ÁCAROS productores de

ÁCAROS productores de enfermedades alérgicas

Desarrollo de tecnologías para su detección

Las enfermedades alérgicas representan un gran problema de salud pública en el mundo. Son el resultado de una compleja interacción entre células, genes y medio ambiente. Estas enfermedades representan, en el mundo, la tercera causa de la consulta ambulatoria en medicina. Dentro de estas enfermedades, el asma bronquial, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica y la urticaria son las de mayor prevalencia.

Eduardo Alberto Egea Bermejo. Médico Cirujano.  Especialista en Alergología. Magíster en Desarrollo Social. Candidato a doctor en Biotecnología. Entrenamiento posdoctoral en Inmunología en Harvard. Docente investigador División Ciencias de la Salud.

Coordinador del Grupo de Investigación en Inmunología y Biología Molecular.  Universidad del Norte. www.uninorte.edu.co

eegea@uninorte.edu.co

Marco Enrique Sanjuan Mejía. Ingeniero Mecánico. Doctor en Ciencias de la Ingeniería. Grupo de Investigación en Uso Racional de la Energía y Preservación del Medio Ambiente (Urema). Profesor investigador del departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad del Norte www.uninorte.edu.co

msanjuan@uninorte.edu.co Grupo de Investigación en Uso Racional de la Energía y Preservación del Medio Ambiente-UREMA: Grabriel Cubas, Ingeniero; Humberto Gómez, Ingeniero PhD. Grupo de Investigación en Inmunología y Biología Molecular: Gloria Garavito, MD, PhD.; Dary Luz Mendoza, QF, MSc. Elkin Navarro, BSc.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha proyectado que, para el 2030, cerca del 40% de la población mundial será alérgica.

Se estima que aproximadamente 300 millones de personas en el mundo sufren de asma alérgica y 25% de la humanidad sufre de rinitis alérgica.

El comportamiento epidemiológico de estas enfermedades muestra en las últimas cuatro décadas que el número de nuevos casos y el porcentaje de la población enferma se encuentra en ascenso, especialmente en los países de economía en transicion, al igual que en los países del mundo en desarrollo. De igual manera, se ha encontrado que en aquellos países que hasta la década anterior representaban los de mayor prevalencia, actualmente se mantienen sin modificaciones y que en las áreas del mundo en donde la prevalencia era moderada o baja se observa un aumento de estas enfermedades. Colombia no escapa a este comportamiento. Un estudio reciente mostró una prevalencia para el asma del 10,4% y del 22,6% para la rinitis. Estos datos se traducen en un gran impacto social. En el mismo estudio, el 38%

de los pacientes con asma han sido hospitalizados o han requerido visitas al servicio de urgencias, y el 50% confirman pérdida de días de trabajo o estudio.

Dos estudios llevados a cabo en nuestro país entre 1999 y 2009 revelan resultados de gran impacto en salud pública; el más reciente señala que Barranquilla es la ciudad con mayor prevalencia de asma y eccema. La situacion es más preocupante aún cuando se encuentra que en todas partes los más afectados son los preescolares y los escolares, lo que proyecta una pérdida social y económica representada por disminución de los años de vida saludable y una caída en la produccion académica y laboral.

En Colombia está demostrado que el asma bronquial alérgica es un problema de salud pública.

Actualmente se acepta que las proteínas o sus fragmentos, llamados alérgenos, presentes en el medio ambiente, son los que más desencadenan las manifestaciones de las enfermedades alérgicas. Está claro el papel preponderante que juegan los alérgenos provenientes de los ácaros del polvo doméstico como factores de riesgo para el desarrollo de estas enfermedades, como también en el desencadenamiento de sus síntomas. Se acepta que el 85% de los pacientes asmáticos alérgicos están sensibilizados

a los antígenos de los ácaros. Las alergopatías, como todas las enfermedades crónicas, alteran la calidad de vida y generan trastornos psicoafectivos en el núcleo familiar de los pacientes.

