UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO RODRÍGUEZ DE
MENDOZA DE AMAZONAS
FACULTAD DE INGENIERÍA Y CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGRÓNOMA
TESIS
PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO
AGRÓNOMO
POTENCIAL DE BIOCONTROL DE CEPAS NATIVAS DE
Trichoderma
spp
SOBRE LA MONILIASIS
(
Moniliophthora
sp)
DEL
CACAO NATIVO FINO DE AROMA, DE LA
PROVINCIA DE BAGUA, AMAZONAS - 2017
AUTOR: Br. Jaime Ramirez Ramirez
ASESOR: Mg. Santos Triunfo Leiva Espinoza
CO-ASESOR : Ing. Malluri Goñas Goñas
CHACHAPOYAS - PERÚ
UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO RODRÍGUEZ DE
MENDOZA DE AMAZONAS
FACULTAD DE INGENIERÍA Y CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGRÓNOMA
TESIS
PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO
AGRÓNOMO
POTENCIAL DE BIOCONTROL DE CEPAS NATIVAS DE
Trichoderma
spp
SOBRE LA MONILIASIS
(
Moniliophthora
sp)
DEL
CACAO NATIVO FINO DE AROMA, DE LA
PROVINCIA DE BAGUA, AMAZONAS - 2017
AUTOR: Br. Jaime Ramirez Ramirez.
ASESOR: Mg. Santos Triunfo Leiva Espinoza.
CO-ASESOR : Ing. Malluri Goñas Goñas.
CHACHAPOYAS - PERÚ
iii
DEDICATORIA
A Dios por darme la vida y permitirme llegar a cumplir cada
una de mis metas, a mis queridos padres Luz María Ramirez
Alcántara y Emérito Ramirez Olivera, quienes con su
ejemplo, esfuerzo y dedicación me enseñaron el verdadero
significado de la vida y me muestran día a día que los
esfuerzos tienen grandes recompensas.
A mis hermanos Moises, Heidy y María Del Carmen,
quienes con su apoyo, comprensión y paciencia
contribuyeron en mi formación profesional.
A la familia Chávez Montenegro en especial a Deisy, María
Nely y Antonio Timoteo, Por su apoyo incondicional, sus
consejos y cada uno de los valores que inculcaron en mi
persona, para ser cada día mejor.
¡Gracias a ustedes!
iv
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza y en particular a la Escuela
Profesional de Ingeniería Agrónoma, de la Facultad de Ingeniería y Ciencias Agrarias,
por los conocimientos teóricos y prácticos recibidos, para la consolidación de mi
formación profesional.
Al M.Sc. Segundo Manuel Oliva Cruz, director ejecutivo del Instituto de Investigación
para el Desarrollo Sustentable de Ceja de Selva (INDES- CES), medio por el cual se
ejecuta el proyecto Moniliasis – Cacao.
Al Dr. Pedro Mansilla y la Ing. Marielita Arce Inga, especialistas del laboratorio de
investigación en sanidad vegetal (LABISANV), por el apoyo incondicional en la
ejecución de la presente investigación de tesis.
Un sincero agradecimiento al Ing. Ing. Rolando Salas López, coordinador del proyecto
“Aplicación de herramientas biotecnológicas para el control de la moniliasis como
alternativa de la producción sostenible del cacao nativo fino de aroma en la provincia de
Bagua- Amazonas”. Por el apoyo en la accesibilidad a las diferentes actividades
desarrolladas en la ejecución del proyecto.
A todos los profesores de la UNTRM, en especial a los de la facultad de Ingenierías y
Ciencias Agrarias, y en especial al Mg. Santos Triunfo Leiva Espinoza. Por su apoyo
como asesor y a la Ing. Malluri Goñas Goñas por su apoyo como co-asesor de la
presente investigación.
A todas las personas que han formado parte de mi vida profesional quiero darles las
gracias por su amistad, consejos, apoyo, ánimo y compañía en los momentos más
difíciles de mi vida.
v
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO
RODRÍGUEZ DE MENDOZA DE AMAZONAS
Dr. POLICARPIO CHAUCA VALQUI
Rector
Dr. MIGUEL ÁNGEL BARRENA GURBILLÓN
Vicerrector académico
Dra. FLOR TERESA GARCÍA HUAMÁN
Vicerrectora de investigación
Ing. MSc. ERICK ALDO AUQUIÑIVÍN SILVA Decano de la Facultad
vi
vii
viii
ix
x
xi
ÍNDICE DE CONTENIDO
Pág.
DEDICATORIA ... iii
AGRADECIMIENTO... iv
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO RODRÍGUEZ DE MENDOZA DE AMAZONAS ... v
VISTO BUENO DEL ASESOR ... vi
VISTO BUENO DEL CO-ASESOR ... vii
JURADO EVALUADOR DE TESIS ... viii
DECLARACIÓN JURADA DE NO PLAGIO ... ix
ACTA D E EVALUACIÓN DE SUSTENTACIÓN DE TESIS ... x
ÍNDICE DE CONTENIDO ... xi
ÍNDICE DE TABLAS ... xiv
ÍNDICE DE FIGURAS ... xv
RESUMEN ... xvi
ABSTRACT ... xvii
I.INTRODUCCIÓN ... 18
1.1. Antecedentes de la investigación... 20
II. OBJETIVOS ... 23
2.1. Objetivo general ... 23
2.2. Objetivos específicos ... 23
III.MARCO TEÓRICO ... 24
3.1. Cultivo de cacao ... 24
3.1.1. Origen ... 24
3.1.2. Cultivo de cacao nativo fino de aroma ... 24
xii
3.1.4. Morfología gene ral ... 25
3.2. Moniliasis del cacao Moniliophthora roreri (Cif y Par) ... 26
3.2.1. Clasificación taxonómica ... 26
3.2.2. Síntomas ... 27
3.2.3. Daños ... 27
3.2.4. Ciclo biológico de la enfermedad ... 27
3.3. Control biológico (Trichoderma spp.) ... 28
3.3.1. Clasificación taxonómica ... 28
3.3.2. Características morfológicas ... 28
3.3.3. Mecanismos de control biológico o biocontrol ... 31
3.4. Definición de términos básicos... 33
IV.MATERIALES Y MÉTODOS ... 34
4.1. Lugar de ejecución ... 34
4.2. Fase laboratorio... 34
4.2.1. Diseño de la investigación ... 34
4.2.2. Población, muestra y muestreo ... 35
4.2.3. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos y procedimiento 36 4.3. Equipos, ins umos y materiales de laboratorio y de escritorio ... 39
4.3.1. Equipos ... 39
4.3.2. Materiales ... 39
4.3.3. Material biológico ... 40
4.3.4. Insumos... 40
4.3.5. Materiales de oficina ... 40
4.4. Procedencia de los hongos, antagonista y fitopatógeno ... 41
4.4.1. Cepas nativas de Trichoderma spp ... 41
4.4.2. Cepa de Moniliophthora sp ... 42
xiii
4.5.1. Preparación del medio del cultivo ... 42
4.5.2. Reactivación deMoniliophthora sp ... 43
4.5.3. Reactivación de las cepas nativas de Trichoderma spp. ... 43
4.5.4. Variables de estudio ... 44
4.5.5. Análisis de datos ... 47
V.RESULTADOS ... 48
VI.DISCUSIONES... 56
VII. CONCLUSIONES ... 59
VIII.RECOMENDACIONES... 60
IX.REFER ENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 61
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla N° 1: Cuadro ANVA ... 35
Tabla N° 2: Características generales del experimento (DCA) ... 36
Tabla N° 3: Tratamientos de la interacción de las cepas Trichoderma spp sobre Moniliophthora sp, más el testigo absoluto ... 37 Tabla N° 4: Cepas nativas de Trichoderma spp evaluados sobre Moniliophthora sp,
causante de la moniliasis del cacao de la provincia de Bagua ... 41
