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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Y ECOLOGÍA APLICADA
INDUCCIÓN DE LACASAS Y CELULASAS PARA
UTILIZARSE EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL CELULÓSICO
Tesis
Para obtener el grado de
Doctor en Ciencias en Ecología y Biotecnología
QUE PRESENTA:
BIOL. CHRISTIAN ARTURO HERNÁNDEZ HERNÁNDEZ
DIRECTOR
Dr. Enrique Alarcón Gutiérrez
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INDUCCIÓN DE LACASAS Y CELULASAS PARA
UTILIZARSE EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL CELULÓSICO
El presente trabajo se ha realizado dentro del Cuerpo Académico Estructura y Funcionamiento de los Ecosistemas Forestales CA-UVER-324, línea de generación y aplicación del conocimiento Ecología Microbiana e interacciones biogeoquímicas planta-suelo-microorganismos, bajo la dirección del Dr. Enrique Alarcón Gutiérrez y subvencionado por el proyecto ECOS-NORD Mexique M13A02
Asímismo, el autor agradece al Centro de Biotecnologia, Escola de Engenharia de Lorena de la Universidade de São Paulo; al Centro de Estudios Multidisciplinarios en Biotecnología de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo; al Institut Méditerranéen de Biodiversité et d’Ecologie Marine et Continentale, y al Spectropole de la Aix Marseille Université; al Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca, por contribuír al desarrollo de la presente tesis.
Se agradece también al comité tutoral, integrado por el Dr. Enrique Alarcón Gutiérrez, la Dra. Beatríz Gutiérrez Rivera, el Dr. Sergio Martínez Hernández, y el Dr. Ángel Trigos Landa, por su consejo y revisión de la presente tesis.
El autor agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT), por la beca de manutención otorgada para realizar los estudios doctorales. A la Red de Macrouniversidades de América Latina, al gupo financiero Santander, al CONACyT y al Gobierno Francés, por las becas para realizar estancias de investigación y movilidad internacional.
Atentamente
Christian A. Hernández Hernández
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Este trabajo lo dedico para mis padres y hermano,
gracias por llenar mi vida de alegrías y compartir conmigo esta pasión por la ciencia
(porque yo sé que también la sienten)
Descubrir que lo extraordinario,
Lo monstruosamente anormal
Es esta breve cosa que llamamos… vida
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Agradecimientos
Durante la realización de esta tesis, he contado con el apoyo sincero y desinteresado de
muchas personas, a las que quisiera agradecer, pues mucho de este logro, lo debo a
ustedes: Primeramente, a mi director el Dr. Enrique Alarcón, por guiar durante los últimos
7 años mi formación científica, por el ánimo, consejo, la confianza y las grandes
enseñanzas, por ser más que un tutor, un amigo; siempre te estaré agradecido. A mis
compañeros de generación, por los ánimos y las experiencias, gracias por dejarme
aprender de ustedes. A mis amigos, los ¡inbio power!, Leo, Lucho y Luis J. ustedes saben
por qué (jaja), a todo el equipo del CMEB-Morelia, por su apoyo durante mi estancia para
la identificación de mis cepas de hongos, especialmente al Dr. Gerardo, Dra Saila y a mi
amiga Heidi. A la Dra. Adriane Milagres por recibirme en su laboratorio en Brasil, a mis
compañeros de laboratorio y a mis roomies de la RepSemNome (Catra, Du e Lumbriga),
obrigado sempre!. Al equipo francés que me recibió en Marsella, a la Dra. Isabelle Gaime,
por tanta hospitalidad, a la Dra. Anne Marie Farnet y al Dr. Fabio Ziarelli por su apoyo, a
Carolina, Bubú, Mary, Quentin et Sonia, merci beaucoup!. Al equipo de Tierra Blanca,
especialmente a la Dra. Beatríz y a la técnico Lucero, por su apoyo con los análisis de
HPLC.
A mis compañeros de laboratorio que hicieron los días de trabajo tan amenos, a Darcy (la
capitana), Vico (por las pláticas eternas), Gera, Miriam, Marycruz (cuñis) y Evelin, y
especialmente a Gabi y a Norma, por apoyarme en mi etapa de experimentación. A Anahí,
por todo tu cariño y paciencia durante el cierre de esta etapa tan importante, gracias. A mis
amigas, las más creativas y artistas de todas, Isabela, Arely, Faby y Griss, que me han
acompañado durante este viaje. A Heidi.Co, Adri y Karla, por su amistad cuando apenas
iniciaba el doctorado; así como a César, Chucho, Yeye (del rock!), Angie, Clau, a Paulina y
Eli, Don Ale (brasileiro), Paty, Fer (Pollita) y Ricardo, por su constante y apreciable
amistad, y por los momentos compartidos.
A todos aquellos que han contribuído a esta historia… mis más sinceros agradecimientos,
sin ustedes, estos sería un cuento vacío.
Christian
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Índice
Resumen
Lista de publicaciones
Lista de asistencia a congresos
Lista de estancias de investigación
Lista de figuras
Lista de tablas
I. Introducción general
1.1 El bioetanol celulósico
1.2 El proceso de producción de bioetanol celulósico
1.3 El bagazo de caña de azúcar como materia prima para la producción de bioetanol
II. Estado del arte
2.1 Métodos de pretratamiento para lignocelulosa 2.1.1 Pretratamientos fisicoquímicos 2.1.2 Pretratamientos biológicos 2.1.3 Las lacasas
2.2 Las celulasas
2.2.1 Organismos productores de celulasas 2.2.2 Métodos de producción de celulasas 2.3 La hidrolisis y fermentación
2.3.1 La hidrólisis enzimática 2.3.2 Fermentación alcoholica 2.4 Planteamiento del problema
III. Preguntas de investigación
3.1 Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar
3.2 Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación simultánea
IV. Hipótesis
4.1 Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar
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V. Objetivos
5.1 Objetivo general 5.2 Inducción de lacasas
5.3 Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación simultánea
VI Metodología general
6.1 Etapas del proyecto
6.2 Etapa 1. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar 6.2.1 Efecto de la exposición a luz sobre la producción de lacasa
6.2.2 Efecto del etanol, la fuente y concentración de nitrógeno sobre la producción de lacasa. 6.2.3 Evaluacion de colorantes fenólicos como inductores de actividad lacasa
6.3 Etapa 2. Optimización de la producción de celulasas para procesos de fermentación-sacarificación simultánea
6.3.1 Bioprospección de cepas de hongos productoras de celulasas de mantillo de bosques veracruzanos
6.3.2 Efecto de la interacción de diferentes cepas de hongos sobre el perfil de celulasas producido. 6.3.3 Bioprospección de hongos productores de celulasas del Parque Nacional Pico de Orizaba. 6.4 Etapa 3.Digestibilidad enzimática de BCA sometido a diferentes pretratamientos
VII. Resultados
7.1 Capítulo 1. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar
7.1.1 Light-induced inhibition of laccase in Pycnoporus sanguineus
7.1.2 Ethanol induction of laccase depends on nitrogen conditions of Pycnoporus sanguineus
7.1.3 Laccase induction by synthetic dyes in Pycnoporus sanguineus (L.), and their use for sugar cane bagasse delignification
7.2 Capítulo 2. Optimización de la producción de celulasas para procesos de
fermentación-sacarificación simultánea.
7.2.1 Cellulases and xylanases production with different fungi (Ascomycota) mixed cultures in liquid media.
7.2.2 Cellulases produced from Pico de Orizaba’s cold-ecosystem fungi, hydrolyze at lower temperature than cellulase from Trichoderma reesei?
