Análisis de compuestos
farmacéuticos en sangre total
Julian de la Mata
Junio de 2012
Contenido
Preparación de muestras en la monitorización terapéutica
de fármacos y química forénsica.
Técnica mini-QuEChERS para el Clean-up de sangre.
La técnica de Puntos de Sangre Seca (Dried blood spots)
como una técnica de recolección de muestra.
Análisis rápidos de HPLC/UHPLC a presiones
convencionales con las columnas Poroshell 120
Dried Blood Spotting
QuEChERS
LC/MS/MS 1290Infinity/QQQ 6400
Análisis de Fármacos reductores del Colesterol
(Estatinas) usando la Tecnología de Gotas en Matriz
Seca (Dried Matrix Spots) y Columnas Poroshell 120
Nota de aplicación 5990-8305EN
Introducción
La tecnología Gota de Sangre Seca como método de muestreo
para el bioanálisis quantitativo de pequeñas moléculas.
Significativa reducción en los volúmenes de sangre necesarios,
lo que simplifica la recogida de muestras.
Reducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los
gastos de almacenamiento en condiciones ambientales
Los compuestos
Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un
grupo de fármacos usados para disminuir los niveles de
colesterol.
Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de
Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa.
Excepto la atorvastatina, estos compuestos, que son ácidos
por naturaleza, son un reto á la hora de lograr unos límites de
detección bajos.
Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina 6.36 6.36
Simvastatina 4.68 NA
Pravastatina 2.18 4.70
Procedimiento DMS
Fortificación de sangre humana entera fresca con cada una de las
cuatro estatinas para crear una curva de calibración.
Adición de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut
DMS (Part #: A400150).
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20
ng/mL y 500 ng/mL.
Secado de las tarjetas.
Perforación de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL .
Disolución de cada gota en el solvente de desorción y vortex.
Evaporación hasta sequedad.
Reconstitución en 100 μL de fase móvil (70% 5 mM formiato
amónico: 30% CH3CN) y agitación.
Cromatograma LC–MS–MS de sangre fortificada
con 50 ng/mL de estatinas después del DMS.
Columna Poroshell 120 en la separación por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolución
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC.
La tecnologia de partículas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones.
Se generaron presiones inferiores a 400 bares.
La Poroshell 120 EC-C8, proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos.
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ng/mL
con una SNR de 797.
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3).
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento ionico, dando lugar a altas recuperaciones artificiales.
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorción de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa.
Conclusiones
Método simple y rápido para el análisis de un grupo de compuestos
acídicos en muestras de sangre humana con DMS y LC–MS–MS.
El método ha demostrado ser exacto, preciso y robusto.
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una
regresión lineal con coeficientes de correlación mejores de 0.998.
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorción
comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa.
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente elección para
las aplicaciones bioanáliticas.
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una
técnica de recolección de muestra para el análisis de fármacos en
estudios clínicos y preclínicos.
•Tecnología Innovadora , no-celulosa
•Proporciona un nuevo nivel de confianza en la recolección de muestras •Mejora significativa en la sensibilidad analítica, reproducibilidad y fácil uso.
Análisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboración con Compañías farmacéuticas y CROs, este dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que •Muestreo de Sangre, plasma o suero (líquido sinovial,lágrimas, bilis, LCR) para análisis bioanalíticos en pruebas farmacéuticas clínicas y preclínicas en
empresasa farmacéuticas de bioanálisis (DMPK, ADME y MetID) (no para Diagnóstico clínico)
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Señal del MS
•Formato libre de celulosa ha reducido el enlazado no específico y no contiene reactivos químicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo más fácil
• La extracción de la muestra de la tarjeta requiere 5 veces menos fuerza que el producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad de la mancha
• Extracciones reproducibles, recuperaciones más altas,
Ventajas Clave de la Técnica DBS de Agilent
• Una vez seca, la muestra de sangre no supone peligro biológico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeración costosos.
• Permite a los laboratorios centralizar los análisis de muestra periféricas
• Se requiere menos volumen de muestra (menor nº de sujetos en el ensayo,
menor nº de repeticiones y eliminación de sujetos satélite)
• Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmacéuticos y Toxinas en Sangre Total
Análisis de Compuestos Farmacéuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120, Usando el método Modificado
Introducción
Determinación de compuestos farmacéuticos en análisis clínicos y
forénsicos ADME (DMPK).
La preparación de muestra va desde la simple precipitación de
proteinas (PPT) a la más compleja extracción en fase sólida (SPE).
Habitualmente la SPE, ha ocupado este vacío, pero simpre hay
espacio para técnicas de preparación de muestras que son rápidas y
baratas de implementar.
