MICROBIOLOGIA GENERAL
Guia de Trabajos Prácticos
Segundo cuatrimestre de
2009
Profesor a cargo: Dra. Nora Iñón de Iannino
Jefe de Trabajos Prácticos: Dr. Rodrigo Sieira
Ayudantes: Dra. Mara Roset
Dr. Andrés Ciocchini
Dra. Inés Marchesini
Lic. Juan Manuel Spera
Lic. Florencia Iannino
Lic. Lucas Bukata
Lic. Soledad Guidolín
Lic. Mariela Del Giudice
Lic. Claudia Hermann
Colaboradores: Bqca. Berta Cazzulo
Liliana Sferco
Agustina Chidichino
OBJETIVOS GENERALES
1) Manipulación general en el laboratorio de microbiología.2) Introducción al mundo microbiológico: nomenclatura, diferenciación, observación.
3) Conocimiento fundamentado de los requerimientos de los microorganismos y de las consecuencias de su desarrollo en el medio.
4) Introducción a la metodología científica: planteamiento de objetivos, desarrollo experimental, elaboración de conclusiones, búsqueda bibliográfica, escritura de informes.
CONDICIONES DE REGULARIDAD DE LA MATERIA
1) Aprobación de los dos parciales teórico/prácticos con nota mayor o igual a cinco. Se podrá recuperar sólo uno.
2) Aprobación de los trabajos prácticos, la cual estará dada por: a) 80% de asistencia
b) 80% de parcialitos aprobados. Los parcialitos se tomarán al comienzo de cada trabajo práctico y se evaluarán con las siguientes notas: D (desaprobado), R (regular), B (bien) y MB (muy bien). Aclaración: la acumulación de dos notas R equivalen a un parcialito desabprobado.
Importante: Se permitirá desaprobar sólo 2 parcialitos, siendo obligatoria la recuperación de uno de los dos (quedará a criterio de los profesores cuál será el parcialito a recuperar).
c) Aprobación de los informes de TP que se deberán entregar al finalizar cada trabajo práctico. d) Aprobación de monografías.
APROBACION DE LA MATERIA DEL ALUMNO REGULAR
1) En forma promocional: con nota mayor o igual a siete en los dos parciales teórico/practicos y nota mayor o igual a siete en los trabajos prácticos (esta nota estará dada por la evaluación de los parcialitos, informes, monografías y nota de concepto general).
2) Con examen final: nota mayor o igual a cinco.
NORMAS DE SEGURIDAD
Uno de los aspectos básicos del trabajo en el laboratorio de microbiología es saber mantener normas de seguridad mínimas para evitar infecciones con los microorganismos con los que se trabaja.
En el curso propiamente dicho algunos microorganismos utilizados pueden ser potencialmente patógenos, así mismo se realizarán aislamientos de fuentes naturales pudiendo aparecer algún posible patógeno por lo que se pide seguir las siguientes reglas:
1) No se puede comer, beber, fumar ni maquillarse en el laboratorio, ni llevarse a la boca ningún elemento que haya sido utilizado en el laboratorio (biromes, marcadores, dedos, etc.)
2) Es obligatorio asistir al laboratorio con guardapolvo, preferentemente de mangas largas y con puño. Las personas de pelo largo deben concurrir con el mismo atado y/o recogido.
3) Si un cultivo es volcado, informar inmediatamente al docente con el que se procederá a limpiar la zona con una solución bactericida.
3) El material contaminado (tips, pipetas, tubos), se descartará en envases provistos a tal efecto. 4) No volcar los cultivos en las piletas.
5) Una vez finalizada la clase lavarse las manos escrupulosamente con agua y jabón y con algún desinfectante (proceder del mismo modo durante la clase si accidentalmente se toca algún cultivo).
……….
BIBLIOGRAFIA
Libros de texto recomendados:-Microbiology. Prescott-Harley-Klein. Ed. Mc Graw-Hill. -Microbiología. Brock-Madigan. Ed. Prentice-Hall
Textos de microbiología disponibles en internet:
-Todar´s online textbook of bacteriology
(
University of Wisconsin-Madison):http://www.textbookofbacteriology.net
-Bacerial/prokaryotic phylogeny:
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Trabajos prácticos y seminarios
Horario: miércoles y viernes de 14 a 17 hs. Comienzo de trabajos prácticos: 21/8/09
Fecha límite de entrega de monografías: 18/11/09
T.P. Nº
tema
fecha
Vie 21/8 -Introducción. -Teórica TP 1. mie 26/8 -Placas de cultivo. -Diluciones seriadas. -Plaqueo de soluciones. 1 Normas de seguridad. Metodología general de trabajo. Técnicas de cultivo. Esterilidadvie 28/8
-Problemas TP 1.
