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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Influencia del medio de cultivo en la Propagación In Vitro de Espécies de Peperomia de las Regiones
de Lambayeque y Cajamarca
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:
DOCTORA EN CIENCIAS AMBIENTALES
Autora: Ms. Rojas Idrogo, Consuelo
Asesor: Dr. López Medina, Segundo Eloy
Trujillo – Perú
2021
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MIEMBROS DE JURADO
………..
Dr. Heber Max Robles Castillo Presidente
……….
Dr. José Mostacero León Secretario
………..
Dr. Segundo Eloy López Medina Asesor
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DEDICATORIA
.
. A Jesús y Dios su padre,
inseparables amigos en cada momento de mi vida
A mi amado hijo Paulo Roberto, mi fuerza y por privarle tantas horas mi presencia
A mis adorados padres Segundo y Celia, a mis amados abuelos Manuel y Gregoria, quienes forjaron en mi los valores de honestidad, respeto, responsabilidad, amor a la familia y al trabajo.
A mis queridos hermanos, Fernando, Yolanda, Vilma, Olga e Icela, por su amor y apoyo constante
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AGRADECIMIENTO
A mi asesor, Dr. Segundo Eloy López Medina, mi sincero agradecimiento por la orientación y monitoreo permanente en el desarrollo de la tesis.
Al Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales y Recursos Genéticos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, por las facilidades prestadas para el desarrollo del presente trabajo.
Al Laboratorio General de Biotecnología de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, por las facilidades prestadas para culminar el presente trabajo.
Al Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, por las facilidades prestadas para la colecta de material botánico.
A mis ex alumnos del área de Botánica, quienes me acompañaron y ayudaron en todas las colectas de campo.
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INDICE
DEDICATORIA ... iii
AGRADECIMIENTO ... iv
INDICE ... v
RESUMEN ... vi
ABSTRACT ... vii
I.INTRODUCCIÓN ... 1
II.MATERIAL Y METODOS ... 6
2.1. Objeto de estudio ... 6
2.2. Instrumentación ... 7
2.3. Metodología y Técnicas ... 7
2.3.1. Cultivo in vitro ... 7
2.4. Diseño experimental ... 8
III. RESULTADOS ... 11
IV. DISCUSIÓN ... 26
V. CONCLUSIONES ... 33
VI. RECOMENDACIONES ... 34
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 35
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RESUMEN
Las técnicas desarrolladas por la biotecnología vegetal, entre las que figuran el cultivo de tejidos vegetales in vitro, constituye una herramienta fundamental que ha servido para resolver múltiples problemas en la agricultura, desde la erradicación de enfermedades sistémicas mediante el cultivo de meristemas, hasta la obtención de plantas a partir de células genéticamente modificadas. Entre ellas, la más accesible y de menos costo está la micropropagación, aplicable a un amplio rango de especies incluyendo las de importancia medicinal. En este contexto, las especies de Peperomia integrantes de la flora de la región Lambayeque y Cajamarca, por el potencial fitoquímico y farmacológico que guardan, además del impacto ambiental que están sufriendo sus habitas, en la presente investigación se trazó como objetivo; determinar la influencia del medio de cultivo en la propagación in vitro de especies de Peperomia de dos regiones que comparten ecosistemas. Fueron utilizadas 18 especies de Peperomia, se presentó un alto grado de contaminación sobre todo en especies epífitas, la oxidación fue insuperable en especies de ambientes estacionalmente secos. Ocho especies; P.albovittata, P. peltigera, P. trinervis, P. resediflora, P. rotundata, P. obtusifolia, P. galioides y P.tenella respondieron positivamente al medio que incluyó sales MS y los reguladores de crecimiento ANA, AIA (0.02, 0.05, 0.1 y 0.5 mg/L) y AG3
(0.02mg/L). Únicamente P. trinervis respondió a todas las formulaciones incluyendo combinaciones con citocininas BAP y KIN (0.02 mg/L). Si bien el número de brotes fue relativamente bajo entre 1 a 4 en promedio, fue suficiente para concluir que en el medio de cultivo constituido por las sales MS suplementados con AIA (0,002 mg/L) y AG3 (0.02 mg/L) fue el medio ideal para la propagación in vitro de todas las especies de Peperomia, permaneciendo incluso por un período de 12 meses a más, augurando posibilidades de su conservación in vitro.
Palabras clave: Peperomia propagación in vitro
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ABSTRACT
The techniques developed by plant biotechnology, including in vitro plant tissue culture, constitute a fundamental tool that has served to solve multiple problems in agriculture, from the eradication of systemic diseases through the cultivation of meristems, to obtaining of plants from genetically modified cells. Among them, the most accessible and least expensive is micropropagation, applicable to a wide range of species including those of medicinal importance. In this context, the Peperomia species that are members of the flora of the Lambayeque and Cajamarca region, due to their phytochemical and pharmacological potential and environmental impact suffered by their habitats, in the present investigacion the objective was to determine the influence of the culture medium on the in vitro propagation of Peperomia species from two regions that share ecosystems. Eighteen species of Peperomia were used, a high degree of contamination was presented, especially in epiphytic species, oxidation was insurmountable in species from seasonally dry environments. Eight species; P.albovittata, P. peltigera, P. trinervis, P. resediflora, P.
rotundata, P. obtusifolia, P. galioides and P.tenella responded positively to the medium that included MS salts and the growth regulators ANA, AIA (0.02, 0.05, 0.1 and 0.5 mg / L) and AG3 (0.02mg / L). Only P. trinervis responded to all formulations including combinations with BAP and KIN cytokinins (0.02 mg / L). Although the number of shoots was relatively low between 1 to 4 on average, it was enough to conclude that in the culture medium constituted by the MS salts supplemented with IAA (0.002 mg / L) and AG3 (0.02 mg / L) it was the Ideal medium for the in vitro propagation of all Peperomia species, remaining for a period of 12 months or more, auguring possibilities of in vitro conservation.