Por otra parte, estudios previos realizados por el Grupo de Investigación en Inmunología y Biología Molecular de la Universidad del Norte, en Barranquilla, muestran que la prevalencia de sensibilización a antígenos de ácaros (proporción de individuos que presenta anticuerpos IgE específicos contra moléculas de los ácaros) en pacientes asmáticos en la ciudad de Barranquilla tiene el mismo patrón de comportamiento que el que se presenta a nivel mundial (80-85%). En estos mismos estudios determinamos que las especies de ácaros más frecuentemente involucradas y encontradas en los ecosistemas hogareños de los pacientes son: Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus y Blomia tropicalis. Estudios realizados internacionalmente confirman la fuerte asociación que existe entre la sensibilización a alérgenos de estos ácaros y las manifestaciones del asma.

Las actuales guías para el tratamiento del asma y otras enfermedades alérgicas recomiendan, como primer paso, que se evite el contacto con los alérgenos. Estas son proteínas que se encuentran en el medio ambiente y que sensibilizan al individuo, generando una respuesta del sistema inmunológico que se traduce en inflamación del órgano o tejido del cuerpo que se compromete.

Esto acarrea un problema y deja un vacío en el manejo, ya que por lo general los pacientes no conocen el grado de infestación por ácaros en sus viviendas. Actualmente en nuestro medio no existe una tecnología, y mucho menos un dispositivo para uso del paciente, que resuelva este problema.

LOS ÁCAROS

Los ácaros son pequeños artrópodos microscópicos con un tamaño de entre 5 y 35 micras, ciegos y fotofóbicos. Se encuentran distribuidos por todo el mundo, adaptados a vivir en diversos medios. Entre las numerosas especies encontramos aquellos que viven en el polvo de las casas, que basan su nutrición en residuos de piel humana y animal (detritus). En el cuerpo de estos animales y en las heces de los mismos se encuentran unas

proteínas enzimáticas dentro de las cuales están las cisteínas proteasas (enzimas digestivas), capaces de producir inflamación.

Cada ácaro produce unas veinte partículas fecales por día, las cuales continúan ocasionando síntomas alérgicos incluso mucho tiempo después de la muerte del ácaro. Estas proteínas son tan resistentes que aguantan la desecación, las altas temperaturas y los ambientes inhóspitos. Los ácaros pueden encontrarse por centenares en cada gramo de polvo (es posible encontrar más de cien ácaros en una pequeña muestra de polvo). Los estudios actuales indican que los niveles críticos de ácaros del polvo doméstico que producen problemas en el organismos son los que superan los diez ácaros por gramo de polvo.

Diversos conteos de ácaros se han usado para determinar la exposición a alérgenos en el hogar por algún tiempo. El número de ácaros y los niveles de proteínas de estos minúsculos animales han sido de gran valor para determinar la importancia alergénica de diferentes especies de ácaros en el mundo entero, no solo en el polvo doméstico, sino también en alimentos almacenados y en otros productos. Estos métodos son utilizados por los especialistas y son esenciales para evaluar la eficacia de los acaricidas y otros productos químicos usados para el control de infestación. El número de ácaros no es necesariamente un buen indicador de los niveles de alérgenos ambientales; por esta razón se utilizan métodos inmunoquímicos en lugar de los biológicos, que determinan la exposición basados en anticuerpos monoclonales (anticuerpos homogéneos producidos por una misma línea de células B) o policlonales (anticuerpos heterogéneos producidos por diferentes líneas de células B) para alérgenos específicos.

El principal alérgeno del polvo doméstico permaneció oculto hasta 1967, cuando se sugirió que los ácaros pertenecientes al género Dermatophagoides conformaban el género más importante de alergia al polvo doméstico. Las partículas fecales producidas por estos ácaros son su principal fuente de alérgenos.

Estas pueden encontrarse flotando en el aire pero, dado su tamaño, se acumulan sobre todo en las superficies, colchones, sábanas y almohadas. Los ácaros representan el 80% del componente del polvo doméstico.

