Optimización de consorcio alga-bacteria para degradación de fenol
Andrea María Cantillo Carrero
Estudiante Ingeniería Ambiental, Departamento Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.
Asesora:
Johanna Husserl
Profesora Asistente, Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
Co-asesor:
Andrés González Barrios
Profesor Asociado, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
RESUMEN
Se evaluó el crecimiento de las micro-algas Chlamydomona reinhardtii, Chlorella vulgaris y de dos cepas de bacterias capaces de crecer en fenol como única fuente de carbono utilizando distintos medios de cultivo. Tanto algas como bacterias crecieron eficientemente en los medios RS y AMAm (descritos en la metodología). Las algas crecieron de manera autótrofa y en presencia de fenol (hasta 100 mg/L). Las bacterias utilizaron fenol como única fuente de carbono durante el crecimiento. Se evaluó la viabilidad de diferentes consorcios de algas y bacterias en los medios. Se observó el crecimiento tanto de algas como bacterias en todos los consorcios establecidos en presencia de fenol (hasta 100 mg/L).
Palabras claves: Consorcio, Chlamydomona reinhardtii, Chlorella vulgaris, bacterias, fenol.
1. Introducción
El fenol es un hidrocarburo aromático que se encuentra entre los contaminantes más comunes en vertimientos de industrias de resinas, plantas petroquímicas, plantas de cerámica, plantas de acero, refinerías de petróleo e industrias farmacéuticas [1] [2]. Es un compuesto tóxico, carcinogénico y con propiedades mutagénicas; se puede dar exposición por contacto con los ojos y piel, por ingestión y por inhalación [3]. En casos de estudio donde la población se ve expuesta al fenol por contaminación en sus fuentes hídricas se evidencian síntomas como: diarrea, afectación en el riñón y en el hígado, nausea, dolores bucales y orina oscura [1]. En altas exposiciones puede generar coma, convulsiones, cianosis y muerte [3].
Diferentes técnicas han sido usadas para tratar aguas contaminadas con fenol como: destilación, adsorción, extracción por membrana, ozono, oxidación fotocatalítica, oxidación anódica y degradación biológica, entre otros [3]. Hay evidencia de degradación biológica por medio de hongos, bacterias y micro-algas; Pseudomonas sp y Acerobacter sp, Chlorella sp Scenedesmus obliquus. [2] [4] [5].
Se ha visto que los consorcios alga-bacteria son una alternativa viable para la descontaminación de aguas, puesto que se da un reciclaje de nutrientes, las algas consumen el CO2
producido por las bacterias mientras estas consumen el O2 que
producen las algas[6].
En este estudio se buscó un medio de cultivo en el que dos cepas de bacterias capaces de crecer con fenol como única fuente de carbono y las algas Chlorella vulgaris y Chlamydomona reinhardtii pudieran crecer con fenol como sustrato.
2. Materiales y métodos
2.1. Microorganismos
Las microalgas Chlamydomona reinhardtii. y Chlorella vulgaris fueron brindadas por el laboratorio de biotecnología del departamento de ingeniería química en la Universidad de los Andes. Ambas se encontraban en medio sólido Tris-Acetato-Fosfato (TAP) a 27 °C en condiciones heterótrofas, con ácido acético como fuente de carbono.
Las cepas de bacterias con las que se trabajó se obtuvieron de la tesis de maestría de Adriana González dirigida por Johanna Husserl del departamento de ingeniería civil y ambiental de la Universidad de los Andes. Estas fueron aisladas de una muestra de mar de Cartagena de Indias, por lo cual se encontraban en un medio líquido de agua de mar artificial (AMA), con fenol como única fuente de carbono a condiciones aerobias. Hasta el momento las bacterias no han sido identificadas, sin embargo se sabe que degradan fenol por pruebas en HPLC.
2.2. Selección medios de cultivo
C. reinhardtii y C. vulgari fueron cultivadas en cuatro medios líquidos (Tabla 1): TAP modificado (TAPm), Sueoka modificado (HSMm), AMA modificado (AMAm) y un medio rico en sales (RS); cada uno con 1 mL de solución de trazas y a un pH entre 6,5 y 8 [7].