Keywords: Peperomia in vitro propagation
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I. INTRODUCCIÓN
La biotecnología vegetal desde sus inicios ha venido desarrollando una serie de técnicas aplicables a la manipulación de tejidos vegetales con múltiples propósitos, entre los que prima la búsqueda de alternativas para incrementar la producción de alimentos para el mundo. Las técnicas que se han desarrollado, van desde las más sencillas y accesibles como la propagación clonal in vitro, cultivo de meristemas, morfogénesis, cultivo de anteras, entre otras, hasta las que incluye la manipulación genética y molecular dirigida al diseño de rutas metabólicas y la biofortificación transgénica aplicable a múltiples cultivos (Garg et al., 2018), como máximo alcance desde hace 9,000 años de manipulación de los vegetales por las civilizaciones (Montagu, 2020).
En los sistemas del cultivo in vitro, donde involucra al genotipo, a los tejidos, condiciones físicas, químicas y el fundamento de la asepsia, tuvieron su máxima expansión en la década de los 90, llegándose a aplicar en innumerables especies, para estudios citológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares, convirtiéndose en una herramienta muy importante para la investigación básica y aplicada (Thorpe, 2007). La micropropagación es una de las técnicas que ha resuelto muchos problemas de disponibilidad de semillas, en especies alimenticias, industriales, forestales (Cano et al., 2017), ornamentales y en la últimas décadas las plantas medicinales (Moraes et al, 2021).
Por otro lado la necesidad imperiosa de búsqueda de alternativas para la cura de múltiples dolencias que aquejan al ser humano, ha permitido un nuevo giro en la mirada hacia las especies con potencial farmacológico, sobre todo cuando el uso indiscriminado e inapropiado de los fármacos como los antibióticos, han permitido el desarrollo de microrganismos multidrogo resistentes (Anad et al., 2019). Entre el 30 al % de los
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compuestos farmacéuticos y nutraceuticos que se consumen en el mundo son derivados de plantas; en países no desarrollados, el uso de plantas medicinales constituye la atención de salud primaria (Sen & Chakraborty, 2017)
En este contexto, existen alrededor de las plantas medicinales, ciertos problemas que urgen ser atendidos, sobre todo cuando se trata de una explotación de plantas medicinales sin estudios previos sobre sus sistemas de reproducción, conservación, estado de vulnerabilidad, entre otros. En el Perú se cuenta con mucho endemismo en plantas medicinales, haciendo más difícil la tarea de conservarlas ex situ. Ante este hecho se recomienda hacer estudios de conservación in situ con las comunidades, ex situ incluyendo las técnicas del cultivo in vitro desarrolladas por la biotecnología vegetal (Chen et al., 2016)
Dentro de las especies con propiedades medicinales, encontramos a las del género Peperomia, pertenece a la familia Piperáceae, la misma que según APG IV (2016) presentaría 3615 especies repartidas en tres subfamilias Verhuellioideae, Piperoideae y Zipelioideae (Wanke et al., 2007), en el mundo están distribuidas en las regiones subtropicales y tropicales, donde el género Peperomia Ruiz & Pav. estaría representada por 1500 a 1700 especies (Machado et al., 2020; Gutiérrez et al., 2016). Este género es monofilético y presentaría 14 subgéneros (Frenzke, 2015), los estudios taxonómicos muestran que es un grupo vegetal complejo para su determinación taxonómica por ello existen pocos especialistas en el mundo que se dediquen a la taxonomía de este grupo vegetal.
La familia Piperaceae en el Perú, estaría representada por tres géneros, Piper, Peperomia y Zipeia, haciendo un total de 830 especies (Brako y Sarucchi,1993), donde el más abundante sería Piper y en segundo lugar estaría Peperomia con 381 especies (Brako y Sarucchi,1993),
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encontrando un alto grado de endemismo (León et al, 2006);se los encuentra habitando ambientes estacionalmente secos, así como bosques muy húmedo (Melo et al., 2016) ya sea como terrestres, epilíticas o epífitas, hábito adquirido por muchas especies de este grupo vegetal (Matheu et al., 2016), así como la modificación de las estructuras foliares.
La clave de su diversidad de este grupo vegetal, es probable que se deba a la capacidad de dispersión y a la flexibilidad y adecuación adquirida en la forma de vida (Frenzke et al., 2016), sobre todo para hacer frente a los problemas de disponibilidad de agua en etapas criticas estacionales. Se encuentras especies que se propagan por semillas, pero también otras que presentarían facilidad para la propagación vegetativa, como compensación a la falta de formación de semillas. Las Peperomias en el Perú son conocidas con el nombre de
“congonas”, siendo la más conocida Peperomia inaequalifolia Ruiz&Pav. que forma parte del conjunto de plantas medicinales que se venden en los mercados locales.