El monitoreo ambiental de los niveles de alérgenos específicos es importante porque tiene efectos prácticos en la vida de los pacientes (por ejemplo, para valorar la cantidad de alérgenos de ácaros presentes en un espacio), pues les permite comprobar por sí mismos el adecuado control de estos niveles. El concepto de “vida con bajos niveles de alérgenos” está siendo utilizado en Europa, y las herramientas están ahora disponibles para que el paciente haga los cambios necesarios en su estilo de vida con una casa libre de alérgenos; esto podría resultar en beneficios clínicos para los pacientes con asma.

Fundamentado en estas consideraciones, el Grupo de Investigaciones en Inmunología y Biología Molecular de la Universidad del Norte viene trabajando desde hace dos décadas en investigaciones relacionadas con la epidemiología, la fisiopatología y la clínica de estas enfermedades, y desde hace diez años en proyectos de investigación y desarrollo que apuntan a la transferencia de resultados al sector productivo externo, con el propósito de aplicar sus resultados en la prevención, el control y el tratamiento de estas enfermedades.

PROYECTO ACARFAST

Luego de lograr el primer desarrollo tecnológico que se convirtió en el primer producto acaricida colombiano, denominado AcarKlean (ver figuras 1 y 1a), actualmente comercializado en Colombia, Centroamérica y varios países de Suramérica, los investigadores formularon y desarrollaron el proyecto “Acarfast:

Dispositivo multipropósito para la detección de infestación de ácaros productores de enfermedades alérgicas”. Este es un proyecto de ingeniería concurrente en el que, como área de la frontera del conocimiento y del diálogo de saberes, la ingeniería mecánica interactúa con las ciencias biomédicas.

La ingeniería concurrente, también llamada ingeniería simultánea, es un enfoque organizativo que pretende que todos los elementos que intervienen en el ciclo de vida de un producto, desde la idea inicial hasta el desarrollo final, colaboren y realicen su trabajo simultáneamente, asegurando que las condiciones estructurales,

funcionales, de fabricación, mantenimiento y demás. Se consideren en las etapas iniciales de análisis. De este modo se consigue disminuir los tiempos de entrega y un mayor control de los recursos y costos durante los diferentes estados de desarrollo.

Esta definición implica una integración entre las diferentes actividades del proceso, lo cual obliga a crear equipos de trabajo multidisciplinarios, formados por profesionales relacionados con el diseño de producto y con los procesos productivos. En el proyecto se utilizaron sistemas computarizados que incluyeron conocimientos y uso de herramientas de bioinformática y química computacional para facilitar el desarrollo del proyecto, la cooperación y la integración de las diferentes actividades.

Este proyecto plantea el diseño de un producto potencialmente comercializable, novedoso en su concepto y con gran aporte tecnológico para sus participantes. Consiste en crear un dispositivo multiprueba para inspeccionar la presencia de ácaros en espacios intradomiciliarios. El creciente interés por el papel de los alérgenos en la generación de asma y otras enfemedades alérgicas ha permitido desarrollar pruebas cualitativas o semicuantitativas de fácil uso para detectar alérgenos y de esta manera establecer el grado de exposición del paciente a los alérgenos en su hogar, lo que le permite monitorear el control de los alérgenos e implementar procedimientos de prevención.

La prueba de inmersión en guanina (prueba de laboratorio) fue el primer test desarrollado para detectar la exposición a ácaros, pero no correlacionaba con los niveles de alérgenos de ácaros debido a su bajo nivel de sensibilidad (ver figura 2).

En años recientes, las técnicas para detectar alérgenos y anticuerpos específicos presentes en las enfermedades alérgicas han utilizado métodos enzimáticos que producen color al evidenciar presencia de estos alérgenos. Se ha desarrollado, además, una refinada característica para una prueba diagnóstica rápida de alérgenos de ácaros y gatos, la cual usa anticuerpos monoclonales marcados con oro y da los resultados en solo diez minutos. Esta prueba de flujo es muy costosa. Se considera que la prueba es positiva cuando se forma una línea roja y cuando el complejo alérgeno/anticuerpo marcado es identificado por el anticuerpo monoclonal. Esta prueba es fácil de utilizar y muy sensible, y puede ser usada en la casa, detectando niveles de entre 100 y 500 ácaros por gramo de polvo aproximadamente.