Tabla N° 5: Aislado de cepa de Moniliophthora sp, causante de la moniliasis del cacao de la provincia de Bagua ... 42
Tabla N° 6: Análisis de varianza (ANVA), para la variable de porcentaje de
micoparasitismo ... 48
Tabla N° 7: Micoparasitismo de Trichoderma spp sobre Moniliophthora sp ... 49 Tabla N° 8: Análisis de varianza (ANVA) para la variable de porcentaje de antibiosis .... 51
Tabla N° 9: Antibiosis de Trichoderma spp sobre Moniliophthora sp ... 52 Tabla N° 10: Análisis de varianza (ANVA) de la variable de porcentaje de antagonismos
potencial………..………..…54
Tabla N° 11: Antagonismo potencial de Trichoderma spp sobre Moniliophthora sp ... 55 Tabla N° 12: Ficha de evaluación del porcetaje de micoparasitismos de las cepas nativas
de Trichoderma spp sobre la Moniliophthora sp ... 73 Tabla N° 13: Ficha de evaluación del porcentaje de antibiosis de las cepas nativas de
Trichoderma spp sobre la Moniliophthora sp... 86 Tabla N° 14: Ficha de evaluación del porcentaje de antagonismo potencial de las cepas
nativas de Trichoderma spp sobre la Moniliophthora sp... 88 Tabla N° 15: Matriz de base da datos para procesamiento estadístico... 91
Tabla N° 16: Pruebas de contraste de normalidad... 92
Tabla N° 17: Prueba de comparación múltiple de Duncan, para la variable de
micoparasitismo.... 93
Tabla N° 18: Prueba de comparación múltiple de Duncan, para la variable de antibiosis. 93
Tabla N° 19: Prueba de comparación múltiple de Duncan, para la variable de antagonismo
xv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura N° 1: Ciclo de la moniliasis del cacao, causada por Moniliophthora roreri (Cif y
Par) ….. ... 27
Figura N° 2: Conidios y conidióforos de Trichoderma spp. ... 30
Figura N° 3: Mapa de ubicación del Laboratorio de Investigación de Sanidad Vegetal (LABISANV), de la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas (UNTRM)-Chachapoyas. ... 34
Figura N° 4: Croquis de la distribución de los tratamientos en laboratorio. ... 38
Figura N° 5: Proceso de micoparasitismo que realiza la cepa nativa de Trichoderma sp (CP 24-6) sobre la Moniliophthora sp, observada en el microscopio invertido con florescencia. ... 50
Figura N° 6: Proceso de antibiosis que realizan las cepas nativas de Trichoderma spp (CP24-6 y CP38-2) sobre la Moniliophthora sp, observada en el método de cultivos pareados... 53
Figura N° 7: Diagrama de la preparación del PDA para 65 y 650 placas petri... 65
Figura N° 8: Diagrama de reactivación de la cepa de Moniliophthora sp ... 66
Figura N° 9: Proceso de reactivación de las cepas nativas de Trichoderma spp. ... 67
Figura N° 10: Diagrama del proceso de instalación del micoparasitismo de la cepa nativa deTrichoderma sp (CP24-6) sobre Moniliophthora sp ... 68
Figura N° 11: Diagrama de evaluación del porcentaje de micoparacitismo de la cepa nativa de Trichoderma sp(CP24-6)sobre la Moniliophthora sp ... 69
Figura N° 12: Diagrama del proceso del proceso de tinción con azul de lactofenol ... 70
Figura N° 13: Diagrama del proceso de instalación de antibiosis de la cepa nativa de Trichoderma sp(CP38-2)sobre la Moniliophthora sp... 71
xvi
RESUMEN
El objetivo de la investigación fue evaluar el potencial de biocontrol de cepas nativas de
Trichoderma spp sobre la moniliasis (Moniliophthora sp) del cacao nativo fino de aroma, de la provincia de Bagua, Amazonas. La investigación se desarrolló a nivel in vitro. Se trabajó con 12 cepas nativas de Trichoderma spp y 1 de Moniliophthora sp, provenientes de plantaciones de cacao de la provincia de Bagua. Las variables evaluadas fueron:
Porcentaje de micoparasitismo, antibiosis y antagonismo potencial, de las cepas nativas de
Trichoderma spp sobre Moniliophthora sp. Para ello, se empleó un DCA, con 13 tratamientos (12 tratamientos más 1 testigo absoluto) y 5 repeticiones por cada tratamiento,
haciendo un total de 65 unidades experimentales. Los resultados obtenidos se evaluaron
con el test (Duncan α ≤ 5 %). Se registraron valores de 100 % de micoparasitismo para las
cepas nativas de Trichoderma spp (CP10-3, CP14-5, CP24-6 y CP53-2), difiriendo significativamente respecto a los demás tratamientos. Las cepas nativas de Trichoderma spp que mostraron porcentajes más altos de antibiosis sobre la Moniliophthora sp corresponden a CP24-6 con 57.27 % y 55.84 % a la cepa CP38-2 respectivamente.
Respecto al porcentaje de antagonismo potencial de las cepas nativas de Trichoderma spp sobre la Moniliophthora sp, la que presento un nivel máximo fue CP24-6 con 78.64 %. Esta investigación pone en manifiesto la posible existencia de cepas nativas de
Trichoderma spp con potencial de biocontrol de Moniliophthora sp, para experimentar en campo, así contribuir a mitigar daños producidos por la moniliasis del cacao.
xvii
ABSTRACT
The objective of the research was to evaluate the potential of biocontrol of native strains of
Trichoderma spp. On the moniliasis (Moniliophthora sp) of the native fine cocoa of aroma, of the province of Bagua, Amazonas. The research was developed in vitro. We worked with 12 native strains of Trichoderma spp and 1 of Moniliophthora sp, from cocoa plantations in the province of Bagua. The variables evaluated were: Percentage of
mycoparasitism, antibiosis and potential antagonism of the native strains of Trichoderma spp. On Moniliophthora sp. For this, a DCA was used, with 13 treatments (12 treatments plus 1 absolute control) and 5 repetitions for each treatment, making a total of 65
experimental units. The results obtained were evaluated with the test (Duncan α ≤ 5 %).
100 % mycoparasitism values were registered for the native strains of Trichoderma spp (CP10-3, CP14-5, CP24-6 and CP53-2), differing significantly with respect to the other
treatments. The native strains of Trichoderma spp. That showed higher percentages of antibiosis on the Moniliophthora sp correspond to CP24-6 with 57.27 % and 55.84 % to the strain CP38-2 respectively. Regarding the percentage of potential antagonism of the
native strains of Trichoderma spp on Moniliophthora sp, the one that presented a maximum level was CP24-6 with 78.64 %. This investigation shows the possible existence
of native strains of Trichoderma spp with the potential of biocontrol of Moniliophthora sp, to experiment in the field, thus contributing to mitigate damages produced by moniliasis of
cocoa.
18
I.
