Las celulasas

Las celulasas son un grupo de enzimas hidrolíticas capaces de degradar la celulosa hasta sus monómeros de glucosa. Estas enzimas generalmente se clasifican de acuerdo a la actividad que presentan dentro de la cadena de celulosa: las endoglucanasas cortan aleatoriamente en las regiones de celulosa amorfa generando oligosacáridos (cadenas cortas de celulosa); las exoglucanasas actúan en las cadenas terminales de las cadenas de celulosa (incluso en estado cristalino) y liberan celobiosa; por último, las β- glucosidasas cortan la celobiosa y liberan dos moléculas de glucosa. La sinergia entre estas actividades determina la eficiencia de hidrólisis de la celulosa (Igarashi, 2013); sin embargo, se conoce poco sobre la manera en la que interactúan entre ellas, aunque se han propuesto algunos modelos (Figura 12).

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Figura 12. Modo de acción de celulasas de Trichoderma reesei. a) las enzimas (Cel6A y Cel7A) se unen en lados opuestos a las cadenas de celulosa cristalina. b) Mediante microscopía de fotolocalización fotoactivada se puede obtener un valor de fluorescencia (Ω) ligado a la preferencia de áreas de hidrólisis de la cadena de celulosa, un valor alto de Ω corresponde a afinidad por celulosa cristalina, un valor bajo a afinidad por celulosa amorfa (Tomado de Igarashi, 2013).

Actualmente estas enzimas son utilizadas en diversas industrias, como la textil, la de detergentes, la papelera y en la alimenticia, y se estima que su valor supera los 2 billones de dólares anuales en ventas (Bhat, 2000). Además, las celulasas son enzimas clave en el proceso de producción de etanol celulósico, pues son las responsables de liberar la glucosa de la lignocelulosa pretratada; por esto, su producción y propiedades han sido el centro de atención de diversas investigaciones pues se les considera un cuello de botella para el escalamiento de la producción de este biocombustible (Garvey et al., 2013).

Las celulasas de Trichoderma reesei poseen un pH óptimo de reacción ligeramente ácido (~ 4.8; Ghose, 1987) y tienden a inhibirse por producto, generalmente por celobiosa (Zhou et al., 2008), lo que indica la importancia de la β-glucosidasa en los cocteles celulolíticos. Asimismo, algunos iones metálicos pueden inhibir o inducir la actividad de las celulasas; por ejemplo, iones metálicos divalentes tiene efectos positivos o negativos en la capacidad catalítica de las celulasas. El Ca2+ y el Mn2+ aumentan la capacidad catalítica de las celulasas, aunque en altas concentraciones el Ca2+ puede tener efectos inhibitorios; por su parte el Cd2+ inhibe parcialmente, al igual que el Fe3+ y el Cu2+ (Wang et al., 2013), mientras que el Pb2+ tiene efectos inhibitorios irreversibles (Zhai et al., 2015).

2.2.1 Organismos productores de celulasas

Las celulasas son producidas por diversos grupos de organismos, principalmente por bacterias simbiontes de rumiantes (Bao et al., 2011) y habitantes del suelo, como Pseudomonas y Bacillus (Sethi et al., 2013). Entre los generos bacterianos más interesantes para la producción de celulasas se encuentra

Clostridium, este genero produce celulasas sobre la superficie de su pared celular (celulosomas) y degrada de manera muy eficiente la celulosa, e incluso puede contener enzimas que contribuyen a la hidrólisis de la hemicelulosa (Thomas et al., 2014). Clostridium ha sido propuesto como un organismo

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que puede ser utilizado en los procesos de transformación de lignocelulosa a etanol y butanol (Pfromm et al., 2010).

A pesar del gran potencial de los grupos bacterianos para la producción de celulasas, son los hongos filamentosos (Ascomycota) quienes dominan la producción industrial de celulasas. Esto debido a que son organismos resistentes y con gran plasticidad para crecer en diferentes sustratos y adaptarse a diversas condiciones ambientales. Entre los generos más utilizados para producir celulasas, se encuentran Trichoderma (Callow et al., 2016) y Aspergillus (Bansal et al., 2012), pero otros generos como Penicillium (dos Reis et al., 2013) y Fusarium (Yuan et al., 2012) también son considerados buenos productores de celulasas.

