cantidad de radioactividad presente en cada fkaccilin en

un espectrbmetro de centelleo líquido. El coeficiente de sedimentacibn se

cornpar6 con

un

tubo testigo que contiene albúmina de suero bovino (ASB) como estándar (marcado con una flecha vertical) y medido por la técnica de determinación do proteínas descrita por Bradford. Los cuadros representan a la

expresión de

RP

inducido por benzoato de estradiol (BE; 5pg/día durante 4 días

consecutivos), los triángulos corresponden a los animales inyectados con

5OOpg

de 3P-NET y los rombos a los animales que recibieron

250pg

de 3P-NET. El

efecto

en

la induccih del RP de la dosis de

lOOpg

de 3fl-NET no pudo ser

detectada empleando esta tecnica. Los asteriscos representan al testigo negativo en el que solamente se administrci aceite de maíz. El valor del coeficiente de

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el presente estudio estan en línea con lo reportado previamente por el grupo de trabajo al cual pertenezco, donde el metabolito reducido de la Noretisterona, 3P-NET, presenta actividad de tipo estrogénica a altas dosis de administración (Vilchis et. al., 1986; Lemus et.

al., 1992).

Se estandarizaron las técnicas de biología molecular para cuantificar la expresión del ARN mensajero que codifica al receptor de progesterona (RP), pudiéndose detectar la presencia de ambas isoformas del receptor (A y

B) debido a que la sonda fue diseñada sobre la secuencia del dominio de unión al ligando del RP. Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Endocrinología Molecular (S-229), que forma parte del área de

investigación “Reproducción Animal Asistida’’ del Departamento de Biología de la Reproducción de la Universidad Autónoma Metropolitana, por lo que ahora ya se cuenta con las técnicas descritas en el presente trabajo.

La determinación de la actividad biológica in vivo de tipo estrogénico, medida a través de la inducción del receptor de progesterona

intrahipofisiario representa un método muy adecuado y específico, ya que éste es totalmente dependiente de estrógenos y se descartan los efectos de otras hormonas, como pudieran ser en otros bioensayos como el crecimiento uterino o la inhibición en la secreción de gonadotropinas hipofisiarias. La determinación de la presencia del RP en la hipófisis de la rata hembra castrada se hacía tradicionalmente a través de la separación mediante un

Uno de los inconvenientes del método aquí descrito es que se detecta la expresión del ARN mensajero del RP, pero no se mide la proteína. Cuando sea necesario determinar si se expresa la proteína del RP es necesario utilizar un método alterno mediante el uso de anticuerpos contra RP de rata, los cuales están disponibles comercialmente para la técnica de Western blot

o para inmunohistoquímica. Para la determinación de la actividad biológica

CRITERIOS DE EVALUACIóN

1 .-Presentación quincenal de resultados obtenidos en el laboratorio.

2.-Revisión mensual de la bibliografía del tema.

3.-Presentación al tercer mes, de un seminario de un tema asignado.

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