INTRODUCCIÓN
El cacao (Theobroma cacao L.) es uno de los cultivos más representativos de la región amazonas. Según la historia y la ecología este cultivo es oriundo de la Selva
Amazónica, en la cuenca de los de ríos de Amazonas y Orinoco zonas tropicales de
américa (Unodoc, 2014 y Mendoza, 2013). Posiblemente debido a que en esos lugares
encontró condiciones ambientales intrínsecas y extrínsecas favorables para su
crecimiento y desarrollo. Los arqueólogos refieren a los primeros consumidores de
cacao hace unos cuatro mil años. Alrededor del mundo los campos de cacao florecen en
más de 50 países y alcanzan los mayores niveles de producción en Costa de Marfil,
Indonesia, Ghana, Nigeria y Brasil. El resto de producción se encuentra en Ecuador,
Colombia, República Dominicana, Venezuela, Perú, Bolivia y otros (Unodoc, 2014).
Actualmente, el cacao en el Perú se ubica como el segundo cultivo permanente con
mayor superficie agrícola, ocupando un total de 144,200 hectáreas (INEI, 2012). En
cuanto a la producción en el Perú alrededor del 44 %, corresponde a cacao fino de
aroma (Nativo) y el 56 % de la producción es cacao corriente o común
(CCN-51+Forastero) (MINAGRI, 2016). De las cuales la provincia de Bagua, región
Amazonas es una de las zonas con mayor área de cultivo de cacao nativo fino de aroma,
en la región Amazonas con 2.124 hectáreas, de acuerdo al censo agropecuario, en este
contexto el cacao nativo fino de aroma, recibió su denominación de origen por el
Indecopi según el expediente N° 665597-2016 (Indecopi, 2016).
El cacao nativo, también conocido como cacao dulce. Su adaptabilidad es a distintas
condiciones ambientales y sus frutos de mayor calidad sin embargo el cultivo de esta
variedad requiere de mucho cuidado. Se caracteriza por su fruto de cáscara suave y
semillas redondas, de color blanco a violeta, dulces y de sabor agradable. El grano
contiene un alto nivel aromático y aceites esenciales y es vendido a altos precios. Esta
variedad crece por lo general en climas cálidos y húmedos de las tierras bajas tropicales
19
El cacao es una planta susceptible de sufrir daños fitosanitarios considerables a causa de
los insectos y hongos (Cerrón, 2012). La enfermedad con mayor influencia en la
reducción de la producción del cultivo es la moniliasis del cacao, (Moniliophthora roreri Cif y Par). Esta puede causar daños hasta del 80 % de la producción (Sánchez y Garcés, 2012). Los daños que causa M. roreri, son directamente al fruto y puede surgir en cualquier edad (Isla, 2009).
La infección por moniliasis del cacao, ocurre principalmente en las primeras etapas de
crecimiento de las mazorcas, la primera señal es la aparición de puntos o pequeñas
manchas de un color que sugiere una maduración prematura en mazorcas que aún no
han alcanzado su desarrollo completo (Cerrón, 2012). Si la enfermedad cumple su ciclo
en el fruto, forma una sustancia algodonosa de color crema o blanquecino, posterior a
ello el fruto se seca provocando su momificación (Isla, 2009).
El biocontrol haciendo uso de cepas de Trichoderma es útil para combatir hongos fitopatógenos indirectamente, puesto que las cepas compiten por el espacio y los
nutrientes, cambian las condiciones ambientales, estimulan el crecimiento de las plantas
y sus mecanismos de defensa o producen antibiótico, las cepas además pueden realizar
el biocontrol directamente mediante micoparasitismo. Ambos mecanismos pueden
actuar en forma coordinada y su importancia en el biocontrol dependerá de la cepa de
Trichoderma (Benítez et al., 2004). Según reportes de investigaciones, uno de los mecanismos antagónicos que utiliza Trichoderma spp es el micoparasitismo. En este mecanismo se ven implicadas enzimas como quitinasas, celulasas, β-1-3-glucanasas y
proteasas que lisan o digieren las paredes celulares de los hongos como Moniliophthora roreri. Las especies T. virens y T. harzianum se han utilizado para el biocontrol de moniliasis del cacao Theobroma cacao L) con resultados óptimos (López et al., 2017).
20
1.1.Antecedentes de la investigación
A nivel internacional, encontramos trabajos como los de Villamil et al. (2012), quienes realizaron la evaluación in vitro de microorganismos nativos por su antagonismo contra Moniliophthora roreri Cif y Par en Cacao (Theobroma cacao L.) en Tunja, Colombia. La evaluación la realizaron en cajas petri con PDA, para lo
cual colocaron en el centro de las mismas, un disco de 5 mm de diámetro
colonizado por el patógeno y a 3 cm del borde, sobre los ejes horizontal y vertical,
cada uno de los aislamientos. Los microorganismos nativos que inicialmente
mostraron antagonismo fueron posteriormente evaluados in vitro por su capacidad de restringir el crecimiento y esporulación de M. roreri. Los resultados indicaron que 7 microorganismos mostraron antagonismo contra M. roreri y entre ellos los más efectivos fueron los hongos H5 y H20 (Trichoderma ) y la bacteria B3, los hongos para la restricción tanto del crecimiento como de la esporulación y la
bacteria para el crecimiento. El hongo H20 inhibió en su totalidad el crecimiento de
M. roreri. de acuerdo con la caracterización morfológica y las pruebas bioquímicas los hongos pertenecen al género Trichoderma y la bacteria al género Bacillus.
Párraga y Zambrano (2012), evaluaron la capacidad antagónica de Trichoderma spp., a nivel in vitro frente a los hongos fitopatógenos Crinipellis perniciosa y Moniliophthora roreri”. Para ello aislaron cepas de estos microorganismos de muestras tomadas del jardín clonal de cacao ubicado en el campo politécnico de la
ESPAM MFL, donde se aislaron 28 cepas de las cuales basadas en sus
características físicas cualitativas como color de esporas olor que emite el medio y
presencia de fiálides se escogieron 12 cepas, siendo codificadas C1, C2, C3, C4,
C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, donde determinó la velocidad de crecimiento
utilizando una regla estandarizada en mm, mediante el diseño completamente al
azar DCA con 4 réplicas y establecer la capacidad antagónica in-vitro de acuerdo a
las clases y zonas de antagonismo, donde se confirmó que las cepas C1, C3, C4,
21
Villamil et al. (2015), evaluaron la aplicación de antagonistas microbianos para el control biológico de Moniliophthora roreri Cif y Par en Theobroma cacao L. bajo condiciones de campo en Tunja, Colombia. Los tratamientos fueron: T1, hongo H5;
T2, hongo H20; T3, bacteria B3 y T4, testigo. Donde valuaron incidencia y
severidad externa e interna en los frutos. Los resultados de severidad externa e
interna mostraron que, respecto al control la disminución del daño en los frutos fue
del 19,5 y 11,2 % en el T1, del 28 y 19,5 % en el T2 y del 13,5 y 8,5 % en el T3,
respectivamente con diferencias estadísticas a favor del T2. Se concluye que entre
los tres antagonistas evaluados, el hongo H20 (Trichoderma sp.) tiene el mayor potencial para el control de la moniliasis del cacao en condiciones de campo.