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LC–MS-MS para la determinación de fármacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes fármacos (lidocaina, tramadol,
amitriptilina, biperidina, oxazepam, lorazepam, clorpromazina,
Compuestos farmacéuticos usados en el estudio
Compuesto Número CAS Log P (o/w) pKa Uso
terapéutico
Lidocaina 137-58-6 2.4 8.01 Anestésico local,
antiarrithmico Tramadol 27203-92-5 2.5 9.41 Analgesico Amitriptilina 50-48-6 4.92 9.4 Antidepresivo Biperidena 514-65-8 4.0 10.8 Anticolinergico Oxazepam 604-75-1 2.23 1.7, 11.3 Antianxiedad Lorazepam 846-49-1 2.47 1.3, 11.5 Antidepresivo Clorpromazina 50-53-3 5.18 9.3 Antipsycótico
Diltiazem 42399-41-7 3.63 7.7 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 1.45 7.9 Antagonista de los
receptores de opio
La Técnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el más complejo de los fluidos biológicos
La determinación de fármacos en sangre total es a menudo necesaria en los análisis forénsicos dada la dificultad de obtener suero o plasma.
Los procedimientos convencionales para analizar fármacos en matrices complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una técnica de preparación de muestra que fue desarrollada para la extracción de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales en 2003
A pesar de que los fluidos biológicos pueden parecer muy diferentes a una pieza de fruta, sin embargo siguen caminos paralelos.
Caminos paralelos en la preparación de muestra
Fluidos Biológicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
• Lisis, agitación, solvente orgánico, hidrólisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades.
Retirar analito o matriz
Análisis por LC/MS/MS, GC/MS o
GC/MS/MS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
• Trituración, agitación, solvente orgánico, hidrólisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades.
Retirar analito o matriz
Análisis por LC/MS/MS, GC/MS o
Procedimiento Básico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada, (fortificada) Añadir 15 mL ACN (1% AA), vortex Añadir Sales de Extracción AOAC, agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC, vortex, centrifugar
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extracción tipo líquido/líquido
Uso de ácido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitación protéica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl, et.at., J Chrom A, 1135 (2006), 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el método no
son “biológicamente adecuados”
Fármacos en sangre. Procedimiento mini-QuEChERS:
mini-Q
Procedimiento:
1. Añadir 2 homogeneizadores cerámicos
2. Añadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centrífuga con tapón de rosca
3. Añadir estandar interno, vortex
4. Añadir 2 mL de ACN acidificado ( 0.4% FA), vortex 30 seg 5. Añadir 500 mg de sales de extracción, agitar vigorsamente 1
minuto, centrifugar 5000 rpm, 1 min
6. Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga, vortex, centrifugar
Conclusiones del estudio
El ACN con 4% de FA como solvente de extracción muestra
una lisis más completa de la muestra frente a otros solventes
de extracción que mostraron una masa sólida.
Las sales tamponadas AOAC de acetato Sódico generan el
extracto más límpio y para la d-SPE se usaron 50mg de PSA y
150mg de MgSO4
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
métodos de extracción con sales EN y no tamponadas
3 x10 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1
+ESI MRM Frag=112.0V [email protected] (278.2000 -> 117.0000) HQC_6.d
1 1 N a loxone Li doca ine T ra m a dol a z e pam Loraz e pam B iper iden A m it ri pt y li ne D il ti a z e m C hl orprom a z ine N ort ri pt y li ne (I S )
Cromatograma LC/MS/MS de 10 ng/mL de sangre total fortificada después
de extracción mini-QuEChERS ; AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
Recuperación y Reproducibilidad
Compuesto
Recuperación RSD 50 ng/mL Spiked Recuperación RSD 100 ng/mL SpikedLidocaine 98.7 15.7 100 11.8 Tramadol 105 3.0 104 8.2 Amitriptyline 104 2.1 104 8.2 Biperidene 97 4.5 99 8.2 Oxazepam 77.0 9.2 78 8.6 Lorazepam 81.9 6.8 81.8 8.6 Chlorpromazine 110 10.3 105 6.3 Diltiazem 88.1 2.7 91.7 8.3 Naloxone 80.6 9.0 75.5 7.7
Conclusiónes y trabajo posterior
El método mini-QuEChERS para la extracción de compuestos farmacéuticos en sangre total ofrece una alternativa a otras técnicas de preparación de muestras La preparación de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple, facil y barato, que requiere una mínima experiencia en preparación de muestras y mínimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas, en otras matrices biológicas, y en sangre postmortem.
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de extracción como de los sorbentes de d-SPE por el método mini-QuEChERS.
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmacéuticos usados en este estudio.