14 hs Armado de columnas de Winogradsky.
8 Diversidad microbiana. Interacciones entre microorganismos que coexisten en un mismo hábitat. mie 2/9 15:30 hs
Entrega de temas de monografías
Vie 4/9 -Teórica TP 2.
mie 9/9
-Preparación de frotis -Tinciones.
-Observación con microscopio.
2 Características macro y microscópicas de cultivos bacterianos. Tinciones. Microscopía. -Problemas TP 2. vie 11/9 -Teórica TP 3. 3 Crecimiento bacteriano. Curva de crecimiento. Recuento de viables mie 16/9
.
-Análisis de resultados y problemas del TP 3. Vie 18/9
-Teórica TP 4.
mie 23/9
-Largar cultivos en medios de enriquecimiento 4 Aislamiento de bacterias.
Medios de enriquecimiento, selectivos y difierenciales. Diversidad metabólica
vie 25/9 -Pasar a medio selectivo.
mie 30/9 -Análisis de resultados y problemas del TP N° 4.
vie 2/10 ---
mie 7/10 -Consultas pre-parcial
vie 9/10 ---
mie 14/10 PARCI AL T EORI CO/PRACT I CO
vie 16/10 -Teórica TP N° 5. mie 21/10 -IMViC y Kligler. -Catalasa/Oxidasa. -Antibióticos. -Motilidad. 5 Metabolismo bacteriano. Pruebas bioquímicas y determinación de géneros. Resistencia a antibióticos.
vie 23/10 -Análisis de resultados y problemas del TP N° 5
6
Protozoos. Metodología general de trabajo. Cultivo. Microscopía mie 28/10 -TP N° 6 7 Genética bacteriana. Transformación. Mutación. Transposición y
complementación funcional. vie 30/10
-Teórica TP N° 7
-Conjugación Agrobacterium pgm. -Conjugación Agrobacterium wt
mie 4/11
-Estría pgm.
-Dilución y plaqueo wt.
vie 6/11 -Discusión de resultados y problemas TP 7.
mie 11/11 ---
vie 13/11 Entrega de monografías
mie 18/11 PRESENTACIÓN DE MONOGRAFÍAS
8 vie 20/11 -Columna de Winogradsky. Observación de resultados
mie 25/11 ---
vie 27/11 SEGU N DO PARCI AL T EORI CO/PRACT I CO
TP Nº 1 METODOLOGÍA GENERAL DE TRABAJO
Objetivo 1: Aprendizaje de la técnicas básicas que se utilizan para el cultivo de microorganismos.
a) Preparación de medios de cultivo. Uso de balanzas, mediciónde pH. b) Técnicas de esterilización.
c) Trabajo en condiciones de asepsia. Preparación de placas dePetri, tubos con medio de cultivo sólido y líquido.
d) Técnicas de siembra en cultivo líquido y en cultivo sólido:estriamiento, punción, rastrillado, volcado.
Objetivo 2: Detección de contaminantes, presencia de microorganismos en el medio ambiente.
a) Observación de la presencia de microorganismos en nuestroambiente. b) Control de trabajo en condiciones de asepsia
c) Control de asepsia.
Desarrollo:
1) Para realizar trabajos en condiciones de asepsia se deberá limpiar el area de trabajo (mesada) con la sustancia desinfectante provista por el docente, acto seguido se deberá encender el mechero bunsen. 2) Se prepararán placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45-50ºC. Volcar el medio en condiciones de asepsia (20-30 ml/placa) y esperar a que solidifique. Luego secar las placas invertidas en estufa a 42ºC.
3) Se prepararán tubos de ensayo con agar nutritivo fundido por volcación (10 ml/tubo). Se taparán con la torunda de algodón, se dejaran enfriar y se secarán en estufa a 42ºC.
4) Se harán diluciones seriadas de agua previamente autoclavada: 1/10, 1/100, 1/1000, y se sembrarán 0,1ml de cada dilución en distintas placas de Petri por la técnica del rastrillado.
5) Con un hisopo se tomarán muestras de distintos lugares: mesada, mano, etc. y se aplicará sobre una placa de medio nutritivo sólido.
f) Se comparará el crecimiento que resulta de apoyar en un medio de cultivo sólido la yema del dedo antes y después de un lavado con etanol 70%.