7.3 Capítulo 3. Digestibilidad enzimática de BCA sometido a diferentes pretratamientos
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VIII. Discusión general
IX. Conclusiones generales
X. Referencias
XI. Anexos
11.1 Curva de calibración para estimar actividad xilanasa 11.2 Curva de calibración para estimar actividad endoglucanase 11.3 Curva de calibración para estimar actividad exoglucanasa
11.4 Curva de calibración para estimar poteína total por el método de Bradford
11.5 Curva de calibración semilogaritmica para estimar peso molecular de isoformas proteicas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
11.6 Protocolo para evaluar la concentración de azúcares reductores en solución 11.7 Protocolo para evaluar la actividad lacasa en cultivos liquidos
11.8 Protocolo para estimar la cantidad de proteína en solución por el método de Bradford (1969) 11.9 Modelos de regresión lineal para estimar la concentración de colorantes en solución líquida 11.10 Protocolo para extracción de ADN
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Resumen
La búsqueda de nuevas fuentes energéticas, alternativas a los derivados de petróleo, ha señalado al bioetanol como una opción viable en el corto y mediano plazo; este alcohol es producido a partir de la fermentación de azúcares con levaduras o bacterias. Sin embargo, el uso de materias primas ricas en almidones, como los cereales (maíz, trigo), o ricos en sacarosa (jugos o azúcar de caña) para la producción de alcohol, puede no ser conveniente en economías en vías de desarrollo. Es por ello, que la transformación de polímeros estructurales vegetales, como la celulosa o la hemicelulosa, hasta sus monómeros de azúcar, podría suplir la demanda de azúcares necesarios para la producción de bioetanol. Este biocombustible de segunda generación, llamado bioetanol celulósico, enfrenta diversas problemáticas para que su producción pueda ser escalada a nivel industrial, debido a la recalcitrancia de la lignocelulosa. Las dos principales son la de optimizar un pretratamiento que aumente la digestibilidad de la lignocelulosa y la de diseñar un complejo de celulasa que cumpla los requerimientos necesarios para lograr una hidrólisis completa de celulosa hasta glucosa. Su principal ventaja es que la materia prima existe en abundancia y es de bajo costo; pues podrían utilizarse residuos de la agroindustria, como el bagazo de caña de azúcar.
Para aumentar la digestibilidad de la lignocelulosa, el pretratamiento debe ser de bajo costo, debe depolimerizar la mayor cantidad de lignina, disminuír el índice de cristalinidad de la celulosa y evitar la formación de compuestos inhibitorios de celulasas u organismos fermentadores. Por otro lado, las celulasas (y en algunos casos xilanasas) utilizadas para la hidrólisis de holocelulosa, deben ser de alta capacidad catalítica, tener un balance entre actividades exo, endo y β-glucosidasa, y es deseable que el complejo hidrolítico sea rico en isoformas, pues esto contribuye a una mejor hidrólisis del sustrato. Las características intrínsecas de las enzimas, como su temperatura óptima de reacción y su actividad específica son muy importantes cuando se les desea proponer para procesos de producción de bioetanol. El presente proyecto, busca generar conocimiento en el campo de la inducción de enzimas estratégicas para utilizarse en las fases de pretratamiento e hidrólisis del proceso de producción de bioetanol celulósico.
El primer objetivo fue optimizar un pretratamiento biológico para bagazo de caña de azúcar, utilizando el hongo Pycnoporus sanguineus; para esto, se evaluaron diversas variables fisicoquímicas para aumentar la producción de la enzima lacasa en este hongo. La lacasa es la enzima responsable de depolimerizar la lignina y contribuir en el conocimiento sobre la regulación de su producción es un paso fundamental para poder utilizar hongos basidiomicetos para deslignificar material lignocelulósico. Encontramos que la lacasa en P. sanguineus, puede regularse mediante señales lumínicas; la presencia de luz blanca –en el espectro de luz visible- inhibe casi completamente la producción de esta enzima, mientras que, en condiciones de oscuridad, es producida. Al fraccionar la luz blanca en luz azul, verde y roja, encontramos que la inhibición es mayor cuando P. sanguineus está expuesto a longitudes de onda corta, ya que longitudes de onda larga solo inhiben parcialmente su producción. En la sección de Resultados 1.1, se discute esta inhibición lumínica de la producción de lacasa.
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probó también el uso de azo-colorantes y colorantes antraquinónicos (ambos producidos y desechados por la industria textil) como posibles inductores de lacasa en medio líquido. Encontramos que el ácido carmínico y el amarillo de alizarina, pueden fungir como potentes inductores en medio líquido (Resultados 1.3); además, esta inducción es acompañada por la degradación de colorantes, via oxidación enzimática.
Las condiciones de oscuridad, fuente de nitrógeno orgánico y presencia de inductor antraquinónico, nos permitieron obtener una hiperproducción de lacasa en medio líquido (700% más que en controles); por lo que el siguiente paso, fue evaluar el efecto de dichas condiciones en cultivos sólidos de P. sanguineus, utilizando bagazo de caña de azúcar como sustrato. Se observó que la inducción de lacasa persiste en medio sólido, aunque en menor medida que en medio líquido; se observó también una ligera represión en la producción de celulasas y biomasa fúngica, cuando el ácido carmínico es usado como inductor (Resultados 1.3). La transformación de la lignocelulosa por el hongo fue seguida mediante Resonancia Magética Nuclear en fase sólida del carbono 13 (13C CPMAS NMR); y observamos que los tratamientos con P. sanguineus remueven más del 50% de la lignina contenida en el bagazo, superando a tratamientos con soluciones alcalinas de NaOH y Ca(OH)2 al 5%. Asímismo, P. sanguineus disminuyó un 40% el banco de carbohidratos, pero incrementó significativamente la cantidad de proteína y lípidos en el bagazo. El rendimiento de hidrólisis enzimática y la producción de glucosa del bagazo de caña pretratado, tanto con P. sanguineus como con soluciones alcalinas, fue relacionado a la composición química obtenida por los pretratamientos, mediante estadística multivariada. Encontramos que el pretratamiento con P. sanguineus, tiene una producción de glucosa y un rendimiento de hidrólisis mayores que los demás pretratamientos; además, el hidrolizado obtenido tiene mayor rendimiento de producción de etanol que los hidrolizados obtenidos de bagazo pretratado con soluciones químicas. En conclusión, las condiciones de inducción de lacasa en medio líquido y medio sólido, permiten utilizar a
P. sanguineus como pretratamiento biológico que deslignifique bagazo de caña de azúcar y lo enriquezca de proteína y lípidos; lo que promovió un mayor rendimiento de hidrólisis y de producción de etanol (Resultados 3.1).
El segundo objetivo fue la producción de celulasas, con características que las hicieran elegibles para ser utilizadas en la etapa de hidrólisis de lignocelulosa. Para esto, se realizaron diversas prospecciones en mantillo de bosques veracruzanos, obteniéndose diferentes cepas de hongos productores de celulasas; las cuales fueron identificadas mediante secuenciación de la región ITS. Cuatro de estas cepas fueron utilizadas para evaluar el efecto de utilizar cultivos mixtos sobre el perfil de celulasas (exo, endo y β-glucosidasas), xilanasas e isoformas proteicas en medio líquido. Nuestros resultados señalan que, con excepción del cocultivo Aspergillus niger-Fusarium oxysporum, el uso de cultivos mixtos tiende a disminuir las actividades enzimáticas, afectando principalmente a las xilanasas. De la misma manera, se observó una disminución en la producción de isoformas proteicas, por lo que concluímos que el uso de cultivos mixtos, con las condiciones aquí descritas, generan estrés biótico a las cepas, lo que afecta negativamente su producción enzimática (Resultados 2.1). Se realizaron diversas recomendaciones para mejorar el sistema de producción enzimática.
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de cepas de Trichoderma, las cuales producen celulasas con TOR de 50° C. Las celulasas mesófilas, producidas por una cepa que pertenece a la familia Pleosporaceae, podrían utilizarse en procesos de fermentación-sacarificación simultánea, pues poseen alta actividad enzimática a la temperatura (30° C), requerida para la fermentación (Resultados 2.2). En conclusión, el uso de prospecciones de hongos de mantillo es una importante actividad para el descrubrimiento de nuevas cepas productoras de xilanasas y celulasas, las cuales poseen características diferentes a las de Trichoderma o Aspergillus. Se requiere de más esfuerzo en este campo, sobre todo en ecosistemas con condiciones extremas, puesto que son fuentes potenciales de organismos extremófilos, que podrían aportar nuevas enzimas con aplicaciones bitoecnológicas.