Mejía y Alvarado (2016), realizaron la evaluación in vitro de hongos nativos antagonistas de Moniliophthora roreri (Cif. y Par., Evans et al.,) en el cultivo de cacao (Theobroma cacao L.) en Managua – Nicaragua. Para ello recolectaron muestras en tres zonas cacaoteras de Nicaragua para la caracterización morfológica
del patógeno y de los potenciales microorganismos antagonistas. Las pruebas de
antagonismo “in vitro” se realizaron a través de la técnica del cultivo dual. Se evaluó el crecimiento radial del patógeno y de los antagonistas, el porcentaje de
inhibición del crecimiento radial (PICR) del patógeno y la capacidad de control
biológico de los hongos antagonistas. Se obtuvieron cuatro aislados del patógeno
M. roreri y 17 aislados de hongos antagonistas. El PICR del patógeno ejercida por aislados del antagonista Trichoderma varió de 40.13 % a 46.77 %, en los aislados del antagonista Paecilomyces el PICR osciló entre 59.38 % y 67.43 %, en el único aislado del antagonista Clonostachys el PICR fue de 62.33 %-67.22 %. Los 17 aislados se ubicaron en las clases 1, 2 y 3 de la escala de valoración de
antagonismo. Los resultados de este estudio indican que en el agroecosistema de
cacao existen microorganismos nativos que tienen potencial para ser usados como
agentes de control biológico del patógeno M. roreri.
22
micelial y la producción de conidios a 25, 30 y 35 °C se consideraron variables
fisiológicas. El micoparasitismo, antibiosis y antagonismo potencial fueron las
variables antagónicas. Se encontraron diferencias significativas (P = 0.0001) en todas las variables evaluadas. El intervalo de temperatura óptima para el crecimiento micelial y producción de conidios fue de 25 a 30 °C. El
micoparasitismo varió de 0 a 100 % y sólo los aislamientos de seis especies
mostraron esta característica. La antibiosis osciló entre 6.8 y 55.5 %, y el
antagonismo potencial varió de 3.4 a 69 %. Trichoderma virens (TTC017) y T. harzianum (TTC090, TTC039, TTC073) mostraron el mejor biocontrol potencial in vitro, por lo que son cepas prometedoras para futuras investigaciones sobre control biológico de la moniliasis del cacao.
A nivel nacional, se reportan investigaciones como la de Torres (2012), quien
evaluó el efecto "in vitro" de especies nativas de Trichoderma sobre la germinación y crecimiento de Colletotrichum sp., aislado del cultivo de café, distrito de Jaén – Cajamarca. Se evaluó el efecto in vitro de la actividad antagónica de las tres especies nativas de Trichoderma sobre C. acutatum para ello se empleó la técnica de cultivo dual en placa, donde los Trichoderma nativos obtuvieron un grado antagónico I según la escala de Bell et al.,(1982) los que fueron capaces de crecer sobre el fitopatógeno en condiciones de laboratorio y finalmente se realizó la
técnica microcultivo con el método del bloque, evidenciándose mediante
observaciones microscópicas, los diferentes mecanismos de micoparasitismo tales
como, fragmentación, formación de clamidosporas, enrollamiento, penetración y
adherencia de las hifas del antagonista. Concluyo que, Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma harzianum nativas disminuyen la germinación conidial y el crecimiento de Colletotrichum acutatum; siendo Trichoderma harzianum y Trichoderma viride las que presentan mayor efecto sobre C. acutatum.
23
(ICT - T), ubicado en el distrito de la Banda de Shilcayo, provincia y región San
Martín - Perú. Se consideraron 14 tratamientos, de los cuales, en cuatro de ellos se
usaron de forma individual las cepas de Trichoderma Nº 17, 22, 91 y 126; se realizaron además, combinaciones de cepas en forma dual en seis tratamientos, así
como una combinación de todas las cepas (Tratamiento 11) y de tres controles
(Tratamientos 12, 13 y 14). Para la obtención de los resultados se evaluaron las
variables; altura de planta, diámetro de tallo, número de hojas; área foliar, longitud
radicular, biomasa total, contenido nutricional y resistencia foliar a Phytophthora palmivora, en la cual se usó discos de hojas, inoculadas con gotas que contenían una densidad de zoosporas de 2x105mr1. Los resultados de este estudio muestran
que el Tratamiento 4 (T.E.-126), obtuvo mejores resultados, siendo una alternativa
biológica, para el control de Phytophthora palmivora; haciendo de éste estudio, un gran aporte en la agricultura orgánica.
II.
OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Evaluar el potencial de biocontrol de cepas nativas de Trichoderma spp sobre la moniliasis (Moniliophthora sp) del cacao nativo fino de aroma, de la provincia de Bagua, Amazonas.
2.2. Objetivos específicos
Determinar el porcentaje micoparasitismo, de las cepas nativas de Trichoderma spp sobre la moniliasis (Moniliophthora sp) del cacao nativo fino de aroma.
Determinar el porcentaje de antibiosis, de las cepas nativas de Trichoderma spp sobre la moniliasis (Moniliophthora sp) del cacao nativo fino de aroma.
Identificar el mejor tratamiento con respecto al porcentaje de antagonismo
24
III.
MARCO TEÓRICO
3.1. Cultivo de cacao
3.1.1.Origen
El cacao (Theobroma cacao L), es uno de los cultivos que han dado los aportes más importantes para la agricultura en cuanto a lo económico e
investigativo. Es originario de la zona tropical de América (cuencas de los
ríos Amazonas y Orinoco), su manejo fue extensivo en Mesoamérica, y
luego cultivado intensivamente por los mayas (México). Después de la
llegada de los europeos a América, el cultivo del cacao se ha expandido al
Caribe, Asia y África, y es hoy día pantropical. En la selva peruana se
encuentra una gran diversidad de especies, constituyendo un banco de genes
para el mejoramiento y obtención de nuevos tipos de cacao con mejores
características agronómicas y organolépticas (Mendoza, 2013).
3.1.2.Cultivo de cacao nativo fino de aroma
Las características de caco nativo, también conocido como cacao dulce, se
caracterizan por su fruto de cáscara suave y semillas redondas, de color
blanco a violeta, dulces y de sabor agradable. El grano contiene un alto nivel
aromático y aceites esenciales y es vendido a altos precios. Esta variedad
crece por lo general en climas cálidos y húmedos de las tierras bajas
tropicales de Latino américa (Cacao silvestre Boliviano, 2011). El cacao
nativo fino de aroma recibió la denominación de origen por el Indecopi
según el expediente N° 665597-2016, gracias a la gestión de la Cooperativa
Central de Productores Agrarios de Amazonas (Ceproaa). De esa manera,
unos 1,239 socios productores de esta región se beneficiarán con la
diferenciación de su producto (Indecopi, 2016).
Los cacaos finos de aroma son la base del chocolate gourmet. Se originan típicamente de árboles criollos, y depende de procesos apropiados para
alcanzar los estándares adecuados de calidad. No existe un criterio único
para aceptar que el cacao de determinado origen se pueda clasificar como
cacao fino de aroma. Los responsables de evaluar la calidad del cacao
25
sus decisiones en el grado de fermentación y el origen genético del grano,
estos dan características específicas de aroma o color de chocolates finos
(Barrientos, 2015).
3.1.3.Clasificación taxonómica
Todas las plantas de acuerdo al lugar en dónde se ubiquen o se cultiven
reciben distintos nombres “nombre común”. Sin embargo, cada planta cuenta con un nombre único o específico “nombre científico” (Mendoza,
2013). El nombre científico del cacao es Theobroma cacao L.; el cual pertenece a la siguiente clasificación según García, 1987 (como se citó en
Silva, 2015).
Clase : Dicotiledónea.
Orden : Malvales.
Familia :Malvaceae
Sub familia: Sterculioideae.
Género : Theobroma. Especie : cacao L.
En la literatura botánica actual se reconocen dos subespecies:
Theobroma cacao L. subesp. cacao: grupo criollo.
Theobroma cacao L. sphaerocapum (chev.): grupo forastero (Dostert et al., 2012).