Para que un hongo sea candidato para producir celulasas que puedan ser utilizadas a nivel industrial, debe cumplir ciertas características, tanto fisiológicas (plasticidad, rápido crecimiento, alta producción enzimática) como enzimáticas (enzimas con alta capacidad catalítica, resistentes a la desnaturalización). Generalmente, las enzimas producidas por una sola especie de hongo, poseen ciertas carencias en alguno de los requerimientos mencionados. Por ejemplo, las enzimas producidas por el género Trichoderma, tienden a ser deficientes en actividad β-glucosidasa (Treebupachatsakul et al., 2016); además, poseen una temperatura óptima de reacción de 50° C, lo cual tiende a ser una limitante en procesos de fermentación-sacarificación simultánea (Ballesteros et al., 2004). A pesar de estas limitantes,

Trichoderma es el hongo más utilizado para la producción de celulasas, gracias a su gran producción enzimática, su resistencia y plasticidad, y a su excelente producción de exoglucanasas (Esterbauer et al., 1991).

Para suplir las deficiencias de las celulasas de Trichoderma, se han generado estrategias para aumentar el rendimiento de hidrólisis de lignocelulosa; como: i) suplementar las enzimas de Trichoderma con β- glucosidasas de Aspergillus (Fortes et al., 2010), ii) modificar genéticamente cepas de Trichoderma

(Chandra et al., 2009), iii) producir celulasas mediante consorcios de hongos. Generalmente, el binomio

Trichoderma-Aspergillus es el más utilizado para producir cocteles celulolíticos para la hidrólisis de lignocelulosa (Ahamed y Vermette, 2008); sin embargo, existe una gran variedad de combinaciones posibles que pueden ser evaluadas para producir una mezcla de celulasas con características deseadas. Además de los organismos conocidos, existe una amplia diversidad de biota celulolítica con potencial para ser utilizada como fuente de enzimas para la industria del bioetanol. Los estudios de bioprospecciones contribuyen a conocer la diversidad de organismos y enzimas de interés industrial, sin embargo, pocos estudios de este tipo se han realizado para descubrir nuevas fuentes de celulasas (Tabla 3).

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Tabla 3. Estudios de bioprospección de organismos celulolíticos

Área muestreada Organismo aislado Características de las celulasas Referencia

Océano Atlántico sur, mar profundo

Bacillis stratosphericus,

Bacillus aerophilus,

Bacillus pumilus

Celulasas con temperaturas óptimas de reacción mesófilas

(28 °C)

Odisi et al., 2012

Distintas áreas geográficas de India

Bacillus simplex, Arthrobactercitreus, Bacillus subtilis, Bacillus

endophyticus, Bacillus amylololiquefaciens, Bacillus megaterium

Celulasas con temperaturas óptimas de reacción psicrofilas,

mesófilas y termófilas

Venkatachalam et al., 2014

Odisha, India Bacterias halófilas Celulasas con potencial para ser utilizadas en hidrólisis de

biomasa algal

Indira et al., 2014

Bosque tropical, Perú Aspergillus sp, Penicillium

sp

Celulasas alcalinas Vega et al., 2012

India Aspergillus terreus Sin características sobresalientes Saritha et al., 2015

2.2.2 Métodos de producción de celulasas

Las celulasas fúngicas pueden ser producidas por diversos métodos, los cuales se clasifican generalmente en dos grandes grupos: fermentación sumergida y fermentación en estado sólido. La primera se refiere, a aquellos cultivos en los cuales el hongo productor se encuentra totalmente inmerso en el medio de cultivo, el cual es líquido. Este tipo de cultivos suelen llevarse a cabo en biorreactores, en condiciones controladas. Entre los parámetros que se pueden controlar en la fermentación sumergida, se encuentran el pH, la oxigenación, temperatura, agitación, cantidad de nutrientes (uso de medios definidos), concentración de inductores (e.g. lactosa) y luminosidad; además, se facilita la recuperación de las enzimas producidas. La desventaja que tiene el uso de este tipo de cultivos, es el grado de tecnificación que se requiere, sobre todo cuando se desea una producción industrial, además dadas las condiciones benéficas para el desarrollo de microorganismos, el riesgo de contaminación suele ser alto. Por otro lado, la fermentación en estado sólido, asemeja las condiciones naturales en las cuales se desarrollan la mayoría de los hongos filamentosos; i.e. humedad alta, ventilación, crecimiento directo sobre sustrato. Este tipo de cultivos propician el desarrollo de los hongos sobre el de las bacterias, requieren un nivel de tecnificación bajo y permite el uso de diversos residuos agroindustriales como sustratos para la producción de celulasas (Subramaniyam y Vimala, 2012). No obstante, también posee desventajas, entre las que se encuentran una menor interacción entre hongo-inductor (cuando se utiliza) y una recuperación enzimática más costosa.