Tabla 1. Composición de los medios (g/L)
La composición de la solución de trazas es: H3BO3 (0,1
g/L), CaCl2 (0,02g/L), ZnSO4 7H2O (0,05 g/L), (NH4)6Mo7O24
4H2O (0,03 g/L), MnCl2 4H2O (1,012 g/L), CoCl2 6H2O (0,322
g/L) y CuSO4 5H2O (0,314 g/L).
2.3. Adaptación de las algas a crecimiento autótrofo y adaptación a fenol
El montaje experimental (Fig. 1) se dio en un agitador con una temperatura entre 25 °C y 30°C a 100 rpm, con bombillos LED de luz blanca bajo una longitud de onda entre 400 y 750 nm y con flux de 400 E/m2s.
Figura 1. Montaje experimental.
Se hizo control de su crecimiento de manera óptica. Cuando el alga entraba en su fase de crecimiento el medio se tornaba color verde. Para mantener un control sobre la posible contaminación se vieron las muestras al microscopio de luz (Fig. 2).
Inicialmente las algas se encontraban creciendo de manera heterótrofa; para el primer cultivo que se realizó, los cuatro medios tenían 1,5 g/L de acetato de sodio como fuente de carbono. Con el fin de adaptar el cultivo a condiciones autótrofas,
se realizó un subcultivo con los medios seleccionados a una concentración de acetato de sodio de 0,075 g/L en frascos de vidrio, con 100 mL de medio y con 1 mL del cultivo original como inóculo. Cada dos meses se le agregaron 5mL de medio para dar una renovación de nutrientes sin acetato de sodio.
Para adaptar las algas al fenol, estas fueron cultivadas en los medios seleccionados con concentraciones de fenol 50 mg/L y 100 mg/L (8mL) [8]. Como inóculo se utilizó 1 mL de los cultivos de algas que se encontraban creciendo de manera autótrofa.
2.4. Crecimiento bacterias
Dado que no se tienen identificadas se les nombro bacterias amarillas y bacterias blancas, por la coloración que presentan en el medio AMA sólido. Ambas cepas se sembraron en medio AMAm y RS en tubos Falcon con 9 mL de medio a 50 mg/L de fenol. Se mantuvieron en un agitador a 130 rpm con temperatura ambiente de 20°C. Para conocer si eran Gram + o Gram – se hizo tinción de Gram y se vieron al microscopio de luz; el microscopio de contraste de fases se utilizó para ver las células vivas. Como control de contaminación se sembraron en Agar Triptona y Soja (TSA) en una incubadora de 27°C.
2.5. Consorcio
Se realizarón pruebas para analizar la viabilidad de diferentes consorcios alga-bacterias, utilizando 8 mL de medio (RS y AMAm) con fenol como única fuente de carbono (Tabla 2).
Tabla 2. Consorcios.
Compuesto químico TAPm HSMm AMAm RS
K₂HPO₄ 0,108 1,44 0,06 -
KH₂PO₄ 0,54 0,72 - 1
NH₄Cl 0,375 0,5 0,06 0,811
MgSO₄ 7H₂O 0.1 0,02 0,02 0,02
CaCl₂ 0,034 0,0067
Na2HPO4 - - - 2,66
FeSO₄ 7H₂O - - 0,003 0,003
Na2SO4 - - 4,0023 -
KCl - - 0,7 -
KBr - - 0,1 -
3. Resultados y discusión.
3.1. Algas
En RS y AMAm se dio el menor tiempo de adaptación de C. vulgaris (10 días), en 1,5 g/L de acetato de sodio (Fig. 2). La fase de adaptación de C. reinhardtii fue 10 y 15 días en RS y AMAm, respectivamente. En los otros dos medios después de 30 días todavía no había crecimiento. RS y AMAm se seleccionaron para trabajar con los otros microorganismos.
Para el subcultivo realizado a 0,075 g/L de acetato de sodio se observó crecimiento de C. vulgaris en el medio RS a los 10 días.
Figura 2. Crecimiento C. vulgaris en medio AMAm (1,5 mg/L acetato de sodio). Izq. Cultivo después de 10 días. Der. Cultivo después de 20
días.