3.1.4.Morfología general
Theobroma cacao L, es un árbol o arbusto semi caducifolio de hasta 12(-20) m de altura, en cultivo se mantienen normalmente a 4-8 m (10, 16, 21). El
tallo es glabro o parcialmente pubescente en ejes jóvenes. La corteza es
oscura, gris-café. Las ramas son cafés y finamente vellosas. Las hojas son
coriáceas (o cartáceas) simples, enteras (ligera e irregularmente situadas),
angostamente a obovado-elípticas, 17-48 (-60) cm de largo y 7-10 (-14) cm
de ancho, La base de las hojas es redondeada a ligeramente cordada, ápice
largamente apiculado. El pecíolo es de 14-27 mm de largo. Las estípulas
26
flores son pentámeras, hermafroditas, actinomorfas, y 10-20 mm de
diámetro; el pedúnculo floral es de 1-3 cm de largo. Los sépalos son
(verdosos) blancos o rosa claros, 5-8 mm de largo, 1.5-2 mm de ancho,
angostamente lanceolados, persistentes y fusionados en la base. Los pétalos
son un poco más largos que los sépalos, 6-9 mm de largo, libres,
amarillentos, con dos (tres) nervios violetas adentro, glabros, con la parte
inferior redondeada o abruptamente atenuada, recurvos y apiculados. Los
estambres son 10 y lineares; cinco estambres fértiles se alternan con cinco
estaminodios; todos los estambres están fusionados en la base formando un
tubo; los estambres fértiles son de 2,5-3 mm de largo y están dispuestos
frente a los pétalos; los estaminodios son violeta y 6.5-7.5 mm de largo. El
ovario es de 2-3 mm de largo, ligeramente pentagonal y pentámero. Los
óvulos se disponen en dos filas con 6-12 (-16) óvulos por fila. El fruto es
una baya grande (mazorca), polimorfa, esférico a fusiforme, púrpura o
amarillo en la madurez, glabro, 10-20 (-35) cm de largo. 7 cm ancho,
200-1000 gr de peso y con 5-10 surcos longitudinales. El endocarpo es de 4-8
mm de grosor, duro y carnoso, y leñoso en estado seco. Las semillas son
café-rojizas, ovadas, ligeramente comprimidas, 20-30 (-50) mm de largo,
12-16 mm de ancho y 7-12 mm de grosor (Dostert et al., 2012).
3.2. Moniliasis del cacao Moniliophthora roreri (Cif y Par) 3.2.1.Clasificación taxonómica
Clasificación taxonómica, según BIOSCIENCE, 2004 (como se citó en
Mosquera, 2014).
Reino : Fungi
Phylum : Basidiomycota
Clase : Basidiomycetes.
Subclase : Agaricomycetidae
Orden : Agaricales
Familia : Marasmiaceae
27
3.2.2.Síntomas
La infección de moniliasis del cacao, ocurre principalmente en las primeras
etapas del crecimiento de las mazorcas, la primera señal de la infección; es
la aparición de puntos o pequeñas manchas de un color aceitoso, que sugiere
una maduración prematura en mazorcas que aún no han alcanzado su
desarrollo completo (Cerrón, 2012).
3.2.3.Daños
Las mazorcas infestadas con frecuencia presentan tumefacciones. Cuando
estas mazorcas se abren se encuentran más o menos podridas en su interior y
parecen más pesadas que las mazorcas sanas de igual tamaño. Con el tiempo
aparece en la superficie de la mazorca, una mancha parda rodeada por una
zona de transición de color amarillento. Esta mancha puede crecer hasta
llegar a cubrir una parte considerable o la totalidad de la superficie de la
mazorca. Bajo condiciones húmedas crece sobre la superficie de la mancha
una especie de felpa dura y blanca de micelios de la M.roreri, que puede cubrir la totalidad de la mancha, y sobre el micelio se produce gran cantidad
de esporas que dan a la masa un color crema o café claro (Cerrón, 2012).
3.2.4.Ciclo biológico de la enfermedad
28
3.3. Control biológico (Trichoderma spp).
El género Trichoderma está integrado por un gran número de cepas fúngicas que actúan como agentes de control biológico y cuyas propiedades antagónicas se
basan en la activación de mecanismos muy diversos. Las cepas de Trichoderma pueden ejercer el biocontrol de hongos fitopatógenos indirectamente, compitiendo
por el espacio y los nutrientes, modificando las condiciones ambientales,
estimulando el crecimiento de las plantas y sus mecanismos de defensa o
produciendo antibióticos, también pueden realizar ese biocontrol directamente,
mediante micoparasitismo. Estos mecanismos pueden actuar de forma coordinada
y su importancia en los procesos de biocontrol depende de la cepa de Trichoderma (Benítez et al., 2004).
3.3.1.Clasificación taxonómica
El hongo tiene la siguiente clasificación taxonómica (Argumedo et al., 2009).
Reino : Myceteae
División : Eumycota
Subdivisión : Ascomycotina
Clase : Euascomycetes
Orden : Hyphocreales
Familia : Hypocraceae
Género : Trichoderma
3.3.2.Características morfológicas
Según Rifai (1969), las características generales para todas las cepas o razas
de Trichoderma spp., son las siguientes:
a) Colonia
Las especies del género Trichoderma pueden formar colonias flojas o compactas, pudiendo presentarse numerosas variaciones entre éstos dos
extremos; ocasionalmente se presentan estas dos características sobre una
29
está relacionada con la estructura de los conidióforos. El color de las
colonias se debe a la pigmentación de las fialosporas, así como, a la
cantidad de esporas producidas; algunos aislamientos pueden producir
cristales o secretar pigmentos que decolora el medio, el pH del medio
influye en la coloración de las colonias de Trichoderma spp., puede mostrar una coloración diferente, que varía de amarillo a amarillento o
verde oscuro; además la presencia de elongaciones de las hifas estériles
sobre los penachos de los conidióforos de Trichoderma hamatum, hacen que las colonias aparezcan blancuzcas o verde grisáceas. Algunas
colonias presentan desprendimiento de olores.
b) Micelio
El micelio se encuentra constituido por hifas hialinas, septadas de
paredes lisas y con abundante ramificación.
c) Clamidospora
Las clamidosporas están presentes en muchas especies, las mismas que
pueden ir intercaladas, ocasionalmente terminales o sobre una
ramificación lateral de una hifa corta, es globosa o elipsoidal, incolora y
de pared lisa.
d) Conidióforo
Los conidióforos poseen una estructura compleja, caracterizada por su
abundante ramificación, cónicos o piramidales. Sobre las ramificaciones
principales de los conidióforos se producen ramificaciones principales
laterales cortas, individuales o en grupos de tres, otros se colocan hacia
fuera, alejado de las ramificaciones laterales cortas.
e) Fiálides
Son estructuras que se parecen a un frasco, a una pera, por lo general
reducida en su base, con una hinchazón en la parte media, luego atenuado
bruscamente cerca del ápice en un cono angosto y con cuello
30
cinco alrededor del extremo de las penúltimas células de las
ramificaciones o pueden originarse a lo largo de las mismas, en forma
individual, alternadamente o en pares opuestos. Generalmente las fiálides
terminales son ligeramente más largas que las originales bajo ellas.
f) Esporas
Las esporas son fialosporas producidas individualmente o sucesivamente
acumuladas en el ápice de las fiálides, conformando una cabeza de
esporas, cuyo diámetro es inferior a 15 micras, rápidamente pueden estar
en cadenas cortas; ovoides, elípticas, cilíndricas o casi oblongas, a veces
con apariencia angular, ocasionalmente trucada en su base.