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Lista de publicaciones
Articulos publicados
Hernández CA, Sandoval N, Mallerman J, García-Pérez JA, Farnet AM, Perraud-Gaime I, Alarcón E. 2015. Ethanol induction of laccase depends on nitrogen conditions of Pycnoporus sanguineus.
Electronic Journal of Biotechnology 18(2015): 327-332 http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbt.2015.05.008
Hernández CA, Perroni Y, García JA, Gutiérrez B, Alarcón E. 2015. Light-induced inhibition of laccase in Pycnoporus sanguineus. Folia Microbiológica DOI 10.1007/s12223-015-0418-7
Christian Hernández, Anne-Marie Farnet Da Silva, Fabio Ziarelli , Isabelle Perraud-Gaime, Beatriz Gutiérrez-Rivera, José Antonio García-Pérez, Enrique Alarcón. 2016. Laccase induction by synthetic
dyes in Pycnoporus sanguineus and their use for sugar cane bagasse delignification. Applied Microbiology and Biotechnology (Aceptado).
Hernández C. 2012. Apuesta biotecnológica: etanol de segunda generación. La Ciencia y el Hombre
XXVI(1).
Articulos sometidos
Hernández C, Milagres A, Vázquez-Marrufo G, Alarcón E. 2016. Cellulase and xylanase production from different Ascomycota in mixed cultures of liquid media. Enzyme and Microbial Technology
(Sometido el 26 de mayo de 2016).
Lista de participación en congresos
Internacionales
Hernández-Hernández CA, Alarcón-Gutiérrez E, Perroni Ventura Y. 2013. Laccase is inhibited by white light in Pycnoporus sanguineus. 9 Congreso internacional de biotecnología vegetal, Ciego de Ávila, Cuba. ORAL
Hernández C, Milagres A, Alarcón E, Gaime I, Farnet AM, Espinoza V, Gutiérrez B. 2014. Production of fungal cellulases and xylanases in mixed cultures. XVI International biodeterioration and biodegradation symposium, Lodz, Polonia. POSTER
Nacionales
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Hernández C, Alarcón E. 2015. Uso de colorantes aromáticos para la inducción de lacasa en
Pycnoporus sanguineus. XI Congreso Nacional de Micología. Mérida, Mexico. ORAL
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Lista de estancias de investigación
Lugar Periodo Fuente de financiamiento Investigador responsable
Universidade de São Paulo, Escola
de Engenharia de Lorena, Centro de
Biotecnología, Lorena, Brasil
Febrero – Junio 2014 Beca de grupo Santander y
RED MACRO
Beca Mixta CONACyT
Dra. Adriane Milagres
Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo, Centro de
estudios multidisciplinarios en
Biotecnología, Morelia, México
Noviembre –
Diciembre 2014
Beca de doctorado
CONACyT
Dr. Gerardo Vázquez
Marrufo
Aix Marseille Université, Faculte ́
des Sciences et Techniques de
Saint-Jérôme, Spectropole y Equipe
Systèmes Microbiens
Septiembre –
Noviembre 2015
Proyecto ECOS-NORD
Mexique M13A02
Beca para realizar estancias
cortas en Francia de
CONACyT
Dra. Anne Marie Farnet Da
Silva
Dr. Fabio Ziarelli
Dra. Isabelle Gaime
Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo, Centro de
estudios multidisciplinarios en
Biotecnología, Morelia, México
Abril – Mayo 2015 Beca de doctorado
CONACyT
Dr. Gerardo Vázquez
Marrufo
Instituto Tecnológico Superior de
Tierra Blanca
Abril – Mayo 2016 Beca de doctorado
CONACyT
Dra. Beatriz Gutiérrez
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Lista de figuras
1. Relación entre la concentración de CO2 atmosférico y la temperatura de la superficie planetaria. 2. Producción de etanol mundial, en miles de barriles diarios.
3. Panorama futuro de producción de biocombustibles
4. Estructura de las fibras de celulosa
5. Ruta metabólica de fermentación alcohólica a partir de glucosa
6. Ruta metabólica común de transformación de xilosa a etanol
7. Bagazo de caña de azúcar del ingenio La Gloria, municipio de Úrsulo Galván, Veracruz
8. Interacción entre cadenas de celulosa y componentes de lignina
9. Deshidratación de xilosa hasta furfural
10.Oxidación de subunidades fenólicas de la lignina por lacasa
11.Modo de oxidación de compuestos no fenólicos de la lignina, utilizando un mediador
12.Modo de acción de celulasas de Trichoderma reesei
13.Representación de los diferentes factores que regulan la expresión de celulasas y xilanasas
14.Esquema general de la organización del proyecto de tesis
15.Cámaras de luz LED construidas para evaluar el efecto de exponer a diferentes longitudes de
onda de la luz al hongo P. sanguineus sobre su producción de lacasa
16.Medición de la actividad lacasa por espectrofotometría
17.Colorantes fenólicos evaluados como inductores de lacasa en cultivos de P. sanguineus
18.Cultivos liquidos de P. sanguineus
19.Prueba cuantitativa de producción de celulasas por tinción con rojo Congo
20.Cultivos liquidos de hongos filamentosos empleados para la producción de celulasas en
cocultivos y policultivos
21.Concentración de proteína mediante liofilización para la caracterización del perfil de isoformas
protéico
22.Sitios de muestreo en la cara nororiental del volcán Pico de Orizaba
23.Toma de muestras de mantillo en campo
24.Toma de muestras para determinación de actividad celulasa de cultivos de hongos
25.Concentración de proteína mediante diálisis en membrana tubular de celulosa
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Lista de tablas
1. Efecto del uso de diferentes agentes alcalinos sobre la composición estructural del bagazo de
caña de azúcar
2. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar utilizando hongos de pudrición blanca
3. Estudios de bioprospección de organismos celulolíticos
4. Condiciones de hidrólisis de bagazo de caña de azúcar
5. Condiciones de fermentación de azúcares derivados de lignocelulosa
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1. Introducción general
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1.1 El bioetanol celulósico
El bioetanol (CH3CH2OH) o etil alcohol, es un líquido sin color, volátil y flamable con un peso molecular de 46.07 g y una densidad de 789 kg/m3 a 294 K (Baeyens et al., 2015). Puede utilizarse como combustible alterativo a la gasolina y es considerado de emisiones de carbono neutras debido
a que se produce a partir de la fermentación de azúcares simples (generalmente hexosas). Dichos
azúcares derivan del proceso de fotosíntesis que utiliza el CO2 ambiental para su producción, a diferencia de los combustibles fósiles, los cuales utilizan carbón subterráneo que al quemarse se
libera a la atmósfera, y contribuye a un aumento del CO2 ambiental. Este aumento causa, entre otros problemas, un aumento en la temperatura atmosférica llamado calentamiento global (Figura 1);
(Hausfather, 2009).
El bioetanol puede utilizarse de manera pura en motores de combustión interna; sin embargo, para
la mayoría de los automóviles se requieren adecuaciones para funcionar con bioetanol puro. Esto se
debe a que el etanol posee un octanaje mayor que la gasolina (i.e. 113 octanos para etanol, 87
octanos para gasolina Magna PEMEX), lo cual requiere modificación del sistema de carburación;
pero a la vez, mayor octanaje brinda mayor potencia al motor, gracias a que la capacidad de
compresión aumenta, disminuyendo con esto el uso de combustible.
El bioetanol también puede utilizarse como aditivo de gasolina hasta en una proporción de 30% sin
necesidad de modificaciones mecánicas. Las mezclas más comunes utilizadas son el E5, E10 y el
E85. El etanol, al ser una molécula oxidante, puede reemplazar el uso de Metil-terbutil éter (MTBE)
como oxigenante de gasolinas; el MTBE es una molécula contaminante que puede causar estragos
en la salud humana y al ecosistema (Peyster y Mihaich, 2014; Rakshit et al., 2013).
La demanda mundial de bioetanol y su respectiva producción ha aumentado significativamente los
últimos 20 años (Figura 2), siendo los principales productores Brasil, que lo produce a partir de jugo
de caña de azúcar, y Estados Unidos, que lo produce en su mayoría a partir de almidón de maíz.
