Modelado, análisis y control de sistemas biológicos biestables
Autor:
Jesús Jiménez Sobrado
Tutores:
Guillermo Heredia Benot
Departamento de Ingeniería de Sistemas y Automática, Universidad de Sevilla.
Luis Merino Cabañas
Departamento de Robótica, Visión y Control, Universidad Pablo de Olavide.
Titulación:
Ingeniería Industrial Intensificación en Automática Industrial
Año:
2013
Escuela Técnica Superior de Ingenieros UNIVERSIDAD DE SEVILLA
Autor:
Jesús Jiménez Sobrado
Ingeniería Industrial, intensificación en Automática Industrial.
Tutores:
Guillermo Heredia Benot
Departamento de Ingeniería de Sistemas y Automática, Universidad de Sevilla.
Luis Merino Cabañas
Departamento de Robótica, Visión y Control, Universidad Pablo de Olavide.
Septiembre, 2013
Índice
Índice del documento
Preámbulo I
1. Paradigma Actual de la biología sintética III
2. Perspectivas de la Biología Sintética IV
3. Biología Sintética e Ingeniería VI
4. iGEM International Genetically Engineered Machines VII
5. El grupo UPO-Sevilla VIII
6. FlashBacter IX
El Biestable Básico IX
El biestable Mejorado XII
Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable 1
1. Objeto 3
2. Alcance 5
3. Antecedentes. Discusión de Metodologías 7
Características de las Redes Reguladoras de Genes 7
Técnicas de modelado de redes reguladoras de genes 8
4. Decisión de las técnicas de modelado 13
Enfoque determinista 15
1. Especies y reacciones 17
El núcleo biestable 17
El biestable básico 19
El biestable modificado 21
2. Dinámica de las reacciones 24
Transcripción 24
Traducción 25
Índice
Represión 25
Degradación 26
Proteólisis 27
Inhibición ARN antisentido 27
3. Biestable Simple. Consideraciones de modelado 28
Represión y transcripción 28
Régimen permanente para la transcripción 28
Traducción 29
Parámetros 29
Modelo del biestable simple 30
4. Biestable modificado. Consideraciones de modelado 32
Agrupación de ecuaciones 34
Modelo del biestable modificado 34
5. Modelado del Sistema Biestable Simple en cinéticas simples 35
Consideraciones sobre el modelo en EDOs 35
6. Modelado del sistema biestable modificado en cinéticas simples 44
Consideraciones de modelado 44
7. Conclusión de los Modelos 50
Análisis de estabilidad determinista 51
1. Análisis de estabilidad del modelo del biestable simple 53 2. Análisis de estabilidad del sistema biestable mejorado 58
Análisis de bifurcaciones 63
1. Introducción de la teoría de bifurcaciones 65
2. Análisis de bifurcaciones del biestable simple 66
3. Estudio de bifurcaciones del modelo del biestable mejorado 72
Índice
Enfoque estocástico 81
1. La visión de Gillespie 83
Fundamentos de la Cinética Química Estocástica 83
La Ecuación Química Maestra 84
El Algoritmo de Simulación Estocástico 85
Tau-Leaping 87
Aspectos de interés del método 87
2. Scripts en Matlab 89
Algoritmos de simulación 89
Modelos de los sistemas 91
3. Selección de parámetros 95
4. Simulaciones estocásticas del biestable simple 98
5. Simulaciones estocásticas del biestable mejorado 102
Control de los sistemas biestables 109
1. Acciones de control de los biestables 111
Inducción 111
Degradación por temperatura 112
2. Modelo del biestable simple con acciones de control 113 3. Modelo del biestable mejorado con acciones de control 120
Análisis de los resultados experimentales en laboratorio 125
1. Experimentos en laboratorio 127
Sobre las medidas de los experimentos 127
2. Resultados experimentales del biestable básico 129
Conclusiones de los experimentos realizados sobre el biestable simple 133
3. Resultados experimentales del biestable mejorado 134
Conclusiones de los experimentos 136
4. Conclusiones generales de los experimentos en laboratorio 137
Índice
Conclusión final 139
Bibliografía 141
ANEXO: Fundamentos Biológicos
Preámbulo I
Preámbulo
Para la lectura de este proyecto fin de carrera, se aconseja la lectura este primer documento, donde se situará al lector dentro del marco histórico y científico en el que este estudio se desenvuelve.
A pesar de tratarse de un trabajo sobre Ingeniería Industrial, cuyo desarrollo radica en el estudio del modelado matemático de sistemas, los procesos sobre los que se trabajarán, tienen un cariz algo alejado de lo cotidiano dentro del mundo de la Ingeniería, en concreto, la biología molecular.
Así pues, también se recomienda hacer una lectura del anexo final “Fundamentos Biológicos”, donde se describen los entes e interacciones necesarias para la comprensión global del sistema que se va a tratar.
Muchas Gracias
II Preámbulo
Preámbulo III
1. Paradigma Actual de la biología sintética
La Revolución Industrial supuso un fuerte cambio de paradigma tecnológico y social que históricamente desembocó en un cambio Era. Durante la edad contemporánea las estructuras económicas europeas fueron remodeladas de tal forma que surgió una nueva estructura social acorde con las nuevas necesidades ocupacionales. A la par con la Revolución Industrial, el propio surgimiento de los modelos de estado democráticos no habría sido tan efectivo sin la participación de los vigentes avances tecnológicos que ayudaron a equiparar el poderío del ciudadano frente a las antiguas clases dominantes.
Todo ello ha dado lugar a la adecuada transformación de la sociedad y de las relaciones propias que se establecen entre los diferentes estratos.
Todas las revoluciones de nuestra era han llevado consigo el descubrimiento de un nuevo concepto y el nacimiento de las ciencias que apoyaban estas ideas. La Primera Revolución Industrial se produjo después de la aparición de la máquina de vapor, las mejoras que se sucedieron tras ella incitaron el estudio de la Termodinámica y el uso de la energía térmica. Algo parecido ocurrió con la electricidad durante la denominada Segunda Revolución Industrial que, tras la formulación de las leyes de Maxwell, el estudio desembocó en nuevos avances técnicos. La conjunción del concepto (Energía térmica, democracia, electricidad,…) y el espíritu innovador propio del ser humano, es suficiente para que las bases de una nueva época se establezcan.
Una situación diferente está teniendo lugar con la Información. Ésta ha conseguido un objetivo mucho más amplio que las anteriores, estar presente en diversas disciplinas.
Desde la biología con la genética, o la física con las actuales teorías de campos unificados, utilizan el concepto de Información como algo inherente en la realidad. Es esta idea la que radica en la computación o Internet. Por tanto, el avance actual de las ciencias no puede comprenderse sino como una relación interdisciplinar.
Observando el presente, podemos sugerir cuáles serán las disciplinas que están destinadas a revolucionar nuestra concepción del mundo en los años venideros. Entre las posibilidades dentro del mundo de la Ingeniería podemos encontrar el estudio de nuevos materiales que está consiguiendo grandes avances en los últimos años y por otro lado la robótica o la nanotecnología, que, aunque fueron grandes apuestas en las últimas décadas, no han conseguido diversificar su campo de aplicación o reformarse para tomar la iniciativa del verdadero cambio de paradigma que se esperaba de ellos.