Figura N° 2: Conidios y conidióforos de Trichoderma spp. (400 x) (Infante et al., 2009).
g) Acción de Trichoderma spp sobre Moniliophthora roreri (Cif y Par)
Actualmente el género Trichoderma es uno de los agentes de mayor uso en programas de control biológico como antagónico y regulador de
fitopatógenos en su caso en los sistemas agroforestales-cacaotal. Uno de
los mecanismos antagónicos que utiliza Trichoderma spp., el que se reportan en las investigaciones es el micoparasitismo, en este mecanismo,
generalmente se ven implicadas enzimas extracelulares como quitinasas,
celulasas, β-1-3-glucanasas y proteasas que lisan o digieren las paredes
de los hongos en su caso la enfermedad Moniliophthora roreri. Las especies T. virens y T. harzianum se han reportado su uso en el cacao
Conidios
31
(Theobroma cacao L.) utilizados para el biocontrol de M. roreri con resultados óptimos con efecto antagónico para esta enfermedad. Aparte
se ha comprobado que T. harzianum estimula y mejora el crecimiento de las plantas, lo que puede significar un posible aumento en los
rendimientos y calidad de la mazorca de cacao (López et al., 2017).
Los hongos antagonistas resultan importantes para el control biológico de
los fitopatógenos. En este sentido, las especies del género Trichoderma se destacan entre las más utilizadas para el biocontrol de patógenos
fúngicos del suelo. Estas especies presentan diferentes modos o
mecanismos de acción que le permiten el control de los fitopatógenos.
Entre estos mecanismos se encuentran: competencia por el sustrato,
micoparasitismo, antibiosis, desactivación de enzimas del patógeno,
resistencia inducida, entre otros. Mientras mayor sea la probabilidad de
que un aislamiento de Trichoderma, manifieste varios modos de acción; más eficiente y duradero será el control sobre el patógeno, aspectos que
no poseen los plaguicidas químicos (Infante et al., 2009).
3.3.3.Mecanismos de control biológico o biocontrol
a) Micoparasitismo
El micoparasitismo es definido como una simbiosis antagónica entre
organismos, en el que generalmente están implicadas enzimas
extracelulares tales como quitinasas, celulasas, y proteasas, y que se
corresponden con la composición y estructura de las paredes celulares de
los hongos parasitados (Infante et al., 2009).
Las especies de Trichoderma durante el proceso de micoparasitismo crecen quimio trópicamente hacia el hospedante (crecimiento
quimiotrófico), se adhieren a las hifas del mismo, se enrollándolas
alrededor de esta (adhesión y este enrollamiento) y las penetran en
ocasiones (actividad lítica). La degradación de las paredes celulares del
hospedante se observa en los estados tardíos del proceso parasítico, que
32
b) Antibiosis
Los metabolitos con actividad anti fúngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de compuestos volátiles y no volátiles, muy diverso
en cuanto a estructura y función. Muchas cepas de Trichoderma producen estos metabolitos secundarios, algunos de los cuales inhiben otros
microorganismos, con los que no se establece contacto físico y estas
sustancias inhibitorias fueron considerados «antibióticos».
La capacidad de una misma cepa de Trichoderma de secretar varios compuestos antifúngicos simultáneamente, limita el riesgo de aparición de
microorganismos resistentes a estos metabolitos, aspecto relevante desde
el punto de vista práctico. Estos resultados ejemplifican la importancia de
la antibiosis como parte de la actividad antagonista de este hongo (Infante
et al., 2009).
c) Antagonismo potencial
El fenómeno de antagonismos involucra diversas relaciones de orden
ecológico como la antibiosis y la competencia y de orden simbiótico como
la explotación o parasitismo. Los antagonistas pueden hacerse presentes
produciendo metabolitos antibióticos, o enzimas que degradan la pared
celular. Sin embargo, el éxito de los antagonistas en la planta puede
también ser gobernada por su capacidad de colonizar y utilizar los
sustratos en la superficie de la planta, permitiendo que compita
efectivamente con los patógenos (Mont, 2002).
Los antagonistas contribuyen a la atenuación de los daños que causan las
enfermedades, en los agroecosistemas donde existan condiciones para su
desarrollo y conservación. Para lograr este objetivo los microorganismos
beneficiosos presentan diferentes modos de acción que les permitan ejercer
su efecto biorregulador. Estos atributos, de conjunto con la capacidad de
multiplicarse abundantemente, se encuentran entre los de mayor
importancia para su selección como agentes de control biológico (Infante
33
3.4. Definición de términos básicos
Moniliasis del cacao: Es un hongo que ataca únicamente los frutos o mazorcas
de caco, causando pudrición de los granos. Se pasa de una planta a otra por el
viento y la lluvia, también por el traslado de frutos o mazorcas con moniliasis
de una plantación a otra (Mendoza, 2013). Esta enfermedad puede causar
daños hasta del 80 % en la producción (Sánchez y Garcés, 2012).
Trichoderma: Las especies pertenecientes al género Trichoderma se caracterizan por ser hongos saprófitos, que sobreviven en suelos con diferentes
cantidades de materia orgánica, los cuales son capaces de descomponerla y en
determinadas condiciones pueden ser anaerobios facultativos, lo que les
permite mostrar una mayor plasticidad ecológica (Infante et al., 2009).
Control biológico: Fundamentalmente el control biológico (lucha o combate
biológico) consiste en la regulación y supresión del potencial reproductor de
organismos a través de la acción de paracitos, predatores (depredadores) y
patógenos (Gonzales y Rojas, 1966).
Potencial de biocontrol: Es la capacidad que tiene ciertos microorganismos
antagonistas y entomopatógenos, que utilizando diferentes tipos de
mecanismos de control biológico, pueden repeler o eliminar las plagas, que
34
IV.
MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Lugar de ejecución
El proceso de evaluación del potencial de biocontrol de cepas nativas de
Trichoderma spp sobre la moniliasis (Moniliophthora sp), se llevó a cabo en los ambientes del Laboratorio de Investigación de Sanidad Vegetal (LABISANV) de
la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas - Ciudad
Universitaria Chachapoyas.
Figura N° 3: Mapa de ubicación del Laboratorio de Investigación de Sanidad Vegetal
(LABISANV), de la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de
Amazonas (UNTRM)-Chachapoyas.
4.2. Fase laboratorio
4.2.1.Diseño de la investigación
Se trabajó con un diseño completamente al azar (DCA), implementado por
13 tratamientos (12 tratamientos de la confrontación de las cepas nativas de
Trichoderma spp con Moniliophthora sp), más 1 tratamiento testigo absoluto) con 5 repeticiones formando un total de 65 unidades
experimentales (cada unidad experimental representó una placa petri de 9
35
Modelo aditivo lineal
Yij = µ + Ti + Eij
Donde:
Yij: mecanismos de biocontrol en el i- esima Moniliophthora sp, j-esima
repetición
fecto de la media general
Ti: Efecto del i-ésimo tratamiento
Eij: Efecto aleatorio (error experimental) que pertenece a la Yij
observación de la variable respuesta con i-ésimo tratamiento, j-ésima
tratamiento.
Análisis de varianza
Prueba de hipótesis
La hipótesis para tratamientos
Ho: T1 = T2 = T3 =… =T12
Ha: T1 T2 T3 … T12 para i = 1, 2, 3,…,12 tratamientos.