Este tipo de etanol es conocido como bioetanol de primera generación, esta categoría engloba a la
producción de bioetanol que derivada de fuentes alimenticias para el ser humano (e.g. azúcar de
caña, maíz, remolacha azucarera) y, a pesar de haberse constituído como una industria millonaria y
en constante crecimiento, se recomienda que en economías en desarrollo se utilicen materias primas
no comestibles para la producción de este combustible (Baeyens et al., 2015); además, su balance
energético no arroja emisiones de carbono neutras, pues se requiere de energía fósil para producir
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Figura 1. Arriba: Medición mensual de CO2 atmosférico. Datos del observatorio Mauna Loa y del HadCRUt. Abajo: Anomalías en la temperatura promedio planetaria, datos del HadCRUt 3 y 4.
Debido a esto, se ha sugerido el uso de otro tipo de biomasa para suplir la demanda de bioetanol; en
este contexto, los azúcares contenidos en los polímeros de celulosa y hemicelulosa son los
principales candidatos para fungir como materia prima para esta industria. Entre las ventajas de
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que la materia prima es de menor costo, pues se utilizan subproductos de la industria alimenticia
(e.g. bagazos, rastrojos), y estos materiales no representan una fuente de alimentación primaria para
el ser humano. Además, los desechos de la agroindustria, de naturaleza celulósica, son los más
abundantes del planeta y se encuentran en diversas formas; se estima que anualmente se generan 1.5
Pg (cuatrillones de gramo) de residuos lignocelulósicos disponibles para la producción de etanol,
cuyo potencial de producción es de 442 billones de litros, que representan el 32% del consumo
mundial de gasolina (Kim y Dale, 2004). Actualmente, estos residuos se aprovechan de manera
mínima, llegando en algunos casos a representar problemas ambientales debido a su cantidad, por lo
que son quemados a campo abierto sin ningún tipo de utilización.
Figura 2. Producción de etanol mundial en miles de barriles diarios. Tomado de IEA (2013).
Sin embargo, a pesar de las diversas ventajas señaladas y de que diversos países (e.g. Estados
Unidos de América) han incluido en sus agendas de desarrollo energético el aumento de la
producción de etanol celulósico para disminuír su dependencia de combustibles fósiles (Figura 3),
con las tecnologías actuales, no es factible la producción a gran escala.
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Esto debido a la compleja estructura de la pared celular vegetal la cual se compone principalmente
de tres polímeros: la celulosa, la hemicelulosa y la lignina. La celulosa puede ser definida como un
conjunto de cadenas de β anhidroglucosa, que al formar dimeros constituyen celobiosa y
posteriormente cadenas de celulosa. Las cadenas de celulosa se unen entre sí de manera lateral
mediante puentes de hidrógeno, esta organización ordenada lleva por nombre celulosa cristalina
(Figura 4) (Chun et al., 2012). La celulosa cristalina es una estructura resistente e hidrófoba, la cual
forma microfibrillas de celulosa; que se asocian entre sí y se rodean de hemicelulosa. Al estar
constituída por hexosas (i.e. glucosa), la celulosa hidrolizada puede ser fácilmente fermentada a
etanol por organismos como Saccharomices cereviceae o Zymomonas mobilis (Figura 5).
La hemicelulosa, a diferencia de la celulosa, es un heteropolímero, el cual contiene como bloques
estructurales glucosa, arabinosa, manosa y principalmente xilosa; la cual forma el esqueleto de la
hemicelulosa llamado xilano. La xilosa, es una pentosa (azúcar de 5 carbonos) la cual no puede ser
metabolizada por Saccharomyces cereviceae a etanol, únicamente por levaduras (Candida shehatae,
Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis), bacterias (Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Bacteroides,
Clostridium, Erwinia, Klebsiella, Thermoanaerobacter) y hongos (Fusarium, Monilia, Mucor,
Neurospora, Paecilomyces, Polyporus, Rhizopus) que posean la ruta metabólica necesaria (Figura
Figura 4. Estructura de las fibras de celulosa. En primer plano se muestra una fotografía de
nanofibras de celulosa por microscopía
electrónica. Abajo, un esquema de las dos
formas en las que puede encontrarse la
celulosa (amorfa o cristalina), en el tercer
plano se muestra el esqueleto de
β-anhidroglucosa y el dímero de celobiosa
22 6).
Figura 5. Ruta metabólica de fermentación alcohólica a partir de glucosa (Tomado de Stal y Moezelaar, 1997).
La eficiente hidrólisis de ambas fracciones: celulosa y hemicelulosa, hasta sus monómeros
estructurales, representa el potencial de la biomasa para la producción de etanol. Sin embargo, el
tercer polímero estructural de la pared celular, la lignina, dificulta los procesos de hidrólisis,
principalmente los enzimáticos, por lo que su depolimerización debe ser considerada en cualquier
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Figura 6. Ruta metabólica común de transformación de xilosa a etanol (Tomado de McMillan, 1993)
La lignina, es un heteropolímero de unidades alquil-fenolicas (Yoshikawa et al., 2013) cuya función
es proveer protección y rigidez a la pared celular vegetal. Generalmente, en procesos de producción
de etanol celulósico, la celulosa es hidrolizada mediante el uso de enzimas (celulasas); sin embargo,
el contenido de lignina disminuye la capacidad catalítica de las enzimas, tanto por impedimento
estérico como por adsorción. Es por ello que la remoción de este polímero es muy importante para
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1.2 El proceso de producción de etanol celulósico
Para poder transformar la compleja estructura de la lignocelulosa a etanol, se utilizan generalmente
tres etapas bien identificadas: la primera es un pretratamiento a la biomasa, con el fin de disminuír
la cantidad de lignina, la cristalinidad de la celulosa e incluso de hemicelulosa (cuando no se
requiere para etapas de fermentación). El resultado de esta etapa debe ser una biomasa constituída
principalmente por celulosa en estado amorfo, que sea propicia para la hidrólisis enzimática.
Existen diversos métodos para pretratar biomasa lignocelulósica, que pueden ser físicos, químicos,
biológicos o una combinación de los anteriores. Entre las características que debe poseer un
pretratamiento para ser considerado viable se encuentran i) que sea de bajo costo, ii) que remueva la
mayor cantidad de lignina y/o hemicelulosa, iii) que disminuya la cristalinidad de la celulosa y iv)
que no decremente significativamente la cantidad de celulosa disponible para etapas subsecuentes.
La descripción de estos procesos de pretratamiento, también llamados procesos de deslignificación
se abordará a fondo en la sección de – estado del arte -.
Debido a la gran importancia de esta etapa, el presente proyecto de tesis dedidca su primer capítulo a a la optimización de un sistema biológico de pretratamiento de bagazo de caña de azúcar (BCA). Se optó por utilizar un sistema biológico debido a que podría disminuír los costos de esta
etapa del proceso.
La segunda etapa del proceso de producción es la hidrólisis o sacarificación de la biomasa. El
objetivo es producir la mayor cantidad posible de azúcares simples (principalmente glucosa) a partir
de la biomasa pretratada; esto se realiza generalmente utilizando enzimas (celulasas) que a partir de
la sinergia de tres enzimas i.e. endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa son capaces de
hidrolizar la celulosa hasta sus monómeros de glucosa.
La capacidad catalítica y el costo de las enzimas utilizadas en esta etapa es determinante para la
viabilidad total del proceso. Usualmente, en plantas piloto de producción de etanol celulósico, se
utilizan enzimas comerciales de Novozymes como celluclast®; sin embargo, estas enzimas
obtenidas a partir del hongo filamentoso Trichoderma reesei poseen ciertas limitantes, como poca
actividad β-glucosidasa y un temperatura óptima de reacción de 50°C, lo cual aumenta el costo
energético del proceso. Además, Celluclast tiene un costo aproximado de $1,695.00 por 1.5 L de
solución acuosa con ≥ 700 U.g (cotización de Sigma Aldrich, 2015), lo que representa un alto costo
para la producción de etanol. La optimización de procesos de producción de celulasas es crucial
para la viabilidad de los sistemas de transformación de lignocelulosa a etanol. Este proyecto de
25
producción de celulasas a nivel de bioreactor; así como descubrir nuevas cepas productoras de este
tipo de enzimas con la realización de bioprospecciones.