La gran apuesta actual parece ser la Biología Sintética. Recordemos que las anteriores revoluciones comenzaron con una idea, un concepto, del cual surgen estudios en diferentes disciplinas y una ciencia la respalde. En este caso concreto, fue el descifrado del código genético junto con la posibilidad de creación de nuevas especies, la idea precursora de este campo de estudios.
IV Preámbulo
2. Perspectivas de la Biología Sintética
La Biología Sintética tiene unas perspectivas de aplicación verdaderamente asombrosas.
Medio Ambiente, biomateriales, procesos industriales, bioenergías, Biomedicina son unos de tantos ámbitos en los que la biotecnología podría participar.
Leyendo el Informe de Vigilancia Tecnológica en Biología Sintética realizado por GENOMA ESPAÑA Tendencias en 2006 [1] podemos concretar éstas perspectivas de aplicación y hacernos una idea de cuán cercanas se encuentran. En el apartado sexto
‘Perspectivas Futuras de la Biología Sintética’ se analizan estos aspectos.
Sintetizando el análisis, el informe muestra el siguiente cuadro:
Como se observa en el cuadro resumen, se contempla los siguientes campos: Medio Ambiente, Materiales, Procesos Industriales, Energía y Biomedicina. Efectivamente, la Biología Sintética se muestra como el gigante capaz de revolucionar tantos ámbitos como quepa esperar.
Preámbulo V La Fundación Alternativas sacó en 2011 un informe llamado Realidad y expectativas de la biología sintética. El documento recoge la transcripción de las ponencias de los participantes un seminario del Laboratorio de Alternativas.
Al final, se hace una recopilación de las conclusiones que se decidieron de las jornadas.
Entre ellas, destaco:
“…
2. La aplicación de los sistemas de trabajo de la ingeniería a la resolución de problemas biológicos está originando avances muy significativos en la biología y en sus aplicaciones biotecnológicas.
3. El uso de los métodos de cálculo avanzado permite conocer el funcionamiento de sistemas biológicos complejos. Estos pueden ser distribuidos en unidades teóricas que pueden considerarse como “piezas” de un proceso completo.
…
7. Esta área científica se encuentra en sus fases iniciales. Aunque los grupos norteamericanos son los más avanzados, no existe demasiada diferencia con los pocos grupos europeos que trabajan en este campo.
8. En España hay varios grupos de gran calidad trabajando en biología sintética y las áreas relacionadas.
…” [2]
Entre estos comentarios, se destaca el gran avance que actualmente está sufriendo esta disciplina y cómo no hay grandes diferencias entre los grandes centro de investigación del mundo.
VI Preámbulo
3. Biología Sintética e Ingeniería
Veamos algunas de las definiciones de que se han dado a la Biología sintética:
”…la ingeniería de la biología: la síntesis de complejos, sistemas basados biológicamente inspirados que desempeñan funciones que no existen en la naturaleza.”
Según: Applying Engineering to Biology: Report of a NEST High-Level Expert Group
“…La Biología Sintética se define como la síntesis de biomoléculas o ingeniería de sistemas biológicos con funciones nuevas que no se encuentran en la naturaleza…”
Wikipedia: Biología Sintética
“…Diseño y fabricación de componentes biológicos que no existen en la naturaleza…”
Tanto en las definiciones citadas como en los pilares de la propia Biología Sintética, se incluye la Ingeniería, la creación y el estudio de Sistemas como parte fundamental de su desarrollo. Es por tanto, una de las tareas que los ingenieros han de ir abarcando si, de hecho, este campo tan asombroso puede llegar a revolucionar el mundo.
La Biología Sintética nace después del avance de la Biología de Sistemas y de la Ingeniería Genética. La primera se centra en el estudio de los organismos a través de simulaciones basadas en algoritmos de resolución de los modelos matemáticos que ajustan el comportamiento de los sistemas; mientras que la Ingeniería Genética ha conseguido modificar los genes de los organismos para crear nuevos entes biológicos.
Algunos autores han señalado que hay que adaptar los métodos de trabajo de la Ingeniería para el desarrollo de la Biología Sintética. Bajo este supuesto, las cuatro ideas básicas que se deben ir cubriendo son:
• Estandarización de partes biológicas
• Reparto y especialización de tareas
• Organización de jerarquías
• Diseño de dispositivos autorreplicativos
Bajo estas premisas, aparece en el MIT (Massachusetts Institute of Technology) el primer concurso internacional de Biología Sintética llamado iGEM (International Genetically Engineered Machine)
Preámbulo VII
4. iGEM International Genetically Engineered Machines
La idea surge entre algunos profesores de ingeniería del MIT (Drew Endy y Tom Knight) con la finalidad de ser referencia internacional en Biología Sintética. Así, en 2003 en el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) comienza un curso de verano en el que un grupo de estudiantes diseñan sistemas biológicos. Esto evolucionó hacia una competición que año tras año ha crecido en número de participantes a nivel mundial.
Desde 2004 con 5 equipos llegaron a 165 en 2011. El concurso ha conseguido ser uno de los pilares fundamentales de la Biología Sintética a nivel internacional [1].
El iGEM además de servir de herramienta educativa y difusiva, encaja perfectamente en este planteamiento. Además de estimular la creación de grupos de trabajo de estudiantes de diversas disciplinas, se está creando toma una base de datos de registros de partes [2] utilizadas por cada grupo, alcanzando un grado de estandarización dispositivos.
Las esperanzas que están puestas en esta ciencia y concretamente en este concurso han hecho que tenga unos patrocinadores del nivel de FBI, NASA o MathWorks, que además son ajenos a la investigación de este campo. Entre los logros que está consiguiendo este concurso, muestro dos de los proyectos que se han presentado:
• Grupo Imperial College de Londres. En 2011 participaron con el proyecto Auxin, que se presentaba como un refuerzo en la lucha contra la desertificación del planeta.
Crearon un producto que ayudaba a las plantas a arraigar en zonas de desertificación.
http://2011.igem.org/Team:Imperial_College_London
• Grupo Washington. En 2011 participaron con el proyecto “Make it or Break it: Diesel Production and Gluten Destruction, The Synthetic Biology Way”. Un doble trabajo sobre la producción de Biofuel utilizando bacterias genéticamente ingeniadas, y sobre la eliminación del Gluten de los alimentos como solución a aquellos que sufren Celiaquía.
http://2011.igem.org/Team:Washington
Estos dos proyectos son claros ejemplos de cómo esta ciencia es de muy amplia aplicación y de cómo hoy por hoy ya está consiguiendo resultados tangibles.
Randy Rettberg, Ingeniero investigador del MIT de Massachusetts en la división de Ingeniería Biológica, dijo en otro artículo realizado por El País: “…la biología sintética la harán compañías nuevas y acabará creando su propia industria”.