Es muy conocido que las especies de Peperomia, sean utilizadas en rituales mágicos, como es el caso de P. inaequalifolia, que además de ser utilizada para el tratamiento de síndromes culturales, como susto, colerina y mal aire (Silva et al., 2019), se utiliza como tranquilizante y sedativo por las comunidades andinas. Otras especies como P. fraserii y P. renzopalmae, conocidas como “llama plata o yerba de la plata”, son utilizadas para elaborar los “seguros”
para traer buena suerte (Pino et al., 2020). Con menor frecuencia se encontran a P. galioides y P. hartwegiana, que se utilizarían como desinflamantes, además de P. hispidula “chanche”
que se consume en ensaladas.
Dentro de las plantas ornamentales, se encuentran incluidas varias especies: P. albovittata, P.
metalica, P. obtusifolia, P. dolabriformis, P. argyreia, P.marmorata, entre otras. Estas
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especies ornamentales se propagan generalmente de manera vegetativa y por la modificación foliar que presentan dentro de su mecanismo de acumulación de agua, las han incorporado dentro del grupo de las suculentas (Pino et al., 2020); sin embargo, es poco lo que aún se sabe sobre la síntesis de metabolitos secundarios que este grupo vegetal es capaz de sintetizar y más aún las aplicaciones farmacológicas que podrían encerrar.
Los estudios realizados en Peperomia, sobre aspectos fitoquímicos, han sido fundamentalmente debido a su importancia medicinal, muchas de ellas se utilizan para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, afecciones respiratorias incluyendo asma, y otras (Amarathunga y Kancanamge, 2017), existe por lo tanto un potencial farmacológico que demuestran su actividad real como citotóxica, antitumoral incluso como herbicida (Gutierres et al, 2016). Las características fitoquímicas que presenta la familia Piperaceae, estaría relacionada estrechamente con la ubicación filogenética entre las angiospermas basales (APG III, 2009).
En varias especies estudiadas se han podido encontrar numerosa sustancias nuevas para la ciencia, así se tiene que de P.vulcanica y P. fernandopoioana se aislaron 27 compuestos (Mbah et al., 2012), 19 compuestos en P.sui (Cheng et al., 2016), en P. blanda cultivada en Brasil tres nuevas secologaninas (Santos et al., 2014). La actividad que estas sustancias presentan, son como antioxidantes, bactericida (Ruiz et al., 2019), antitripanomicida, antilarvaria y anticancerígena, existen grandes posibilidades de encontrar en este grupo vegetal solución alternativa a los tratamientos convencionales (Narayana et al, 2015) a ciertas enfermedades.
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Las regiones de Lambayeque y Cajamarca en el norte del Perú, se encuentran compartiendo ecosistemas que corresponden a bosque de neblina y bosques estacionalmente secos. En estos ecosistemas se encuentra una considerable diversidad vegetal que cuentan con especies del género Peperomia. Se las encuentra desde los 220 hasta 3800 m.s.n.m, especies poco estudiadas y que ante los problemas mencionados, cobra importancia su investigación que parte por conocer si es factible utilizar técnicas de cultivo de tejidos que permitan la propagación clonal y posterior conservación de su acervo genético en condiciones in vitro, sistema que garantiza la sanidad vegetal sobre todo (Bonilla, 2015).
Los ecosistemas donde habitan especies del género Peperomia son considerados ecosistemas frágiles y amenazados, ya sea por la actividad antrópica, fragmentación de los bosques o el calentamiento global, estas especies en la mayoría de los casos, habitan lugares vulnerables, sumándose al hábito epífito que han desarrollado buen número de ellas. Es el único género entre las angiospermas divergentes tempranas que desarrollaron epifitismo (Frenzke et al., 2016). Este hábito al igual que otros grupos vegetales entre los cuales se encuentran los helechos, les ha permitido establecer una relación muy estrecha de sobrevivencia con ciertos microorganismos (Pérez y Chamorro 2013; Nascimento et,al 2015).
Ante este panorama referente al género Peperomia y a las ventajas que ofrece la biotecnología vegetal vía la propagación clonal, para el presente trabajo se consideró formular medios de cultivo para establecer tejidos in vitro de especies de Peperomia de las regiones Lambayeque y Cajamarca para observar las respuestas in vitro que permitan micropropagarlas como pasos iniciales, frente a una futura conservación in vitro de este importante grupo vegetal, que guardaría un gran potencial como productor de metabolitos de interés farmacológico, así como ornamental.
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II. MATERIAL Y METODOS 2.1.Objeto de estudio
Material Vegetal
El material, vegetal estuvo constituido por especímenes de 18 especies de Peperomia, colectadas en la región Lambayeque y Cajamarca a lo largo de las vías de mayor acceso a poblados, ubicados en zonas de bosques estacionalmente secos y bosques de neblina (Figura 1). Los especímenes fueron colectados a razón de tres muestras por cada especie, en estado reproductivo, a fin de poderlas identificar taxonómicamente. Dos muestras fueron herborizadas y una muestra fue colocada en bolsas sipló para mantener la humedad del ambiente, a fin de trasladarlos en buen estado al Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales y Recursos Genéticos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Los especímenes vivos fueron acondicionados en invernadero con sustrato de origen y regados de manera interdiaria con agua mineral, simulando sus condiciones de hábitat para mantenerlas con vida.