La tercera etapa es la fermentación, aquí se utilizarán los azúcares simples generados en la etapa de
hidrólisis para ser transformados a etanol. Los azúcares pueden ser glucosa o una mezcla de hexosas
(e.g. glucosa, manosa) + pentosas (e.g. xilosa, arabinosa). En el primer caso, la glucosa es
fácilmente transformada a etanol utilizando Saccharomyces cereviceae o Zymomonas mobilis, así
como tecnologías convencionales. Cuando también se hidroliza la hemicelulosa y se enriquece la
mezcla de azúcares con pentosas, es necesario utilizar organismos (e.g. Pichia stipitis) que tengan la
maquinaria matabólica para transformar pentosas a etanol.
Una opción alternativa es realizar la etapa de hidrólisis (sacarificación) y la de fermentación de
manera simultánea, esto debido a que las celulasas inhiben su capacidad catalítica a altas
concentraciones de glucosa o celobiosa (inhibición por producto). Fermentar los azúcares liberados
por las enzimas de manera simultánea evita su acumulación, y con esto se evita la inhibición de las
celulasas.
Este proceso es conocido como – Fermentación-sacarificación simultánea (FSS) -, sin embargo,
diversos factores actúan como limitantes para que este proceso alcance altos rendimientos,
principalmente la diferencia de temperaturas entre las etapas de hidrólisis (50°C) y la de
fermentación (30°C). Por lo tanto, esta tesis (Capítulo 2.2) se enfocó en evaluar la producción de celulasas con una temperatura óptima de reacción cercana a los 30°C (derivado de los procesos de
bioprospección).
El Capítulo 3 del proyecto de tesis fue dedicado a la evaluación de la producción de etanol a partir de bagazo de caña de azúcar, pretratado con compuestos alcalinos (Ca(OH)2 y NaOH) y con
P. sanguineus, utilizando las mejores condiciones para la producción de lacasa, obtenidas en el
capítulo 1.
1.3. El bagazo de caña de azúcar como materia prima para la producción de
bioetanol
México es uno de los principales productores de azúcar de caña en el mundo, posee 54 ingenios, la
industria genera 450 000 empleos directos, de los cuales 164 000 están registrados como
productores; en 2012 la producción de caña de azúcar fue de 52 495 311 ton, de las cuales Veracruz
produjo el 37%, manteniendo el liderato nacional de producción de azúcar (SAGARPA, 2015).
El bagazo de caña de azúcar (Figura 7) representa entre el 25 y el 40% del total de la materia
26
25% de hemicelulosa y 25% de lignina (Pandey et al., 2000); lo que lo hace una biomasa muy
atractiva la la industria del etanol celulósico, así como de otras con enfoque de biorefinería.
El bagazo de caña de azúcar puede utilizarse como combustible directo en las calderas de los
ingenios azucareros, lo que disminuye o elimina su dependencia de combustibles fósiles, y en los
ingenios más tecnificados, se genera electricidad a partir de su combustión. A pesar de este uso,
existe un excedente de aproximadamente el 50% en la producción de bagazo de caña de azúcar
(Edwards, 1991), este excedente puede destinarse a la producción de bioetanol celulósico.
Diversas investigaciones se han enfocado en estudiar el procesamiento de esta biomasa para la
producción de etanol (Cardona et al., 2010), lo cuál lo ha convertido en una biomasa modelo, tanto
para la industria del bioetanol como para las biorefinerías. En México, dadas las condiciones
geográficas (tierras idóneas para el cultivo de caña), económicas (México es el sexto productor
mundial de este cultivo) e históricas (el cultivo de caña de azúcar es la agroindustria más antigua
del país), la investigación para el uso de subproductos, como lo es el bagazo de caña de azúcar,
hacia su transformación a productos de valor agregado está plenamente justificada.
Es por esto que este proyecto utiliza como materia prima bagazo de caña de azúcar para la
producción de etanol celulósico, teniendo como objetivo primario el desarrollo de un protocolo de
producción de etanol a partir de bagazo de caña de azúcar regional (Mahuixtlan, Veracruz), que
solo utilice métodos biotecnológicos, con el fin de disminuir costos de producción.
Figura 7. Bagazo de caña de azúcar del ingenio La Gloria, municipio de Úrsulo Galván, Veracruz. Este ingenio utiliza parte de su bagazo de caña de azúcar para quema directa en caldera, con lo que eliminó el uso de combustóleo.
Fotografía del periódico El Dictamen
27
2. Estado del arte
28
2.1 Métodos de pretratamiento para lignocelulosa
2.1.1 Pretratamientos fisicoquímicos
La lignocelulosa es una estructura estable y resistente a la hidrólisis, esto se debe principalmente al
entrecruzamiento entre polisacáridos (celulosa y hemicelulosa) con la lignina, mediante enlaces éster o
éter (Figura 8). Las fibras de celulosa y hemicelulosa son densamente cubiertas por capas de lignina, lo
que da protección contra hidrólisis enzimática (Verma et al., 2011).
Figura 8. Interacción entre cadenas de celulosa y componentes de lignina. Se observa los enlaces tipo éster y éter (Tomado de Zhou et al., 2010).
Como se mencionó anteriormente, el objetivo de un pretratamiento es aumentar la digestibilidad
enzimática de la lignocelulosa por medio de: i) disminuír la cantidad de lignina, ii) disminuír la cantidad
de celulosa cristalina y aumentar su estado amorfo y iii) disminuír la cantidad de hemicelulosa (cuando
no se requiere para los procesos de hidrólisis y fermentación). Existen diversos métodos fisicoquímicos,
los cuales al ser utilizados como pretratamiento aumentan el rendimiento de hidrólisis enzimática de la
lignocelulosa, entre ellos se encuentran tratamientos alcalinos, ácidos, explosión con vapor, explosión
con dióxido de azufre, explosión de fibras con amonio, uso de liquidos ionicos, entre otros (Behera et al.,
2014).
Generalmente, los tratamientos con agentes alcalinos y ácidos conllevan el uso de altas temperaturas
(~120°C) y presión (~15 lb), lo cual permite obtener altos rendimientos de deslignificación y/o remoción
de hemicelulosa en cortos periodos de tiempo (5 a 30 min). Entre los agentes alcalinos más utilizados
29
los resultados reportados para estos álcali se resumen en la Tabla 1. El efecto deslignificador de los
agentes alcalinos se atribuye a su capacidad para saponificar los enlaces ester contenidos entre la
celulosa y la hemicelulosa con la lignina (Figura 8) (Sun y Cheng, 2002). Asimismo, se sabe que los
álcali reaccionan con las fibras de celulosa, y pueden generar celulosa alcalina, mediante intercambio
iónico (Bahar et al., 2009). La reacción simplificada se muestra a continuación:
Cellulosa-OH + NaOH → Cellulosa-O-Na+ + H2O Esto puede afectar procesos subsecuentes como la hidrólisis o la fermentación.
Tabla 1. Efecto del uso de diferentes agentes alcalinos sobre la composición estructural del bagazo de caña de azúcar.