VIII Preámbulo
5. El grupo UPO-Sevilla
En 2010 se crea este grupo por iniciativa de estudiantes de la licenciatura de Biotecnología en la Universidad Pablo de Olavide. Estos estudiantes (Adrián Arellano, David Caballero, Félix Reyes, Paola Gallardo, Eduardo Pavón y Eva Fernández) cuentan con el apoyo, supervisión y colaboración de los
profesores Fernando Govantes y Luis Merino para participar por primera vez en el concurso iGEM en ese mismo año. Preparan el proyecto ‘Bacterial Crowding’
con el que terminan compitiendo. El objetivo principal del trabajo fue el de explorar la posibilidad de dirigir una
pequeña población de bacterias hacia una diana expuesta en una superficie biológica para conseguir una interacción eficaz.
Fue el primer equipo andaluz y tercero de España en competir en el concurso y recibió una medalla de bronce honorífica por el trabajo realizado.
Página web del proyecto: http://2010.igem.org/Team:UPO-Sevilla
En 2011 tras la experiencia del año anterior, el grupo continúa su voluntad de competir y otros estudiantes y profesores se adhieren, logrando doblar el número de participantes.
• Alumnos: David Caballero, Aida Moreno, José Gutiérrez, Paola Gallardo, Adrián Arellano, Amalia Martínez, Eduardo Pavón, Félix Reyes, Yolanda González y Jesús Jiménez.
• Profesores: Luis Merino, Fernando Govantes, Víctor Álvarez, Manuel Béjar, Rafael Rodríguez, Antonio Prado, Antonio Pérez
La incorporación de personal más especializado hace posible realizar un proyecto más profundo y amplio. El objetivo general marcado fue el de sumergirse en el estudio de sistemas biológicos biestables. Basado en artículos de investigación y en trabajos ya realizados, consiguen preparar un trabajo competitivo.
En la competición regional europea celebrada en Amsterdam en Octubre del 2011, logran el pase a la final mundial y reciben el premio a la mejor labor de difusión ‘Best Human Practices Advance’. El mérito más reconocido, fuera de lo estrictamente científico, fue el de crear el primer blog en español sobre Biología Sintética [1] que tenía 66 post y recibió más 11.000 visitas hasta la fecha de la competición europea.
Página web del proyecto: http://2011.igem.org/Team:UPO-Sevilla
Preámbulo IX
6. FlashBacter
El proyecto presentado por el grupo UPO-Sevilla para el concurso de Biología Sintética iGEM 2011, pretendía continuar el trabajo realizado por numerosos investigadores en su búsqueda de sistemas biológicos biestables. La búsqueda de un biomarcador robusto, estable y de alta sensibilidad es la base de los sistemas de almacenamiento de la información en informática. El objetivo marcado fue el de la construcción de microorganismos que tengan la capacidad de almacenar información al igual que se hace en electrónica, en dos estados estables distinguibles.
En este sentido, el grupo subdividió parte del trabajo en 3 partes.
• El biestable básico (The Toggle Switch) – Este apartado, puso en marcha el dispositivo descrito por Timothy S. Gardner [1], y trabajar con él hasta conseguir sus curvas de funcionamiento.
• El biestable mejorado (Improving Toggle Switch) – Esta idea se basa en la del artículo mencionado anteriormente, pero lleva dos mejoras con el objetivo de lograr una estabilidad más evidente, y aumentar la robustez del sistema.
• El biestable epigenético (Epigentic Bistable) – Esta idea es algo más compleja desde el punto de vista biológico. De alguna manera, la robustez con este diseño estaría muy por encima de los anteriores. Además de usar unos fundamentos diferentes para conseguir tanto los estados de funcionamiento, como la estabilidad propia del sistema.
El Biestable Básico
El sistema básico consiste en un conjunto de dos represores controlados por dos promotores que se reprimen en presencia del represor gobernado por el promotor adversario.
La imagen esquemática del sistema recuerda al esquema de los biestable electrónicos tipo RS, donde tenemos dos señales de acción y dos salidas. A pesar de que pueda parecer más complejo, se tratan básicamente de mismos esquemas.
X Preámbulo El cambio de estado se produce por la adición de un químico que se asocia con alta afinidad al represor 1 y lo inactiva. Así se favorece la síntesis del represor 2 y queda reprimida la expresión del primero. La estabilidad se encuentra en el propio ciclo de retroalimentación que provoca que la aparición de uno de los productos sea inhibidora de la acción contraria. Durante la síntesis del represor 2 se produce una molécula fluorescente (GFP – green fluorescent protein) que facilitará el reconocimiento de este estado ya que la bacteria, físicamente, se iluminará de color verde. Si en este momento, aumentamos la temperatura del ambiente en el que está inmersa la bacteria hasta unos 42ºC, la proteína represora 2 se desestabiliza y se degrada más rápidamente. Esto hace que la expresión del represor 1 sea posible al no sufrir la acción inhibitoria que ejercía la partícula adversaria. De forma análoga a la anterior, el represor 1 se unirá al promotor 1 evitando así la expresión de su competidor. La nueva producción de proteína lleva asociada otra partícula fluorescente (RFP – red fluorescent protein)
Veamos el Data Page elaborado por Amalia Martínez Segura en el marco de este proyecto.
Preámbulo XI Otros sistemas parecidos a éste han sido desarrollados y probados por otros investigadores consiguiendo un éxito considerable. Sin embargo, la simplicidad de estas construcciones tiene ciertos inconvenientes en la consecución de un biestable con unas características similares a las de los informáticos:
• Baja velocidad en el cambio. Esto provoca que durante las etapas intermedias nos encontremos con una mezcla de partículas de ambos represores en convivencia transitoria que hace difícil la determinación del estado.
• En ausencia de señal de control, el sistema tiende espontáneamente a un estado aleatorio. Incluso en el caso de favorecer alguna expresión, la falta de autoexclusión hace fallar la robustez.
• Incluso con la inducción del químico, no siempre es posible asegurar que el estado se mantenga estable.
XII Preámbulo
El biestable Mejorado
El núcleo del sistema sigue siendo el mismo que el del biestable básico, sin embargo, en este caso se añaden dos nuevos efectos que mejorarán la exclusión de una reacción frente a la otra.
Los dos efectos que se añaden en este nuevo concepto son: Proteólisis y ARN antisentido.
PROTEÓLISIS
Cuando se expresa una de las proteínas represoras se crean además, proteasas. La labor de las proteasas es la de digerir las proteínas del estado anterior que queden en la bacteria. De esta manera se acelera la posición de la primera proteína como mayoritaria. La proteasa utilizada en la construcción es ClpX, que degrada sustratos a los que se les asocia un adaptador SspB.
ARN ANTISENTIDO
Durante la expresión de una de las proteínas, junto con ella se producen estas moléculas. Estos ARN tienen la misma estructura que la del ARN mensajero de la proteína adversaria.
Cuando un ARN mensajero y su ARN antisentido se encuentran, se unen, eliminando así la posibilidad de que sean traducidas en una nueva proteína.