Medio de cultivo
El medio de cultivo estuvo constituido por las sales minerales MS ( Murashige & Skoog, 1962) suplementado con las vitaminas Inositol (100 mg/L-1) y Tiamina (0.4 mg/L-1), los reguladores de crecimiento Acido Naftalenacético (ANA), Ácido Indolacético (AIA), Acido Giberélico (AG3),Bencilaminopurina (BAP) y Kinetina (KIN) en diferentes concentraciones, haciendo un total de 36 tratamientos (Cuadro 1), de igual manera fue utilizada sacarosa (3%) como fuente de carbono y el pH de medio de cultivo fue ajustado a 5, 7 ± 0,1. Para dar consistencia al medio de cultivo fue utilizado agar agar (0,6%). El medio de cultivo fue distribuido en tubos de ensayo y en frascos de vidrio de tipo
“compota” a razón de 7 y 20 ml en cada uno respectivamente. La esterilización fue
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realizada utilizado autoclave a 120 °C y 1 Atm. de presión, durante 15 a 20 minutos, dependiendo del volumen de medio y tipo de envase de vidrio.
2.2. Instrumentación
Para realizar las sesiones de trabajo se utilizó una cámara de flujo laminar horizontal de aire esterilizado, además de placas de Petri esterilizadas con calor húmedo, pinzas y bisturíes completamente esterilizados a la llama de un mechero, el mismo que permaneció encendido durante todas y cada una de las sesiones de trabajo en un ambiente totalmente aséptico.
2.3. Métodos y Técnicas 2.3.1. Cultivo in vitro
Hojas, peciolos, nudos y entrenudos, según correspondiera a cada especie, fueron extraídos de planta madres donadoras de Peperomia luego de ocho días de colectadas, este material, fue sometido a desinfestación utilizando alcohol etílico (70 %) e hipoclorito de sodio (lejía comercial Clorox © al 2.5 g/L) durante 1 y 3 minutos, y luego fueron eliminados con 1 y 4 enjuagues con agua destilada esterilizada.
A partir del material desinfestado fueron obtenidos fragmentos pequeños de 1cm2 los cuales fueron cultivados en los medios preparados y previamente esterilizados en tubos de ensayo. Toda esta fase fue realizada en cámara de flujo laminar de aire esterilizado, utilizando placas, pinzas y bisturíes tomando en cuenta las medidas de asepsia que este tipo de trabajo requiere. En los fragmentos de hoja, se priorizaron para el cultivo aquellos que contenían parte del sistema vascular central de la hoja.
Los cultivos fueron incubados bajo luz indirecta durante 48 horas y luego fueron transferidos a un ambiente con una intensidad luminosa de 40 a 50 µmol m-2sec-2 y un fotoperiodo de 16/8 horas luz y oscuridad.
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Las plántulas que fueron diferenciadas en cada uno de los tratamientos, al alcanzar 3 a 5 cm de longitud, fueron separadas y segmentadas con dos y tres nudos y cultivadas nuevamente en medio de cultivo con bajas concentraciones de los reguladores de crecimiento AIA (0.02 mg/L) y AG (0.02 mg/L), distribuidos en frascos tipo compota (Figura 2)
2.4.Diseño experimental
El diseño experimental utilizado fue el de estímulo creciente, donde la variable independiente estuvo constituida por los tratamientos del medio de cultivo y la variable dependiente por los tejidos de cada especie de Peperomia en estudio. En total 17 especies, 36 tratamientos y 10 repeticiones por tratamiento. Para el análisis de los datos se utilizaron valores porcentuales y los análisis de variancia de un factor y pruebas de Tukey, se realizaron utilizando el complemento Exel Megastat ver, 10.4
Figura 1.
Zonas de colecta de especies de Peperomia en las Regiones Lambayeque y Cajamarca (Fuente:
Google Map 2021)
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Cuadro 1.
Medios de cultivo formulados para el establecimiento de tejidos de in vitro de especies de Peperomia de las regiones de Lambayeque y Cajamarca.
Tratamiento ANA AIA AG3 BAP KIN
T1 0.5 0.02
T2 0.05 0.02
T3 0.1 0.02
T4 0.5 0.02
T5 0,02 0,02
T6 0.05 0.02
T7 0.1 0.02
T8 0.5 0.02
T9 0.02 0.02
T10 0.05 0.02
T11 0.1 0.02
T12 0.5 0.02
T13 0,02 0,02
T14 0.05 0.02
T15 0.1 0.02
T16 0.5 0.02
T17 0.02 0.02
T18 0.05 0.02
T19 0.1 0.02
T20 0.5 0.02
T21 0.02 0.02
T22 0.05 0.02
T23 0.1 0.02
T24 0.5 0.02
T25 0.02
T26 0.05
T27 0.1
T28 0.5
T29 0.02
T30 0.05
T31 0.1
T32 0.5
T33 0.02
T34 0.05
T35 0.1
T36 0.5
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Figura 2.