Agente químico Condiciones Resultado obtenido Referencia
NaOH 1 N 100 °C
12 L
Reducción de lignina
de 17.52 a 7.16%
Maryana et al. (2014)
NaOH 0.5 M 80 °C, 2 horas en
agitación
Reducción de lignina
de 25.03 a 8.26%
Liu et al. (2016)
KOH 2.5% 120 °C, 45 min Deslignificación del
70.7%
Irfan et al. (2011)
KOH 10% 121 °C, 35 min Deslignificación del
74%
Paixão et al. (2016)
Ca(OH)2 10% 120 °C, 60 min Deslignificación del 30%
Grimaldi et al. (2015)
NaOH 10 % +
Ca(OH)2 8% (w/w)
Temperatura
ambiente
156 h
Deslignificación
41.2%
Ahmadi et al. (2016)
Por otro lado, el uso de ácidos diluidos (concentración menor a 10%) contribuye a la remoción de la
hemicelulosa, lo cual es importante ya que las celulasas se inhiben en presencia de xilosa, xilano y
xilo-oligosacáridos (Negahdar et al., 2016). Los ácidos que mayormente han sido utilizados para hidrolizar
hemicelulosa son el ácido sulfúrico, el ácido clorhídrico, el ácido nítrico y el ácido fosfórico (Kumar et
al., 2015). Cuando la reacción ocurre a pH 2 o menor, únicamente importa la cantidad de protones (H+) liberados, y no la naturaleza del ácido empleado (Kim et al., 2013). Asimismo, las cadenas laterales de la
hemicelulosa tienden a hidrolizarse más rápidamente que el esqueleto de xilano, esto debido a que las
unidades de arabinogalactano y galactoglucomanano se encuentran más accesibles que el xilano, y a que
en ellas predominan enlaces tipo α; más fácilmente hidrolizables que los enlaces β del xilano (Negahdar
et al., 2014). Entre las desventajas de utilizar ácidos diluidos, se encuentra que al interactuar con la
xilosa liberada de la hemicelulosa pueden producir furfurales e hidroximetil-fufurales (Yemis y Mazza,
30
levaduras (Palmqvist et al., 1999). Los furfurales se producen cuando las pentosas (principalmente la
xilosa) se deshidratan por la acción de ácidos a un intermediario (xilosa 2,5-anhidro) y, posteriormente,
una segunda deshidratación produce furfural por la perdida de 3 moléculas de agua (Antal et al., 1991;
NimLos et al., 2006; Yang et al., 2012), (Figura 9).
Figura 9. Deshidratación de xilosa hasta furfural (tomado de Yang et al., 2012)
La formación de furfurales puede evitarse disminuyendo la temperatura de reacción a un máximo de 90
°C; sin embargo, esto aumenta el tiempo de reacción hasta por 24 h (Negahdar et al., 2014). Tanto
tratamientos ácidos como alcalinos requieren una posterior neutralización de su pH, para propiciar las
condiciones de hidrólisis y/o fermentación. Esto, aunado al gasto energético, hace que su uso más allá de
escalas piloto se considere inviable, hasta la fecha.
De manera similar, las reacciónes de explosión con vapor, o explosiones de vapor-amonio, a pesar de ser
métodos altamente efectivos para romper la estructura de la lignocelulosa, conllevan un alto gasto
energético. Estos métodos consisten en elevar la temperatura hasta 220 °C por un corto periodo de
tiempo y posteriormente disminuírla súbitamente a temperatura ambiente, con esto se generan
condiciones de explosión, al interior de la lignocelulosa, que remueven lignina y hemicelulosa (Sun y
Cheng, 2002). Los métodos de explosión aumentan significativamente el rendimiento de hidrólisis
enzimática; sin embargo, generan compuestos inhibidores de la fermentación, por lo que se requiere de
lavados subsecuentes para eliminar dichos compuestos, lo que a su vez provoca la pérdida de
monosacáridos liberados de la hemicelulosa y celulosa (McMillan, 1994), además de contaminación de
31
2.1.2 Pretratamientos biológicos
A diferencia de los pretratamientos fisicoquímicos, los pretratamientos biológicos involucran el uso de
organismos vivos (hongos, bacterias) o sus derivados (enzimas) para modificar la estructura de la
lignocelulosa y aumentar su digestibilidad enzimática. Entre las características deseables de un
pretratamiento biológico se encuentran: i) que contribuya a disminuír la cantidad de lignina, ii) que
utilice condiciones de bajo costo económico, iii) que evite la pérdida de carbohidratos del sustrato y, iv)
que utilice tiempos de retención cortos.
Generalmente, el decremento en la cantidad de lignina se logra gracias a la exposición del sustrato a
diversas enzimas del grupo de las oxidoreductasas, las cuales oxidan los anillos aromáticos de la lignina
provocando el rompimiento de sus enlaces (Figura 10). Entre estas enzimas se encuentran la lacasa, la
Mn-peroxidasa y la ligninasa (Sindhu et al., 2016). Estas enzimas, pueden ser producidas en grandes
cantidades tanto por bacterias como por hongos; sin embargo, se considera que el grupo de los hongos de
pudrición blanca (pertenecientes a los Basidiomicetos) son los organismos más eficientes para producir
estos complejos enzimáticos y degradar lignina (Saha et al., 2016).
Diversos estudios se han enfocado en lograr la sobreproducción de estas enzimas (principalmente lacasa)
para poder utilizarlas en procesos de deslignificación biológica. Producto de estas investigaciones, se
conoce que las lacasas responden a diferentes estimulos ambientales, generalmente estímulos químicos,
entre ellos podemos enlistar la presencia de compuestos fenólicos o aromáticos (Kuhar y Papinutti,
2014), metales pesados (Lorenzo et al., 2006), algunos alcoholes como etanol (Meza et al., 2005),
diferentes fuentes de carbono y de nitrógeno (Stajić et al., 2006). Generalmente, las lacasas se inducen
cuando fuentes complejas de estos nutrientes se encuentran disponibles (e.g. bagazo de caña de azúcar,
extracto de levadura) en lugar de fuente de fácil asimilación (e.g. glucosa, nitrato de amonio) (Karp et
al., 2015).
32
2.1.3 Las lacasas
La acción de la lacasa puede ser potencializada para que oxide compuestos no fenólicos mediante el uso
de mediadores, como el ABTS [2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)] (Figura 11). El
uso de mediadores fue utilizado inicialmente para el bio-blanqueado de la pulpa de madera; sin embargo,
actualmente su uso se está extendiendo para procesos de deslignificación para producción de bioetanol
(Madhavi y Lele, 2009).
Figura 11. Modelo de oxidación de compuestos no fenólicos de la lignina, utilizando un mediador (Tomado de Archibald et al., 1997)
Además de propiciar las condiciones idóneas para la producción de lacasas u otras enzimas relacionadas
a la depolimerización de la lignina, es necesario seleccionar adecuadamente la especie y cepa de hongo
que se utilizará para pretratar un sustrato lignocelulósico. Los hongos de los géneros Trametes (Pal et al.,
1995), Pleurotus (Asgher et al., 2013) y Pycnoporus (Eugenio et al., 2009), entre otros, han sido
reconocidos como buenos productores de lacasas, y han sido utilizados para deslignificar bagazo de caña
de azúcar (Tabla 2).
Tabla 2. Deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar utilizando hongos de pudrición blanca.
Hongo Tiempo de retención
(días)
Deslignificación (%)
Referencia
Trametes versicolor 40 27.39 Pal et al., 1995
Flamulina velutipes 40 29.13 Pal et al., 1995
Pleurotus ostreatus 48 horas directamente con enzimas
33.5 Asgher et al., 2013
Pleurotus ostreatus 84 85 Dong et al., 2013
Phanerochaete chrysosporium
84 93 Dong et al., 2013
33
Pycnoporus sanguineus 14 días para alcanzar la máxima producción de
lacasa en bagazo de caña
de azúcar
ND* Meza et al., 2005
* ND. No determinada
Como se observa en la Tabla 2, los tiempos de retención son sustancialmente mayores a los utilizados en
pretratamientos fisicoquímicos, por lo tanto, se requiere mayor investigación para lograr obtener altos
índices de deslignificación en el menor tiempo posible. Para esto, se deben optimizar las condiciones de
cultivo de acuerdo a la cepa que se desee emplear, manipulando las variables fisicoqúimicas que más
afecten la producción de lacasa u otras enzimas oxidoreductasas (e.g. fuente y concentración de
nitrógeno, temperatura, presencia de inductores, grado de exposición a luz, etc.).
El presente proyecto de tesis evalúa la deslignificación biológica de bagazo de caña de azúcar utilizando
al hongo Pycnoporus sanguineus, esto con base en reportes (Meza et al., 2005) que lo señalan como un
potencial productor de lacasas y a que podría ser utilizado para deslignificar selectivamente sustratos
lignocelulósicos.