Preámbulo XIII COMPORTAMIENTO GLOBAL
Estas dos nuevas acciones trabajan en colaboración con el sistema anterior para la robustez del sistema.
La idea por tanto, es añadir esta secuencia (Das4) específica en la fase de la proteína LacI y expresar condicionalmente el adaptador proteico bajo el promotor que controla el otro estado, de modo que cuando se añade IPTG, este inhibe la acción de lacI, que además es degradado por ClpX, incluso en ausencia de IPTG, eliminando cualquier actividad residual del inhibidor LacI y haciendo el cambio mucho más rápido.
En el otro caso además se incluirá en la fase de la GFP y su regulador correspondiente una secuencia con alta afinidad por un RNA antisentido específico que previsiblemente inhibirá su traducción. La secuencia se identifica como Ompn.
Veamos el Data Page realizado por Félix Reyes Martín y Yolanda Elisabet González Flores.
Estas implementaciones por un lado aumentarán radicalmente la velocidad de cambio de un estado a otro y por otro harán mucho más robusto todo el sistema, ya que los posibles niveles basales de los promotores y la relajación de los sistemas de inhibición se verán anulados imponiendo dos escalones más de regulación por la proteólisis e inhibición de la traducción.
XIV Preámbulo
Introducción 1
Modelado, análisis y control de un sistema biológico
biestable
El trabajo que se detalla en este documento compendia y profundiza en los estudios de modelado matemático que llevé a cabo durante el año 2011 para el proyecto de investigación 'Flashbacter' realizado por el grupo de trabajo UPO-Sevilla.
En el preámbulo del texto, se ha intentado situar al lector en el contexto de la Biología Sintética como marco científico y tecnológico. Además se recomienda la lectura del
“Anexo: Fundamentos Biológicos” al final de este documento para el lector no conocedor de aspectos de biología molecular.
El desarrollo que se explica a continuación elaborará una argumentación que pasará desde la presentación de las construcciones a modelar y su comportamiento esperado, hasta la contraposición de los resultados extraídos de las simulaciones realizadas en Matlab, con los resultados experimentales presentados en el concurso de biología sintética iGEM 2011.
Además, a lo largo de todo este estudio, se mostrarán el bajo el cual se han alcanzado todos los sistemas, se procederá a un análisis de estabilidad, robustez y bifurcaciones en los parámetros. Tras ellos, y con el enfoque estocástico, se simularán los modelos estudiados, logrando así una comprensión mayor de los mismos.
Por último, y antes de las conclusiones finales del documento, mostraremos los resultados experimentales que, el grupo de investigación UPO-Sevilla de la Universidad Pablo de Olavide, realizaron durante el año 2011.
2 Introducción
Introducción 3
1. Objeto
El proyecto Flashbacter creó un sistema que variaba entre dos situaciones estables. Al igual que un conmutador puede estar abierto o cerrado, se planteó la posibilidad de tener un sistema viviente que asemejara su comportamiento al de un interruptor. Así, partiendo de diversos estudios actuales que habían conseguido sintetizar construcciones que actuaban de esa forma, se buscó ir un paso más allá en la creación de nuevas células que tuvieran un comportamiento más estable y robusto.
El problema surge en el momento de comprender el sistema una vez creado. Una bacteria es un sistema viviente cuyas interacciones internas no se pueden controlar desde el exterior. Aunque ésta se usa como chasis, i.e. como ambiente aislado, no es controlable cada aspecto de la evolución de las poblaciones. Además, tampoco es posible obtener una medición fiable de la cantidad de moléculas que se encuentran en su interior.
Dada la dificultad que se encuentra al tratar con sistemas vivientes donde no podemos predecir exactamente lo que ocurre en su interior, se hizo necesario tener una herramienta capaz de simular este funcionamiento de la forma más simple y rápida posible. Es esta necesidad la que se intentó cubrir con el trabajo que se presenta a continuación.
Por lo tanto, los objetivos generales que pretende cubrir este estudio son:
• Crear modelos fiables de los sistemas que comprende el proyecto Flashbacter.
• Lograr que las simulaciones de estos modelos reproduzcan el comportamiento cualitativo observado en laboratorio.
• Profundizar en el estudio de los modelos, de forma que podamos conocer la estabilidad y robustez de cada sistema.
• Modelar las acciones de control sobre los sistemas.
• Desarrollar herramientas de simulación, no sólo para estos sistemas.
4 Introducción
Introducción 5
2. Alcance
Tras haber definido el objeto del proyecto, se comenzó a plantear la alcanzabilidad de tales propósitos.
En un primer enfoque se pensó en la posibilidad de estudiar el sistema en laboratorio, de forma que pudiéramos obtener diferentes datos acerca del comportamiento de algunas de las especies interviniente. De esta forma, podríamos aproximar los modelos, conociendo parte de las evoluciones reales, a la realidad.
Esta primera idea se desechó debido a la dificultad de estudio de etapas tan específicas de las reacciones moleculares como a la cantidad de datos necesarios.
Se comprendió que lo primero que se haría era comenzar con el modelo matemático e ir simplificándolo hasta hacerlo lo más manejable posible. Así, a partir de estudios anteriores de otros científicos, podríamos establecer una meta alcanzable y realista.
El modelo simplista debería ayudarnos a comprender de forma global las respuestas observadas en laboratorio. Sin embargo, el modelo no podría asemejarse cuantitativamente a lo observado a través de los experimentos dada la dificultad de encontrar experimentos válidos para nuestra construcción en la bibliografía.
Así, establecemos los siguientes puntos a alcanzar dentro de este estudio:
• Crear modelos cualitativos.
• Análisis de estabilidad de tales modelos.
• Análisis paramétrico y de bifurcaciones. Establecer valores críticos.
• Modelado cualitativo de las acciones de control. Comprender la manera en que éstas afectan al sistema autónomo.
Por lo que, los resultados que de este documento extraigamos:
• No reflejarán los comportamientos estudiados en laboratorio.
• Los valores de decisión que podamos obtener durante el desarrollo, serán orientativos y cualitativos, entendiendo que suponen una barrera para la estabilidad o robustez del sistema, pero no así su valor concreto.
6 Introducción
Introducción 7
3. Antecedentes. Discusión de Metodologías
El problema al que nos enfrentamos al comenzar la tarea de modelado del sistema biológico es el de encontrar el método adecuado. Las redes reguladoras como sistemas biológicos reales no tienen un comportamiento ideal ni determinista, lo cual, implica que sea necesario utilizar técnicas de modelado no convencionales que nos pongan a disposición una visión más amplia y adecuada del funcionamiento interno de los entes biológicos que participan de la regulación.
Características de las Redes Reguladoras de Genes
La expresión de un gen es un proceso complejo regulado por varias etapas de diferentes niveles. Una red reguladora de genes se compone de la expresión de las proteínas reguladoras (que a su vez se descompone en la transcripción y traducción del gen), de su activación o inhibición, además de la síntesis y degradación de las especies intervinientes, tales como, ARN mensajero, ARN polimerasa, ribosomas, proteasas,... La gran cantidad de datos de los que se compone un sistema de este tipo convierte el estudio de su dinámica en una tarea compleja.