Fases del trabajo del cultivo in vitro de las especies de Peperomia de la región Lambayeque y Cajamarca
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III. RESULTADOS
La colecta de material vegetal en los principales lugares de acceso, tanto en la región Lambayeque como en Cajamarca proyectados, permitió dispones de 18 especies taxonómicamente determinadas. Las muestras botánicas se encuentran depositadas en el Hebarium Truxiliense de la Universidad Nacional de Trujillo y el Herbario Isidoro Sánchez de la Universidad Nacional de Cajamarca. La especies colectadas (Cuadro 2) casi en su totalidad se encuentran distribuidas tanto en los hábitats de la Región Lambayeque como en Cajamarca; sin embargo, debe remarcarse que P. peltigera, P.obtusifolia, P. inaequalifolia, P.Riosaniensis y P. trinervis, se encontraron sólo en La región Cajamarca.
La mayoría de especies fueron ubicadas en zonas húmedas de quebradas y bosques de neblina, las dos especies P. dolabriformis, P. riosaniensis y P. asperula, fueron ubicadas en zonas correspondientes a bosques estacionalmente secos, tanto de Lambayeque como de Cajamarca. En la región Lambayeque se encuentran distribuidas desde 270 m hasta 3600 m, cabe indicar que hace tan solo una década en el caso de P. dolabriformis se la podía encontrar desde 220 m, así también. Para la región Cajamarca, el piso más bajo de distribución de Peperomia se inicia a 900 metros con P. riosaniensis y P. trinervis como los pisos más bajo (Figura 3). La riqueza de Peperomias se encuentra sobre los 2000 m.
de altitud.
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Cuadro 2.
Especies del género Peperomia sp. colectadas en localidades de la Región Lambayeque y Cajamarca para ser cultivadas in vitro.
N° Especie Altitud
(m) Distrito Provincia Región 1 P. asperula Hutchinson &
Raug. 1413 Llama Chota Cajamarca
2 P.microphylla Kunth 1639 Miracosta Chota Cajamarca
3 P. inaequalifolia Ruiz & Pav. 2737 Miracosta Chota Cajamarca
4 P. albovittata C.DC. 1228 Puará Jaén Cajamarca
5 P. peltigera C.DC. 1500 Jaén Jaen Cajamarca
6 Peperomia dolabriformis
var.velutina Trel. 1100 Pucará Jaén Cajamarca
7 P. obtusifolia (L.) A. Dietr 2500 San Ignacio San Ignacio Cajamarca
8 P.riosaniensis 900 La Florida San Miguel Cajamarca
9 P. trinervis Ruiz & Pav. 900 La Florida San Miguel Cajamarca
10 P. pinoi 2515 San Andrés Cutervo Cajamarca
11 P. tenela (Sw.) A. Dietr. 2390 San Andrés Cutervo Cajamarca 12 Peperomia dolbriformis
Kunth. 270 Chongoyape Chiclayo Lambayeque
13 P. galioides Kunth 585 Reque Chiclayo Lambayeque
14 P. residiflora Linden & Andre 2368 Motupe Lambayeque Lambayeque
15 P.rotundata Kunth 2975 Kañaris Ferreñafe Lambayeque
16 P. hartwegiana Miq. 3603 Incahuasi Ferreñafe Lambayeque 17 P. acuminata Ruix & Pav. 2718 Kañaris Ferreñafe Lambayeque 18 P. tetraphylla (G. Forst.)
Hook & Arn. 2820 Kañaris Ferreñafe Lambayeque
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Figura 3.
Distribución altitudinal de las zonas de colecta de las especies de Peperomia de Lambayeque y Cajamarca.
Establecimiento de los cultivos in vitro
En el establecimiento de los cultivos in vitro de la presente investigación, se presentaron dos problemas fundamentalmente, la contaminación y oxidación de los tejidos en el momento inicial del cultivo y la vitrificación en el momento de la diferenciación de órganos. Se observó un alto grado de contaminación en todos los tejidos cultivados, llegando al 100% en todas las especies colectadas. En las especies terrestres y rupícolas, se observó la presencia de levaduras y en las especies de hábito epífito como P.
tetraphylla, P. hartwegiana y P.microphylla, la presencia de hongos. Se consideró ser de carácter endógena esta contaminación, ya que apareció luego de 10 y 15 días de instalados los cultivos. Luego de ser aislados en cultivos puros para ser identificados, se llegó a determinar que pertenecerían al género Fusarium sp. (Figura 4).
270 585
2368 2718 2820
2975 3603
1000 1000 1100 12281413
1200 3297
2390 2500
2515 2737
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Metros sobre el nivel del mar
Zonas de colecta de especies de Peperomia
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Como se habían utilizado los tejidos de las plantas silvestres luego de 8 días de haber sido colectadas, se optó por dejarlas por un período de 30 a 90 días en condiciones de invernadero con la finalidad de tener nuevos brotes con material menos expuesto al ambiente, de manera que se pueda disminuir también la contaminación in vitro.
Utilizando este material aclimatado se pudo reducir la contaminación a 50% únicamente en las especies terrestres y rupícolas, mas no en las especies de hábito epífito donde la contaminación continúo en 100%. De igual manera los explantes obtenidos a partir de entrenudos fueron desestimados por el mismo motivo, quedando finalmente sólo 15 especies.
El problema de oxidación de los tejidos se presentó en 100% en cinco especies;
P.asperula, las dos especies de P. dolabriformis, P.riosaniensis, y P.acuminata .En las demás especies este problema fisiológico fue superado de 50 a 100%. En los tratamientos que incluían BAP en su composición la oxidación fue letal. En el caso de los tratamientos que incluía ANA y AG3 en su formulación, en algunos casos el necrosamiento fue superficial, puesto que aún oxidados los tejidos llegaron a diferencias raíces y brotes, como en el caso de tejidos de peciolo de P. albovitata. P. pinoi no toleró la presencia de los desinfestantes y murieron los tejidos foliares en el medio de cultivo (Cuadro 3).