Nivel de significación: α = 5%
Tabla N° 1: Cuadro ANVA
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
Libertad
Cuadrados
Medios
Fc
Tratamiento SC
tratamientos
t-1 CMtratamiento CMtratamientos/
CME
Error SC error Σ𝑖−1𝑡 ( 𝑛𝑖− 1) CME
Total SC total Σ𝑗−1𝑡 ( 𝑛𝑖− 1)
Fuente: Cuadro ANVA (Torres, 2013.).
4.2.2.Población, muestra y muestreo
Población:
36
Muestra:
Representada por 65 placas petri, (c/u de 9 cm de diámetro que constituyó
una unidad experimental.) en el presente estudio.
Muestreo:
El muestreo fue de tipo probabilístico.
4.2.3.Técnicas e instrumentos para la recolección de datos y procedimiento
4.2.3.1. Técnicas de recolección de datos
La técnica que se utilizó para la recolección de datos en esta
investigación realizada el Laboratorio de Investigación de Sanidad
Vegetal (LABISANV), fue la observación directa.
4.2.3.2. Instrumentos de recolección de datos
Los datos fueron sistematizados en fichas de evaluación la misma
que fue utilizada para obtener datos cuantitativos precisos al
estudio de las variables de porcentaje de micoparasitismo,
antibiosis y antagonismo potencial.
4.2.3.3. Procedimiento
a) Características del experimento
Tabla N° 2: Características generales del experimento (DCA)
Descripción Indicador
Repeticiones 5
Tratamientos 13
N° de unidades experimentales 65
Área de la unidad experimental 63.62 cm2
Placas por repetición 1 de 9 cm de diámetro c/u
37
b) Descripción de los tratamientos
Tabla N° 3: Tratamientos de la interacción de las cepas de
Trichoderma spp sobre Moniliophthora sp, más el testigo absoluto
Tratamientos Descripción Códigos*
T0 Testigo absoluto CMP1-1 M.c0
T1 CP61-1 vs CMP1-1 T.c1 vs M.c0
T2 CP24-7 vsCMP1-1 T.c2 vs M.c0
T3 CP10-3 vs CMP1-1 T.c3 vs M.c0
T4 CP14-5 vs CMP1-1 T.c4 vs M.c0
T5 CP4-3 vs CMP1-1 T.c5 vs M.c0
T6 CP24-6 vs CMP1-1 T.c6 vs M.c0
T7 CP38-2 vs CMP1-1 T.c7 vs M.c0
T8 CP15-2 vs CMP1-1 T.c8 vs M.c0
T9 CP53-2 vs CMP1-1 T.c9 vs M.c0
T10 CP27-1 vs CMP1-1 T.c10 vs M.c0
T11 CP1-4 vs CMP1-1 T.c11 vs M.c0
T12 CP11-3 vs CMP1-1 T.c12 vs M.c0
*Los tratamientos se identificaron con las siguientes
abreviaturas: T.c12 vs M.c0 (T= Trichoderma, c12= número de cepa, M= Moniliophthora sp y c0= cepa 0)
c) Tratamiento control (testigo absoluto)
Tratamiento en el cual no se le aplico ningún tipo de
confrontación y estuvo distribuido en las 5 repeticiones. Este
sirvió para determinar si existe algún efecto o cambios entre los
38
d) Croquis de la distribución de tratamientos
39
4.3. Equipos, insumos y materiales de laboratorio y de escritorio 4.3.1.Equipos
Incubadoras Estufas Autoclaves Agitador vórtex
Cámara de flujo laminar Refrigerador
Microscopio invertido Cocinas eléctricas Balanza gramera
4.3.2.Materiales
Placas petri
Vasos Baker de 50 ml, 1000 ml y 2000 ml Pizeta
Espátula Asa de drigalski Asa de siembra en aro Hornilla eléctrica Lámina Porta objeto Lámina Cubre objeto Cinta adhesiva Cinta adhesiva Papel toalla Papel crack
Matraz erlenmeyer de 500 ml. Tubos de ensayo
40
Algodón Microtubos
Plumón indeleble azul Vernier digital
Aguja de disección Saca bocado de 5 mm Bisturí
Probeta de 1000 ml de vidrio Probeta de 25 ml de plástico Frascos de penicilina
4.3.3.Material biológico
Cepas de Trichoderma spp Cepas de Moniliophthora roreri
4.3.4.Insumos
Lejía al l % Alcohol al 96 % Ácido láctico Agua destilada Agua destilada estéril Agar papa dextrosa Azul de lactofenol Lugol
4.3.5.Materiales de oficina
Laptop
Calculadora científica Papel bond A-4
USB 8 GB
41
4.4. Procedencia de los hongos, antagonista y fitopatógeno
4.4.1.Cepas nativas de Trichoderma spp
Se trabajaron con 12 aislamientos de cepas nativas de Trichoderma spp, debidamente codificados como se describe en la (tabla N° 4).
Tabla N° 4: Cepas nativas de Trichoderma spp evaluados sobre Moniliophthora sp, causante de la moniliasis del cacao de la provincia de Bagua
*Las cepas se identificaron con las abreviaturas CP61-1. (C=Cepa,
P=Parcela, 61 N° de parcela y -1=N° de aislado).
Actualmente estos aislados de cepas nativas de Trichoderma spp, provenientes de agroecosistemas de cacao nativo fino de aroma de la
provincia de Bagua, se encuentran conservadas en el laboratorio de
LABISANV, de la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de
Amazonas (UNTRM). Todos los aislamientos de dichas cepas nativas de
Distrito Localidad Cepas* Tratamiento
Aramango Pomabamba CP61-1 T1
Copallín Santa Ana CP24-7 T2
Imaza Pakum CP10-3 T3
La Peca San francisco CP14-5 T4
Imaza Nuevo Horizonte CP4-3 T5
Copallín Santa Ana CP24-6 T6
La Peca Arrayan CP38-2 T7
La Peca San Francisco CP15-2 T8
Copallín Lluhuana CP53-2 T9
La Peca San Luis CP27-1 T10
Aramango Mirador CP1-4 T11
Imaza Pakum CP11-3 T12
42
Trichoderma spp, se reactivaron en placas petri con medio de cultivo de papa dextrosa agar (PDA).
4.4.2. Cepa de Moniliophthora sp
Este aislado de cepa de Moniliophthora sp, fueron tomados de la colección del laboratorio de LABISANV, proveniente de frutos de cacao nativo fino
de aroma, de la provincia de Bagua, tal como se observa en la (tabla N° 5).
Dicho aislamiento proveniente de la cepa de M. roreri, se reactivaron en placas petri con medio de cultivo de papa dextrosa agar (PDA).
Tabla N° 5: Aislado de cepa de Moniliophthora sp, causante de la moniliasis del cacao de la provincia de Bagua
*
Los aislamientos se identificaron con las siglas CMP1-1.
(C=Cepa, M=Moniliophthora sp, P=Parcela, 1=N° de parcela y -1=N° de aislado).
4.5. Métodos
4.5.1.Preparación del medio del cultivo
Se realizó con la siguiente metodología según (Párraga y Zambrano, 2012).
Se depositó en una probeta 2 Litro de agua destilada para luego ser
vertido a un vaso precipitado, seguidamente se pesó 78 gramos de medio
de cultivo patato dextrose agar (PDA) en una balanza analítica.
Luego se encendió la cocina eléctrica y se disolvió los gránulos del
medio de cultivo con una espátula y se esperó hasta que hierva el medio
de cultivo.
