FISICOQUIMICA
TEORICO 11-11-13
RADICALES LIBRES E SISTEMAS
BIOLOGICOS
Material de estudio
•
Radicales libres y Resonancia de espín
electrónico
(EPR).
Material de enseñanza complementaria para
el curso de Fisicoquímica.
• Información de las clases teóricas.
¿Qué es un radical libre?
Indique las características de los radicales
libres y mencione al menos tres ejemplos
de radicales libres generados en sistemas
biológicos.
¿Con qué criterio se clasifican?
¿Qué es un radical libre?
Especie química (átomo ó molécula)con un número impar de electrones de valencia (octeto incompleto). Es decir, un electrón en un orbital.
Especie química de existencia independiente, con uno o más electrones no apareados en su capa externa
Electrones apareados (con espines opuestos)
2 electrones apareados en un orbital
Características de un radical libre
Paramagnético:
Especie atraída por un campo magnético
Alta reactividad:
Tendencia a adquirir un segundo
electrón
adquirirdeslocalización del
e-X e-+ X•+
Y + e- Y
•-Las
especies
radicales
pueden
estar
cargadas
positivamente, negativamente o neutras
Características de un radical libre
Dan reacciones en cadena:
(1) iniciación
(2) propagación
(3) terminación
Inespecificidad
Homólisis unimolecular (unión débil) Fotólisis
Transf. de 1 e-a partir de un metal
Reacción en cadena PROPAGACIO TERMI ACIÓ
→
+
• 2Br
H
•+
Br
H
2→
+
• 2H
Br
HBr
+
H
• •+
Br
HBr
→
+
•HBr
H
→
+
• •Br
Br
Br
2 •→
Br
Br
22
I ICIACIO H2(g) + Br2(g) → 2 HBr (g) hν→
+
• •Br
H
HBr
Radicales libres: clasificación
Clasificación Ejemplos Símbolo t1/2 (s)
Centrados en H Atomo de H H• 10-8 Centrados en C Triclorometilo •CCl3 10 -4 Ubisemiquinona Q10H• 10 -2 -1 Melanina - 104
Centrados en S Tiílo /Pertiílo RS•/RSS• 10-5
Centrados en N Oxido nítrico •NO 1
Dióxido de nitrógeno •NO2 1 Centrados en O
Inorgánicos Anión superóxido O2•- 10 -4
Hidroxilo HO• 10-9
Orgánicos Alcohoxilos RO• 10-6
Peroxilos RO2• 10-1
Metales de transición Cobre Cu+/Cu2+ 10-8-10-4
Hierro Fe2+
/Fe3+
10-2
-10-4
Pryor, 1976
Describa la secuencia de reducción
univalente del oxígeno.
Especifique cuáles de dichos productos
son radicales libres.
Para
el
oxígeno
en
su
estado
fundamental, el anión superóxido y el ión
peróxido, justifique esquematizando la
configuración
electrónica
(últimos
orbitales).
Formas en que existe el oxígeno
1. Ozono (O
3): principalmente en altitud
2. Oxígeno monoatómico (O): forma transiente reconocida
en química atmosférica
3. Dioxígeno (O
2)
Perdiendo e
-O
2e
-+ O
2+ dioxigenilo radicalGanando e
-O
2-; H
2O
2;
.OH ; H
2O
Oxígeno
Elemento más abundante en la naturaleza (54%) Constituye el 21% del aire atmosférico
Configuración electrónica del O: 1s22s22p x22py1 2pz1
O
O
O2: Birradical (2 electrones no apareados, 1 electrón no apareado sobre cada átomo de O)
Estado fundamental: triplete (los 2 electrones tienen igual número de espín (+1/2), espín paralelos)
Químicamente estable
O
Estados del oxígeno
El O2 tiene la particularidad de que el estado basal es un triplete, con 2 electrones no apareados y que el estado excitado, altamente reactivo, es un singulete con los electrones apareados
Estado del O2 2oestado excitado 1erestado excitado Estado basal Orbital 1O 2 Singulete Triplete Michaelis, 1946
La reducción parcial, univalente y sucesiva, del oxígeno produce tres intermediarios, dos de ellos radicales libres.
O
2O
2 •-H
2O
2 •OH
H
2O
e- e- e- e -Anión superóxido Peróxido de hidrógeno Radical hidroxilo Oxígeno Aguaσ* 2p π* 2p π2p σ2p σ* 2s σ2s σ* 1s σ1s Ground-state O2 (3Σg -O 2) Singlet O2 (1∆g O 2)
Estado basal O2singulete Radical
superóxido Ión peróxido (O2: 3ΣgO2) (1∆gO2) (O2-) (O22-)
Configuración electrónica de las especies del oxígeno
σ2p * π2p* π2p σ2p σ2s* σ2s σ1s* σ1s
O
2O
2 •-H
2O
2 •OH
H
2O
e- e- e- e -Anión superóxido Peróxido de hidrógeno Radical hidroxilo Radicales libresEspecie estable no radical
Habilidad para difundir a través de membranas biológicas
¿Qué causa los efectos tóxicos del oxígeno?