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Cuadro 3.
Oxidación de tejidos de especies de Peperomia cultivados in vitro *
El fenómeno fisiológico de la vitrificación, se observó en casi todos los brotes diferenciados a partir de los tejidos cultivados in vitro, a excepción de los diferenciados en P. trinervis; sin embargo, fue controlada con la transferencia a medio de cultivo con las más bajas concentraciones de reguladores de crecimiento, en este caso AIA (0.01 mg/L) y AG3 (0.02 mg/L).
N° Especie
Oxidación (%)
Ausente Parcial Total Muerte
1 P. asperula - - 100 100
2 P. albovittata - 50 50 50
3 P. peltigera - 50 50 50
4 Peperomia dolabriformis var.grandis
- - 100 100
5 P. obtusifolia - 100 - -
6 P.riosaniensis - - 100 100
7 P. trinervis 100 - - -
8 P. pinoi - - - 100
9 P. tenela 50 - - 50
10 Peperomia dolbriformis - - 100 100
11 P. galioides 40 30 30 30
12 P. residiflora 30 50 20 20
13 P.rotundata - 40 60 60
14 P. acuminata - - 100 100
15 P. inaequalifolia - - 100 100
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Figura 4.
Hongos endófitos en especies de Peperomia epífitas: a. P. microphylla y contaminación con levaduras; b y c. hongos endófitos en tejidos de P. hartwegiana y P. tetraphylla; d y e. Fusarium sp1 y sp2 (macroconidias).
Morfogénesis in vitro
De las 18 especies de Peperomia con las que se inició la investigación, únicamente en ocho especies se logró finalmente observar la diferenciación de brotes, raíces o ambas estructuras como el caso de P. albovittata. Las especies, fueron discriminadas por los problemas de contaminación, oxidación y no tolerancia a los desinfestantes por lo delicado de sus tejidos. A partir de los tejidos utilizados se observó como respuesta la organogénesis somática directa. Aun cuando el número de brotes principalmente no fue abundante, los que se obtuvieron fueron suficientes para que estas especies logren una propagación in vitro, con posibilidades de conservarse en esas condiciones a futuro.
a
b
c
d
e
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Como se puede observar en el Cuadro 4, no todas las especies respondieron a los tratamientos del medio de cultivo. La excepción resultó ser P. trinervis, donde las respuestas caulogénicas se observaron en el 100% de los explantes cultivados, en los tratamientos que incluyeron la combinación de auxina y giberelina y auxina citocinina, seguida de P. obtusifolia, que también tubo respuestas en la combinación ANA y BAP en el 20% de los explantes peciolo y un alto porcentaje de diferenciación de raíces. Las demás especies como P. albovittata llegó a diferenciar brotes en el 80% en tejidos de peciolo, P. residiflora y P. rotundata hasta 40% en tejidos de hoja.
En el caso de P. Peltigera se diferenciaron brotes solo en 1% y brotes y raíces en 20%
de los tejidos foliares. Los nudos de P. tenela y P. galioides brotaron y enraizaron en un 50%. De todas las especies sometidas a cultivo, destaca P. trinervis, como un caso excepcional por las respuestas observadas, en todos los tratamientos que incluían auxinas combinadas ya sea con giberelinas o citocininas. No se presentaron respuestas en presencia de auxinas o citocininas solas, sólo se observó hinchamiento y necrosis de los tejidos, en algunos casos la formación de callos incipientes alrededor de la zona periférica.(Figura 5).
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Cuadro 4.
Respuestas al medio de cultivo in vitro de especies de Peperomia, luego de 60 días de establecidos los cultivos*.
*10 repeticiones por tratamiento
B: brotes, R: raíces; BR: brotes y raíces
REGULADORES DE CRECIMIENTO (mg/L)
DIFERENCIACIÓN DE ÓRGANOS (%)
Tratamiento ANA AIA AG3 BAP KIN P.albovittata (P)
P. Peltigera (H)
P.trinervis (H)
P. tenella (N)
P. galioides (N)
P.resediflora (H)