2.2 Las celulasas
Las celulasas son un grupo de enzimas hidrolíticas capaces de degradar la celulosa hasta sus monómeros
de glucosa. Estas enzimas generalmente se clasifican de acuerdo a la actividad que presentan dentro de la
cadena de celulosa: las endoglucanasas cortan aleatoriamente en las regiones de celulosa amorfa
generando oligosacáridos (cadenas cortas de celulosa); las exoglucanasas actúan en las cadenas
terminales de las cadenas de celulosa (incluso en estado cristalino) y liberan celobiosa; por último, las
β-glucosidasas cortan la celobiosa y liberan dos moléculas de glucosa. La sinergia entre estas actividades
determina la eficiencia de hidrólisis de la celulosa (Igarashi, 2013); sin embargo, se conoce poco sobre la
34
Figura 12. Modo de acción de celulasas de Trichoderma reesei. a) las enzimas (Cel6A y Cel7A) se unen en lados opuestos a las cadenas de celulosa cristalina. b) Mediante microscopía de fotolocalización fotoactivada se puede obtener un valor de
fluorescencia (Ω) ligado a la preferencia de áreas de hidrólisis de la cadena de celulosa, un valor alto de Ω corresponde a
afinidad por celulosa cristalina, un valor bajo a afinidad por celulosa amorfa (Tomado de Igarashi, 2013).
Actualmente estas enzimas son utilizadas en diversas industrias, como la textil, la de detergentes, la
papelera y en la alimenticia, y se estima que su valor supera los 2 billones de dólares anuales en ventas
(Bhat, 2000). Además, las celulasas son enzimas clave en el proceso de producción de etanol celulósico,
pues son las responsables de liberar la glucosa de la lignocelulosa pretratada; por esto, su producción y
propiedades han sido el centro de atención de diversas investigaciones pues se les considera un cuello de
botella para el escalamiento de la producción de este biocombustible (Garvey et al., 2013).
Las celulasas de Trichoderma reesei poseen un pH óptimo de reacción ligeramente ácido (~ 4.8; Ghose,
1987) y tienden a inhibirse por producto, generalmente por celobiosa (Zhou et al., 2008), lo que indica la
importancia de la β-glucosidasa en los cocteles celulolíticos. Asimismo, algunos iones metálicos pueden
inhibir o inducir la actividad de las celulasas; por ejemplo, iones metálicos divalentes tiene efectos
positivos o negativos en la capacidad catalítica de las celulasas. El Ca2+ y el Mn2+ aumentan la capacidad catalítica de las celulasas, aunque en altas concentraciones el Ca2+ puede tener efectos inhibitorios; por su parte el Cd2+ inhibe parcialmente, al igual que el Fe3+ y el Cu2+ (Wang et al., 2013), mientras que el Pb2+ tiene efectos inhibitorios irreversibles (Zhai et al., 2015).
2.2.1 Organismos productores de celulasas
Las celulasas son producidas por diversos grupos de organismos, principalmente por bacterias
simbiontes de rumiantes (Bao et al., 2011) y habitantes del suelo, como Pseudomonas y Bacillus (Sethi
et al., 2013). Entre los generos bacterianos más interesantes para la producción de celulasas se encuentra
Clostridium, este genero produce celulasas sobre la superficie de su pared celular (celulosomas) y
degrada de manera muy eficiente la celulosa, e incluso puede contener enzimas que contribuyen a la
35
que puede ser utilizado en los procesos de transformación de lignocelulosa a etanol y butanol (Pfromm et
al., 2010).
A pesar del gran potencial de los grupos bacterianos para la producción de celulasas, son los hongos
filamentosos (Ascomycota) quienes dominan la producción industrial de celulasas. Esto debido a que
son organismos resistentes y con gran plasticidad para crecer en diferentes sustratos y adaptarse a
diversas condiciones ambientales. Entre los generos más utilizados para producir celulasas, se
encuentran Trichoderma (Callow et al., 2016) y Aspergillus (Bansal et al., 2012), pero otros generos
como Penicillium (dos Reis et al., 2013) y Fusarium (Yuan et al., 2012) también son considerados
buenos productores de celulasas.
Para que un hongo sea candidato para producir celulasas que puedan ser utilizadas a nivel industrial,
debe cumplir ciertas características, tanto fisiológicas (plasticidad, rápido crecimiento, alta producción
enzimática) como enzimáticas (enzimas con alta capacidad catalítica, resistentes a la desnaturalización).
Generalmente, las enzimas producidas por una sola especie de hongo, poseen ciertas carencias en alguno
de los requerimientos mencionados. Por ejemplo, las enzimas producidas por el género Trichoderma,
tienden a ser deficientes en actividad β-glucosidasa (Treebupachatsakul et al., 2016); además, poseen
una temperatura óptima de reacción de 50° C, lo cual tiende a ser una limitante en procesos de
fermentación-sacarificación simultánea (Ballesteros et al., 2004). A pesar de estas limitantes,
Trichoderma es el hongo más utilizado para la producción de celulasas, gracias a su gran producción
enzimática, su resistencia y plasticidad, y a su excelente producción de exoglucanasas (Esterbauer et al.,
1991).
Para suplir las deficiencias de las celulasas de Trichoderma, se han generado estrategias para aumentar el
rendimiento de hidrólisis de lignocelulosa; como: i) suplementar las enzimas de Trichoderma con
β-glucosidasas de Aspergillus (Fortes et al., 2010), ii) modificar genéticamente cepas de Trichoderma
(Chandra et al., 2009), iii) producir celulasas mediante consorcios de hongos. Generalmente, el binomio
Trichoderma-Aspergillus es el más utilizado para producir cocteles celulolíticos para la hidrólisis de
lignocelulosa (Ahamed y Vermette, 2008); sin embargo, existe una gran variedad de combinaciones
posibles que pueden ser evaluadas para producir una mezcla de celulasas con características deseadas.
Además de los organismos conocidos, existe una amplia diversidad de biota celulolítica con potencial
para ser utilizada como fuente de enzimas para la industria del bioetanol. Los estudios de
bioprospecciones contribuyen a conocer la diversidad de organismos y enzimas de interés industrial, sin
embargo, pocos estudios de este tipo se han realizado para descubrir nuevas fuentes de celulasas (Tabla
36
Tabla 3. Estudios de bioprospección de organismos celulolíticos
Área muestreada Organismo aislado Características de las celulasas Referencia
Océano Atlántico sur, mar
profundo
Bacillis stratosphericus,
Bacillus aerophilus,
Bacillus pumilus
Celulasas con temperaturas
óptimas de reacción mesófilas
(28 °C)
Odisi et al., 2012
Distintas áreas geográficas
de India
Bacillus simplex, Arthrobactercitreus, Bacillus subtilis, Bacillus
endophyticus, Bacillus amylololiquefaciens, Bacillus megaterium
Celulasas con temperaturas
óptimas de reacción psicrofilas,
mesófilas y termófilas
Venkatachalam et al.,
2014
Odisha, India Bacterias halófilas Celulasas con potencial para ser
utilizadas en hidrólisis de
biomasa algal
Indira et al., 2014
Bosque tropical, Perú Aspergillus sp, Penicillium
sp
Celulasas alcalinas Vega et al., 2012
India Aspergillus terreus Sin características sobresalientes Saritha et al., 2015
2.2.2 Métodos de producción de celulasas
Las celulasas fúngicas pueden ser producidas por diversos métodos, los cuales se clasifican
generalmente en dos grandes grupos: fermentación sumergida y fermentación en estado sólido. La
primera se refiere, a aquellos cultivos en los cuales el hongo productor se encuentra totalmente inmerso
en el medio de cultivo, el cual es líquido. Este tipo de cultivos suelen llevarse a cabo en biorreactores, en
condiciones controladas. Entre los parámetros que se pueden controlar en la fermentación sumergida, se
encuentran el pH, la oxigenación, temperatura, agitación, cantidad de nutrientes (uso de medios
definidos), concentración de inductores (e.g. lactosa) y luminosidad; además, se facilita la recuperación
de las enzimas producidas. La desventaja que tiene el uso de este tipo de cultivos, es el grado de
tecnificación que se requiere, sobre todo cuando se desea una producción industrial, además dadas las
condiciones benéficas para el desarrollo de microorganismos, el riesgo de contaminación suele ser alto.