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTÁNDAR CON COLUMNAS
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:
•
80-90% de eficacia de las sub 2um
•
A presiones un ~40-50% más bajas
•
Con un tamaño de partícula de 2.7um
•
Con una frita de entrada de 2um
•
Con el doble de resolución de una
columna de 3.5um
•
Con un límite de presión de 600 bar
•
La partícula tiene un núcleo sólido
(1.7um) y una cubierta exterior porosa
de 0.5um como zona de difusión
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente!
Flujo: 0.582 mL/min
Acetonitrilo/Agua (60:40) Volumen de Inyección: 4 µL
TCC: 26 oC
DAD: Sig=254,4nm Ref=360,100nm Muestra: Muestra de test RRLC (PN 5188-6529) inoculada con 50 µL 2 mg/mL Tiourea en agua/acetonitrilo (65:35) 2.5 5 7.5 10 mAU 0 200 400 600 0 .6 4 6 0 .8 2 6 1 .1 4 8 1 .5 1 8 2 .0 1 6 2 .2 2 3 2 .8 1 6 4 .1 3 2 6 .2 7 3 9 .7 5 3 ← N = 25053, Presión = 182 bar Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 100 mm, 2.7 um min 2.5 5 7.5 10 12.5 mAU 0 200 400 600 0 .6 4 9 0 .8 6 5 1 .2 7 5 1 .7 5 6 2 .4 1 8 2 .7 0 5 3 .4 9 4 5 .2 8 1 8 .2 1 8 1 3 .0 4 1 ← N = 27295, Presión = 386 bar Eclipse Plus C18, 3.0 x 100 mm, 1.8 um
¿En qué tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120? HPLC’s y UHPLC’s
Consideraciones en UHPLC
• Las columnas Poroshell 120 tienen un límite de presión de 600 bar
• Los UHPLC están ajustados para columnas de bajo volumen, por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
• Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
• Minimize los volumenes extra columna para las columnas 2.1 y 3.0mm ID –
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (1.8um, 600 bar)
• Use en el detector velocidades adecuadas de adquisición para picos
estrechos , de alta eficacia.
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 P res sure 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 E ff ici
ency (N) End PressPlates
Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes Plasma: 7 Partes 20/80 Agua-MeCN w/0.1 % Ácido Fórmico con 1 Parte de Diflusinal en 50/50 Agua-MeCN 10 ug/ml (Concentracion Final Diflusinal 1 ug/ml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado/ No Filtrado Volumen de Inyección: 1ul
Solvente A: Agua w/0.1 % TFA Solvente B: MeCN w/0.08 % TFA Flujo 1 ml/min 1 ul inyección
Tiempo % B 0 20 0.5 90 0.6 90 1.1 20 2.5 20
Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um
min 5 10 15 20 25 30 mAU 0 20 40 60 80 100 9 .7 1 2 1 1 .1 1 6 1 1 .5 9 6 1 2 .6 7 4 1 5 .2 4 8 1 6 .1 5 1 1 6 .4 3 5 2 0 .6 8 7 2 3 .0 7 6 2 9 .2 9 0 min 5 10 15 20 25 30 mAU 0 50 100 150 200 250 1 .7 1 9 2 .1 8 9 2 .3 1 1 2 .6 0 6 3 .8 6 7 4 .4 3 7 4.5 5 8 5 .4 5 0 5 .9 2 0 7 .0 3 7Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)
Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho) Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor) Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada de 2 micras en ambas columnas.
325 bar 110 bar Sulfadiazina, Sulfatiazol Sulfapiridina Sulfamerazina, Sulfametazina, Sulfametazol, Sulfametoxipiridazina, Sulfacloropiridazina Sulfametoxazol, Sulfadimetoxina Tiempo %B 0 8 33 33 34 33
Columna: Eclipse Plus C18 4.6 x 250mm, 5um
Flujo: 1 mL/min
Fase Móvil:
A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN
Tiempo %B 0 8 12 33 13.2 33 Columna: 4.6 x 100mm Poroshell 120 EC-C18, 2.7um Flujo: 1.85 mL/min
Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um
min 5 10 15 20 25 30 mAU 0 20 40 60 80 100 9 .7 1 2 1 1 .1 1 6 1 1 .5 9 6 1 2 .6 7 4 1 5 .2 4 8 1 6 .1 5 1 1 6 .4 3 5 2 0 .6 8 7 2 3 .0 7 6 2 9 .2 9 0 110 bar 5 mAU 0 50 100 150 200 250 1 .7 1 9 2 .1 8 9 2 .3 1 1 2 .6 0 6 3 .8 6 7 4 .4 3 7 4.5 5 8 5 .4 5 0 5 .9 2 0 7 .0 3 7 325 bar minVer condiciones en diapositiva anterior
Mejor Resolución , linea base!!