P. rotundata (H)
P. obtusifolia.
(H)
B R BR B R BR B R BR B R BR B R BR B R BR B R BR B R BR
T1 0.02 0.02 20 40 20 20 - - 100 - - - 50 - - 50 30 - - 20 - - 30 -
T2 0.05 0.02 - - - - - 20 100 - - - 50 - - - - - - 40 - - 20 -
T3 0.1 0.02 - - - - - - 100 - - - 50 - - - - - - 10 - - - - -
T4 0.5 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T5 0,02 0,02 80 - - - - - 100 - - - - 50 - - 50 40 - - - - - - - -
T6 0.05 0.02 - - - - - - 100 - - - - 50 - - - - - - - - - - - -
T7 0.1 0.02 - - - - - - 100 - - - - 50 - - - - - - - - - - - -
T8 0.5 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - -
T9 0.02 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T10 0.05 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - 10 - -
T11 0.1 0.02 - - - - - - 100 -- - - - - - - - - - - - - - 20 - -
T12 0.5 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - 20 - -
T13 0,02 0,02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T14 0.05 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T15 0.1 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T16 0.5 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T17 0.02 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - -
T18 0.05 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - -
T19 0.1 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - -
T20 0.5 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - -
T21 0.02 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T22 0.05 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T23 0.1 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T24 0.5 0.02 - - - - - - 100 - - - - - - - - - - - - - - - - -
T25 0.02 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T26 0.05 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T27 0.1 - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T28 0.5 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T29 0.02 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T30 0.05 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T31 0.1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T32 0.5 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T33 0.02 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T34 0.05 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T35 0.1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T36 0.5 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
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La diferenciación de brotes se llegó a observar desde 25 y 45 días luego del cultivo, en algunos casos como P. albovittata se diferenciaros brotes a partir de los explantes aparentemente oxidados. En todos los casos durante este período de diferenciación, los tejidos originales fueron oxidándose, a excepción de P. trinervis que presentó los tejidos siempre verdes, oxidándose sólo en presencia de los tratamientos que incluían BAP. El número de brotes diferenciado por explante varió de acuerdo al genotipo y a la formulación del medio de cultivo, observándose respuesta preferencial en las combinaciones de ANA y AIA más AG3. El número de brotes diferenciados fue relativamente bajo; sin embargo, fueron suficientes para desarrollar plántulas con brotamiento basal que permitieron la propagación clonal de las especies (Cuadro 5).
Todas las especies diferenciaron brotes en el medio de cultivo que incluía ANA y AG3, observándose mejor respuesta en ANA 0.05, 0.1 mg/L y AG3 0.02 mg/L. P. trinervis, P.
resediflora, P.rotundata y P. obtusifolia, diferenciaron entre 2 y 4 brotes por explante. 3 presencia se AIA y AG3, sólo respondieron P. albovittata, P. trinervis y P. resediflora, con 1.5, 3 y 2 brotes por explante respectivamente. En las combinaciones de ANA y BAP, solo respondieron P. trinervis y P. obtusifolia, con tres y 2.5 brotes en promedio en las concentraciones de 0.05, 0.5 mg/L y 0.02 respectivamente.
La especie que más destacó en mayor número de brotes fue P. trinervis y en presencia de la combinación ANA (0.05, 0.1 y 0.5 mg/L) y KIN (0.02 mg/L), alcanzando un promedio de 12 brotes por explante. El bajo número de brotes resultó no ser significativo para los tratamiento y especies, sin embargo en el caso de P. trinervis, para sus mejores respuestas, el análisis de varianza mostro significancia para los tratamientos que incluyeron ANA, AIA (0.02, 05, 0.1 y 0.5 mg/L)) y KIN(0.02 mg/L) y por lo menos uno fue diferente y mejor que los demás (Cuadro 6).
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Figura 5.
Especies con respuesta morfogénica in vitro; a-c. P.albovittata; d y e, P. rotundata; f- g. P. trinervis;h-i.P. Peltigera; j-k- P. tenella; l-ll. P. galioides; m-n. P. obtusifolia y ñ-o. P. residiflora.
a
a c d
f e
g
h i
j
k
m
l
ll
ñ b
n o
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Cuadro 5.
Diferenciación de brotes en seis especies de Peperomia, luego de 90 días de instalado el cultivo in vitro.*
*10 repeticiones por tratamiento
Cuadro 6.
Análisis de Varianza para número de brotes diferenciados en Peperomia trinervis en tratamientos que incluyen ANA, AIA y KIN.
FV SC GL MC F P - Valor
Tratamientos 1,475.00 7 210.714 145.88 6.61E-40
Error 104.00 72 1.444
Total 1,579.00 79
FV: Factor de variación; SC: Suma de cuadrados; GL: Grados de libertad: MC: Media de cuadrados; F: Esperado; Valor de P.
Trat.
Reguladores de
Crecimiento Número de Brotes por explante (Promedio)
ANA AIA AG3 BAP KIN P.albovittata P.peltijera P. trinervis P. resediflora P. rotundata P. obtusifolia
T1 0.02 0.02 1.5 1.5 1 2 2 2
T2 0.05 0.02 2 2.5 2.4 4
T3 0.1 0.02 3 3 1.9 2
T4 0.5 0.02 3 2 1
T5 0,02 0,02 1.5 3 2
T6 0.05 0.02 3 2
T7 0.1 0.02 3 1
T8 0.5 0.02 3
T9 0.02 0.02 3
T10 0.05 0.02 3 2
T11 0.1 0.02 3 2.5
T12 0.5 0.02 3 1.5
T13 0,02 0,02 3
T14 0.05 0.02 3
T15 0.1 0.02 3
T16 0.5 0.02 3
T17 0.02 0.02 5
T18 0.05 0.02 11
T19 0.1 0.02 12
T20 0.5 0.02 10
T21 0.02 0.02 4
T22 0.05 0.02 2
T23 0.1 0.02 1
T24 0.5 0.02 1
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Las especies P. tenella y P. galioides, por el hecho de haber iniciado su cultivo a partir de nudos con yemas predeterminadas, no se consideraron dentro del proceso de organogénesis de novo; si bien presentaron crecimiento de yemas y raíces en los medios de cultivo que incluían ANA y AIA combinados con AG3, resultó mejo el medio que incluía AIA (0.02 mg/L) y AG3 (0.02 mg/L), razón por la cual se optó por propagar en este medio de cultivo a todas las Peperomias
Propagación clonal
En cuanto a la propagación clonal, el 100% de brotes y nudos cultivados en el medio que incluía ANA (0.02 mg/L) y AG3 (0.02 mg/L), alcanzaron un óptimo desarrollo, considerándose a esta combinación un medio ideal para propagación clonal in vitro de cualquier especie de Peperomia una vez diferenciados los brotes. Al cabo de 15 días de propagada en medio de cultivo fresco, las plantas empiezan un desarrollo armónico y se inicia un brotamiento basal de yemas, la presencia de raíces en los nudos también es evidente (Figura 6), presentando 100% de respuesta a la propagación in vitro, con un crecimiento óptimo y la permanencia en el cultivo superó los 10 meses (Cuadro 7).El tipo de envase no tuvo mayor repercusión en el número de brotes, el mismo que osciló entre 2 a 3 y 5 brotes en su mayoría (Cuadro 8).