Metodología

El grupo desarrolló anticuerpos policlonales de origen aviar para lograr la detección de ácaros en espacios intradomiciliarios. Para hacer esto, se hizo gestión con Acondesa, empresa del sector agroindustrial en el Caribe colombiano, que aportó los recursos y el apoyo suficiente para crear un modelo experimental en el que se empleó una cepa de pollos de 16 semanas de vida, provenientes de Newcastle, Inglaterra, denominados hi line brown (ver figura 3).

Una vez se obtuvo la camada, se usó un protocolo de inmunización o vacunación aplicando en las pechugas de los pollos unos fragmentos de proteínas denominados oligopéptidos, los cuales previamente se diseñaron y se obtuvieron in silico (por simulación computacional) usando varios programas especializados como herramientas de biocomputación y delineados con conocimientos de química computacional. Una vez se obtuvieron dichos oligopéptidos, se sintetizaron (o fabricaron) en el laboratorio usando técnicas de química orgánica y analítica. Los pollos produjeron una respuesta a dichos péptidos. El sistema inmunológico de defensa de estas aves produjo otros componentes denominados anticuerpos, los cuales se concentraron en los huevos de gallina, que fueron recolectados y su contenido fue procesado por técnicas de química denominadas delipidación, separación y purificación, por medio de las cuales se consiguieron dichos anticuerpos.

Posteriormente los anticuerpos fueron probados por su capacidad para identificar los alérgenos de los ácaros mediante técnicas inmunoquímicas. Una vez se comprobó que los experimentos funcionaban a satisfacción y que sí eran capaces de identificar los alérgenos de los ácaros del polvo, se procedió a estandarizar un protocolo inmunoquímico para detectar los alérgenos de los ácaros.

El sistema de revelado mediante enzimas tiene diversas desventajas, una de las cuales es la necesidad de usar una cadena de frío para su transporte y mantenimiento. Con el objetivo de superar estas desventajas, se sintetizaron nanopartículas de oro coloidal (NPG), las cuales se preparan por reducción química mediante calentamiento con reflujo y agitación constante. La calidad de las NPG se evaluó por espectrofotometría UV-Visible y por microscopía electrónica de transmisión (MET). La conjugación se produjo al mezclar las nanopartículas de oro en solución con los

anticuerpos IgY, a diferentes pH. La unión de las nanopartículas a los anticuerpos ocurrió por adsorción de estas al fragmento Fc del anticuerpo, el cual es un sitio del anticuerpo distinto del punto de interacción con el antígeno (ver figura 4).

Después de la reacción de conjugación, el complejo se estabiliza con un compuesto orgánico inerte. El tamaño y la forma de las nanopartículas de oro coloidal no conjugado y de las partículas de oro coloidal conjugado con el anticuerpo se obtienen por microscopía electrónica de transmisión. Los anticuerpos unidos a las nanopartículas de oro coloidal se usaron para detectar los alérgenos, para lo cual se contruyó una tira de prueba que consta de cuatro secciones o cojines, así:

a) La primera sección o “cojín muestra” está formada por una fibra de celulosa cuya función es remover el material viscoso o particulado presente en la mezcla y ajustar las condiciones de reacción para la inmunodetección.

b) La segunda sección o “cojín del conjugado” está compuesta por fibra de vidrio y constituye la fase móvil del sistema inmunocromatográfico con otro anticuerpo IgY, antioligopéptido sintético de los alérgenos de ácaros conjugado a las nanopartículas de oro.

c) La tercera sección de la tira está formada por una membrana de nitrocelulosa y constituye el soporte sólido del sistema inmunocromatográfico. Constituye los sitios de reacción que tienen dos zonas: una zona de reacción primaria (T) que sirve de control positivo y nos indica que la prueba se encuentra funcional, y una zona de reacción secundaria (C) que indica la presencia de alérgenos de ácaros, según la presencia de banda o no: es positivo cuando no hay banda, y negativo si hay banda en esta zona secundaria (ver figura 5). En presencia o en ausencia del alérgeno en la muestra, la señal en la zona C debe estar presente, por lo que esta se constituye en un control de la prueba, es decir, confirma que una prueba es funcional o válida independientemente de si la zona T indica un resultado negativo o positivo.

d) La cuarta sección sobre la tira de prueba está formada por un

“cojín absorbente”, que dirige el flujo de la muestra en solución de forma continua.