8 Introducción Desde la visión de la mecánica clásica, dadas unas condiciones iniciales y definidas las ecuaciones diferenciales que gobiernan el comportamiento del sistema, es posible conocer el estado final que alcanzará en un determinado tiempo. Sin embargo hay varias razones por las que en nuestro sistema, esto no es válido:
• Incluso si el sistema evolucionara de forma determinista respecto a posición, velocidad, aceleración de las partículas y población de las especies, le evolución de cada una de ellas no puede ser calculada deterministamente.
• No se pueden evitar las implicaciones que resultan de la indeterminación cuántica. No podemos saber cuándo se producirá la reacción.
• El sistema real no puede estar mecánicamente aislado.
Según Adam P. Arkin, “Las simulaciones deterministas son suficientes para predecir el comportamiento medio de los niveles de población, pero no pueden abordar cuestiones sobre el ruido, el cambio aleatorio entre estados estables del sistema, o el comportamiento del sistema con unas pocas moléculas de las especies claves. Estos temas se tratan con simulaciones estocásticas” [1].
Técnicas de modelado de redes reguladoras de genes
Se expondrán a continuación algunas de las técnicas de modelado para redes reguladoras de genes, que se utilizan hoy día entre numerosos investigadores. Tras la exposición de los diferentes enfoques se incluirá una decisión y los motivos que han llevado a adoptarlos.
Entre las más importante se encuentran: Modelo en EDOs (Ecuaciones Diferenciales Ordinarias) acopladas, Redes de Petri, Booleanas o Bayesianas, o Ecuaciones Estocásticas.
Introducción 9 ECUACIONES DIFERENCIALES ORDINARIAS
Es el método más utilizado para el estudio de sistemas en ingeniería y ha sido amplia su aplicación para el estudio de sistemas reguladores de genes. Gracias a esto, en la literatura podemos encontrar un amplio número de enfoques de modelado por ecuaciones diferenciales ordinarias así como de diversas leyes cinéticas.
La regulación se modela mediante ecuaciones cinéticas del nivel de expresión de cada componente del sistema como una función de la concentración del resto de componentes.
𝑥 = [𝑥1, … , 𝑥𝑛]′ ≥ 0 Concentración de las proteínas, y otros elementos.
𝑑𝑥𝑖
𝑑𝑡 = 𝑓𝑖(𝑥), 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 Ecuaciones cinéticas del nivel de expresión de cada elemento.
También existe una versión discreta en el caso en que se desee modelar los retrasos debidos al tiempo que requiere cada reacción en ocurrir.
Consideraciones
• Resulta adecuado utilizar el método cuando lo que son resultados cualitativos del sistema que se analiza.
• La simulación del funcionamiento de las redes se suele complementar con un análisis de bifurcaciones para investigar la sensibilidad de los regímenes permanentes y los valores de los ciclos límites de los parámetros.
• El principal problema que tiene este método es que es muy difícil encontrar valores para los parámetros cinéticos. Sólo están disponibles valores para sistemas que se han estudiado en profundidad.
• Los parámetros se estimaran usando técnicas de identificación de sistemas.
10 Introducción REDES BAYESIANAS
El regulador génico es un sistema donde cada módulo recibe un número de entradas y las procesa según combinaciones lógicas que confiere al sistema una característica de causalidad. Por otro lado, la red se componente de diversos subconjuntos que realizan una función específica. Las redes bayesianas representan comúnmente una red de variables cuyas relaciones son causales. La probabilidad condicional, de la que hace uso esta técnica, parece las más adecuada para interpretar las relaciones que se establecen entre los subsistemas de los que se compone una red reguladora compleja.
La estructura de los sistemas reguladores de genes se modela a través de un grafo 𝐺 = 〈𝑉, 𝐸〉. Los nodos representan los genes u otros elementos a los que se le asocie una variable aleatoria. Si el nodo es un gen, la variable describe su nivel de expresión. A cada variable aleatoria se le asocia una probabilidad condicional. El grafo G y las probabilidades condicionadas definen la red bayesiana.
𝑋 = {𝑥1, … , 𝑥𝑛} Variables aleatorias de la red 𝑖 ∈ 𝑉 , 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 Cada uno de los nodos de la red Pr{𝑥1, … , 𝑥𝑛} = ∏ Pr{𝑥𝑛𝑖=1 𝑖| 𝑝𝑎(𝑋𝑖)} Distribución de probabilidad de X Consideraciones
• Este método es muy atractivo ya que la base estadística es muy sólida, permitiendo incorporar los aspectos estocásticos de las redes reguladores y los ruidos de las mediciones de forma natural en el modelo.
• Tienen el problema de eliminar la dinámica implícita en la regulación de genes.
Una solución de este inconveniente es la de estudiarlos haciendo uso de las redes bayesianas dinámicas.
Introducción 11 REDES BOOLEANAS
Los nodos del gráfico de una red booleana, se asocian a un gen y otro elemento que participe en el sistema. Cada uno de los nodos se puede describir en 2 estados:
activo/inactivo. El estado de un gen se puede describir como una variable Booleana que indique si está activa su expresión o no. Las interacciones entre los elementos también se pueden representar mediante funciones Booleanas que calcule el estado de un gen a través de la activación de otros.
𝑥� = {𝑥�1, … , 𝑥�𝑛} Variables booleanas que describen el estado de un sistema regulador de genes de n elementos.
𝑥�𝑖(𝑡 + 1) = 𝑏�𝑖�𝑥�(𝑡)�, 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 El nuevo estado de cada variable booleana se calcula a través del estado actual y de una función booleana 𝑏�𝑖.
Consideraciones
• No es posible incluir los efectos de aleatoriedad o ruidos.
• Las redes booleanas son muy aconsejables en el caso de tener grandes redes reguladoras de genes. Las simplificaciones que hace sobre la estructura de estos sistemas, permite analizarlos de una manera muy eficiente.
• Las transiciones entre estados se asumen síncronos, pero el algoritmo no es capaz de tratar con situaciones no simultáneas.
• El nivel de expresión de un gen sólo se puede modelar como activo/inactivo
12 Introducción ECUACIONES ESTOCÁSTICAS MAESTRAS
Este método toma modelos discretos y estocásticos de la red reguladora. Tomando variables discretas para el número de moléculas de cada especie, y una función de distribución probabilística.
𝑝(𝑋, 𝑡 + ∆𝑡) = 𝑝(𝑋, 𝑡) �1 − � 𝛼𝑗∆𝑡
𝑚 𝑗=1
� + � 𝛽𝑗∆𝑡
𝑚
𝑗=1
Evolución temporal de las poblaciones
𝑚 El número de reacciones que pueden ocurrir en el sistema
𝛼𝑗∆𝑡 Probabilidad de que ocurra la reacción j en el intervalo de tiempo [𝑡, 𝑡 + ∆𝑡) Hallando ∆𝑡 → 0 se alcanza la expresión de la ecuación maestra
𝜕
𝜕𝑡 𝑝(𝑋, 𝑡) = � 𝛽𝑗− 𝛼𝑗 · 𝑝(𝑋, 𝑡)
𝑚
𝑗=1
Consideraciones
• La resolución analítica resulta aún más complicada que en el enfoque determinista
• Bajo ciertas condiciones, la ecuación maestra se puede simplificar en ecuaciones diferenciales estocásticas, permitiendo aligerar el coste computacional para la resolución numérica.