Por otro lado, la fermentación en estado sólido, asemeja las condiciones naturales en las cuales se
desarrollan la mayoría de los hongos filamentosos; i.e. humedad alta, ventilación, crecimiento directo
sobre sustrato. Este tipo de cultivos propician el desarrollo de los hongos sobre el de las bacterias,
requieren un nivel de tecnificación bajo y permite el uso de diversos residuos agroindustriales como
sustratos para la producción de celulasas (Subramaniyam y Vimala, 2012). No obstante, también posee
desventajas, entre las que se encuentran una menor interacción entre hongo-inductor (cuando se utiliza) y
37
El método de producción enzimática debe ser cuidadosamente seleccionado, puesto que se conoce que
un mismo hongo (e.g. Aspergillus niger) puede variar su metabolismo dependiendo del tipo de cultivo
que se utilice (Maghsoodi y Yaghmaei, 2010). Aunque, independientemente del método a utilizar,
existen ciertas variables reconocidas que afectan la producción de celulasas.
Las celulasas son generalmente, enzimas controladas por la represión catabólica del carbono. De esta
manera, se acepta que cuando existen carbohidratos simples abundantemente, como la glucosa y la
celobiosa, en el medio de cultivo, la producción de las celulasas es reprimida (Aro et al., 2005). Esta
regulación tipo operón se ha localizado en diversos hongos filamentosos, los cuales producen de manera
constitutiva pequeñas cantidades de celulasas, las cuales liberan pequeñas cantidades de glúcidos de la
celulosa, mismos que activan la transcripción de celulasas. Empero, cuando la cantidad de glucosa se
encuentra en altas concentraciones la transcripción se inhibe mediante la acción de proteínas Cre (Aro et
al., 2005). Todo esto ocurre gracias a la presencia de receptores en la membrana celular de las hifas
(Figura 13).
Entre los disacáridos conocidos que más inducen la producción de celulasas se encuentran la soforosa y
la lactosa (Sternberg y Mandels, 1980; Lo et al., 2010), así como algunos derivados de la hemicelulosa.
Estos azúcares han sido utilizados ampliamente como inductores de celulasas, principalmente en
fermentación sumergida.
Figura 13. Representación de los diferentes factores que regulan la expresión de celulasas y xilanasas. CRE es el represor catabólico del carbono, PacC el regulador asociado a pH, AreA es el regulador ligado a las condiciones de nitrógeno del
38
El pH es otro importante factor que afecta la producción de celulasas, generalmente estas enzimas se
producen a pH ligeramente ácido; en cambio, pequeñas variaciones en el pH pueden afectar el tipo de
celulasa que se produce. En este sentido, se ha reportado que el pH óptimo para producir β-glucosidasas
con T. reesei es 6, mientras que esta misma especie puede producir altas concentraciones de
endoglucanasa y exoglucanasa en pH de 4 a 6 (Prasetyo et al., 2010). El efecto del pH puede ser
especie-específico o cepa-especie-específico, puesto que Hendy et al., (1984) reportan que producir celulasas con T.
reesei a un pH mayor de 5 resulta en una pérdida de rendimiento. Se ha sugerido que cada componente
del complejo celulolítico de T. reesei posee un pH óptimo para ser producido, y que la sincronización de
los cambios en el pH del medio de cultivo con la fase de crecimiento del hongo puede aumentar los
rendimientos de producción enzimáticos (Li et al., 2013).
La fuente de nitrógeno per se no afecta la producción de celulasas, pero si puede alterar el pH
(Rodriguez-Gomez y Hobley, 2013); lo cual, como ya se enunció, tiene fuertes efectos en la producción
enzimática.
Cuando se utiliza fermentación en estado sólido para la producción de celulasas, el sustrato puede ser
pretratado para aumentar su colonización por parte de las hifas, y evitar los efectos negativos de la
lignina. Si bien, como se mencionó anteriormente, posterior a un pretratamiento químico, el pH debe ser
regulado para permitir la producción de celulasas (Li et al., 2013); y dependiendo el tipo de agente
químico utilizado, serán las características del sustrato obtenido. Se recomienda no utilizar ácido diluído
para remover la hemicelulosa, puesto que los derivados del xilano son potentes inductores de celulasas
(Sørensen et al., 2014); además, el uso de NaOH puede producir sustancias inhibitorias que disminuyen
el rendimiento de producción de celulasas (Xin y Geng, 2010).
Pretratamientos que aumenten el índice de cristalinidad de la celulasa, como el uso de NaOH, pueden
afectar la producción de celulasas, porque esto limita el acceso de las celulasas a la celulosa (Ojumu et
al., 2003). Asímismo, el tipo de álcali utilizado para pretratar la lignocelulosa puede ser determinante no
solo desde el punto de vista estructural, si no por el tipo de celulosa alcalina resultante (Bahar et al.,
2009). Por ejemplo, mientras que el NaOH puede provocar sustancias inhibitorias, el Ca(OH)2 podría resultar benéfico puesto que el Ca2+ puede actuar como cofactor e inductor de endoglucanasas (Van Lieshout etal., 2012; Eckert et al., 2002).
2.3 La hidrólisis y la fermentación
2.3.1 La hidrólisis enzimática
La hidrólisis enzimática de la lignocelulosa es el proceso por el cual se liberan los azúcares contenidos
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hidrólisis enzimática se encuentran su potencial alto rendimiento, su alta especificidad, su bajo
requerimiento energético, y que no se requieren contenedores especiales como en el caso de la hidrólisis
química (Yang et al., 2011). Existen dos enfoques para realizar este proceso: i) un enfoque donde una
mezcla de celulasas y xilanasas se agregan para hidrolizar conjuntamente celulosa y xilano, y ii) donde
únicamente se agregan celulasas, pues se pretende obtener únicamente glucosa como producto de
hidrólisis.
La mezcla de enzimas que se utilizarán para el proceso de hidrólisis depende tanto de la naturaleza del
sustrato (contenido de celulosa, accesibilidad, grado de polimerización, grado de cristalinidad, contenido
de hemicelulosa) (Yang et al., 2011), como del producto que se desea obtener. Cuando se utiliza una
mezcla de celulasas y xilanasas, el producto obtenido será una mezcla de azúcares, tanto pentosas
(D-xilosa y L-arabinosa) como hexosas (D-glucosa, D-manosa y D-galactosa) (Cuervo et al., 2009). Esto es
muy importante ya que, dependiendo la concentración y el tipo de azúcares obtenidos, se elegirá una
estrategia de fermentación.
La hidrólisis de material lignocelulósico pretratado, suele llevarse a cabo en un biorreactor con
condiciones controladas. Las variables más importantes de este proceso son: la temperatura de hidrólisis,
la carga de sustrato, la cantidad de enzima (FPU, U.ml-1 o U.g-1 de sustrato), las características de la enzima (e.g. actividad endo, exo y β-glucosidasa), el pH (tipo de buffer utilizado), tiempo de residencia
y la agitación (Tabla 4).
Tabla 4. Condiciones de hidrolisis de bagazo de caña de azúcar
Temperatura Carga de sustrato
Cantidad de enzima
Tipo de enzima pH Tiempo de residencia
(h)
Agitación Referencia
50° C - 10 FPU.g-1
cellulosa
Mezcla Cellubrix 4.8 - Si Ahi et al., 2000
50° C De 8 a 12 % 20 FPU.g-1 biomasa
Mezcal de enzimas de Chrysoporthe cubensis y
Penicillium pinophilum.
5 96 220 rpm Visser et al., 2015
40 °C - - Enzimas de T. reesei,
mezcla CL de AB Enzymes Company
4.5 45 No Pietrobon et
al., 2011
50° C 1 g de biomasa en
25 ml de buffer
40 U de endoglucanasa y exoglucanasa, y 20 U de β-glucosidasa por g de biomasa
Enzimas de Aspergillus niger