Una vez terminada la tira de celulosa, sobre esta se pegaron los anticuerpos para luego introducirla en el dispositivo que desarrollaron los ingenieros del Grupo de Investigación en Uso Racional de la Energía y Preservación del Medio Ambiente, UREMA, de la Universidad del Norte.

Sin embargo, para hacer realidad el detector multipruebas, se requirió desarrollar un encapsulado que permitiera en primera instancia la recolección adecuada de polvo en el área a evaluar, para luego mezclar el polvo y la solución específicas y difundir la solución de la zona de mezclado hacia la membrana de nitrocelulosa — soporte en donde se da una reaccion inmunoquímica y la difusión a través de la membrana para que se revele y permita la lectura del resultado—.

La metodología empleada tuvo una alta interacción multidisciplinaria, con una visión concurrente por parte de sus participantes, y siguió los pasos propios del diseño de un producto. El equipo de trabajo, conformado por profesionales del área médica, la ingeniería mecánica, el diseño de moldes y la selección de materiales, llevó a cabo el diseño del dispositivo funcional con una visión integradora y enmarcada dentro del entorno tecnológico de la región Caribe colombiana.

Se llevó a cabo una fase experimental de las variables que debían definir la fiabilidad de la prueba. Con los datos arrojados experimentalmente se definieron en detalle los elementos necesarios para el diseño, así como los materiales a utilizar, las condiciones de los elementos y sus dimensiones. En esta fase se emplearon herramientas de programas computacionales CAD de alto nivel, con las cuales se puede integrar fácilmente un módulo CAM. Se llevó a cabo además un modelo computacional de elementos, se realizaron análisis estructurales de los elementos fijos y móviles, y se realizaron simulaciones dinámicas del dispositivo para conocer su comportamiento, así como su interacción en el proceso de recolección del polvo.

El dispositivo puede ser utilizado en la metodología de one step (un solo paso) y bajo el concepto hágalo usted mismo, de modo que el usuario recolecta la muestra de polvo pasando el dispositivo por la superficie a evaluar y esperando que se formen una o dos bandas según la prueba sea positiva o negativa, respectivamente (ver figuras 6).

Acarfast es el primer producto de un proyecto de ingeniería biomédica en el que concurrieron diferentes disciplinas que, desde la bioinformática, la química computacional, la inmunología y la ingeniería mecánica, permitieron el desarrollo de este dispositivo que se perfila como una innovación usada como herramienta de apoyo en salud pública para controlar la contaminación biológica por ácaros en espacios intramuros. Este dispositivo les da a los pacientes o usuarios la posibilidad de conocer los niveles de alérgenos de ácaros, para que, en caso de ser necesario, se realicen acciones de intervención ambiental que redunden en el mejoramiento de la calidad de vida.

www.propiedadpublica.com.co

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Cultivo de ácaros Blomia tropicalis, especie predominante en Barranquilla.

http://www.uninorte.edu.co/web/grupo-prensa /noticia?articleId=339604&groupId=73923

Evaluación por Dotblot de la interacción entre los anticuerpos nanoconjugados con oro coloidal y alérgenos de ácaros intradomiciliarios.

Imagen del Investigador.

Inmunización del modelo animal.

Imagen del Investigador.

Prototipo del dispositivo de detección multiprueba Acarfast.

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Imagen del Investigador.

Cultivo de ácaros Blomia tropicalis.

http://alergiaweb.com/la-alergia-en-imagenes/

Tira cromatográfica para la detección de alérgenos en muestras de polvo mediante el uso de los anticuerpos IgY – NPG.

Imagen del Investigador.

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