Presiones elevadas de O2(hiperoxia) son tóxicas para los animales
Los radicales libres de oxígeno son el mecanismo molecular común para la toxicidad del oxígeno y la radiación ionizante
Un aumento en la presión de oxígeno o una disminución de la defensa antioxidante conducen a un daño celular Es un fenómeno continuo
Science 119: 623-626 (1954)
La teoría de Gerschman
(1954)
Indique (en el caso en que las haya) que
enzima metaboliza cada especie reactiva
del oxígeno en los sistemas biológicos.
Mecanismos de defensa antioxidante
1. Previniendo la formaciónCitocromo oxidasa
Proteínas quelantes de Fe y Cu (ferritina, transferrina, ceruloplasmina) Glutatión transferasa
2. Desactivando las especies (Antioxidantes)
Enzimáticos (SOD, catalasa, GPx/GR)
No enzimáticos - hidrosolubles (GSH, vit C)
- liposolubles (vit E, carotenoides, ubiquinoles)
3. Reparando el daño producido Enzimas reparadoras del ADN Enzimas lipolíticas Enzimas proteolíticas Hidrosolubles Liposolubles Glutatión (GSH) Acido ascórbico Vitamina E Coenzima Q10 Carotenoides
Antioxidantes no enzimáticos
• Moléculas que pueden atrapar especies radicales ya
formadas (
•OH, ROO
•, etc) y/o estados excitados (
1O
2
,
RO*)
• Presentes en concentraciones
µ
M o mM
• Fácilmente oxidables
O
2O
2 ••••-H
2O
2HO
••••H
2O
e- e- e- e -SOD Catalasa GSH GSSG GPx GREnzimas antioxidantes
GlutatiónIndique los sitios celulares de producción
de anión superóxido y de peróxido de
hidrógeno.
Anión superóxido (O
2••••-)
UQH• + O2 → UQ + H+ + O 2•••• -k = 8 x 103M-1s-1 FMNH• + O2→ FMN + H+ + O 2••••-Complejo I: NADH -ubiquinona reductasa
Complejo III: ubiquinol-citocromo c reductasa
Auto-oxidación de componentes de cadenas de
transporte de electrones
Auto-oxidación de compuestos
de bajo peso molecular
Reacciones enzimáticas
Peróxido de hidrógeno (H
2O
2)
2 O2•- + 2 H+ → H2O2 + O2
Dismutación no enzimática o enzimática de O
2•-Reacciones catalizadas por enzimas peroxisomales (2 e
-)
O2 + 2 H+ Sustrato reducido Sustrato oxidado H2O2 Ej. Glicolato oxidasa, Urato oxidasa, Acil-CoA oxidasa
Reacciones que generan especies activas del oxígeno
I. O2- Autooxidación de moléculas de bajo peso molecularReacciones enzimáticas
Transporte mitocondrial de electrones
II. H2O2 Dismutación de O2
-Doble reducción directa de oxígeno molecular
III. •OH Reacción de Haber Weiss
Reacción de Fenton
Sitios subcelulares de generación de especies activas del oxígeno
Mitocondrias
Membrana de retículo endotelial Membrana nuclear
Membrana plasmática Peroxisomas Enzimas citosólicas
Se estima que el 1-3% del O2consumido, se metaboliza a especies activas del oxígeno en condiciones fisiológicas
Otras especies activas
•
Peróxido de hidrógeno
– alta constante de permeabilidad en membranas
biológicas
•
Oxígeno singulete, carbonilos excitados
– emiten energía al volver al estado fundamental
•
complejos ferrilos y perferrilos
– pueden intervenir en la iniciación de cadenas de
oxidación lipídica
¿Es el óxido nítrico un radical libre?
¿Cuáles son sus principales características?
Indique vías de formación y degradación en
sistemas biológicos.
itrógeno y óxido nítrico (
••••O)
N2constituye el 79% del aire atmosférico Configuración electrónica del N: 1s2 2s22px12py1 2pz1
(3 electrones no apareados)
Cuando un átomo de N (3 electrones no apareados) se combina con un átomo de O (2 electrones no apareados) forma el óxido nítrico (•NO) con un electrón desapareado
O
Oxido nítrico itrosonio ( O+) itrosación Efectos directos Anión nitrosilo ( O-) Efectos indirectos deaminación itrosilación (nitrosotioles) itración (nitrotirosinas) Lipid oxidación Lipid nitración D A oxidación D A nitraciónPRODUCCIÓ BIOLÓGICA DE ÓXIDO ÍTRICO
En organismos fotosintéticos
:
Vias reductivas: Actividad de la enzima nitrato reductasa (NR) 2 NO2-+ NAD(P)H + 3 H3O+ 2 NO + NAD(P)++ 5 H2O
Producción de O asociada a membrana plasmática o mitocondrial (sistema NR:NiNOR)
Vías oxidativas: Actividad de la enzima óxido nítrico sintasa-like (utiliza L-Arginina, poliaminas o hidroxilamina)
Vías no enzimáticas: A partir de nitritos en medio ácido.