C. reinhardtii mostró crecimiento más estable en ambos medios durante los cuatro meses, mantuvo su color y no hubo evidencia de muerte celular en los cultivos. De igual manera, vista al microscopio fue de la que más especímenes se veían (Fig. 3).
Figura 3. C. reinhardtii en medio RS.
A 50 mg/L de fenol las micro-algas tuvieron un mejor crecimiento que las que se encontraban a 100 mg/L. Su crecimiento se vio de manera óptica, tal como se hizo en los tarros de vidrio. Al sacar los tubos del agitador se veían partículas suspendidas de color verde, las cuales se sedimentaban al dejar el
tubo en superficie por unos minutos (Fig.4). Se evidenció el mismo tiempo de crecimiento en ambos medios, 8 días.
Ambas micro-algas siguen viviendo después de cuatro meses de manera adecuada en el medio RS sin adición de fuente de carbono adicional a la inicial. En el medio AMAm las micro-algas sobrevivieron por tres meses.
3.2. Bacterias
El crecimiento de las dos cepas de bacterias se dio de manera óptima en ambos medios, con una fase de adaptación de 8 días. En AMAm se dio el mejor crecimiento, lo cual puede estar asociado con que este es el medio más similar a las condiciones naturales de donde fueron aisladas.
Con tinción de Gram ambas presentaron coloración rosa por lo cual son bacterias Gram negativas, en el microscopio de contraste se evidencia que ambas bacterias son bacilos (Fig. 5. Fig. 6.). Lo anterior permite disminuir el rango de bacterias posibles con las que se puede estar trabajando, no obstante llevando a cabo un montaje de PCR será la única manera de identificarlas.
Figura 5. Bacterias blancas en medio RS vistas en el microscopio de contraste.
Figura 6. Bacterias amarillas en medio AMAm vistas en el microscopio de contraste
Figura 4. Crecimiento de C. reinhardtii en RS con Fenol de 50 mg/L.
Figura 7. Cultivo sólido de bacterias amarillas en medio TAS.
Los cultivos en TSA crecieron a los dos días, no hubo evidencia de contaminación (Fig 7), garantizando que se pudieran usar como inoculo de los consorcios.
3.2. Consorcio
Las muestras 3 y 4 se tornaron totalmente verdes. En las muestras 1 y 2 hubo evidencia de crecimiento con alta sedimentación de color verde. En las muestras 5 a 8 la coloración fue mucho más tenue, evidenciando el efecto que tiene el fenol sobre el crecimiento de los microorganismos.
En las muestras 9 a 16 se evidenció crecimiento por medio del microscopio de contraste de fases. El tamaño de las algas disminuyó lo cual puede estar relacionado con la toxicidad que tiene el fenol en altas concentraciones (Fig 3 Fig 8). En [8] se evidencia que a partir de 100 mg/L de fenol el crecimiento de C. vulgaris se empieza a ver inhibido y que la fase de adaptación puede demorar hasta 7 días más antes de empezar su etapa de crecimiento exponencial y encontrar su equilibrio de crecimiento. Esto concuerda con lo observado; se observó crecimiento en los consorcios a los 15 días, cuando micro-algas y bacterias por separado tardaban 8 días a concentraciones de 50 mg/L de fenol (Fig 8 y Fig 9).
Figura 8. Micro-alga en el consorcio Bacterias amarillas - C. reinhardtii en medio AMAm (100 mg/L fenol).
AMAm fue el medio en el que se vio un mejor crecimiento de las micro-algas en consorcio, resultado que se esperaba para establecer la relación simbiótica. Las bacterias, tuvieron un mejor crecimiento en AMAm, por lo que podrían haber mayores concentraciones de CO2 que ayudan al crecimiento
de las algas. Simultáneamente el alga estaría generando mayor concentración de O2 que beneficiaría el crecimiento de las
bacterias [6]. Hay que mencionar además que la presencia de oxígeno favorece la degradación de fenol [10].