• La aproximación de la realidad molecular de una red reguladora es mucho más cierta.
Introducción 13
4. Decisión de las técnicas de modelado
Las técnicas basadas en redes (Booleanas, Bayesianas) parecen muy adecuadas para sistemas reguladores de subconjuntos y especies al permitir establecer relaciones muy simples entre ellas. Aunque nuestro sistema no sea demasiado complejo, lo que pretendemos conseguir con el modelo es hacer una descripción capaz de reproducir los resultados mostrados en laboratorio de la bacteria.
Las redes no profundizan en las dinámicas de las reacciones, y centran su estudio en el comportamiento global. Además, parece no ser posible introducir en las probabilidades de las transiciones, las dinámicas propias de las reacciones moleculares. Por ese motivo, las redes no permiten alcanzar el nivel de profundidad en el estudio del comportamiento ni identificar los procesos que confieren la estabilidad. No nos interesa este enfoque, ya que no parece que cubra el objetivo planteado.
Por otro lado, el modelado en ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales plantea una situación determinista y los efectos del ruido propio de un sistema molecular no se modelan. Una resolución analítica no tiene sentido plantearla para mecanismos donde la aleatoriedad gobierna el desarrollo dinámico de las especies. Sin embargo, parece muy adecuado comenzar con esta técnica para obtener unas primeras nociones del comportamiento global al que tenderá en función de los diferentes estados que pueda alcanzar.
Por último, acudimos a las ecuaciones estocásticas maestras. Parece el más adecuado de todos para hacer un estudio cuantitativo y cualitativo del sistema. El inconveniente que tenemos es que no tenemos tantas herramientas como en el caso anterior para comprender la estabilidad y robustez del sistema.
Por estos motivos, nos parece adecuado llevar a cabo un doble modelado.
Comenzaremos estudiando el sistema a través del método por EDO. Tras el análisis de estabilidad y de bifurcaciones en los parámetros y una comprensión del comportamiento global que muestra el sistema, acudimos al modelado por ecuaciones estocásticas maestras.
14 Introducción
Enfoque Determinista 15
Enfoque determinista
En esta sección, comenzaremos recorriendo las especies participantes tanto en el biestable simple como en el mejorado, y las relaciones que se producen entre ellas, con el objeto de alcanzar un modelo de sistema en ecuaciones diferenciales ordinarias.
La estructura de este apartado continuará con el detalle de las posibles reacciones que se puedan establecer en entre las especies, para más tarde, analizar las dinámicas de cada especie.
Seguiremos nombrado y aplicando las simplificaciones y consideraciones oportunas en búsqueda de la expresión de un sistema matemático manejable.
Para finalizar, mostraremos el modelado final y realizaremos un estudio preliminar de las constantes y parámetros que participan a fin de comprender el efecto sobre los resultados que se puedan extraer de las simulaciones.
Durante este apartado, gran parte del desarrollo se ha seguido el planteamiento propuesto por Timothy S. Gardner en el estudio: “Design and construction of synthetic gene regulatory networks” [2] publicado por la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Boston en el año 2000.
16 Enfoque Determinista
Enfoque Determinista 17
1. Especies y reacciones
El núcleo biestable
Identificamos esta unidad como el conjunto de especies y relaciones que en su funcionamiento autónomo logra alcanzar los objetivos mínimos y necesarios para mantener un comportamiento definido biestable. Por tanto, no incluimos las acciones que nos permitan modificar dichos estados, ni siquiera, nos referimos a un sistema robusto.
Aquí encontramos las expresiones de ambas proteínas represoras y las mutuas represiones de sus expresiones. El conjunto de especies que intervienen en el sistema propuesto son:
Promotores ARNm Represores
𝑃𝑟𝑚 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑙𝑎𝑐𝐼 𝐿𝑎𝑐𝐼
𝑃𝑙𝑎𝑐 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 𝑐𝐼
Además, estas especies reaccionan entre sí de la forma que muestra la siguiente imagen:
18 Enfoque Determinista Por otro lado, las reacciones son:
Transcripción LacI 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑃𝑙𝑎𝑐 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 Traducción LacI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐿𝑎𝑐𝐼 Represión LacI 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝑃𝑟𝑚 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚 Transcripción cI 𝑃𝑟𝑚 → 𝑃𝑟𝑚 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 Traducción cI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 + 𝑐𝐼 Represión cI 𝑐𝐼 + 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑐𝐼|𝑃𝑙𝑎𝑐
Enfoque Determinista 19
El biestable básico
(Plásmido BBa_177038) [3]
Para completar el esquema hasta llegar al del biestable simple, debemos añadir sobre el núcleo anterior, las especies y dinámicas de las acciones que nos permitirán controlar el estado activo, además de los indicadores.
INDICADORES
Es necesario el modelado de los indicadores ya que cuando analicemos los resultados que se hagan en laboratorio, no obtendremos las evoluciones de las proteínas represoras sino de los indicadores. Por lo tanto es necesario conocer su dinámica para poder extrapolar los datos que extraigamos de los experimentos hacia un conocimiento interno del sistema. Analizamos este hecho de forma detenida.
Cuando el transcriptor, se encuentra con un promotor, comienza a leer la cadena y cuando termina de leer su código es cuando comienza a crear la cadena de ARN transcrito.
De la transcripción obtendremos una ARNm, una para la proteína represora y otra para el indicador. Las cadenas negras de la imagen, reflejan la presencia de terminadores.
Estos entes tienen una significación y un objetivo claro para la traducción. La polimerasa detendrá su copia al encontrarse con un doble terminador, como la imagen patenta.
Una vez el mensajero se ha creado completamente, una ribosoma tomará este mensaje y creará la proteína análoga. Los terminadores indican al ribosoma el fin de una proteína y el comienzo de otra.
Por lo tanto, la síntesis de los indicadores se puede igualar a la dinámica de creación de proteínas represoras.
ACCIONES
Las acciones son el aumento de temperatura y la adición de un inductor.
• Aumento de Temperatura: concretamente a 42ºC temperatura a la que la proteína cI termosensible precipita su degradación.