Descripción Indicador
Distrito La peca
Localidad Guayaquil
Código de aislamiento* CMP1-1
Género Moniliophthora sp
43
Rápidamente se depositó 250 ml de PDA en 8 matraces Erlenmeyer, para
luego llenar 20 ml en una probeta para depositar a cada uno de los tubos
de ensayo y se tapó con un papel aluminio a cada tubo de ensayo.
Los tubos de ensayo con 20 ml de potato dextrose agar (PDA), fueron
llevadas a esterilizar en la autoclave a 15 PSI, por 15 minutos a 121 °C,
después se dejó enfriar a 48 °C a 45 °C.
Después se transportó las placas petri a la cámara de flujo laminar para
ser esterilizados con rayos ultravioleta (UV) por 30 minutos, se apagó los
rayos UV, se hizo llegar los tubos de ensayo con 20 ml de medio de
cultivo potato dextrose agar (PDA), para verter el medio de cultivo a las
placas en este proceso se trabajó bajo un mechero prendido.
Una vez llenas las placas se rótulo indicando el medio de cultivo y la
fecha, luego dichas placas se llevó a refrigerar a 8 °C, para luego ser
utilizadas en la instalación de la tesis.
4.5.2.Reactivación de Moniliophthora sp
Consistió en reactivar la Moniliophthora sp conservados a 4 °C en tubos de ensayo, Con un asa de siembra en aro, previamente esterilizada en fuego 3
veces en mechero de alcohol, se extrajo una parte del micelio del hongo
Moniliophthora sp, para luego sembrar en la parte central de una placa petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) posteriormente se tapó y
rotulo metodología utilizada con algunas modificaciones de (Gordillo,
2017). Todo este proceso se realizó en la cámara de flujo laminar, todas las
placas petri se incubaron a 30 ± 1 °C por 10 días (Evans et al., 2003).
4.5.3.Reactivación de las cepas nativas de Trichoderma spp.
Consistió en reactivar las 12 cepas de Trichoderma spp conservadas a 4 °C presentes en los tubos de ensayo. Con una asa de siembra en aro,
previamente esterilizada en fuego 3 veces en mechero de alcohol, luego se
extrajo una parte del micelio del hongo Trichoderma spp, para luego sembrar en 12 placas petri en la parte central de cada una de las ellas con
medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) seguidamente se tapó y rotulo,
44
utilizada de (Gordillo, 2017) con algunas modificaciones. Todas las placas
petri se incubaron a 30 ± 1 °C por 4 días (Evans et al., 2003).
4.5.4.Variables de estudio
a) Micoparasitismo de cepas nativas de Trichoderma spp sobre
Moniliophthora sp
La habilidad micoparasítica de las cepas de Trichoderma spp sobre Moniliophthora sp, se evaluó con el siguiente método de (Evans et al., 2003).
Método de placas de petri precolonizadas
Un fragmento de 5 mm de diámetro de colonias de Moniliophthora sp de 10 días de edad fue colocado al borde de una placa petri de 9 cm de
diámetro con medio PDA. La que posteriormente fueron incubados
durante 25 días a 30 ± 1 °C en oscuridad. Consecutivamente un
fragmento de inóculo de Trichoderma spp de 2.5 cm de largo x 0.5 cm de ancho, se obtuvo de una colonia de 4 días de edad (cepa de
Trichoderma spp en placa petri), se sembró en el lado opuesto del inóculo de M. roreri. Las placas precolonizadas por Moniliophthora sp e inoculadas con Trichoderma spp se incubaron durante 15 días bajo las mismas condiciones señaladas para la precolonización.
Fueron establecidos cinco repeticiones por tratamientos
(confrontados) y cinco del tratamiento testigo. El testigo consistió de
placas petri precolonizadas por Moniliophthora sp, sin enfrentamiento de Trichoderma spp.
Después de la incubación, 10 muestras de 5 mm de diámetro se
extrajeron iniciando del inóculo de Moniliophthora sp en dirección al inóculo de Trichoderma spp. Las muestras se sembraron en placas petri con medio PDA se incubaron a 30 ± 1 °C bajo oscuridad. Las
muestras se observaron durante 7 días para detectar la presencia del
45
PP = (CT x 100) / N
Donde:
PP = Parasitismo (%).
CT = Muestras con crecimiento de Trichoderma spp N = Número de muestras extraídas de cada réplica.
Micoparasitismo (en microscopio) de cepa nativa de Trichoderma spp
sobre la Moniliophthora sp
Como referencia e ilustración del proceso de micoparasitismo que
realiza Trichoderma spp sobre el fitopatógeno de Moniliophthora sp, se observó una muestra del tratamiento más significativo (pequeña
estructura del micelio) al microscopio invertido con florescencia a un
aumento de 40x y 60x. Para ello en una lámina porta objetos se realizó
una tinción con azul de lactofenol según Suárez y Cabrales (2008), la
preparación de la muestra se realizó una extracción con una cinta
adhesiva de una pequeña estructura del micelio de la placa
confrontada con Trichoderma spp vs la Moniliophthora sp para luego pegarlo en la lámina porta objetos que contenía una gota de azul de
lactofenol.
Se realizó una observación minuciosa de las muestras preparadas ya
que durante el proceso de micoparasitismo la cepa de Trichoderma spp de crece quimiotrópicamente hacia el hospedante, adhiriéndose a
las hifas del mismo y se enrollan en ellas, en algunas ocasiones estas
penetran las hifas del fitopatógeno (Infante et al., 2009). También realizan interacción mediante el enrollamiento de las hifas de
Trichoderma spp sobre las esporas de Moniliophthora sp, en la mayoría de los casos deformándolas (Suárez y Cabrales, 2008). Todo
esto proceso se observa en la (figura N° 5) indicadas con flechas (rojas
las esporas de la Moniliophthora sp y amarilla las hifas de la cepa nativa de Trichoderma sp (CP24-6) y comparadas con esporas del testigo (T0) y las estructuras de la cepa CP24-6 (hifas del T6), se
46
(Moniliophthora sp), se enrollándolas y deformándolas hasta eliminarles por completo.
b) Antibiosis decepas nativas Trichoderma spp sobreMoniliophthora sp Método de cultivos pareados según (Holmes et al., 2004)
La antibiosis se calculó por el porcentaje de reducción del crecimiento
radial de Moniliophthora sp, para ello un fragmento de 5 mm de diámetro fue extraído con un sacabocado de la placa con
Moniliophthora sp de 10 días de edad se colocó en la periferia de una placa petri con medio PDA con la ayuda de un bisturí N° 11. Las
placas inoculadas se incubaron en oscuridad durante 7 días a 30 ± 1
°C, para establecer la colonia. Posteriormente la colonia de
Moniliophthora sp fue confrontada con el micoparásito, para lo cual, un fragmento de 5 mm de diámetro se obtuvo con un sacabocado de la
placa con Trichoderma spp de 4 días de edad se situó en el lado opuesto aMoniliophthora sp
Todas las placas petri se incubaron a 30 ± 1 °C en condiciones de
oscuridad, se establecieron cinco repeticiones por aislamiento y un
testigo, el que consistió en colonias de Moniliophthora sp sin confrontación, se rotuló las placas petri de acuerdo a cada una de las
cepas nativas de Trichoderma spp incluyendo la fecha, todo este proceso se realizó en la cámara de flujo laminar dentro de la cual
además había un mechero prendido. Para el crecimiento radial se
registró diariamente de acuerdo a una cartilla de evaluación donde
constaba la variable de estudios. Se paralizó la evaluación hasta que
uno de los aislamientos tuviera contacto micelial con Moniliophthora sp.
El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial fue determinado