Dentro de los consorcios las micro-algas pueden estar teniendo un crecimiento mixotrófico, donde utilizan el fenol como fuente de carbono pero siguen usando la luz. Esto significa un mejor crecimiento de las algas que beneficiaría el consorcio [9].
Por otro lado, en relación con la evidencia que [8] presenta de degradación de fenol por medio de Chlorella sp.es importante continuar el estudio con pruebas de laboratorio que muestren cómo se está llevando a cabo realmente la degradación de fenol en el consorcio. También cómo es la relación de los microorganismos dentro de éste.
4. Conclusiones
Los medios RS y AMAm soportaron el crecimiento de las algas de manera autotrófica, así como el crecimiento de los consorcios a concentraciones de 50 y 100 mg/L de fenol.
Agradecimientos
A Dios y a mis padres María Teresa Carrero e Ismael Cantillo por darme la oportunidad de cumplir este sueño y por la formación que me han dado, a ellos y a mi hermana Diana Cantillo agradezco su apoyo. Así mismo a Johana Husserl, Andrés González, Adriana González y David Páez sin cuyo apoyo, guía y soporte no hubiera podido llevar a cabo esta investigación. A Johana Husserl por darme la oportunidad de ser parte de este proyecto, por ser guía constante en mi desarrollo como ingeniera ambiental, de igual manera a todos los profesores que hicieron parte de él. A todas las personas que me acompañaron en este proceso de formación y me ayudaron a llegar donde estoy. Por último quiero agradecer a Ángela Quiroga por compartir sus estudios previos conmigo y brindarme así una base esencial para este proyecto.
Referencias
[1] U.S. Environmental Protection Agency, «Toxicological Review of Phenol,» Washington D.C., 2002.
[2] V. Santos y V. R. Linardi, «Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated from industrial effluents - identification and degradation potential,» Process Figura 9. Bacterias en el consorcio Bacterias amarillas - C.
Biochemestry, nº 39, pp. 1001-1007, 2004.
[3] G. Busca, S. Berardinelli, C. Resini y L. Arrighi,
«Technologies for the removal of phenol from fluid streams: A short review of recent developments.,» Journal of Hazardous Materials, pp. 265-288, 2008.
[4] V. K. Chetty, R. Ramanjaneyulu y G. Srinikethan, «Biological phenol removal using immobilized cells in a pulsed plate bioreactor. Effect of dilution rate and influent phenol cocnentration.,» Journal of Hazardousmaterials, nº 149, pp. 452-459, 2007.
[5] G. Pinto, A. Pollio, L. Previtera y F. Temussi,
«Biodegradation of phenols by microalgae,» Biotechnology Letters, nº 24, pp. 2047-2051, 2002.
[6] S. Subashchandrabose, B. Ramakrishnan, M. Megharaj, K. Venkateswarlu y R. Naidu, «Consortia of
cyanobacteria/microalgae and bacteria: Biotechnological potential,» Biotechnology Advances, nº 29, pp. 896 - 907, 2011.
[7] Kuei-Ling Yeh, Chun-Yen Chen y Jo-Shu Chang, «pH-stat photoheterotrophic cultivation of indigenous Chlorella vulgaris ESP-31 for biomass and lipid production using acetic acid as the carbone source,» Biochemical Engineering Journal, nº 64, pp. 1-7, 2012.
[8] A. Scragg, «The effect of phenol on the growth of Chlorella vulgaris and Chlorella VT-1,» Enzyme and Microbial Technology, nº 39, pp. 796-799, 2006.
[9] D. Mitra, J. (. van Leeuwen y B. Lamsal,
«Heterotrophic/mixotrophic cultivation of oleaginous Chlorella vulgaris on industrial co-products,» Algal Research, nº 1, pp. 40-48, 2012.
[10] J. Melo, S. Kholi, A. Patwardhan y S. D'Souza, «Effect of oxygen transfer limitations in phenol biodegradation,» Process Biochemestry, nº 40, pp. 625-628, 2005.
[11] Agency for Toxic Substances & Disease Registry, «Agency for Toxic Substances & Disease Registry,» [En línea]. Available:
http://www.atsdr.cdc.gov/mmg/mmg.asp?id=144&tid=27. [Último acceso: 1 Junio 2013].