• Adición de Inductor: mientras que la desaparición acelerada de proteína represora no afecta al funcionamiento mismo del núcleo biestable, la inducción
Prm LacI RFP
Plac cI GFP
20 Enfoque Determinista sí que lo hará, ya que modulará la transcripción frente a la represión del agente adversario.
Transcripción LacI 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑃𝑙𝑎𝑐 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼
Traducción LacI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝑅𝐹𝑃 Represión LacI 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝑃𝑟𝑚 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚
Transcripción cI 𝑃𝑟𝑚 → 𝑃𝑟𝑚 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼
Traducción cI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 + 𝑐𝐼 + 𝐺𝐹𝑃 Represión cI 𝑐𝐼 + 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑐𝐼|𝑃𝑙𝑎𝑐
Inducción 1 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺 + 𝑃𝑟𝑚 Inducción 2 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺
Temperatura 𝑐𝐼 → 𝑛𝑢𝑙𝑙
Enfoque Determinista 21
El biestable modificado
(Plásmido BBa_K510019) [4]
(Plásmido BBa_K510036) [5]
De nuevo este sistema se basa en el anterior. Por tanto todo lo explicado hasta el momento se mantendrá, al menos las especies y su aportación. Las nuevas reacciones son la proteólisis y la inhibición por ARNas, llevando asociadas proteasas y ARN antisentido respectivamente.
PROTEÓLISIS
Tras el promotor Plac se encuentra el código de la proteína represora pero antes de llegar al indicador está insertada la cadena de la proteasa (encargada de digerir las proteínas). Observar que tanto la proteasa (Sspb) como el indicador (RFP) llevan un prefijo (Ompn). Éstas serán las cadenas de ARN sobre las que se pegará la ARN antisentido, obligándolas a quedar inservibles hasta su degradación. El represor del fago lambda no se consume.
ARN ANTISENTIDO
En esta rama del plásmido tenemos la misma estructura que en el biestable simple. Tras el promotor Prm se encuentra el código de la proteína represora y el indicador. También podemos ver como en este caso se han añadido un sufijo (Das4) a las proteínas. Este código quedará transcrito en una especia de cola unida a las proteínas originales. Esto implica que las proteasas serán sensibles a digerir esta cola, digiriendo tras ella el resto de la proteína
La creación de las ARN antisentido, se crea con el mismo promotor Prm, sin embargo este módulo no lo comparte con el resto de la cadena, sino que tiene una copia propia.
Esto significa que su transcripción no se sitúa en el mismo instante que la del resto (LacI y GFP).
Plac cI(ts) Ompn::Sspb Ompn::RFP
Prm LacI::Das4 GFP::Das4
Prm ARNas
22 Enfoque Determinista Incluimos una tabla que recoge todas las especies intervinientes de este sistema:
Promotores ARNm Represores Inhibidores
𝑃𝑟𝑚 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑙𝑎𝑐𝐼 𝐿𝑎𝑐𝐼 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠
𝑃𝑙𝑎𝑐 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 𝑐𝐼 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏
Y además, en la siguiente imagen se muestra cómo se interrelacionan las especies y a través de qué mecanismos.
Ahora vemos una tabla resumen de todas las reacciones que se nombran en la imagen anterior.
Transcripción LacI 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑃𝑙𝑎𝑐 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼
Traducción LacI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐺𝐹𝑃 Represión LacI 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝑃𝑟𝑚 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚
Transcripción cI 𝑃𝑟𝑚 → 𝑃𝑟𝑚 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼
Traducción cI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 + 𝑐𝐼 + 𝑅𝐹𝑃 Represión cI 𝑐𝐼 + 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑐𝐼|𝑃𝑙𝑎𝑐
Enfoque Determinista 23 Inhibición por ARNas 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝑛𝑢𝑙𝑙
Proteólisis 1 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏+ 𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏 Proteólisis 2 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏+ 𝐺𝐹𝑃 → 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏
Inducción 1 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺 + 𝑃𝑟𝑚 Inducción 2 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺
Temperatura 𝑐𝐼 → 𝑛𝑢𝑙𝑙
24 Enfoque Determinista
2. Dinámica de las reacciones
Transcripción
Desarrollamos un modelo de la unión de la ARN polimerasa al elemento promotor y la transcripción completa de la molécula ARN mensajera tal que, siendo la reacción:
𝐴𝑅𝑁𝑝 + 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 𝜆𝑓 ⇌
𝜆𝑏
𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑟𝑖𝑝𝑡𝑜𝑟 𝜆𝑓
→ 𝐴𝑅𝑁𝑝 + 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + 𝐴𝑅𝑁𝑚
Las ecuaciones de velocidad para cada elemento, son las siguientes:
𝐴𝑅𝑁𝑝̇ = −𝜆𝑓· 𝐴𝑅𝑁𝑝 · 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + (𝜆𝑏+ 𝜆𝑐) · 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟̇ = −𝜆𝑓· 𝐴𝑅𝑁𝑝 · 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + (𝜆𝑏+ 𝜆𝑐) · 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝚥𝑜̇ = 𝜆𝑓· 𝐴𝑅𝑁𝑝 · 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 − (𝜆𝑏+ 𝜆𝑐) · 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 𝐴𝑅𝑁𝑚̇ = 𝜆𝑐· 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜
Este modelo de la transcripción es correcto para el caso en que la reacción se lleve a cabo en un volumen reactivo homogéneo. Sin embargo, resulta engorroso trabajar con tantas ecuaciones y parámetros, por ello ponemos atención en la reacción y en la formulación planteada por Michaelis-Menten para reacciones catalizadas por enzimas.
Primero comparamos las reacciones que modela con la transcripción:
𝐸 + 𝑆 𝑘1 ⇌
𝑘−1 𝐸𝑆 𝑘2
→ 𝐸 + 𝑃
Podemos identificar enzima, sustrato y producto con nuestro modelo:
Sea: E = Promotor; S = ARNp; ES = Cc; P = ARNm
La diferencia frente a este modelo, es que el sustrato se consume al convertirse en producto. Sin embargo, en la transcripción, el ARN polimerasa queda libre al finalizar este proceso, pudiendo participar de nuevo en otra transcripción.
Por tanto,
[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ =𝜆𝑐 [𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟]0· [𝐴𝑅𝑁𝑝]
[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚 𝐾𝑚=(𝜆𝑏+ 𝜆𝑐) 𝜆𝑓
La constante de Michaelis queda como una ponderación de las cinéticas intervinientes en la cinética de la transcripción.
Enfoque Determinista 25 [𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟]0 se refiere a la concentración inicial de promotores, que dependerá del número de copias de plásmidos que absorba cada bacteria. Concretamente, por cada copia hay un promotor de cada represor.
Y el modelo completo del producto de la transcripción:
[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ = 𝜆 · [𝐴𝑅𝑁𝑝]
[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚
Donde 𝜆 = 𝜆𝑐 [𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟]0
Los parámetros que aparecen en el factor de la ecuación diferencial que crea 𝐴𝑅𝑁𝑚, son constantes excepto [ARNp] que se refiere a una especie dentro de la bacteria e.
coli.