Las óxido nítrico sintetasas ( OS) producen O
a partir de Arginina, ADPH
2y O
2.
Hay cuatro OS:
I, nNOS (neuronal) II, iNOS (macrófagos) III, eNOS (endotelio) IV, mtNOS (mitocondria)
Arg + ADPH
2+ O
2=> Cit + H
20 + O
ADPH FAD FM CaM Alternative Splicing
En organismos no fotosintéticos:
k= 1.9 x 1010M -1s -1 (Peroxinitrito)O
2 ••••- ••••O
O OO
-Reacción entre el O
2 ••••-y el
••••O
Reacción de terminación entre 2 especies radicales:
se forma el anión (no radical) peroxinitrito
Reacción muy rápida, controlada por difusión
Potente oxidante
Utilizando un diagrama relacione la
generación de especies activas del
oxígeno y del nitrógeno.
Defina el concepto de estrés oxidativo
Reacciones
fotoquímicas Polimorfonucleares
Intracelular
Concentraciones celulares en estado
estacionario
ón superóxido
10
-11M
Peróxido de hidrógeno 10
-7-10
-9M
Radical hidroxilo
10
-18M
Oxido ítrico
10
-7M
Peroxinitrito
10
-9M
Estrés oxidativo como un desbalance. Un aumento de oxidantes o una disminución de antioxidantes llevan igualmente al estrés oxidativo.
ESTRÉS OXIDATIVO
• Estrés oxidativo como un aumento de las concentraciones en estado estacionario de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno. La concentración intracelular aumentada, de por lo menos una, de las especies reactivas del oxígeno o del nitrógeno es la base química del estrés oxidativo.
[O2-]ss [H2O2 ]ss [HO·]ss
[ROO·]
ss [1O2 ]ss
[ O ]ss [O OO -]ss
Daño causado por radicales libres y otras especies activas
D A
Oxidación/NitraciónProteínas
Modificaciones conformacionalesLipídos
Peroxidación Mutaciones¿Cuál es la importancia de ciertos metales
de transición (por ejemplo, Fe) en la
bioquímica de los radicales libres?
Fe2+ + H
2O2 →••••OH + HO- + Fe3+
Reacción del H
2O
2con Fe
2+(o Cu
+)
Reacción de Fenton
Reacción de Haber-Weiss
Fe3+ + O 2•- → Fe2+ + O2 Fe2+ + H 2O2 →••••OH + HO- + Fe3+ H2O2 + O2•- →••••OH + HO- + O2 Muy reactivoDistribución celular del Fe no hemínico
-
Pool
de Fe lábil: Fe unido a compuestos de bajo
peso molecular (citrato, ATP, pirofosfato, ácido
ascórbico).
- Ferritina: Es la proteína intracelular más
importante en el almacenamiento de Fe.
- Hemosiderina
Peroxidación lipídica
Definición:
¿Cuáles
son
los
indicadores
más
empleados
para
evaluar
daño
por
radicales libres a lípidos, proteínas y
AD .
Metodología
Utilizada en el estudio de la bioquímica de especies
activas del oxígeno y nitrógeno
Métodos indicadores de estrés oxidativo
in vivo
Detección de especies activas del oxígeno y del
nitrógeno
Detección de antioxidantes
Detección de daño a macromoléculas/estructuras
celulares
Relación GSSG/GSH (espectrofotometría y HPLC)
Relación ascorbilo/ascorbato (EPR)
Quimioluminiscencia in vivo
Métodos indicadores de estrés oxidativo
in vivo
Velocidad de producción (espectroscopía y espectrofluorometría) Cálculo de estados estacionarios
Detección de especies activas específicas
Actividad de enzimas antioxidantes (espectrofotometría)
Antioxidantes (HPLC)
Detección de antioxidantes específicos
Lípidos Proteínas
DNA
Carbonilos (espectrofotometría y Western Blot) Nitrotirosina (Western Bloty HPLC)
8-hidroxi-2´-deoxiguanosina (Western Bloty HPLC) Hidroperóxidos lipídicos (espectroscopía y espectrofluorometría)
Lípidos nitrados (Espectrometría de masa)