Las placas y tubos sembrados se cultivarán 24-48 h a 37ºC. Se deberán observar las colonias desarrolladas teniendo en cuenta las siguientes características macroscópicas:
FORMA TAMAÑO COLOR BORDE ELEVACION SUPERFICIE
CUESTIONARIO T.P. 1
1) Defina los siguientes términos: Desinfección, Desinfectante, Antisepsia, Germicida, Bactericida, Bacteriostático, Bacteriolítico.
2) Discuta la siguiente afirmación:
La muerte de una población bacteriana, del mismo modo que el crecimiento de la misma, es por lo general exponencial o logarítmica, es decir, la población se reduce en una fracción constante a un intervalo de tiempo constante. Este proceso se representa en el siguiente gráfico:
Por lo tanto, dado que la destrucción de la población es logarítmica, es teóricamente imposible eliminar a todos los microoganismos de una población por más que se incremente la extensión de tiempo usada en el tratamiento.
3) Describa cómo funciona un autoclave. ¿Qué condiciones se deben cumplir para esterilizar por calor húmedo? ¿Cuáles son las tres cosas que uno debe hacer al operar un autoclave para que el proceso sea seguro?
4) ¿Qué métodos usaría para esterilizar: pipetas de vidrio y placas de petri, agar nutritivo, soluciones de antibióticos, paquetes de placas de petri plásticas, solución de glucosa 2M, solución de glucosa 0,2M, interior de una cabina de flujo laminar, aceite mineral, material quirúrgico?
5) ¿Qué características de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para la elección de un método de esterilización?
6) ¿Por qué se requiere mayor tiempo de esterilización en horno que en autoclave? ¿Cuál es el agente esterilizante en cada caso?
7) ¿Cómo decontaminaría un erlenmeyer de vidrio donde fue crecido un cultivo de Bacillus subtilis y uno utilizado para crecer Escherichia coli?
7) Un tubo que contiene medio M9 + 0,5 % de glucosa fue autoclavado y posteriormente incubado a 37°C durante 72 horas. Al cabo de dicho tiempo se detectó crecimiento de microorganismos.
a) ¿Qué parámetros debería controlar para que el proceso de esterilización se lleve a cabo de manera adecuada?
b) Una vez solucionado el inconveniente, ¿Cómo determinaría si dicho caldo nutritivo está efectivamente estéril?
TP Nº 2
CARACTERÍSTICAS MACRO Y MICROSCÓPICAS DEL
DESARROLLO BACTERIANO.
Objetivo: entrenamiento en la preparación de extendidos y en distintas técnicas de coloración. Observación de distintas morfologias y agrupamientos bacterianos.
1. Coloración de Gram.
Gram halló una técnica basada principalmente en la coloración de las células con cristal violeta. Mediante esta técnica, aquellas células capaces de mantener el colorante violeta luego de un proceso de decoloración son consideradas Gram+ y las que no lo retienen y por lo tanto pueden ser coloreadas por un segundo colorante de contraste, son Gram-. Dado que se trata de células su visualización es por microscopía.
Desarrollo: A) FIJACION
Se tomará una ansada de cada colonia a analizar crecida en agar nutritivo y se la resuspenderá en una gota de agua colocada sobre un portaobjeto limpio, desengrasado y previamente rotulado. Se dejarán secar al aire estos materiales junto a la llama del mechero y posteriormente se los fijará por calor, pasando el preparado por encima de la llama SIN QUEMARLOS.
B) TINCION:
1-Cubrir el portaobjeto con la solución de Cristal Violeta y dejar en contacto 1 minuto. 2-Volcar el colorante y lavar con agua corriente.
3-Cubrir con la solución de Lugol (1 minuto). 4-Lavar con agua corriente.
5-Decolorar por arrastre con la solución decolorante(alcohol/acetona). (5 segundos). 6- Lavar con agua para parar la acción del decolorante.
7-Contrastar con la solución de Safranina por 1 minuto.
8-Lavar suavemente con agua corriente y dejar escurrir el porta en posición vertical.
9-Una vez seco el material teñido, se lo examinará usando aceite de inmersión bajo el microscopio óptico con el aumento de 100x.
Se deberán reconocer las características morfológicas y tintoriales de las distintas bacterias provistas. Se deberá informar el agrupamiento, forma, coloración según la siguiente guia:
FORMA: cocos (esféricas), bacilos (bastones, cilindros), cocobacilos (bastones cortos, ovoidales), vibrios (bacilo en forma de coma), espirilos (bacilos en forma de tirabuzón).