Traducción
Continuamos con un razonamiento parecido al de la transcripción. Veamos primero como es la reacción de la traducción:
𝐴𝑅𝑁𝑚 + 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 𝑘𝑓
⇌ 𝑘𝑏
𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 𝑇𝑟𝑎𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑘𝑐
→ 𝐴𝑅𝑁𝑚 + 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 + 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟
Así, según Michaelis-Menten, obtenemos una expresión análoga a la de la transcripción, [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]̇ =𝑘𝑐 [𝐴𝑅𝑁𝑚] · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎]
[𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] + 𝐾𝑚𝑢 ; 𝐾𝑚𝑢=𝑘𝑏+ 𝑘𝑐 𝑘𝑓
𝑘𝑚𝑢 es, también, una ponderación de las cinéticas que intervienen, y además, ocurre de nuevo que tanto 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 como 𝐴𝑅𝑁𝑚 son especies de la bacteria y del sistema, respectivamente.
Represión
La reacción de la represión, no podemos modelarla con la formulación de Michaelis- Menten, ya que su comportamiento cooperativo difiere del predicho por éste. Sin embargo, como vimos, dentro de las cinéticas no Michaelianas, podemos usar la formulación planteada por Hill.
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + 𝛽 · 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟 ⇌ 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽
Se observa como la expresión, realmente comprende varias etapas. Primero, el represor debe formar un multímero de tamaño 𝛽,
𝛽 · 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟 ⇌ 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽
Y tras ello, encontrarse con el promotor al que unirse, 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽 ⇌ 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽
26 Enfoque Determinista Evitándose así su lectura.
Tras formarse el multímero, se une competitivamente con la ARN polimerasa a los operadores del gen. La cooperatividad se patenta en la formación de multímeros.
�𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟̇ 𝛽�= [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽 𝐾𝑖𝑢+ [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽
Transformando esta ecuación podemos ver el efecto de las constantes que aparecen en el modelo.
�𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟̇ 𝛽�=
[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽 𝐾𝑖𝑢 1 + [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝐾𝑖𝑢 𝛽
Se advierte más claramente la función de la constante Kiu. Hace una ponderación, significando que una parte de los represores que han formado el 𝛽-mero, participarán de la represión. A este valor, se le conoce como la constante del equilibrio de la unión efectiva del represor al promotor adverso.
Degradación
Las proteínas son sistemas vivientes que se sustituyen continuamente. Por tanto, todas mueren tras un periodo activo variable (desde unos minutos hasta semanas). La muerte o degradación en sus aminoácidos, es un proceso relativamente sencillo de modelar, ya que no nos interesa tanto el proceso de la degradación de la proteína sino cuán rápido se produce para cada tipo. El tiempo característico de cada proteína se mida en base a su vida media, de la cual se puede extraer la tasa de mortalidad δ (mortalidad/unidad de tiempo). Cualquier compuesto (ARNp, ARNm, proteína, proteasa, ARNas,…) que intervine en un sistema biológico tendrá una valor característico de vida media desde el cual estimaremos el valor del parámetro. En este sentido, la ecuación diferencial que modela esta desactivación es de primer orden (ley de acción de masa).
[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ = 𝛿 · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]
La cantidad de moléculas que desaparecen es proporcional a su población.
Hay que mencionar que el valor de la tasa de mortalidad varía con la temperatura. En un caso especial, el represor cI, con un aumento de 37ºC a 42ºC, precipita este valor casi a la unidad.
Enfoque Determinista 27
Proteólisis
Como vimos en el apartado de fundamentos biológicos, este mecanismo lo realiza una proteasa, que se encarga de digerir las proteínas para las que esté diseñado. Veamos la reacción que explica el proceso de la proteólisis:
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎 + 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 → 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎
La cinética que suponemos a este proceso será la acción de masa, una suposición apoyada sobre el argumento expuesto en el proceso de degradación: no nos interesa la dinámica propia de esta reacción sino saber cuántas proteínas se verán afectadas en el tiempo en función de la población de proteasas. En este proceso se consume proteína, mientras que la proteasa vuelve a quedar libremente funcional cuando se separa del degradado.
[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠· [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎] · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]
El proceso de degradación vuelve a ser más complejo de lo que muestra la ecuación diferencial. La dinámica de este proceso es de segundo orden, y por tanto, la constante cinética tiene unas características diferentes:
𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 ∶ [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛]−1[𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1
Inhibición ARN antisentido
La inhibición del ARN mensajero gracias a un ARN antisentido análogo, se produce como se indicó en los fundamentos biológicos. La cinética de esta reacción no es conocida, sin embargo podemos suponerla como una reacción de primer orden (ley de acción de masa), ya que su efecto en el sistema es el comienzo de la unión entre las cadenas.
𝐴𝑅𝑁𝑚 + 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠 → 𝐴𝑅𝑁 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑒𝑛𝑎
El bloqueo de la traducción del ARNm se produce desde el instante en que estas dos hebras se aparean. Una vez que se ha formado este complejo, no queda más que esperar su degradación enzimática, ya que no puede participar de otro proceso y en el estudio general se tomará como una degradación.
[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ −= 𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠· [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠] · [𝐴𝑅𝑁𝑚]
Al igual que en la proteólisis, la constante cinética tiene las mismas unidades al tratarse de un proceso de dinámica de orden mayor:
𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 ∶ [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛]−1[𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1
28 Enfoque Determinista
3. Biestable Simple. Consideraciones de modelado
Represión y transcripción
Trataremos conjuntamente las reacciones de transcripción y la de represión, ya que podemos asumir de forma directa que la proteína represora se unirá compitiendo con la ARNp al promotor. Además, esta represión no sólo la realizará la proteína represora, sino que puede ocurrir que esta forme multímeros y que éstos también participen de la represión. Así, y siguiendo a T. S. Gardner [2] planteamos un modelo conjunto:
[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ = 𝜆 · [𝐴𝑅𝑁𝑝]
[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚· �1 + �[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝐾𝑖𝑟 �𝛼�
Añadiendo cualquier otra dinámica que afecte directamente a la población de ARNm podríamos conseguir un modelo matemático completo que describa su población
Régimen permanente para la transcripción
Según T. S. Gardner, basándose en otro documento [6] el tiempo necesario para la creación del 𝐴𝑅𝑁𝑚 es rápido en comparación con el tiempo necesario para la expresión final de una proteína. Esta suposición se ve respaldada por los siguientes datos extraídos de la base de datos de Harvard [7]:
• Velocidad de transcripción por ARN polimerasa en batería Escherichia Coli: 24/79 nucleótidos/segundo
• Velocidad de traducción por ribosomas en bacteria Escherichia Coli: 12/21 aminoácidos/segundo
Efectivamente, la transcripción es un proceso entre 2 y 4 veces más rápido que la traducción y podemos considerarlo cuasi-estático. Además a estos datos hay que sumarle el tiempo que tras la aparición de un ARN mensajero hasta su encuentro con el primer ribosoma. Podemos asegurar que la transcripción ocupa menos de un 30% en el tiempo de la expresión. Incluso, la componente estocástica intrínseca en estos procesos, favorece la implantación de esta suposición.
Por otro lado, hay que considerar, que esto no afecta a las condiciones de biestabilidad del sistema, aunque sí tendría un efecto a la cinética global.
[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ = 𝜆 · [𝐴𝑅𝑁𝑝]
[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚· �1 + �[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝐾𝑖𝑟 �𝛼�
− 𝛿 · [𝐴𝑅𝑁𝑚]