Todas las especies en condiciones in vitro presentaron posibilidades de ser transferidas a condiciones de sustrato, habiéndose experimentado únicamente en P. albovittata, al parecer esta especie tiene mucha facilidad para multiplicarse, ya que sólo colocando hojas sin peciolo en agua se logra enraizamiento y al colocar hojas con peciolo se logra brotamiento, lo mismo ocurre con P. trinervis, fragmentos de tallo puede enraizar con
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mucha facilidad en presencia de agua (Figura 7). La única especie que presentó lento crecimiento fue P. tenella.
Cuadro 7.
Frecuencia de respuesta a la propagación in vitro de Peperomia en medio de cultivo complementados con AIA 0.02 mg/L y AG3 0.02 mg/L.*
Especie Frecuencia
(%)
Grado de crecimiento
Tiempo máximo.
de permanencia en cultivo
P.albovittata 100 Óptimo 10 meses a más
P. peltigera 100 Óptimo 10 meses a más
P. trinervis 100 Óptimo 10 meses a más
P. resediflora 100 Óptimo 10 meses a más
P. rotundata 100 Óptimo 10 meses a más
P. obtusifolia 100 Óptimo 10 meses a más
P. galioides 100 Óptimo 8 meses a más
P. tenella 100 Óptimo 8 meses a más
¨*10 repeticiones por tratamiento
Cuadro 8. Efecto del medio de cultivo complementados con AIA 0.02 mg/L y AG3 0.02 mg/L.
en el número de brotes por yema establecida in vitro*
N° Especie
Número de brotes por yema
Tubo de ensayo Frasco
(tipo compota)
1 P.albovittata 2-3 2 -5
2 P. peltigera 2-3 2-3
3 P. trinervis 2-3 2-5
4 P. resediflora 2-3 2-3
5 P. rotundata 2-3 2-5
6 P. obtusifolia 2-3 2-3
7 P. galioides 1-2 2-3
8 P. tenella 1-3 1-3
*10 repeticiones por tratamiento
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Figura 6.
Plantas micropropagadas en AIA 0.02 mg/L y AG3 0.02 mg/L.: a. P.albovittata; b. P.
peltigera; c. P. trinervis; d. P. resediflora; e. P. rotundata; f. P. obtusifolia; g. P. galioides y h. P, tenella.
a
c
b
d
e f
g h
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Figura 7.
Organogénesis directa en agua corriente en: a y b. Raíces y brotes en P. albovittata; c.
Raíces en esqueje de P. trinervis y c. Planta in vitro de P, albovittata transferida a sustrato (tierra de cultivo con vermiculita 1:3)
a
c d
b
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IV. DISCUSIÓN
Los sistemas de propagación de plantas in vitro, ha resuelto muchos problemas de disponibilidad de plantas a gran escala en muchas especies agronómicamente importantes, en segundo lugar se encuentran las plantas industriales y finalmente las medicinales; sin embargo, uno de los problemas críticos que afronta el inicio de todo cultivo aséptico ha sido la contaminación (Ravinder, 2018). La situación es más crítica aun, cuando las sustancias utilizadas frecuentemente en la esterilización superficial de los tejidos no es suficiente para eliminar los microrganismos y se tienen que utilizar otras sustancias que resultan ser tóxicas para los tejidos vegetales. En este caso se agrava más la situación por cuando los tejidos siempre morirán (Gangopadhyay et al., 2017).
En el presente trabajo la contaminación no se pudo controlar en las especies de Peperomia de hábito epífito, al parecer el comportamiento epífito de este grupo vegetal, estaría comprometido con una suerte de asociación simbiótica con hogos preferentemente. Este hábito adquirido, provendría desde su ancestro y formaría parte del mecanismo generador de la diversidad y comportamiento CAM (Frenzke et al., 2016). La presencia de estos hongos conceptuados como endófitos, desempañarían un rol muy importante en la vida de la planta, favoreciendo el crecimiento y desarrollo de la misma al suministrarle hormonas, nitrógeno y otras sustancias esenciales (Perez & Chamorro, 2013).
Por otro lado estos microorganismos estarían involucrados también en los mecanismos de defensa contra otros patógenos (Nascimento et al., 2015), los diferentes nichos ecológicos, han permitido en sus habitantes el desarrollo de una complejidad genética específica, la misma que involucra la síntesis de metabolitos en los vegetales inducidos por sus endófitos, que habitan en este caso en los espacios intercelulares y pueden tener actividad también