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El método de producción enzimática debe ser cuidadosamente seleccionado, puesto que se conoce que un mismo hongo (e.g. Aspergillus niger) puede variar su metabolismo dependiendo del tipo de cultivo que se utilice (Maghsoodi y Yaghmaei, 2010). Aunque, independientemente del método a utilizar, existen ciertas variables reconocidas que afectan la producción de celulasas.

Las celulasas son generalmente, enzimas controladas por la represión catabólica del carbono. De esta manera, se acepta que cuando existen carbohidratos simples abundantemente, como la glucosa y la celobiosa, en el medio de cultivo, la producción de las celulasas es reprimida (Aro et al., 2005). Esta regulación tipo operón se ha localizado en diversos hongos filamentosos, los cuales producen de manera constitutiva pequeñas cantidades de celulasas, las cuales liberan pequeñas cantidades de glúcidos de la celulosa, mismos que activan la transcripción de celulasas. Empero, cuando la cantidad de glucosa se encuentra en altas concentraciones la transcripción se inhibe mediante la acción de proteínas Cre (Aro et al., 2005). Todo esto ocurre gracias a la presencia de receptores en la membrana celular de las hifas (Figura 13).

Entre los disacáridos conocidos que más inducen la producción de celulasas se encuentran la soforosa y la lactosa (Sternberg y Mandels, 1980; Lo et al., 2010), así como algunos derivados de la hemicelulosa. Estos azúcares han sido utilizados ampliamente como inductores de celulasas, principalmente en fermentación sumergida.

Figura 13. Representación de los diferentes factores que regulan la expresión de celulasas y xilanasas. CRE es el represor catabólico del carbono, PacC el regulador asociado a pH, AreA es el regulador ligado a las condiciones de nitrógeno del medio. Tomado de Aro et al. (2005).

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El pH es otro importante factor que afecta la producción de celulasas, generalmente estas enzimas se producen a pH ligeramente ácido; en cambio, pequeñas variaciones en el pH pueden afectar el tipo de celulasa que se produce. En este sentido, se ha reportado que el pH óptimo para producir β-glucosidasas con T. reesei es 6, mientras que esta misma especie puede producir altas concentraciones de endoglucanasa y exoglucanasa en pH de 4 a 6 (Prasetyo et al., 2010). El efecto del pH puede ser especie- específico o cepa-específico, puesto que Hendy et al., (1984) reportan que producir celulasas con T. reesei a un pH mayor de 5 resulta en una pérdida de rendimiento. Se ha sugerido que cada componente del complejo celulolítico de T. reesei posee un pH óptimo para ser producido, y que la sincronización de los cambios en el pH del medio de cultivo con la fase de crecimiento del hongo puede aumentar los rendimientos de producción enzimáticos (Li et al., 2013).

La fuente de nitrógeno per se no afecta la producción de celulasas, pero si puede alterar el pH (Rodriguez-Gomez y Hobley, 2013); lo cual, como ya se enunció, tiene fuertes efectos en la producción enzimática.

Cuando se utiliza fermentación en estado sólido para la producción de celulasas, el sustrato puede ser pretratado para aumentar su colonización por parte de las hifas, y evitar los efectos negativos de la lignina. Si bien, como se mencionó anteriormente, posterior a un pretratamiento químico, el pH debe ser regulado para permitir la producción de celulasas (Li et al., 2013); y dependiendo el tipo de agente químico utilizado, serán las características del sustrato obtenido. Se recomienda no utilizar ácido diluído para remover la hemicelulosa, puesto que los derivados del xilano son potentes inductores de celulasas (Sørensen et al., 2014); además, el uso de NaOH puede producir sustancias inhibitorias que disminuyen el rendimiento de producción de celulasas (Xin y Geng, 2010).

Pretratamientos que aumenten el índice de cristalinidad de la celulasa, como el uso de NaOH, pueden afectar la producción de celulasas, porque esto limita el acceso de las celulasas a la celulosa (Ojumu et al., 2003). Asímismo, el tipo de álcali utilizado para pretratar la lignocelulosa puede ser determinante no solo desde el punto de vista estructural, si no por el tipo de celulosa alcalina resultante (Bahar et al., 2009). Por ejemplo, mientras que el NaOH puede provocar sustancias inhibitorias, el Ca(OH)2 podría resultar benéfico puesto que el Ca2+ puede actuar como cofactor e inductor de endoglucanasas (Van Lieshout etal., 2012; Eckert et al., 2002).